DE1919837C3 - Leupeptine, deren Salze und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

worin R₁ und R₂ den Substituenten

/CH,

/ITT OTT '

CH_a

und so

R₃ die Substituenten CH₃ — oder CH₃ — CH₄ — bedeuten, sowie deren Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung der Leupeptine nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß einer der folgenden Streptomyces-Stämme: Streptomyces roseus MA 839-Al (NIHJ MC-9-42), Streptomyces roseus MB 262-M1 (NIHJ MC-11-42) oder Streptomyces roseochromagenes MA 943-M1 (NIHJ MC-10-42), in einem Medium gezüchtet wird, das ein stickstoffhaltiges und kohlenstoffhaltiges Nährmittel enthält.

Die Erfindung betrifft Leupeptine der allgemeinen Formel

R_a R₁ CHO

I I I

R₃ — CO — NH — CH — CO — NH — CH — CO — NH — CH — (CH_t)₃ — NH — C (L) (L)

NH

NH,

worin Ri und R₁ den Substituents

/CH₃

-CH₁-CH

CH,

und R₃ die Substituenten CH₃ — oder CH₃ — CH₂ — bedeuten, sowie deren Säureadditionssalze.

Diese Verbindungen sind wertvolle Arzneistoffe.

Wie aus der allgemeinen Formel hervorgeht, sind die beanspruchten Leupeptine Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-D L-argininal, Propionyl- L-leucy 1- L-leucyl- d L-argininal. Die Erfindung unifaßt die therapeutisch geeigneten Substanzen sowie ihre Säureadditionssalze Leupeptine eignen sich zur Inhibierung von enzymatischen Reaktionen von Trypsin, Papain, Kallikrein, Plasmin und Thrombokinase sowie zur Inhibierung einer Fibrinolyse, einer Kininbilaung aus Kininogen sowie einer Blutkoagulierung. Leupeptine besitzen eine niedrige Toxizität und zeigen eine therapeutische Wirkung auf eine durch Karragenin erzeugte Entzündung in Ratten. Sie eignen sich zur Behandlung von Pankreatitis und Entzündungskrankheiten, insbesondere zur Behandlung von Entzündungskrankheiten der Haut, beispielsweise Verbrennungen.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der vorgenannten Leupeptine, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Streptomyces roseus MA 839-Al (NIHJ MC-9-42), Streptomyces roseus MB 262-M1 (NIHJ MC-11-42) oder Streptomyces roseochromagenes MA 943-M1 (NIHJ MC-10-42) in einem Medium gezüchtet wird, das stickstoffhaltiges und kohlenstoffhaltiges Nährmittel enthält, und daß die entstandenen Leupeptine· von der Nährbrühe abge-

4o trennt werden.

Die Züchtung wird submers unter aeroben Bedingungen so lange durchgeführt, bis eine merkliche Menge des Leupeptins oder an Leupeptinen in der Lösung angereichert ist.

Wie die vorstehende allgemeine Formel zeigt, existieren zwei Gruppen von Leupeptinen, die danach unterschieden werden, ob eine Acetyl- oder eine Propionylgruppe vorliegt. Im folgenden werden Leupeptine mit einer Acetylgruppe als »Leupeptin Ac« und

Leupeptine mit einer Propionylgruppe als »Leupeptin Pr« bezeichnet. Acetyl- oder Propionyl-L-leucyl-L-leucyl-DL-argininal wird als Leupeptin Ac-ll bzw. Ργ-ll

abgekürzt.

Die Erfindung ist nachstehend in Verbindung mit den Zeichnungen näher beschrieben. Es zeigt:

Fig. 1 das lR-Absorptionsspektrum von gereinigtem Leupeptin-Pr-LL-Hydrochlorid (KBr-Preßlinge) und
F i g. 2 das IR-Absorptionsspektrum von gereinigtem Leupeptin-Ac-LL-Hydrochlorid (KBr-Preßlinge). Es hat sich gezeigt, daß Leupeptine von vielen Stämmen verschiedener Spezies von Streptomyces erzeugt werden. Zehn Stämme, von denen sichergestellt ist, daß sie Leupeptine erzeugen, sind nachstehend genannt: Streptomyces roseus, (2 Stämme; die Labornummern des Institute of Microbial Chemistry sind MA 839-Al, MB 262-M1), Streptomyces roseochromogenes (3 Stämme, MA943-M1, MB 456-AEl MB

3 4

Streotomyces chartreusis (1 Stamm, MB58- einer Zeitspanne von 48 bis 72 Stunden beobachtet und

"ir-n qtrentomycesalbirsticuü (1 Stamm, MB26-A1), verschwinden anschließend. Dies ist ein wertvoller Hm-

^ tonwcesthioluteus (1 Stamm, MB 321-Al), Strep- weis auf die maximale HersteUungsperiodevonLeupep-

strepio y _{ndulao (1Stamm>} MB172-A2) und tinen während der Gärung.

/ces noboritoensis (1 Stamm, MB46-AG). 5 In tinem Medium, das organische Matenaüen, wie

η dieser Spezies werden in »The beispielsweise Pepton, Kaseinhydrolysat od. dgl. ent-

Bandll (von S.A. Waksman, hält, werden im allgemeinen verschiedene Leupeptine

£%^t;^rZr ^i^m^rnderAnU_?rS

Γ£ eSunigemäßen Methoden zum wird wie folgt durchgeführt: Die Mischung, welche AküviSTsowie'd« Herstellungsvermögens aus 0,5 ml einer Euglobulinlösung, die aus> mensch-Stämme von Streptomyccs aufzufinden, i₅ lichem Serum nach der von Kl' MJB'j« Herstellung von Leupeptinen in Kulturen 204, ^^^-^

ESSSSäSSS" SpIIS

innerhalb des breiten Bereiches von 23 bis einer Fibnnogen-Losung (2,0 _/o in PBb) zügese

ΙΤη wobei innerhalb dieses Temperatur- den. Dann wird 20 Minuten lang be 37 C mkutaen

Squellen zur Herstellung von Leupeptmen verwen- jJ"»J ^^3^5·^ Zersetzung auf. Daher

SSrerts

E, werfen bereils nach 24 Slunden H^u'^ie?¹,^ne _d!.^r: Sf₁₁ woL die Leupepli« cmc.« duert «er-

»ugt. Die maximale Ausbeute wird wahrend eine ^"ff™' Beispielsweise werden Leupcpl.ne an einer

ätepanne »on 48 bis 72 Stunden erhalten und nimmt den^können MP ^ _mU .„_g„_äu„,_cl„ WaMer

danach ab. Die Dünnschichtchroinatographie unter «^k'2°"'rcrn Methanol, einem angesäuerten waBngen

Las„„_gS,it.e,

neutrale Lösungsmittel. Ein Anionenaustauscherharz dampft wird. Dabei werden gereinigte Mischungen der

ist ein geeigneteres Adsorptionsmittel zur Extraktion Hydrochloride von Leupeptinen erhalten.

von Leupeptinen. Ein poröses, schwachsaures Harz, Das am meisten gereinigte Leupeptin-Pr-Hydro-

beispielsweise Lewatit-CNP® (Farbenfabriken Bayer Chlorid, das hauptsächlich Leupeptin-Pr-ix enthält,

AG) ist vorzuziehen. Das Kationenaustauscherharz 5 wie sich durch die Aminosäureanalyse ergibt (Leucin

kann in der H-, NH₄-, Na- und Li-Form sowie in 1,00, Isoleucin 0,10 und Valin 0), besitzt folgende Eigen-

Mischungen aus diesen Formen verwendet werden. schäften: Weißes Pulver, das zwischen 110 und 140⁰C

Wird ein Kationenaustauscherharz in der Η-Form ver- schmilzt, [α]?—56° (c = 1, Methanol), pKa' mehr

wendet, dann werden die adsorbierten Leupeptine lang- als 12.

sam mit verdünnter Salzsäure oder mittels eines io Analyse:

50 %igen wäßrigen Acetons eluiert. Jedoch ist ein saures CHON- HCl -HO

organisches Lösungsmittel, beispielsweise eine 0,5 n- "Berechnet ... C 50^95, H 8,76, 016,16,

HCl in einem 50%igen wäßrigen Aceton oder eine N 16 98 Cl 716·

0,5n-HCHn einem 50-bis 80%igen wäßrigen Methanol gefunden C 51,13,' H 8,77,'O 14,96,

für die Eluierung geeigneter. 15 N 17,10, Cl 5,73.

Zur weiteren Reinigung eignet sich eine Aktivkohle-Chromatographie, beispielsweise eine Adsorption der Es wird keine charakteristische UV-Absorption fest-Leupeptine aus derwäßrigen Lösung und eine Eluierung gestellt. Das IR-Spektrum zeigt eine Absorption, welunter Verwendung von saurem wäßrigen Methanol. ehe Aldehyd entspricht (1720 bis 1730 cm"¹), und Eine Aluminiumoxyd-Chromatographie kann ebenfalls 20 starke Amidbenden (1650, 1540 cm"¹). Das NMR-für Reinigungszwecke verwendet werden. Die Alumi- Spektrum (100 MHz) in (CD₃)₂SO zeigt das Vorliegen niumoxyd-Chromatographie wird mit Methanol, Ätha- einer N-Propionylgruppe in dem Molekül, und zwar nol, Chloroform/Methanol, Äthylacetat/Methanol od. an Hand von Peaks bei δ 1,00 (Triplett, 3H) und bei dgl. entwickelt. Werden Leupeptine in Methanol, Ätha- δ 2,12 (Quartett, 2H).

nol oder in den Mischungen dieser Lösungsmittel mit 25 Das am meisten gereinigte Leupeptin-Ac-Hydro-

Wasser gelöst, dann durchlaufen die Leupeptine die chlorid, das hauptsächlich Leupeptin-Ac-LL enthält,

Aluminiumoxydsäule. Dieses Verfahren eignet sich wie sich an Hand einer Aminosäureanalyse ergibt

zur Abtrennung von Leupeptinen von gefärbten Ver- (Leucin 1,00, Isoleucin 0,04 und Valin 0,01), besitzt

unreinigungen. Eine lonenaustausch-Chromatographie folgende Eigenschaften: Weißes Pulver, das bei 75 bis

eignet sich ebenfalls zur Reinigung von Leupeptinen, 30 110° C schmilzt, [»]?—52° (c = 1, Methanol), pKa'

beispielsweise läßt sich ein Kationenaustauscherharz mehr als 12.
in der gemischten H- und Na-Form verwenden, wobei
die Leupeptine mit 0,1 bis 0,2 n-HCl eluiert werden.

Eine Kieselsäure-Säulenchromatographie ist ebenfalls zur Reinigung von Leupeptinen geeignet. Bei- 35
spielsweise werden Leupeptine in einer Mischung aus
Chloroform und Methanol (9:1) gelöst, worauf das
Chromatogramm mit Chloroform/Methanol (8 : 2) entwickelt wird. Es wird kein charakteristisches UV-Absorptions-

Eine Gegenstromverteilung kann ebenfalls zur Ex- 40 Spektrum festgestellt. Das IR-Spektrum ähnelt dem-

traktion oder Reinigung von Leupeptinen angewendet jenigen von Leupeptin-Pr-Hydrochlorid. Das NMR-

werden. Ein Vielstufenzentrifugalextraktor, wie bei- Spektrum (100 MHz) in (CD₃)₂SO (Peak bei δ 1,85

spielsweise der Polbielniak-Zentrifugalextraktor, kann (Singlett, 3 H) zeigt das Vorliegen einer N-Acetylgruppe.

für diesen Zweck verwendet werden. Der Verteilungs- Die Hydrochloride von Leupeptinen sind in Wasser,

koeffizient von Leupeptinen zwischen Butanol und 45 Methanol, Äthanol, Butanol, Essigsäure, Dimethyl-

einem Phosphatpuffer mit einem pH von 6,0 beträgt formamid und Dimethylsulfoxyd löslich und kaum

ungefähr 1. Die Extraktion von Leupeptinen mit Bu- löslich in Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Tetra-

tanol eignet sich zur Reinigung von Leupeptinen. chlorkohlenstoff, Äthyläther und n-Hexan.

Die Leupeptine lassen sich aus den wäßrigen Lösun- Leupeptine ergeben positive Rydon-Smith-, rote gen als ihre Pikrate, Flavianate, Reineckate und 5-Me- 50 Tetrazolium-, 2,4-Dinitrophenylhydrazin-, Sakaguchi-, thyl-j8-naphthalinsulfonsäuresalze ausfällen. Diese Aus- Diacetyl- und Pentacyanoaquoferriat-Reaktionen und fällungsmethode eignet sich ebenfalls zur Herstellung negative Ninhydrin-, Jaffe-, Eisen(III)-chlorid-, Anvon Leupeptinen. Diese Salze werden mit orga- thron-, Molisch- und Benzidin-Reaktionen.
nischen Lösungsmitteln behandelt, welche Chlor- Die Papierchromatographie von Leupeptinen nach wasserstoffsäure enthalten, und werden in Hydro- 55 der aufsteigenden Methode ergibt einen einziger chloride von Leupeptinen umgewandelt. Nach- Flecken, der durch die Rydon-Smith-, rote Tetrazoliumstehend wird ein wirksames Verfahren zur Extraktion oder Sakaguchi-Reaktion entwickelt wird. Der Rf-Wer! und Reinigung von Leupeptinen aus einer Kultur- beträgt 0,9 bis 0,95, und zwar bei einer Entwicklung brühe angegeben: Leupeptine werden unter Verwen- mit einer oberen Schicht aus Butanol/Essigsäure/Was· dung eines porösen Kationenaustauscherharzes mit 60 ser (4:1:5, bezogen auf das Volumen), 0,9 bis 0,9i Carbonsäuregruppen adsorbiert und mit Chlorwasser- unter Verwendung von n-Propanol/Wasser*(7: 3) und stoffsäure/Methanol eluiert, worauf das Eluat unter 0,4 bis 0,6 bei Verwendung von Äthylacetat/Methanol/ Vakuum konzentriert wird. Die konzentrierte wäßrige Wasser (4:1:1). Bei einer Hochspannungspapier-Lösung wird einige Male mit Butanol extrahiert, wo- elektrophorese (3500 V, 15 Minuten) unter Verwen rauf der Butanolextrakt zur Trockne eingedampft 65 dung von Ameisensäure/Essigsäure/Wassei wird. Der Rückstand in der wäßrigen Lösung wird (25: 75: 900) findet man die Leupeptine in einer Ent durch Durchleiten durch die Säule aus dem Anionen- fernung von 5 bis 6 cm vor dem Ausgangspunkt ir austauscherharz entfärbt, worauf der Abstrora einge- Richtung auf die Kathode. Bei einer Dünnschicht

Analyse:	HCl-	H2O	H	8,59,	O	16,63,
C20H38O4N6	... C	49,93,	Cl	7,37;
Berechnet	N	17,47,	H	8,57,	O	16,42,
	... C	50,34,	Cl	5,27.
gefunden	N	16,03,

7 8

Chromatographie unter Verwendung von Kieselgel G Die IR-Spektren zeigen eine starke Absorption bei (Merck) ergeben Leupeptine einen einzelnen Flecken 1070 cm"¹, die dem Acetal zugeschrieben wird. Bei der bei einem Rf.-Wert von 0,6 bis 0,7 bei Verwendung Durchführung einer Dünnschicht-Chromatographie von n-Propanol/Wasser (7 : 3), 0,2 bis 0,4 bei Verwen- unter Verwendung von Kieselgel G und Butanol/Butyldung von Chloroform/Methanol (7: 3), 0,2 bis 0,3 bei 5 acetat/Essigsäure/Wasser (4:2:1:1) ergeben Leu-Verwendung von Aceton/Wasser (1:1) und 0,3 bis 0,4 peptin-Pr-di-n-Butylacetal und -Ac-di-n-Butylacetal jebei Verwendung von Äthylacetat/Essigsäure/Wasser weils einen einzigen Flecken mit einem Rf .-Wert von (60:17 :17). Leupeptine Pr und -Ac lassen sich nicht 0,65 bzw. 0,60.

durch Papier- und Dünnschicht-Chromatographie so- Die gereinigten Leupeptine besitzen eine Antiplaswie durch Hochspannungspapier-Elektrophorese unter io minaktivität und zeigen eine Inhibierung von Trypsin, den vorstehend angegebenen Bedingungen unterschei- Papain und Kallikrein, jedoch nicht von Chymotrypsin, den. Bei der Dünnschicht-Chromatographie an Kiesel- Die 50%igen Inhibierungskonzentrationen von Leugel G unter Verwendung von Butanol/Butylacetat/Es- peptinen werden in folgender Weise erhalten: Durch sigsäure/Wasser (4: 2:1:1, bezogen auf das Volumen) proteolytische Hydrolyse von Fibrin durch Plasmin, als Entwicklungsmittel werden die Leupeptine Pr und 15 von Kasein durch Trypsin und Hämoglobin durch -Ac getrennt. Jedes dieser Leupeptine ergibt zwei Papain bei 6 mcg/ml 2 mcg/ml und 0,15 mcg/ml Leu-Flecken mit folgenden Rf.-Werten: 0,45 bis 0,50 und peptinen und esterolytische Hydrolyse von p-Toluol-0,35 bis 0,45 für Leupeptin Pr und 0,35 bis 0,45 und sulfonyl-L-argininmethylester (TAME) und a-N-Ben-0,30 bis 0,35 für Leupeptin Ac. Der Extrakt aus beiden zoylargininäthylester (BAEE) durch Plasmin, Trypsin Flecken läßt sich in Form von 2 Flecken bei Anwen- so oder Kallikrein bei 65 bis 85 mcg/ml Leupeptinen. Die dung der gleichen Dünnschicht-Chromatographienach- Art der Inhibierung von Leupeptinen verläuft in Konweisen, kurrenz zu der Hydrolyse von TAME durch Trypsin Leupeptin Pr-LL-di-n-Butylacetalhydrochlorid ist und Hämoglobin durch Papain. Die Leupeptine ein weißes Pulver, das bei 70 bis 90⁰C schmilzt. inhibieren eine Blutkoagulierung bei Menschen, [«]?'—46° (c = 2, Methanol), pKa' mehr als 12. as Kaninchen, Katzen und Rindern. Die Inhibierung Analyse: einer Koagulierung des Blutes von Mäusen, Ratten r u r» w um η r» ^un(* Hunden ist sehr schwach. Diese Wirksamkeit von W-I₆₈U₆Ne-HU-H₂U η is IS Leupeptinen wird mit Trasylol, Trypsin-Inhibitor, üerecnnet ... ^d./u, "W""^ trans - 4 - Aminomethylcyclohexancarbonsäure (tr«₇, ho« nudi so AMCHA) und «--Aminocapronsäure (ε-ACA) vergligeiunden ... <-">'£ «^ ⁰^ ^{u 1H}>^HJ' chen. Leupeptine, Trypsin-Inhibitor und Trasylol haben

' sich als wirksame Inhibitoren gegenüber Plasmin und

Die Molekülformel wird zu C₂₉H₆₈O₆N, ermittelt, Trypsin erwiesen. Die inhibierende Wirkung von und zwar durch den Stammpeak mje = 570 in dem Leupeptinen ist um das lOOfache stärker als diejenige Massenspektrum. 35 von e-ACA und um das 20fache kräftiger als die-Leupeptin Pr-LL-di-n-Butylacetalpikrat ist ein gelbes jenige von t-AMCHA auf das Piasminsystem. Leukristallines Pulver mit einem Schmelzpunkt von 60 bis peptine sind wirksame Inhibitoren gegen eine Throm-90° C. bokinase, jedoch nicht gegen a-Chymotrypsin. Trasylol Analyse: vermag nicht eine Thrombokinase zu inhibieren, ist je-PHnMrHON ⁴° ^^{ocn em w}i^rk^samer Inhibitor gegen a-Chymotrypsin. Sh pr?Vc u 7 69 O 24 00 N 15 76- Leupeptine zeigen ferner eine inhibierende Wirkung JfwÜÜ?!! '" r v'v H 7W η 24KQ N 15*43' gegenüber einer Carrageenin-Entzündung in Ratten, gefunden ... C 52,32, H 7,80, O 24,80, N is.«. ^ _{intraperitoneale Injektion von mehr als} ^₂₅mg/kg

Leupeptin Ac-LL-di-n-Butylacetalhydrochlorid ist von Leupeptinen oder eine orale Verabreichung von

ein weißes Pulver. F. 70 bis 90⁰C, [«]"— 43° (c = 2, 45 mehr als 12,5 mg/kg an Ratten inhibiert eine Entzün-

Methanol), pKa' mehr als 12. dung der Fußpolster, welche durch eine subkutane

. . Injektion von 0,05 ml einer 1,0 %igen Caarageenin-Lö-

Analyse. _sung _eTZeugt worden ist. Leupeptine werden gut auf

C₂₈H₅₈O₅N, · HCl · 1/2Hj₁O oralem Wege absorbiert. Werden 1000 mg/kg auf

n u γ·««α η o 7i Ct Λ &fA ⁵° oralem Wege an Ratten verabreicht, dann wird dei

Berechnet ... L. 53,84, «»."._^{υ lif}·⁰¹' höchste Blutgehalt von ungefähr 200 mcg/ml in dem

«rf α nifffvx hoict' η la 77 Serum nach 1,5 Stunden festgestellt, während

getunden ... <~J°·"* h*,o/ υ ι*,//, 2400 mcg/ml in dem Urin nach 3 bis 5 Stunden er-

is ΐί,οο, uo, . mittelt werden. Insgesamt ungefähr 40% der verab-

Die Molekülformel ergibt sich aus dem Hochauf- 55 reichten Leupeptine werden aas dem Urin wiederge-

lösungsmassenspektrum des Hydrocblorids: Berechne- wonnen. Die LD₆₀ sind wie folgt: Mäuse 118 mg/kj

tes Molekulargewicht für Cj₈H₅₈O₅N₆: 556,431; ge- durch intravenöse Injektion, 1405 mg/kg durch sub

fundeo: m\e 556,429 ± 0,003. kutane Injektion, 1550 mg/kg auf oralem Wege; Rat

Leupeptin Ac-LL-di-n-Butylacetalpikrat ist ein gel- ten: 125 mg/kg durch intravenöse Injektion

bes kristallines Pulver. F. 60 bis 100⁰C. 60 > 4000mg/kgdurch subkutane Injektion, > 4000mg/kj

. auf oralem Wege; Kaninchen 35 mg/kg durch intra·

Analyse: venöse Injektion, 300 mg/kg dorch subkutane Injek

C₂₈H₆₈O₆N, · QH₈O₇N, tion, > 1500 mg/kg auf oralem Wege.
Berechnet ... C 51,96, H 7,57, O 24,43, N 16,04:

gefunden ... C 51,78, H 7,51,0 25,17, N 15,67. 65 B e 1 s ρ 1 e I 1

Streptomyces roseus MA 839-Al wird bei 27° C wäh

Leupeptin-Pr- und -Ac-di-n-Butylacetalhydrochlo- rend einer Zeitspanne von 71 Stunden in 85 Kolbet

ride besitzen keine charakteristische UV-Absorption. (eingenommenes Volumen in einem Kolben: 12SmI

ίο

gezüchtet, wobei die Kolben mittels einer sich hin- extrahiert, worauf der Extrakt zur Trockne eingedampft und herbewegenden Schüttelvorrichtung (130 Bewe- wird. Dabei werden 979,1 g eines bräunlichen Pulvers gungen/Minute) geschüttelt werden. Das Medium ent- (Antiplasminaktivität: ID₆₀ 13 mcg/ml, Aktivitatsaushältl% Glukose, 1% Stärke, 2% Polypepton (Daigo beute: 75%) erhalten.

Eiyo Co.) und 0,5% Natriumchlorid und wird unter 5 164 mg des bräunlichen Pulvers in 2 ml wasser Verwendung von 2n-Natriumhydroxyd auf einen pH werden entfärbt und mittels Harzchromatographie von 7,0 eingestellt. Ein vegetatives Inokulum, das 2Tage unter Verwendung von Dowex® 1-2 100 bis 200 mesh, lang in dem gleichen Medium gezüchtet worden war, Cl-Form, 10 ml), wobei mit Wasser entwickelt wird, wird in einer Menge von 1 Volumenprozent verwen- gereinigt. Das Eluat, das positive Rydon-Smith- und det. Die Kultu.rbrühe wird gesammelt (101, Antiplas- io Kasaguchi-Reaktionen ergibt, wird zur Trockne minaktivität: ID₅₀ 0,015 ml/ml) und zentrifugiert, und eingedampft, wobei 126 mg eines weißen Pulvers aus zwar bei 3000 Upm während einer Zeitspanne von Leupeptinhydrochloriden anfallen (Antiplasminaktivi-10 Minuten. Der überstehenden Flüssigkeit (91, tat: ID₈₀ 11 mcg/ml, Aktivitätsausbeute: 91%). pH 7,3) werden 135 g Kohle (Wako Pure Chem.) zugesetzt. Nach einem 30 Minuten dauernden Rühren 15 B e i s ρ i e 1 3 wird die Kohle durch Filtration abgetrennt und mit 61 Trennung der Leupeptin-Pr- und -Ac-di-n-Butyl-Wasser gewaschen. Dann erfolgt eine Eluierung mit ti 1500 ml und 1200 ml eines sauren 80 %igen Methanols acetale (pH 2, eingestellt unter Verwendung von 2n-Chlor- 19,2 gderLeupeptinhydrochloride(ID₅₀:15 mcg/ml) wasserstoffsäure). Das aktive Eluat wird mit »Amber- ao werden in 270 ml Butanol 2 Stunden lang am Rücklite® TR 45« (OH-Form) neutralisiert und bis zur fluß gehalten. Die Butanollösung wird mit 270 ml Was-Trockne eingedampft. Dabei fallen 22 g eines bräun- ser gewaschen und zur Trockne eingedampft. Dabei liehen Pulvers an (Antiplasminaktivität :ID₅₀95 mcg/ml, werden 23,4 g eines Rohpulvers erhalten. 14,0 g des Aktivitätsausbeute: 38%). Das bräunliche Pulver wird Rohpulvers werden in 20 ml Butanol/Butylacetat/Esin 500 ml Wasser (pH 7,0) gelöst und auf eine Kohle- 25 sigsäure/Wasser (4:8:1:1) aufgelöst und einer Säusäule (Wako Pure Chem., 110 g) geschüttet. Die Säule lenchromatographie (Kieselsäure, Mallinckrodt, 900g) wird mit 21 Wasser und 2 1 einer 0,02n-Salzsäure ge- unterzogen, wobei mit dem gleichen Lösungsmittel waschen und mit einer 0,02n-Salzsäure in 80% Metha- entwickelt wird. Das erste Eluat (150 ml), das Rydonnol eluiert. Das Eluat wird mit »Amberlite® IR 45« Smith- und Sakaguchi-Reaktionen ergibt, wird zur (OH-Form) neutralisiert und zur Trockne eingedampft. 30 Trockne eingedampft. Dabei werden 1,5 g Leupeptin-Dabei werden 8,9 g eines gelblichen Pulvers (Anti- Pr-di-n-Butylacetalhydrochlorid in Form eines weißen plasminaktivität: ID₅₀ 53 mcg/ml, Aktivitätsausbeute: Pulvers erhalten. Das zweite Eluat (500 ml) wird zur 72%) erhalten. 7,5 g des gelblichen Pulvers werden in Trockne eingedampft, wobei 5,3 g einer Mischung an-50 ml Methanol gelöst und auf eine Aluminiumoxyd- fallen, die Leupeptin-Pr- und -Ac-di-n-Butylacetal säule (Woelm, sauer, 750 g) gegossen. Die Säule wird 35 (Hydrochlorid) enthält. Das dritte Eluat (1400 ml) wird mit Methanol entwickelt. Das Eluat, das positive zur Trockne eingedampft Dabei werden 3,4 g Leupep-Rydon-Smith-, Sakaguchi- und rote Tetrazolium- tin-Ac-di-n-Butylacetalhydrochlorid in Form eines Reaktionen liefert, wird zur Trockne eingedampft. weißen Pulvers erhalten. Dabei werden 2,3 g Leupeptinhydrochloride erhalten

(Antiplasminaktivität: ID₆₀ 12 mcg/ml, Gesamtaktivi- 4° B e i s ρ i e 1 4

tätsausbeute: 24%). Leupeptin-Pr-Hydrochlorid

^{B e}' ^{s p}'^{e 1 2} 93 mg Leupeptin - Pr - di - η - Butylacetalhydrochlorid

Streptomyces rossus MA 839-Al wird in einem werden in 5 ml einer 0,01 n-Chlorwasserstoffsäure ge-

20001-Gärgefäß (eingenommenes Volumen: 15001) 45 löst und 3 Stunden lang auf 60°C erhitzt. Die Lösung

gezüchtet. Das Medium enthält 2% Glukose, 1% wird unter Verwendung von Amberlite® IR 45 (OH-

Stärke, 2% Pepton, 0,5% NaCl und 0,2% KH₂PO₄ Form) auf einen pH von 6,0 neutralisiert und zur

und ist bei HO⁰C während einer Zeitspanne von Trockne eingedampft Dabei werden 72 mg Leupeptin-

30 Minuten sterilisiert worden. Ein vegetatives Ino- Pr-Hydrochlorid in Form eines weißen Pulvers erhal-

kulum, das 48 Stunden lang in dem gleichen Medium 50 ten (ID₆₀: 8 mcg/ml). gezüchtet worden ist, wird in einer Menge von 0,13

Volumenprozent verwendet Die Temperatur wird Beispiel 5

rend mit einer Geschwindigkeit von 200 Upm gerührt 55 1,0 g Leupeptin-Ac-di-n-Butylacetalhydrochloric

wird. Die Kulturbrühe (15001, pH 7,15, Antiplasmin- wird in 50 ml einer 0,01 n-Chlorwasserstoffsäure gelös

aktivität: ID₄₀ 0,015 ml/ml) wird nach 53,5 Stunden und nach der im Beispiel 4 beschriebenen Arbeitsweis«

gesammelt und unter Verwendung von 45 kg Dica- behandelt Auf diese Weise wird ein weißes Pulv©

lite® als Filterhilfsmittel filtriert. Das Filtrat wird durch aus Leupeptin-AG-Hydrochlorid (800 mg, ID₅₀:12mcg

eine mit Lewatit· CNP-Harz (Farbenfabriken Bayer 60 ml) erhalten.

AG, pH 6,0 unter Verwendung von Natriumhydroxyd,

1801) gefüllte Säule geschickt Die Säule wird mit Was- B e i s ρ i e 1 6

ser gewaschen und mit 30011 n-Chlorwasserstoffsäure Leunentm-Pr-Hi η nntvlaoptainikrat

fa, 80% Methanol und 2001 einer 0,2 n-Chlorwasser- Leupeptm-Pr-di-n-Butylacetalpikrat

stoff säure in 80% Methanol eluiert. Das aktive 65 Einer Lösung von Leupeptin-Pr-di-n-Butyiacetal

Eluat (5651) wird auf einen pH von 5,2 unter Verwen- hydrochlorid (48 mg) in 2 ml Wasser werden 31 m; dung von 6n-Natriumhydroxyd eingestellt und auf 901 Natriumpikrat in 1 ml Wasser bei 40 bis 50⁰C züge konzentriert Das Konzentrat wird mit 801 Butanol setzt Nachdem die Mischung über Nacht bei Zur

mertemperatur stehengelassen worden ist, wird der ölige Sirup durch Dekantierung abgetrennt und unter vermindertem Druck getrocknet. Der Rückstand wird mit 2 ml kalten Wassers gewaschen, wobei 50 mg eines gelben kristallinen Pikrats von Leupeptin-Pr-di-n-Butylacetal erhalten werden. Das Pikrat wird mit heißem Wasser umkristallisiert.

Beispiel 7
Leupeptin-Ac-di-n-Butylacetalpikrat

Einer Lösung von Leupeptin-Ac-di-n-Butylacetalhydrochlorid (100 mg) in 2 ml Wasser werden 88 mg Natriumpikrat in 1 ml Wasser bei 40 bis 50° C zugesetzt. Ein gelbes kristallines Pikrat von Leupeptin-Acdi-n-Butylacetal (109 mg) wird nach der im Beispiel 6 beschriebenen Arbeitsweise erhalten.

Beispiel 8

Ein Leupeptin erzeugender Stamm (Streptomyces roseus MA 839-Al) wird 48 Stunden lang unter Schütteln unter Bedingungen gezüchtet, die den im Beispiel 1 beschriebenen ähnlich sind. Das Myzel wird aus der Kulturbrühe (375 ml) durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 80 ml einer sterilisierten physiologischen Kochsalzlösung gewaschen. 7,0 bis 7,8 g des erhaltenen feuchten Myzels werden in 26 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. 2 ml der Suspension werden auf 30 ml eines synthetischen Mediums auf geimpft, das 0,2% NH₄NO₃,0,1 % K₂HPO₄,0,05% MgSO₄ · 7H₂O, 0,05% KCl, 0,001% FeSO₄-7H₂O, 1,0% Glukose, 1,0% Stärke und eine Mischung aus Aminosäuren (3,05 mMol L-Leucin, 0,61 mMol L-Isoleucin, 0,70 mMol L-Prolin und 0,23 mMol L-Arginin) enthält,|worauf 24 Stunden lang bei 27⁰C geschüttelt wird. Die Reaktionsmischung wird nitriert und an Amberlite® IRC 50-Harz (5 ml der Η-Form), eingefüllt in eine Säule, adsorbiert. Die Säule wird mit 50 ml eines 50%igen wäßrigen Acetons gewaschen und mit 0,5 n-HCl in einem 50 %igen wäßrigen Aceton eluiert. 15 ml des Eluats werden mit Amberlite® IR 45 (OH-Form) neutralisiert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 1 ml eines 80%igen Methanols gelöst und auf eine mit 5 g eines sauren Aluminiumoxyds gefüllte Säule gegeben. Die Entwicklung erfolgt mit 25 ml Methanol. Das aktive Eluat (5 ml) wird konzentriert und auf eine Dünnschicht-Chromatographie-Platte (Silicagel G) punktweise aufgebracht. Die Platte wird mit einer Mischung aus Chloroform und Methanol (4 : 1) entwickelt. Die Leupeptine werden mit Methanol aus dem Kieselgel, das an einer Stelle gesammelt wird, die einem Rf.-Wert von 0,15 bis 0,30 entspricht, extrahiert. Die Methanollösung wird zur Trockne eingedampft, wobei 1,2 mg eines aus Leupeptinen bestehenden weißen Pulvers anfallen. Antiplasminaktivität: ID₅₀ 10 mcg/ml. Die Aminosäureanalyse des sauren

ίο Hydrolysats (Molverhältnis) ergibt 1,13 Leucin, 0,12 Isoleucin, 0,09 Prolin, Spuren Arginin und 0 Valin.

Bei der Durchführung eines Experiments, das dem

vorstehend beschriebenen ähnlich ist, wobei 2,96 mMol L-Leucin, 0,57 mMol L-lsoIeucin und 0,65 mMol L-Prolin als Mischung von Aminosäuren verwendet werden, werden 0,6 mg an Leupeptinen erhalten. Die Aminosäureanalyse ergibt 1,16 Leucin, 0,10 Isoleucin

und 0,06 Prolin. Werden 3,05 mMol L-Leucin, 0,7 mMol L-Prolin

ίο und 0,23 mMol L-Arginin als Mischung von Aminosäuren verwendet, dann werden 2 mg Leupeptine erhalten. Die Aminosäureanalyse ergibt 1,39 Leucin, 0,01 Isoleucin und 0,10 Prolin.

Auf Grund der vorstehend beschriebenen biologisehen Wirksamkeiten eignen sich Leupeptine sowie ihre Salze zur Behandlung von verschiedenen Entzündungskrankheiten. Zur Behandlung von Pankreatitis werden Leupeptine in einer sterilen Formulierung subkutan, intramuskulär, intravenös oder oral verabreicht. Zur Heilung von Hautkrankheiten können Leupeptine als Paste, Creme, Lösung oder Suspension verwendet werden.

In den Rahmen der Erfindung fallen auch die Säureadditionssalze von Leupeptinen mit organischen und anorganischen Säuren, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Weinsäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Ascorbinsäure. Essigsäure, Pikrinsäure, Phytinsäure, Levopimarsäure-6,8 a-cis-endobernsteinsäure, Sulfaminsäure, Glykolsäure und Mandelsäure. Für therapeutische Zwecke greift man auf Salze nichttoxischer Säuren zurück, wobei jedoch auch Salze toxischer Säuren, beispielsweise von Pikrinsäure, zur Durchführung von Isolierungsmethoden geeignet sind, beispielsweise zum Ausfällen aus wäßrigen Lösungen sowie für Desinfektionszwecke, bei welchen eine Toxizität ohne Bedeutung ist.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Leupeptine der Formel

Patentansprüche:

i I ι

R₃-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-(CHi)₃-NH-C

(l)

NH₈