DE1906699A1 - Neue Polymyxinderivate und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

• Neue Polymyxinderivate und Verfahren zu deren Hersielluna Die Erfindung betrifft neue Polymyxinderivate und ein Verfahren zu deren Herstellung. Unter dem allgemeinen Ausdruck "Polymyxin" sollen die verschiedenen Polypeptidantibiotika verstanden werden, die unter dem Namen Polymyxin bekannt sind, wobei die bekanntesten Polymyxin A, B, a, D und E sind, die von Kulturen verschiedener Bacillenstkmme, zu denen der Bacillus Polymyxa gehört, isoliert werden können.
• Polymyxin läßt sich im allgemeinen durch die Formel P(NH2)n darstellen, wobei P den Rest des Polymyxins bedeutet, den man erhalten würde, wenn man die n NH2-Gruppen (im Fall von Polymyxin B 5 Gruppen) vom Molekül abtrennen würde.
• Bekanntlich ist Polymyxin ein Antibiotikum mit einem antibakteriellen Spektrum von sehr großem therapeutische: Interesse. Jedoch ist Polymyxin und auch dessen bisher bekannte Derivate nicht ohne Toxizität und seine parenterale Anwendung ist eine bedenkliche Angelegenheit.
• Es wurden bereits Versuche unternommen, Polymyxinsalze herzustellen, die unter Beibehaltung der antibakterialler Wirkung des Polymyxins wesentlich weniger toxisch als Polymyxin selbst sind, wie beispielsweise Natriumpolymyxinmethansulfonate. Letztere werden durch Umsetzung von Polymyxin mit Formaldehyd und Umsetzung des in der 1. Stufe erhaltenen N-Methylolderivates mit Natriumbisulfit erhalten. Das Salz wird durch die Formel P(NH-CH2-SO3Na) n dargestellt.
• Diese 2. Umsetzung besitzt jedoch den Nachteil, eine Gleichgewichtsreaktion zu sein, und um eine vollständige Umsetzung des genannten Methylolderivates in Natriumpolymyxinmethansulfonat zu erzielen, ist es erforderlich, einen Überschuß an Natriumbisulfit zu verwenden.
• Man erhält dabei ein Produkt, dessen Toxizität unterschiedlich ist und nicht zu vernachlässigen ist, und das eine Zusammensetzung besitzt, deren Konstanz schwierig zu steuern ist. Diese Unterschiede in der Toxizität sind wahrscheinlich eine Folge der unvermeidlichen Unterschiede im Substitutionsgrad der NH2-Gruppen des Polymyxins.
• Außerdem enthalten diese Natriumpolymyxinmethansulfonate oft eine Menge an freiem Bisulfit als auch einen unerwünschten übenrhEssigen Gehalt an Natrium, was sich ungünstig auf die Erzielung eines Produktes mit pharmazeutischen Qualitäten auswirkt. Ein solches Produkt bcsitzt deshalb den Nachteil,weil es eine beachtliche Menge eines festen Rückstandes bei seiner Kalzinierung hinterläßt.
• Aufgabe der Erfindung ist es, Polymyxinderivate mit genau definierter Zusammensetzung zu schaffen, die nicht die vorstehend erwähnten Nachteile besitzen und praktisch nicht toxisch sind, jedoch die antibiotische Wirkung des Polymyxins aufweisen.
• Durch die Schaffung von Polymyxinmethansulfonsäure wurde diese Aufgabe gelöst.
• In den Rahmen der Erfindung fallen außerdem Zubereitungcn, die Polymyxinmethansulfonsäure zusammen mit anderen Wirkstoffen enthalten, oder Zubereitungen, die Polymyxinmethansulfonsäure freizusetzen vermögen.
• Es wurde gefunden, daß Polymyxinmethansulfonsäurt im wesentlichen die gleiche antibiotische Wirkung besitzen wie die reinen Polymyxine, jedoch dabei wesentlich weniger toxisch sind, so daß sie einen sehr wertvollen wirksamen Hauptbestandteil bei der Herstellung antibiotischer Arzneimittel darstellen. Ihre Anwendung in der Human-tirapie ist deshalb im Hinblick auf das wesentliche Anwachsen ihres therapeutischen Indexes über denjenigen des Polymyxinsulfate, welches bereits weitestgehend in der Humantherapie verwendet wird, besonders günstig.
• Auf Grund seines sehr breiten antibakteriellen Spektrums kann Polymyxinmethansulfonsäure zur Behandlung zahlreicher Infektionen verwendet werden, beispielsweise zur Behandlung von Meningitis und Infektionen der Harnwege, die durch bestimmte gram-negative Bakterien, wie Colibacillen oder pyocyanische Bakterien, von denen einige gegendber anderen Antibiotika und chemotherapeutischen Mitteln resistent sind, verursacht werden.
• Polymyxinmehansulfonsäure läßt sich durch Umsetzung von Polymyxin, beispielsweise in Form von Polymyxinsulfat in wässriger Lösung mit Formaldehyd entweder in Form einer Formollösung oder als gasförmiges Formaldehyd, das in die wässrige Lösung eingeblasen wird, herstellen.
• Man erhält dabei ein N-Methylolderivat des Polymyxins nach folgender Reaktionsgleichung: (1) P(NH2)n + nHCHO P(NH - CH2OH)n Die Umsetzung ist vollständig ., wenn ein Überschuß an Formaldehyd verwendet wird. Der pH-Wert der Lösung erwies sich nach dieser 1. Umsetzung eindeutig als sauer.
• Bei der Neutralisierung der Lösung erhält man einen feinen Niederschlag des N-Methylolderivates von Polymyxin, der zur Erzielung eines im wesentlichen reinen Produktes gewaschen wird.
• Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das auf diese Weise erhaltene N-Methylolderivat in einem inerten Medium suspendiert und mit Schwefeldioxyd umgesetzt, welches beispielaweise bei Temperaturen, die vorzugsweise über Raumtemperatur und insbesondere zwischen 50 und 700C liegen, in die Suspension eingeblasen wird, insbesondere wenn das Suspensionsmedium aus Wasser besteht, worin Polymyxinmethansulfonsäure bei dieser Temperatur löslich ist, worauf man die Polymyxinmethansulfonsäure gemäß folgender Reaktionsgleichung erhält: (2) 9(NAH - CH2OH)n + nSO2 P(NH-CH2 - SO3H)n Außerdem ist es möglich, eine Suspension der N-Methylolverbindung mit einer gesättigten Lösung von S02 unter starkem Rühren umzusetzen.
• Es ist relativ unwichtig, ob die erhaltene Polymyxinmethansulfonsäure im ursprünglichen Suspensionsmedium des N-Methylolderivates löslich ist oder nicht.
• Wenn die Polymyxinmethansulfonsäure im Medium gelöst ist, beispielsweise wenn letzteres Wasser ist, kann es am Schluß der Reaktion durch Aus frieren und Lyophilisieren der Lösung gewonnen werden.
• Im anderen Falle, beispielsweise wenn das Suspensionsmedium Methanol ist, ist die Polymyxinmethansulfonsäure direkt im unlöslichen Zustand erhältlich.
• Um eine vollständige Methansulfonierung sämtlicher ursprünglich freier Aminogruppen des Polymyxins (im Fall von Polymyxin B 5 freier Aminogruppen) zu erzielen, und um die mögliche Bildung von inneren Salzen der Polymyxinmetllansulfonsäure zu vermeiden, ist die oben angeführte Reihenfolge der Verfahrensstufen sehr wichtig.
• Die Polymyxinmethansulfonsäure ist in Wasser relativlöslich, wobei Lösungen mit einem sauren pH-Wert erhalten werden und ist in Alkalien oder in wesentlich neutralen Lösungen löslich.
• Bei der Hydrolyse des Produktes mit verdünnter Salzsäure werden Formaldehyd und Schwefeldioxyd freigesetzt, wodurch bestätigt wird, daß das Produkt ein Methansulfonsäurederivat ist.
• Dies wird außerdem durch Elementaranalyse und Bestimmung der Infrarotabsorptionsspektren bestätigt, welche außer den charakteristischen Polymyxinbanden die zwei charakteristischan Banden des Uethansulfonsäureanteils des erzielten Produktes zeigen.
• Dieses Produkt besitzt eine genau definierte Zusammen-Umsetzung, und zwar ist es frei von Natrium, besitzt einen Gehalt an freiem S02, der nicht höher als 1 Teil/1000 Teile oder sogar 0 ist und hinterläßt bei der Kalzinierung keinen bemerkenswerten festen Rückstand, was durch die Analyse einer typischen Polymyxinme thansulfonsäureprobe (die insbesondere von Polymyxin B stammt) und die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, gezeigt wird. Die Analyse führt zu folgenden Ergebnissen: Sulfatierte Asche 0,6 % Schwermetalle weniger als 50 ppm Schwefel 11,2 %0 LD0 von Polymyxin B, gelöst in eimer isotonischen Natriumchloridlösung 69,5. mg/kg Microbiologische Wirkung in Einhalten pro mg, bezogen auf den internationalen Polymyxinstandard 500C-6000 Einheiten/mg Das Verhältnis von antibiotischer Wirkung des erhaltenen Produktes zu derjenigen des ursprünglichen Polymyxinsulfats liegt im wesentlichen in der gleichen Größenordnung wie das Verhältnis der Molekulargewichte dieser beiden Substanzen.
• Es wurde außerdem das antibiotische Spektrum festgestellt und es wurde insbesondere die minimale Hemmkonzentrat ion der Polymyxinmethansulfonsäure bei einer großen Anzahl an Bakterien sowohl bei Sammlungen als auch klinisch durch die Methode bestimmt, die in dem Werk von Y. Chabbert, "LtAntibiogramme'2, veröffentlicht 1963 durch Lcs Editions de la Tourelle, beschrieben wird.
• Die Ergebnisse, die als Einheiten an Polymyxin ausgedrückt sind und in nachfolgender Tabelle wiedergegeben werden, zeigen, daß die Modifikation der Formel, die während der Umsetzung von Polymyxin in Polymyxinmethansulfonsäure erzielt wurde, in keiner Weise die Wirksamkeit des Antibiotikums modifiziert hat.
• Microorganismus Polymyxin- Polymyxinmethylensulfat sulfonsäure (c) in Ein- (c) in Einheiten/ml heiten/ml heiten/ml Sarcina lutea 9 341 100 100 Salmonella thyphi 124-66 12,5 25 Salmonella typhi 121-66 50 50 Salmonella para B 82-66 12,5 12,5 Salmonella typhimurium 250-66 12,5 12,5 Salmonella Dublin 09 p 12,5 12,5 Salmonella enteritidis 25 12,5 Escherichia coli 2 12,5 12,5 Escherichia coli 3068 12,5 12,5 Eseheriehia coli Monod 12,5 12,5 Escherichia coli 113-3 Escherichia coli 10-536 6,25 6,25 Escherichia coli 13-467 6,25 6,25 Escherichia coli 4 12,5 12,5 Cillopasteurella pseudotuberculois > 100 >100 Achromobacter 25 25 Aerobacter aerogenes 50 25 Arizona 25 25 Pseudomonas aeruginosa 100 50 Klebsiella pneumoniae 12,5 25 Proteus mirabilis > 100 > 100 Proteus vulgaris >100 >100 Bacillus subtilis 6633 >100 > 100 Listeria Saint-Nazaire > 100 100 Staphylococcus aureus 3569 >100 ? 100 Staphylococcus aureus 209 P >100 100 Staphylococcus albus 12-228 50 50 Micrococcus flavus 100 50 Enterococcus brevis 7 100 > 100 Streptococcus viridans (Poulet) >100 >100 Streptoooccus foecalis 8043 >100 > 100 Verglichen mit dem ursprünglichen Polymyxinsulfat ist die Toxizität der Polymyxinmethansulfonsäure sehr gering.
• Sie steigt von 7-8 mg/kg Maus für Polymyxin B-Sulfat auf 69,5 mg/kg Maus für Polymyxin B-Methansulfonsäure. Der niedrige Toxizitätsgrad bleibt von einer Probe Polymyxinmethansulfonsäure zur anderen relativ beständig.
• Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.
• Beispiel 1: 5 g Polymyxinsulfat,- enthaltend7500 Einheiten/mg, wurden in 100 ml Wasser gelöst. 20 ml 30 %iger Formaldehydlösung wurden danach dieser Lösung zugesetzt. Die saure Lösung wurde 15 Minuten unter Rühren gehalten und anschließend der pH-Wert der Lösung, während noch gerührt wurde, mit In Natronlauge auf 8,5 gebracht. Das Rühren wurde 1 Std.
• fortgesetzt und der pH-Wert periodisch geprüft und, falls erforderlich, wieder auf 8,5 eingestellt.
• Während dieser Behandlung bildete sich in Folge der Bildung des Methylolderivates ein weißer Niederschlag.
• Nach mehrmaligem Waschen mit destilliertem Wasser, jeweils gefolgt durch Filtrierung, wurde der Niederschlag wieder in 200 ml Wasser suspendiert und auf eine Temperatur nahe 6500 gebracht, wobei immer kräftig gerührt wurde. Danach wurde ein S02-Strom in dia Suspension oingeleitet, bis sich der Niederschlag vollständig gelöst hatte. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat ausgefroren und anschließend bei niederer Temperatur unter Vakuum eingedampft.
• Man erhielt etwa 5 g eines Produktes mit einem biologischen Gehalt von 5400 Einheiten/mg (erzielt durch eine Diffusionsmethode mit Bordetella bronchisepica als Testbakterien), was eir Ausbeute von 75 1> entspricht.
• Der Unterschied im Gehalt kommt vom Anwachsen des Molekulargewichtes, da das Polymyxinmolekül nicht mehr als Salz mit 1/2 H2SO4 vorliegt, sondern durch das Vorliegen von 5-CH2-S03H-Resten schwerer ist. Beim Kalzinieren hinterließ das Produkt keinerlei Asche. Der pH-tYrN einer 0,5 zeigen Lösung des Produktes in Wasser betrug 3,1.
• Beispiel 2: 10 g Polymyxin B-Sulfat, enthaltend 7400 Einheiten/mg (bezogen auf den internationalen Polymyxinstandard), wurden bei Raumtemperatur (20-250C) in 100 ml reinem Wasser gelöst. Danach wurden unter Rühren 25 ml einer 30 %igen Formaldehydlösung der Lösung zugesetzt und es wurde weite 20 Minuten gerührt. Die Lösung, deren pH-Wert etwa 2,5 betrug, wurde mit In Natronlauge auf 8,5 eingestellt, wodurch sich ein feiner Niederschlag des Methylolderivates bildete. Dieses Derivat wurde filtriert und mehrere Male mit Wasser gewaschen und anschließend wieder suspendiert und filtriert. Schließlich wurde das Methylolderivat nochmals in 300 ml reinem Wasser suspendiert und die Temperatur auf 60-65°C eingestellt. In die heiße Suspension wurde mit Hilfe eines Schwefeldioxyd-Generators ein Strom dieses Gases eingeleitet.
• Das heißwasserlösliche Polymyxinmethansulfonsäureprodukt löste sich auf. Die Lösung wurde filtriert, ausgefroren und bei niedriger Temperatur unter Vakuum-getrocknet (Filtrierung und Trockung wurden steril durchgeführt).
• Man erhielt 9,2 g eines Produktes mit 5000 Einheiten/mg (bezogen auf ein Polymyxin B-Standard).
• Beispiel 3: 20 g Polymyxin B-Sulfat, enthaltend 7500 Einheiten/mg, wurden in 200 ml reinem Wasser gelöst. Danach wurden 50 cm3 einer 30 %igen Formaldehydlösung zugesetzt und 15 Minuten gerührt. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von in Natroniauge von 2,5 auf 8,5 erhöht. Das Methylolder' tat wurde mehrere Male wie im Beispiel 1 gewaschen und mit S02 in 600 ml Wasser bei 650C behandelt. Die auqgefrorene filtrierte Lösung wurde danach im Vakuum bei niedriger Temperatur getrocknet. Ausbeute 20,4 g eines Produktes, enthaltend 5735 Einheiten/mg (LD50 = 19,5 mg/kg).
• Beispiel 4: Das Prinzip dieser Herstellung ist unterschiedlich.
• 10 g Polymyxin B-Sulfat, enthaltend 7500 Einhciten/mg, wurden in 100 ml reinem Wasser gelöst. Auf die gleiche Weise wurden 25 ml Formol mit dem Polymyxinsulfat unter 15 minütigem Rühren in Berührung gebracht, das dabei sich bildende Methylolderivat wie vorstehend beschrieben mit Wasser und dann mit einem Wasser-Methanol-Gemisch gewaschen. Das Methylolderivat wurde in 100 ml eines Wasser-Methanol.GeMisches suspendiert, wobei gegebenenfalls zurückbleibende Körnchen feinpulverisiert wurden.
• Die Temperatur wurde auf 5600 gehalten und ein S02-Strom 1/2 Stunde lang in die Suspension eingeleitet. Nach 15 Minuten sah man, daß sich die stückige Struktur änderte, wobei sich sehr feine Kristalle bildeten. Nach einer 1/2 Stunde war die Umwandlung abgeschlossen. Das Produkt wurde filtriert, bei 56°C unter Vacuum getrocknet und zerkleinert. Ausbeute 10,2 g Polymyxinmethansulfonsäure, enthaltend 5375 Einheiten/mg, Das Infrarotspektrum dieses Produktes war charakteristisch für Polymyxinmethansulfonsäure.
• Beispiel 5: 10 g Polymyxin B-Sulfat, enthaltend 7400 Einheiten/mg, wurden in 100 ml reinem Wasser gelöst und danach eine halbe Stunde mit gasförmigem Formaldehyd bei Raumtemperatur und dann mit 5°2 unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 2 behandelt. Ausbeute 8,9 g Polymyxinmethansulfonsäure, enthaltend 5100 Einheiten/mg.
• Beispiel 6: Nach Beispiel 1 wurde das Methylol hergestellt, jedoch unter Verwendung von 10 g Polymyxinsulfat, enthaltend 7400 Einheiten/mg, als Ausgangsstoff. Danach wurde das gewaschene Methylolderivat in etwa 100 ml destilliertem Wasser suspendiert. Danach wurden in einen Behälter 200 ml Wasser gegeben, auf 6500 erhitzt und mit S02 durch Einblasen desselben in die Flüssigkeit gesättigt.
• Diesem Behälter wurde die Methgolouspension unter heftigem Rühren zugesetzt, wobei sich das Methylolderivat nach und nach auflöste. Neue Zugaben wurden erst gemacht, nachdem sich der vorher zugegebene Stoff vollständig gelöst hatte. Das Produkt wurde danach filtriert, das Filtrat ausgefroren und die gefrorene Lösung im Vakuum bei niederer Temperatur getrocknet. Ausbeute 10 g Polymyxinmethansulfonsäure p enthaltend 6000 Einheiten/mg, vollständig löslich in Wasser.
• Polymyxinmethansulfonsäure ist in zahlreichen, biologisch verträglichen Lösungsmitteln, die laufend zum Lösen von Antibiotikn verwendet werden, löslich. Aus diesem Grunde läßt es sich ohne Schwierigkeiten an Patienten Verabreichen. Diese Lösungsmittcl lassen sich entweder dazu verwenden, das trockene Pulver, sobald es zur Anwendung gelangen soll, zu lösen, oder um sofort eineinjizierbare Lösung herzustellen, die verwendungsfertig ist und vom Standpunkt seines antibiotischen Titers beständig ist.
• Es lassen sich Lösungen von Polymyxinmethansulfonsäure in folgenden Mischungen von Lösungsmiteln herstellen: Wasser-Dime thylac etamid Wasser-Äthyllactat Wasser-Glycofurol Wasser-N-Hydroxyäthyllactamid und Wasser-Propylenglyc ol.
• Die Konzentration dieser organischen Produkte in Wasser sind variabel und die vorstehend angeführte Liste stellt keine Begrenzung der verwendbaren Lösungsmittelgemische dar. Es kann jedes nichttoxische Lösungsmittel verwendet werden.
• Zwar können sämtliche Verabrcichungsmethoden angewendet werden, jedoch wird dieses Derivat hauptsächlich parenteral, intravenös oder intramuskulär oder sogar durch spirale Injektion verabreicht, und zwar in Dosen, die 4 bis 5 mal größer sein können als diejenigen des Polymyxinsulfats. Das bedeutet: 60 000 bis 100 000 Einheiten/ kg/Tag, ohne jedoch vorzugsweise 10 Millionen Einheiten/ Patient/Tag zu übersteigen. Polymyxinmethansulfonsäure kann beispielsweise parenteral, intravenös oder intramuskulär in folgenden pharmazeutischen Formen verabenthal d reicht werden: 1. PolYmyxinmethansulfonsäur/ 000 Einheiten, wird mit einer 50 %igen wässrigen Polypropylenglycollösung auf 4 ml in einer Ampulle aufgefüllt.
• 2. Polymyxinmethansulfonsäure, enthaltend 500 000 Einhinten, mit; einer 20 zeigen wässrigen Äthyllactatlösung aufzufüllen auf eine 2 ml Ampulle. 3. Polymyxinmethansulfonsäure, enthaltend 500 000 Einheiten, mit 20 zeiger wässriger Glycofurollösung aufzufüllen auf eine 2,5 ml Ampulle. 4. Polymyxinmethansulfonsäure, enthaltend 500 000 Einheiten, V. 286 Hydrochlorid (Lokalanästhesie) 0,05 g 70 sige wässr. M-Hydroxyäthyllactamidlösung 1,4 ml destilliartes Wasser, aufzufüllen auf eine 5 ml Ampulle.
• 5. Polymyxinmethansulfonsäure, enthaltend 500 000 Einheiten 70 %ige wässr. N-llydroxyäthyllactamidlösung 1,4 ml destilliertes Wasser, aufzufüllen auf eine 5 ml Ampulle.
• Man erhält wertvolle Arzneimittel auf der Grundlage von Polymyxin, dio sich auf Grund ihrer verringerten Toxizität viel breiter anwenden lassen als beispielsweise Polymyxin B-Sulf.lt.

Claims (7)

Patentansprüche:

1. Polymyxinmethansulfonsäure.

2. Polymyxin-B-Methansulfonsäure.

3. Polyrr.yxinderivate desi Anspruchs 1 in Form einer parenteral verabreichbaren Lösung.

4. osi£rungsforrn einer Lösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine tägliche Dosis zwischen 60 000 und 100 000 Einheiten/kg liefert.

5. Verfahren zur Herstellung eines Polymyxinderivates des Anspruchs 1 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man N-Methylolpolymyxin mit Schwefeldioxyd umsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässrige Suspension von N-Methylolpolymyxin bei erhöhter Temperatur so lange mit Schwefeldioxyd behandelt, bis der sich bildende Niederschlag vollständig'gelöst ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als N-Methylolpolymyxin N-Methylolpolymyxin-B verwendet.