DE19963690A1

DE19963690A1 - Vektoren und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine in Pilzen

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Publication number: DE19963690A1
Application number: DE19963690A
Authority: DE
Inventors: Andre Diesel; Gerd Gellissen; Jens Klabunde; Manfred Suckow; Cornelis P Hollenberg
Original assignee: Rhein Biotech GmbH
Current assignee: Dynavax GmbH
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 1999-12-29
Publication date: 2001-06-13
Also published as: KR100510628B1; KR20030072201A; DE50006189D1

Abstract

Die Erfindung betrifft Integrationsvektoren zur gezielten und stabilen Integration heterologer DNA in das Genom eines Wirtsorganismus, insbesondere eines Pilzes, und ihre Verwendung. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer rekombinanter Proteine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren. Aufgabe der Erfindung ist es, Integrationsvektoren bereitzustellen, die es erlauben, Fremd-DNA in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorganismus stabil zu integrieren und bei Bedarf unterschiedliche Gene für eine simultane Koproduktion verschiedener Proteine zu exprimieren. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, stabile Produktionsstämme und ein Verfahren zur Herstellung heterologer Proteine bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch einen Integrationsvektor gelöst, welcher: a) mindestens eine rDNA-Sequenz aus Hefe, b) mindestens ein nicht-defizientes Selektionsmarkergen und c) mindestens eine Expressionskassette umfaßt, wobei die Expressionskassette ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Promotorelement, einen für ein gewünschtes Protein kodierenden Bereich eines heterologen Gens und ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Terminatorelement umfaßt. Von der Erfindung wird ebenfalls ein Wirtsorganismus umfaßt, der mindestens einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Ein bevorzugter Wirtsorganismus ist die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Integrationsvektoren zur gezielten und stabilen Integra tion heterologer DNA in das Genom eines Wirtsorganismus, insbesondere eines Pilzes, und ihre Verwendung. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines oder mehrerer rekombinanter Proteine unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vek toren.

Pilze und insbesondere Hefen stellen attraktive Systeme für die Produktion rekombi nanter Proteine dar. Ein prominenter Vertreter ist die fakultativ methylotrophe Hefe Han senula polymorpha, die für die Produktion von pharmazeutischen Substanzen und indu striellen Enzymen genutzt wird. Die Generierung rekombinanter Stämme von H, polymorpha erfolgt routinemäßig mit Vektoren, die in das Genom der Hefe integriert werden. Aufgrund der genomischen Lokalisation der heterologen DNA zeichnen sich die rekombinanten Stämme von H. polymorpha durch eine hohe mitotische Stabilität aus. Jeder Transformationsansatz resultiert jedoch in unterschiedlichen rekombinanten Stämmen, die sich in Integrationsort und Kopienzahl der integrierten heterologen DNA unterscheiden, wobei die Kopienzahl von 1 bis 80 variieren kann. Da der Integrationsort zufällig ist, wird für die Integration eine nicht-homologe Rekombination in nicht näher charakterisierte Genloci angenommen.

Die zielgerichtete Integration von heterologer DNA in das Genom von H. polymorpha hat sich dagegen als sehr schwierig erwiesen. In jüngerer Zeit wurden erste Möglichkeiten für eine gezielte homologe Integration in definierte Genorte beschrieben. Diese wenigen Beispiele sind auf einen Disruptions-Integrations-Ansatz beschränkt, bei dem die rekom binante DNA zielgerichtet in den MOX (Methanol oxidase)-Locus (Agaphonov et al., 1995) oder in Telomer-assoziierte HARS-Sequenzen von H. polymorpha (Sohn et al., 1999) integriert wurde.

Von Vorteil wäre eine zielgerichtete homologe Integration in einen Genlocus, der gute Voraussetzungen für Exprimierbarkeit bietet. Dies gilt in der Regel für solche Bereiche eines Chromosoms, die ein stark exprimiertes Gen enthalten, wie z. B. das oben ange führte MOX-Gen. Für eine zielgerichtete Integration von Fremdsequenzen wurde ferner ein hochexprimierter Genombereich, der die Gene für die ribosomalen RNAs enthält (die sogenannte rDNA) in Betracht gezogen.

Dieser Ansatz wurde für zwei Hefearten, die Bierhefe Saccharomyces cerevisiae (Lopes et al., 1989; Lopes et al., 1991) und die Milchhefe Kluyveromyces lactis (Bergkamp et al., 1992) getestet. Die Integration erfolgte in diesen Fällen durch homologe Rekombination mit Hilfe von rDNA-Fragmenten des entsprechenden Wirtes. Auf diese Weise generierte rekombinante Stämme enthielten multiple Kopien der heterologen DNA integriert in den rDNA-Locus der Transformanden. Als ein wichtiger, unabdingbarer Faktor für die Inte gration des Vektors in hoher Kopienzahl wurde die Anwesenheit eines Komplementa tionsgens mit einem defizienten Promotor (d. h. Leu2-d oder Ura3-d) mit einer hohen selektiven Wirkung genannt. Die Kombination eines defizienten Promotors und eines definierten rDNA-Segments erwies sich als unverzichtbar.

Die Generierung von rekombinanten Stämmen mit unterschiedlichen Fremdgenen in einer erwünschten Kopienzahl war bisher nur durch aufeinanderfolgende Transforma tionsschritte möglich. Dazu müssen die genutzten Plasmide unterschiedliche Selek tionsmarkergene aufweisen. Beispiele dafür sind Stämme für die Koexpression der Gene für das HbsAg-L- und -S-Antigen (Janowicz et al., 1991), für die Entwicklung eines Hepatitis B-Impfstoffes oder die Koexpression von zwei Enzymgenen für die Entwicklung eines Biokatalysators (Gellissen et al., 1996). Es besteht also ein Bedarf an Vektoren, die die simultane Integration verschiedener heterologer DNA-Sequenzen in das Genom eines Wirtsorganismus erlauben.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, weitere Integrationsvektoren bereitzustellen, die es erlauben, die Fremd-DNA in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorganismus stabil zu integrieren und bei Bedarf unterschiedliche Gene für eine simultane Koproduk tion verschiedener Proteine zu exprimieren. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, stabile Produktionsstämme und ein Verfahren zur Herstellung heterologer Proteine be reitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch einen Integrationsvektor gelöst, welcher

a) mindestens eine rDNA-Sequenz aus Hefe,
b) mindestens ein nicht-defizientes Selektionsmarkergen und
c) mindestens eine Expressionskassette

umfaßt, wobei die Expressionskassette ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Pro motorelement, einen für ein gewünschtes Protein kodierenden Bereich eines heterologen Genes und ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Terminatorelement umfaßt.

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß eine stabile Multi-Copy-Integration eines Integrationsvektors mit mindestens einer rDNA-Sequenz aus Hefe unter Verzicht auf ein defizientes Selektionsmarkergen erreicht werden kann, und daß verschiedene Integrationsvektoren mit identischen, nicht defizienten Markergenen gleichzeitig integriert werden können. Bei der gleichzeitigen Integration mehrerer Vektoren bleibt die Stöchio metrie mitotisch stabil erhalten. Die Etablierung eines "universellen" Hefevektors, basie rend auf den neu identifizierten Elementen, erlaubt eine breite Anwendung der Erfin dung.

Unter einer "rDNA-Sequenz aus Hefe" wird im Sinne der Erfindung eine Sequenz ver standen, die aus einem Abschnitt des Genoms einer Hefe, der die Gene für die riboso malen RNAs enthält, hergeleitet ist. Zur Ausführung der Erfindung in Betracht kommende rDNA-Sequenzen stammen unter anderem aus Hefen der Gattungen Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula oder Trichosporon, und insbesondere aus den methylotrophen Hefen Hansenula polymorpha und Pichia pastoris.

Ein "nicht-defizientes Selektionsmarkergen", wie hier verwendet, bezeichnet ein Gen, dessen Proteinprodukt dem Wirtsorganismus bestimmte selektierbare Eigenschaften verleiht, die er vor der Transformation und Integration des erfindungsgemäßen Vektors bzw. der erfindungsgemäßen Vektoren nicht besaß (beispielsweise Resistenz gegen ein Antibiotikum, Komplementation einer Auxotrophie), wobei die Aktivität des von einer ein zigen Kopie des Selektionsmarkergens kodierten Produkts für ein normales Wachstum des Wirtsorganismus ausreicht. Beispiele für nicht-defiziente Selektionsmarkergene, die für die Ausführung der Erfindung in Betracht kommen, sind unter anderem die URA3-, HIS3-, ADE2-, LYS2-, AR07- und TRP1-Gene von S. cerevisiae und das LEU2-Gen von H. polymorpha. Alternativ kann ein dominantes Selektionsmarkergen wie z. B. das bakte rielle Kanamycinresistenz-Gen eingesetzt werden.

"Expressionskassette", wie hier verwendet, bezeichnet ein DNA-Fragment, das in min destens eine mRNA transkribiert wird, die nachfolgend in ein Genprodukt translatiert wird. Erfindungsgemäß umfaßt die Expressionskassette ein im Wirtsorganismus funk tionsfähiges Promotorelement, einen für ein gewünschtes Protein kodierenden Bereich eines heterologen Genes und ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Terminator element. Die Expressionskassette kann ferner eine Sequenz für ein Signalpeptid und/oder eine Polylinker-Sequenz enthalten. Die vorgenannten Bestandteile einer Ex pressionskassette können aus einem Gen oder aus verschiedenen Genen stammen.

Ein "im Wirtsorganismus funktionsfähiges Promotorelement", wie hier verwendet, be zeichnet ein DNA-Fragment, durch das der Initiationspunkt und die Initiationshäufigkeit der Transkription (RNA-Synthese) eines unter der Kontrolle des Promotorelements ste henden Gens im Wirtsorganismus festgelegt werden. Zur Ausführung der Erfindung in Betracht kommende Promotorelemente schließen unter anderem die FMD-, MOX, TPS1-, PMA1- und DAS-Promotoren aus Hansenula polymorpha, die MOX, AOX1- und GAP1-Promotoren aus Pichle pastoris und die ADH1-, PDC1-, GAP1- und CUP1-Promotoren aus S. cerevisiae ein.

Ein "heterologes Gen", wie hier verwendet, bezeichnet ein Gen, das von einem anderen Organismus stammt als dem Wirtsorganismus, in dem es exprimiert werden soll. Bei spiele für exprimierbare heterologe Gene sind unter anderem die Gene für Insulin, Phytase, HGH, Hirudin, Lactoferrin oder G-CSF.

Ein "im Wirtsorganismus funktionsfähiges Terminatorelement", wie hier verwendet, be zeichnet ein DNA-Fragment, das Signalstrukturen für die RNA-Polymerase enthält, die zur Termination der Transkription führen. Beispiele für verwendbare Terminatorelemente sind der MOX- oder der PHO1-Terminator von H. polymorpha.

Als Wirtsorganismen zur Ausführung der vorliegenden Erfindung kommen insbesondere Pilze in Betracht, beispielsweise filamentöse Pilze wie etwa Aspergillus, Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium, Sordaria und Penicillium oder Hefen wie Saccha romyces, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula, Trichosporon und Candida. Vorzugsweise ist der Wirtsorganismus, in dem die Expres sion heterologer Gene zur Herstellung von einem oder mehreren Proteinen mit Hilfe der erfindungsgemäßen Integrationsvektoren stattfindet, eine Hefe, insbesondere eine me thylotrophe Hefe. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die erfin dungsgemäßen Integrationsvektoren für die Herstellung von Proteinen in einer Hefe der Gattung Hansenula, vorzugsweise Hansenula polymorpha, eingesetzt.

Als besonders vorteilhaft haben sich erfindungsgemäße Integrationsvektoren erwiesen, bei denen mindestens eine rDNA-Sequenz aus einem Bereich der rDNA einer methylo trophen Hefe stammt, der ein 400 bp langes Fragment des 3'-Bereichs des 25S-rDNA- Gens und ein 600 bp langes Fragment des 5'-Bereichs des 18S-rDNA-Gens sowie die dazwischen liegenden Sequenzen einschließlich der 5S-rDNA-Sequenz umfaßt. Geht man von einer ähnlichen rDNA-Struktur wie in Saccharomyces cerevisiae aus, so enthält dieser ca. 3 Kb lange Bereich eine TOP-Sequenz, eine oder mehrere HOT1-Sequenzen sowie NTS1- und NTS2-Sequenzen. Erfindungsgemäße Vektoren, die eine solche rDNA-Sequenz enthalten, werden in hoher Kopienzahl und stabil integriert. Bevorzugt stammen diese rDNA-Sequenzen aus Hansenula polymorpha. Alternativ können rDNA-Sequenzen aus anderen methylotrophen Hefen wie z. B. Pichia pastoris, Pichia methanolica oder Candida boidinü verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Integrationsvektoren mindestens eine rDNA-Sequenz, die aus folgenden Sequenzen ausgewählt wird:

a) eine Sequenz nach SEQ ID NO 1;
b) ein Fragment der Sequenz nach a), das für die stabile Integration von Se quenzen des Vektors in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorga nismus, insbesondere einer Hefe geeignet ist;
c) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach a) oder b) zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% identisch ist;
d) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach a) oder b) hybridisiert;
e) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehreren Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis c), das für die stabile Integration von Sequenzen des Vek tors in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorganismus, insbeson dere einer Hefe geeignet ist, und f) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e).

Die 2,4 Kb lange, als BamHI/EcoRI-Fragment isolierbare rDNA-Sequenz nach SEQ ID NO 1 umfaßt 400 bp des 3'-Bereiches des 25S-rDNA-Gens sowie TOP-, HOT1-, NTS1- und NTS2-Sequenzen, die das 55-rDNA-Gen flankieren. Zur Ausführung der Erfindung können auch Fragmente dieser Sequenz eingesetzt werden, die für die stabile Integra tion von Sequenzen des Vektors in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorganis mus, insbesondere einer Hefe geeignet sind, beispielsweise ein Fragment, das keine Sequenzen des 25S-rDNA-Gens enthält, oder ein Fragment, das die zwischen dem 3'-Ende des 25S-Gens und dem 5'-Ende des 5S-Gens gelegenen TOP-, HOT1-, NTS- und 5S-Sequenzen umfaßt. Für die Ausführung der Erfindung kommen ebenfalls Frag mente in Betracht, in denen eine oder mehrere der HOT- und/oder NTS-Sequenzen fehlen, sowie Fragmente, in denen die TOP- und/oder die 5S-rDNA-Sequenz fehlt. Da jedoch angenommen wird, daß die TOP- und HOT-Sequenzen wichtige Bestandteile der in den erfindungsgemäßen Integrationsvektoren enthaltenen rDNA-Sequenz sind, werden Fragmente der SEQ ID NO 1 bevorzugt, die mindestens eine TOP-Sequenz und mindestens eine HOT-Sequenz enthalten.

Der Ausdruck "stabile Integration", wie hier verwendet, bezeichnet eine Integration, bei der Restriktionsmuster und Kopienzahl nach mindestens 100 Generationen Dauerkultur in nicht-selektivem Medium im wesentlichen unverändert bleiben.

Im Sinne der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% identisch" auf Identität auf DNA- Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z. B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Basic local alignment search tool, S. F. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410) bestimmt werden kann.

Der dem Fachmann bekannte Ausdruck "Identität" bezeichnet den Grad der Verwandt schaft zwischen zwei oder mehr DNA-Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwi schen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der "Identität" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.

Die Identität miteinander verwandter DNA-Moleküle kann mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besonde ren Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zwi schen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (12): 387 (1984); Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul, S. et al., J. Molec Biol 215: 403/410 (1990)). Das BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S., et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. 215 : 403/410 (1990)). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Identität verwendet werden.

Bevorzugte Parameter für den Sequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48: 443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmung (matches) = +10,
Nichtübereinstimmung (mismatch) = 0
Lücken-Wert (Gap Penalty): 15
Lückenlängen-Wert:

(Gap Length Penalty): 1.

Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeig net. Die vorstehenden Parameter sind die Standardparameter (default parameters) für Nukleinsäuresequenz-Vergleiche.

Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich ab hängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.

Das Merkmal "Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach a) oder d) hybri disiert" weist auf eine Sequenz hin, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegen strang einer Sequenz mit den unter a) oder b) angegebenen Merkmalen hybridisiert. Beispielsweise können die Hybridisierungen bei 68°C in 2 × SSC oder nach dem Proto koll des Dioxygenin-Labelling-Kits der Firma Boehringer (Mannheim) durchgeführt werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die erfindungsgemäßen Integrations vektoren ein zusätzliches Selektionsmarkergen für E. coli, beispielsweise ein Ampicillin- Resistenzgen, ein Tetracyclin-Resistenzgen oder ein Kanamycin-Resistenzgen. Als Se lektionsmarkergen für E. coli kommt ebenfalls das URA3-Gen aus S. cerevisiae in Be tracht, das eine Selektion von Transformanden des Uracil-auxotrophen E. col/-Stamms MC1066 erlaubt.

Vorzugsweise weisen die erfindungsgemäßen Vektoren eine Länge von 7 bis 12 Kb auf. Solche Vektoren bieten eine gute Handhabung in E. coli und eine problemlose Trans formation von Hefe.

Ein Wirtsorganismus, der mindestens einen erfindungsgemäßen Integrationsvektor stabil im Genom integriert umfaßt, wird von der Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Vorzugs weise ist der Wirtsorganismus eine Hefe, insbesondere eine methylotrophe Hefe. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Wirtsorganismus eine Hefe der Gattung Hansenula, vorzugsweise Hansenula polymorpha.

Die Erfindung stellt ferner einen Wirtsorganismus bereit, der durch stabile Integration von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Integrationsvektoren in das Genom einer Hefe erhältlich ist. Vorzugsweise gehört die Hefe der Gattung Hansenula an; besonders bevorzugt wird die Hefe Hansenula polymorpha verwendet. In einer besonderen Ausfüh rungsform der Erfindung ist der Wirtsorganismus durch stabile Integration mehrerer Vektoren, die voneinander unterschiedliche Expressionskassetten umfassen, erhältlich.

Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von einem oder mehreren Proteinen in einem eukaryontischen Mikroorganismus bereit. Erfindungsgemäß wird da für ein erfindungsgemäßer Wirtsorganismus in an sich bekannter Weise kultiviert und das erzeugte Protein gewonnen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Integrationsvektoren und Wirtsorganismen zur Herstellung von einem oder mehreren Proteinen wird von der Erfindung ebenfalls um faßt.

Die folgenden Figuren und Beispielen erläutern die Erfindung.

Fig. 1 zeigt die Organisation einer rDNA-Einheit von S. cerevisiae (A) und H. polymorpha (B) sowie die davon abgeleitete Position der klonierten rDNA-Sequenz (SEQ ID NO 1) in einer rDNA-Einheit von H. polymorpha. Die grauen Pfeile kennzeich nen die Transkriptionsrichtung der rmA-Gene. Die gestrichelten Kästen kennzeichnen das primäre Amplifikat und die in den Integrationsvektoren genutzte Integrations sequenz, wobei die Darstellung nicht maßstabgerecht ist. NTS = Non-transcribed spacer; 5S = 5S-rDNA; HOT = Hot spot of recombination; TOP = Topoisomerase-Bindestelle. (A) Die rDNA-Einheit von S. cerevisiae nach Lopes et al. (1996). (B) Position des primären Amplifikates. Die zu S. cerevisiae homologen Primer binden an die hoch konservierte 25S-rDNA (Primer A) und an das 5'-Ende der 18S-rDNA (Primer B) inner halb der rDNA-Einheit von H. polymorpha. Die schwarzen Pfeile kennzeichnen das pri märe PCR-Amplifikat. (C) Position der 2,4 Kb langen Integrationssequenz (SEQ ID NO 1) in der rDNA-Einheit von H. polymorpha. Diese Sequenz beinhaltet das 5S-Gen, die NTS1-Sequenz und Teilbereiche der NTS2-Sequenz und 25S-Sequenz.

Fig. 2 stellt die 2,4 Kb lange rDNA-Sequenz eines Integrationselementes (SEQ ID NO 1) eines erfindungsgemäßen rDNA-Integrationsvektors dar. Der Bereich der 5S rDNA ist grau schattiert.

Fig. 3 stellt den rDNA-Integrationsvektor pM2 dar.

Fig. 4 stellt den rDNA-Integrationsvektor pM2Δ dar.

Fig. 5 stellt pM2ZT (lacZ, TPS1-Promotor), einen rDNA-Integrationsvektor zur Expres sion von lacZ in H. polymorpha dar.

Fig. 6 stellt pM2GT (GFP3,TPS1-Promotor), einen rDNA-Integrationsvektor zur Expres sion von GFP in H. polymorpha dar.

Fig. 7 zeigt das Ergebnis einer Southern Blot-Analyse zum Nachweis der Integration von pB14 in die rDNA von H. polymorpha.

Fig. 8 zeigt ein Modell für die Integration eines rDNA-Integrationsvektors (pB14) in die DNA. Die Figur zeigt die Zuordnung der Fragmente aus der Southem-Blot Analyse in Fig. 7. Aus der Restriktionstelle für Bg/II und den bekannten Längen der Fusionsfrag mente aus heterologer DNA und rDNA ergibt sich die Zuordnung der Fragmentlängen aus der Southern Blot-Analyse.

Fig. 9 zeigt das Ergebnis einer Southem Blot-Analyse für eine Auswahl rekombinanter Stämme nach Transformation von RB11 mit drei verschiedenen Vektoren.

Fig. 10 zeigt das Ergebnis einer Southern Blof-Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl der kointegrierten Vektoren in dem rekombinanten Stamm RB3T-19.

Fig. 11 zeigt das Ergebnis einer Southern B/of-Analyse zum Nachweis der mitotischen Stabilität des rekombinanten Stammes RB3T-19. Die Ziffern kennzeichnen den Tag der Probenentnahme.

Fig. 12 zeigt eine Southern Blot-Analyse von vier rekombinanten Stämmen, die durch gleichzeitige Transformation mit fünf Vektoren generiert wurden. Drei dieser Stämme enthalten Sequenzen von mindestens einem rDNA-Integrationsvektor.

Fig. 13 zeigt die durch den TPS9-Promotor kontrollierte Expression von lacZ in rekom binanten Stämmen von H. polymorpha. Die Kolonien sind von links oben nach rechts unten durchgehend numeriert.

Fig. 14 zeigt die Identifizierung von rekombinanten Insulin-sezernierenden Stämmen von H. polymorpha in einem immunologischen Filtertest. Die Ziffern auf den Filtern ent sprechen den Nummern der rekombinanten Stämme. Filter A zeigt die Stämme RB4T 1-66. Die Positivkontrolle befindet sich an Position 67. Filter B zeigt die Stämme RB4T 67-132. Die Positivkontrolle befindet sich an Position 133.

Beispiele Material und Methoden 1. Abkürzungen

amp Ampicillin
amp^R

Ampicillin-Resistenz
ARS Autonomously Replicating Sequence
BSA Rinderserumalbumin (Bovine Serum Albumin)
Bp Basenpaare
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA Enzyme Linked Immuno Assay
FMD Gen für die Formiat-Dehydrogenase
HARS H. polymorpha Autonomously Replicating Sequences
HOT Hot spot of recombination
Kb Kilobasenpaare
LB Luria-Broth-Medium
MOX-Gen für die Methanol-Oxidase aus Hansenula polymorpha
NTS Non-transcribed spacer
ori Replikationsursprung eines Plasmides (origin of replication)
ODX Optische Dichte bei _x

nm Wellenlänge
PCR Polymerase Chain Reaction
pH potentia Hydrogenii
rDNA ribosomale DNA
rmA ribosomale RNA
rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
SDS Natriumdodecylsulfat (Sodium Dodecyl Sulphate)
TOP Topoisomerase-Bindestelle
TPS1 Gen für Trehalose-6-Phosphat-Synthase
Tris Tris-(hydroxymethyl)-Methylamin
ÜK Übemachtkultur
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Galactopyranosid
YNB Yeast Nitrogen Base (Selektionsmedium ohne Uracil)
YPD Vollmedium

2. Chemikalien und Enzyme

Chemikalien wurden, soweit nicht besonders erwähnt, von folgenden Herstellern bezo gen: Acros Organics (New Jersey); Amersham International plc. (Buckinghamshire, England); Baker (Deventer, Niederlande); Biorad (Richmond, USA); Biozym (Hess. Oldendorf); Caesar & Loretz GmbH (Hilden); Difco-Laboratories (Detroit, USA); Fluka AG (Basel, Schweiz); Gibco (Paisly, Schottland); Janssen (Beerse, Belgien); Merck (Darm stadt); Oxoid Ltd. (Basingstone, England); Pharmacia (Freiburg); Riedel de Haen (Seelze); Roth (Karlsruhe); Serva (Heidelberg); Sigma (St.Louis, USA); Restriktions enzyme wurden von den Herstellern Boehringer (Mannheim), Gibco BRL (Paisly, Schottland) und New England Biolabs (Schwalmbach) bezogen. Es wurde in den jeweilig mitgelieferten Puffern gearbeitet. Das Enzym Zymolyase wurde von der Seikaguko Corp. bezogen. DNA-Präparationen wurden mit Hilfe verschiedener DNA-Isolationskits der Firma Quiagen (Hilden) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt.

3. Stämme 3.1 E. coli

DHSαF' F'endA1hsdR17r_k

m_k

+supE44thi-9recA1gyra relA(lacZYA-argF) U169(ϕ80Δ(lacZ)M15) (Gibco BRL, Gaithersburg MD, USA)
MC 1066: Δ(lacI POZYA) A74, galU, galK, strA^-

, usdR^-

, trpC 9830, leu B6, pyr F74::Tn5 (Km^r

) (Casadaban et al., 1983).

3.2 H. polymorpha

RB11 odc1 Orotidin-5-phosphat-Decarboxylase-defizienter (Uracil auxotropher) H. polymorpha-Stamm (Weydemann et al., 1995).

4. Medien 4.1 Medien zur Kultivierung von H. polymorpha

Vollmedium: 2% Glucose oder Glycerin, 1% Hefeextrakt, 2% Bacto-Peptone.
Selektionsmedium: 0,17% Yeast Nitrogen Base, 0,5% Ammoniumsulfat, 2% Glucose oder Glycerol, 38,4 mg/l Arginin, 57,6 mg/l Isoleucin, 48 mg/l Phenylalanin, 57,6 mg/l Valin, 6 mg/ml Threonin, 50 mg/l Inositol, 40 mg/l Tryptophan, 15 mg/l Tyrosin, 60 mg/l Leucin, 4 mg/l Histidin. Uracil fehlt im Selektionsmedium.

4.2 Medien zur Kultivierung von E. coli

Luria Broth-Medium (LB): 10 g/l Casein-Hydrolysat (Pepton No.140, Gibco), 5 g/l Hefe extract, 5 g/l NaCl. Als Antibiotikum wurde Ampicillin (Roth) in einer Konzentration von 500 mg/l, nach dem Autoklavieren hinzugegeben.

M9-Medium: 2% Glucose, 30 g/l Na₂HPO₄, 15 g/l KH₂PO₄, 5 g/l NH₄Cl, 2,5 g/l NaCl, 0,015 g/l CaCl₂, 2,28 g/l, MgSO₄, 0,05% Vitamin B1 (nicht autoklaviert) 38,4 mg/l Arginin, 57,6 mg/l Isoleucin, 48 mg/l Phenylalanin, 57,6 mg/l Valin, 6 mg/ml Threonin, 50 mg/l Inositol, 40 mg/l Tryptophan, 15 mg/l Tyrosin, 60 mg/l Leucin, 4 mg/l Histidin.

Feste Nährböden wurden durch Zugabe von 1,6% Agar zu den Flüssigmedien herge stellt.

5. PCR (Polymerase Chain Reaction)

In einem Personal Cycler (Biometra, Göttingen) wurden PCR-Reaktionen mit dem PC- Long-Expand-Kit oder dem PCR-High-Fidelity-Kit der Firma Boehringer (Mannheim) in 50 µl-Ansätzen durchgeführt. Eine Aufreinigung der Produkte erfolgte mit dem PCR-Puri fication-Kit der Firma Qiagen (Hilden) nach den Abgaben des Herstellers.

6. Transformation 6.1 Transformation von E.coli 6.1.1 Elektroporation

400 ml LB-Medium wurden 1 : 100 verdünnt aus einer ÜK angeimpft und bei 37°C bis zu einer ODsoo von 0,5-1 kultiviert. Nach 30 min. Inkubation auf Eis wurde die Kultur bei 4°C und 3000 rpm für 15 min. zentrifugiert. Die Zellen wurden 2× mit eiskaltem Wasser (1 Vol./l/4 Vol.) und 1× mit 1/50 Vol. 10%igem Glycerin gewaschen. Anschließend wurde das Zellpellet in 1,5 ml 10% Glycerin aufgenommen und 40 µl Aliquots bei -70°C aufbe wahrt. Zur Transformation wurde ein Aliquot auf Eis aufgetaut und mit 0,01-1 µg Plas mid-DNA mit einem Gene Pulser (Bio Rad) bei 1,6 KV, 25 µF und 200 Ohm in einer 1 mm Küvette transformiert. Danach wurden die Zellen zur Erholung für 30-45 min. bei 37°C in 1 ml LB-Medium inkubiert und dann auf LB-amp Platten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert.

6.1.2 RbCl₂-Methode

Die Transformation von RbCl2-Zellen erfolgte nach dem Protokoll von Hanahan (1985).

Pro Transformation wurden 20-500 ng DNA mit 200 µl auf Eis aufgetauter kompetenter Zellen gemischt. Nach 20 min. Inkubation auf Eis, 45 sec. Hitzeschock (42°C) und er neuter 2 min. Inkubation auf Eis wurden die Zellen zur Erholung mit 1 ml LB-Medium versetzt und für 30-45 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf LB-amp-Platten ausplattiert, die dann über Nacht bei 37°C inkubiert werden.

6.2 Transformation von H. polymorpha durch Elektroporation

100 ml YPD wurden mit 5 ml einer dichtgewachsenen ÜK beimpft. Die Kultur wurde bei 37°C bis zu einer ODsoo von 0,8-1, 2 geschüttelt (ca. 3 Std.). Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 3000 rpm geerntet und in 20 ml KP; -Puffer (50 mM/pH 7,5) resuspen diert. Nach Hinzufügen von 0,5 ml DTT und 1Sminütigem Schütteln bei 37°C wurden die Zellen bei 2500 rpm abzentrifugiert und 2× mit STM-Puffer (270 mM Saccharose, 10 mM TrisCl, 1 mM MgCl₂, pH 7,5) gewaschen. Danach wurden die Zellen in 0,25 ml STM- Puffer aufgenommen und 60 µl-Aliquots bei -70°C gelagert. Zur Transformation mit rDNA-Integrationsvektoren wurde die Plasmid-DNA zunächst mit Xhol oder Sacl lineari siert. 0,1-1 µg der linearisierten Plasmid-DNA wurden mit frische, auf Eis aufgetauten kompetenten Zellen gemischt, diese Ansätze dann in 2 mm eine Küvette gegeben. Die Transformation erfolgte in einem Gene-Pulser (Bio-Rad, München) bei 2,0 kV, 25 µF und 200 Ohm. Anschließend wurden die Zellen zur Erholung in 1 ml YPD für 1 Std. bei 37°C inkubiert und dann auf Selektions-Medium ausplattiert. Nach 2-4 Tagen Inkubation bei 37°C wurden makroskopische Kolonien sichtbar.

7. Generierung von H. polymorpha-Stämmen

Zur Integration von Vektoren in die Hefe H. polymorpha wurden die aus der Transforma tion hervorgegangenen Uracil-prototrophen Klone dreimal nacheinander auf Selektions medium-Platten, einmal auf Vollmediumplatten, und dann nochmals auf Selektions medium-Platten übertragen (je nach 24 Std. Wachstum bei 37°C).

8. Dauerkultivierung von H. polymorpha

Für Stabilitätsstudien wurden 50 ml-Flüssigkulturen (YPD, 2% Glukose) über 27 Tage bei 37°C geschüttelt, dabei jeden Tag frisch überimpft. Die H. polymorpha-Kulturen hat ten zum Zeitpunkt des Überimpfens und der Probenentnahme eine ODsoo zwischen 3 und 4, die Zellen waren also noch vor dem Eintritt in die stationäre Phase. Es wurden jeden zweiten Tag 2 ml-Glycerinkulturen (27%) angefertigt und bei -70°C aufbewahrt.

9. Präparation von Nukleinsäuren 9.1 Fragment-Isolierung aus Low-Melting-Gelen

Die DNA-Präperation aus Low-Melting Agarose-Gelen erfolgte mit Hilfe der Phenoll Chloroform-Extraktion. Unter UV-Licht ausgeschnittene Gelblöcke mit DNA-Fragmenten wurden mit 130 µl Wasser versetzt und bis zum Schmelzen der Agarose bei 70°C erhitzt. Nach Zugabe von 150 µl Phenol und 50maligen Schütteln wurde die Probe zentrifugiert (2 min. bei 13000 rpm) und die untere Phenolphase verworfen. Nun wurden 150 µl Phe nol/Chloroform (1 : 1 Mischung) auf die wässrige Phase gegeben, gemischt und erneut zentrifugiert. Wiederum wurde die untere Phase verworfen und die wässrige Phase zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (1 : 24) gewaschen (je 150 µl). Anschließend wurde ein 1/10-Volumen NaAc (3 M, pH 8) und 1 ml 96%iger Ethanol hinzugefügt und die DNA durch 15 min. Inkubation bei -70°C gefällt. Nach Abzentrifugieren der DNA, einmaligem Waschen mit 70% Ethanol und anschließendem Trocknen wurde die DNA in 15-30 µl Wasser aufgenommen.

9.2. Fragment-Isolierung aus PCR-Ansätzen

Die Fragment-Isolierung aus PCR-Ansätzen und aus Low-Melting Gelen erfolgt mit Hilfe des PCR-Purification Kits (Quiagen, Hilden) entsprechend den Herstellerangaben.

9.3 Plasmid-Präparation E. coli (Mini-Präp)

Die Präparation von Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte nach der von Maniatis et al (1982) beschriebenen Methode der alkalischen Lyse. 1,5 ml einer ÜK wurden bei 13000 rpm abzentrifugiert (2 min.). Das Zell-Pellet wurde in 100 µl P1 (50 mM Tris/HCl, 10 mM EDTA) resuspendiert. Die Lyse erfolgt durch Zugabe von 100 µl P2 (200 mM NaOH, 1% SDS). Proteine und sonstige Zellbestandteile wurden anschließend durch Zugabe von 100 µl P3 (2,55 M KOAc, pH 4,8) gefällt. Nach Zentrifiugieren für 10 min. bei 13000 rpm wurde die DNA aus dem Überstand mit dem doppelten Volumen 96%igem Ethanol ge fällt. Nach Waschen und Trocknung wurde das Pellet in 20 µl Wasser aufgenommen.

Der Reinheitsgrad dieser DNA war hinreichend für Restriktionsanalysen.

9.4. Plasmid-Präparation aus E. coli (Midi-Präp)

Für DNA-Präparationen höheren Reinheitsgrades und größerer Mengen wurde das Plasmid-Midi-Kit der Firma Quiagen nach Herstellerangaben verwendet.

9.5. Konzentrationsbestimmungen von Nukleinsäuren

Die Konzentration von DNA mit niedrigem Molekulargewicht (Oligonucleotide) erfolgte durch Absorptionsbestimmung bei 260 nm. Die Konzentration hochmolekularer DNA wurde durch Vergleich mit einem kalibrierten Mengenstandard (KB-Leiter, Pharmacia) im Agarosegel abgeschätzt.

9.6 Präparation chromosomaler DNA aus H. polymorpha

Zellen aus einer 2 ml ÜK wurden die bei 13 000 rpm geerntet und in 0,5 ml STEHp- Puffer (0,5 M Sorbitol; 0,1 M Tris/HCl; pH 8; 0,1 M EDTA) resuspendiert. Die Zellwand wurde durch Zugabe von 10 µl Zymolyase (2,5 mg/ml) und 1 µl β-Mercaptoethanol und Inkubation für 1 Std. bei 37°C entfernt. Unter dem Mikroskop wurde kontrolliert, ob die Zellen als Protoplasten vorliegen. Danach wurden die Protoplasten vorsichtig abzentrifu giert (5 min bei 3000 rpm), in TEHp-Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 8, 20 mM EDTA) resus pendiert und mit 25 µl SDS (20%) versetzt. Die Lyse erfolgte durch Inkubation für 20 min. bei 65°C. Durch Zugabe von 200 µl KOAc und Inkubation auf Eis (30 min.) wurden Pro teine und Zelltrümmer gefällt. Nach Zentrifugation bei 13 000 rpm für 10 min. wurde der Überstand durch Watte filtriert und die im Filtrat gelöste DNA mit 0,7 Volumen Isopropa nol gefällt. Nach Waschen mit 70% Ethanol wurde das getrocknete DNA-Pellet in 20-30 µl Wasser aufgenommen.

9.7 Präparation chromosomaler DNA zur Gewinnung großer Fragmente

Zur Gewinnung von genomischer DNA von besserer Qualität wurde das in 9.6 beschrie bene Standardprotokoll modifiziert. H. polymorpha-Zellen wurden aus 50 ml ÜK bei 3000 rpm geerntet. Die Zellen wurden in 30 ml STEHp-Puffer resuspendiert, abzentrifu giert und darauf in 1,5 ml STEHp aufgenommen. Zum Auflösen der Zellwand wurden 30 µl Zymolyase hinzugegeben. Die Protoplasten wurden mit 2 ml 5 M KOAc gemischt, das Lysat für 30 min. bei 13 000 rpm abzentrifugiert (4°C). Nun wurde der Überstand mit 2 ml 5 M NH₄OAc versetzt und die gelöste DNA mit 10 ml kaltem 96% Ethanol gefällt. Nach 5 min. Inkubation auf Eis wurde die DNA bei 3000 rpm 5 min. abzentrifugiert, mit 50%igem Ethanol gewaschen und in 2 ml TE (10 mM Tris/HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5) aufgenommen. Diese gesamte Prozedur wurde in abnehmenden Volumina mehrfach wiederholt. Die DNA wurde schließlich in einem Volumen von 200 µl TE aufgenommen.

10. Southern Blot-Analyse

5 µg chromosomaler DNA (H. polymorpha) oder 0,5 µg Plasmid-DNA wurden über Nacht mit 1 U/µg der entsprechenden Restriktionsendonuclease behandelt. Die Auftrennung der DNA erfolgte in 0,6-0,8%-igen Agarose-Gelen. Durch lange Trennzeiten (2-12 Std. bei 200 mA) konnten auch relativ große (5-12 Kb) DNA-Fragmente unterschieden werden. Nach dem Photographieren des Geles wurde der DNA-Transfer auf eine Ny lonmembran (Hybound M, Amersham) in einer Vakuum-Blot Apparatur (LKB 2016 Vacu gene, Pharmacia) vorgenommen. Hierzu wurde zuerst für 15 min. mit Depurinierungs lösung (0,25 M HCl) transferiert. Dieser zusätzliche Schritt ermöglicht den Transfer auch sehr großer Fragmente. Mit Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH) und Neu tralisierungspuffer (3 M NaAc, pH 5, 5) wurde das Gel je 20 min. lang überschichtet. Ab schließend wurde für 20 min. mit 20 × SSC Transferpuffer (3 M NaCl, 0,3 M NaCitrat, pH 7) überschichtet. Durch eine 2minütige Bestrahlung der Membran mit UV-Licht (254 nm) und anschließende 30minütige Inkubation bei 80°C wurde die DNA an die Nylonmembran fixiert.

Die Herstellung der Sonde, die Hybridisierung und der Nachweis des Hybrids erfolgten mit Hilfe einer enzymatischen Reaktion werden nach dem Protokoll des Dioxygenin- Labeling-Kit der Firma Boehringer (Mannheim). In einigen Fällen wurden die Southern- Blots mit einer zweiten Sonde hybridisiert und entwickelt. Dazu wurde die erste Sonde durch eine Abfolge von Waschschritten von der Membran entfernt (1 Std. in Dimethyl formamid bei 60°C, dann Waschen in Lösung 1 (0,2 M NaOH, 0,1% SDS) und Lösung 2 (0,3 M NaCl, 0,03 M Citrat) für jeweils 10 min.).

11. X-Gal-Overlay-Assay - Nachweis von β-Galactosidase

Der Nachweis der p-Galactosidase-Aktivität erfolgte nach Suckow and Hollenberg (1998). Die zu testenden Stämme wurden für 4-6 Stunden in Selektionsmedium bei 37°C kultiviert. Ein 4 µl-Tropfen einer jeden Kultur wurde auf eine Selektionsplatte gegeben und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Platte wurde mit frischen Überschichtungsagar (0,5% Agarose, 0,5 M Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (pH 7); 0,2% SDS; 2% DMF (Dimethylforma mid) 2 mg/ml X-gal (o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside) bei 70°C überschichtet. Nach wenigen Minuten zeigten die Klone mit lacZ-Expression eine Blaufärbung.

12. Phytase-Nachweis

Aus 3 ml ÜK wurden die H. polymorpha-Zellen geerntet und in 200 µl YNB Medium und 1 ml 5%igem Glycerin aufgenommen. Nach 1-2 Tagen Wachstum wurde zuerst die OD₆₀₀ bestimmt. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und 25 µl des Überstandes weiterverwendet. Zu diesem Aliquot wurden 25 µl 5 M NaAc und 50 µl 4-Nitrophenylphosphat hinzugegeben. Der Ansatz wurde 30 min. bei 37°C inkubiert. Die enzymatische Umsetzung des Substrates wurde durch Zugabe von 100 µl 15%iger Trichloressigsäure abgestoppt. Nach Zugabe von 100 µl 1 M NaOH erschienen positive Kulturüberstandsproben intensiv gelb gefärbt. Die Gelbfärbung wurde durch OD₄₀₅-Mes sung im Photometer quantifiziert.

13. immunologischer Nachweis von Insulin

Die Zellen wurden für 1-2 Tage in 2 ml Selektionsmedium (2% Glycerin) bei 37°C kulti viert. 4 µl-Aliquots dieser Kulturen wurden auf eine Selektionsplatte aufgetropft und diese über Nacht bei 37°C inkubiert. Danach wurde eine Nitrozellulose-Membran (Amersham Int., England) auf die Platte gelegt, dann erfolgte eine erneute Inkubation über Nacht bei 37°C. Die Membran wurde vorsichtig abgezogen, und alle an der Membran haftenden Zellen wurden mit Wasser sorgfältig abgespült. Nach dem Trocknen der Membran konnte das sezernierte Genprodukt auf den Filtern mit Insulin-Antikörpern immunolo gisch nachgewiesen werden. Der Nachweis erfolgte nach Standardmethoden mit Hilfe des NOVEX-Anti-Maus-Kits. Insulin-sezernierende Klone konnten mit dieser Methode eindeutig nachgewiesen werden.

14. Nachweis der GFP-Expression

Für diese Studie wurde eine speziell für die Translation in der Hefe S. cerevisiae opti mierte Mutante des wt-GFP verwendet, das yeast enhanced green fluorescent protein3 (yEGFP). In S. cerevisiae zeigt dieses Protein eine stärkere Fluoreszenz als wt-GFP (Cormack et al., 1997). Auf dem Plasmid pM2GT befindet sich das Gen für yEGFP unter der Kontrolle des TPS1-Promotors aus H. polymorpha. Es konnte gezeigt werden, daß yEGFP in H. polymorpha zu einer mit S. cerevisiae vergleichbaren Fluoreszenz führt. In dieser Studie wurde die GFP-Expression qualitativ analysiert. Hierfür wurden die Stämme in Doppelproben für 12 Std. bei 37°C in YNB-Medium (2 ml-Kulturen) herange zogen und unter dem Fluoreszenz-Mikroskop auf grünes Leuchten untersucht.

Beispiel 1 Gewinnung und Charakterisierung eines rDNA-Fragmentes für die Konstruktion eines rDNA-Integrationsvektors

Voraussetzung für die Integration eines Vektors in die rDNA von H. polymorpha ist die Anwesenheit einer Sequenz, die zu diesem Bereich homolog ist. Dazu wurde ein 2,4 Kb langes rDNA-Fragment aus dem rDNA-Bereich von H. polymorpha festgelegt. Im folgen den wird diese 2,4 Kb lange Sequenz (SEQ ID NO 1) (Figur2) als Integrationssequenz bezeichnet. Für die Klonierung dieses Fragments aus der ribosomalen DNA von H. polymorpha wurde mit Hilfe einer PCR-Reaktion zunächst ein 3 Kb langes Fragment aus der chromosomalen DNA von H. polymorpha amplifiziert. Die Festlegung der Primer erfolgte nach Sequenzen der 18S- und 26S-rDNA aus S. cerevisiae mit flankierenden BamHI-Erkennungssequenzen. Das Amplifikat wurde später durch EcoRI/BamHI- Restriktion (das Fragment enthält eine interne EcoRl-Erkennungssequenz) auf 2,4 Kb verkürzt. Das 2,4 Kb lange Fragment wurde in den Vektor pM1 kloniert und vollständig sequenziert. Es entstand der Basisvektor pM2 (Fig. 3), aus dem alle in dieser Anmel dung beschriebenen Plasmide hervorgegangen sind.

Durch Vergleich mit bekannten Sequenzen aus der rDNA-Einheit von S. cerevisiae konnte das 5S-rmA-Gen innerhalb der klonierten Sequenz nachgewiesen werden. Die 5S-DNA aus H. polymorpha besitzt eine 96%ige Homologie zu dem entsprechenden Gen von S. cerevisiae. Das 5S-Gen befindet sich an Position 958-1079 der Integrations sequenz, gezählt von der flankierenden EcoRl-Schnittstelle. Mit diesem Befund und der Kenntnis über die Isolierung der Integrationssequenz konnte die Position des klonierten rDNA-Fragmentes in einem rDNA-Repeat von H. polymorpha festgelegt werden und eine gleichartige Organisation der rDNA-Sequenzen wie in S. cerevisiae angenommen werden. Teilbereiche des ITS2 und der 18S-Sequenz gehen bei der Verkürzung verlo ren. Die Position des klonierten Fragmentes in der rDNA-Einheit von H. polymorpha wird in Fig. 1 (C) gezeigt. Seine vollständige Sequenz ist in der nachfolgenden Fig. 2 do kumentiert. Die grau schattierte Sequenz zeigt die Lage der 121 bp langen 5S-rDNA.

Beispiel 2 Herstellung der Basis-rDNA-Integrationsvektoren pM2 und pM2A

Das im vorigen Beispiel beschriebene 2.4 Kb EcoRI/BamHI-rDNA Fragment wurde in einen E. coli I H. polymorpha Shuttle-Vektor pM1 eingebracht, der die folgenden Ele mente enthält: HARS1 und MOX-Terminator aus H. polymorpha; ori and amp^R aus E. coli. Zwischen HARS1 und MOX-Terminator ist eine Polyklonierungstelle für die Auf nahme heterologer Promotor/Genfusionen positioniert. Einige Beispiele der resultieren den Integrations/Expressionsvektoren sind in den Beispielen 3 und 4 angegeben. Die integrierte rDNA enhält eine BrsGI, SacI, SnaI und eine Xhol-Erkennungssequenz zur Linearisierung des resultierenden Vektors M2. Der Vektor ist in Fig. 2 dargestellt.

Zur Generierung des Grundvektors pM2Δ wurde dder Vektor pM2 mit DraI/AatII verdaut, und das resultierende 8,7 Kb-Fragment nach Entfernen des 3'-Überhanges des AatII kohäsiven Endes mit T4-Polymerase religiert. Es entsteht ein verkürzter Shuttle-Vektor ohne amp^R. Die Propagierung dieses Vektors und seiner Derivate wurde in dem E.coli- Stamm MC1066 durchgeführt, der Uracil-auxotroph ist, und somit über das Ura3-Gen auf Uracil-Prototrophie selektioniert werden konnte. Der Grundvektor M2Δ ist in Fig. 4 dar gestellt.

Beispiel 3 Integrations-/Expressionsvektor für die Expression von IacZ

Der in Fig. 5 dargestellte Vektor pM2ZT wurde durch Integration einer Expressions kassette für das bakterielle lacZ Gen in die Polyklonierungsstelle von pM2 generiert. Als Promotorelement wurde der TPS1-Promotor aus H. polymorpha verwandt (pM2ZT), in Beispiel 4 wurde durch Integration eines geeigneten Fragmentes in pM2 eine Expres sionskassette für GFP generiert. Als Promotorelement wurde der TPS1-Promotor aus H. polymorpha verwendet.

Beispiel 4 Integrations-/Expressionsvektor für die Expression von GPF

Der in Fig. 6 dargestellte Vektor pM2GT wurde durch Integration einer Expressionskas sette für GFP in die Polyklonierungsstelle von pM2 generiert. Als Promotorelement wurde der TPS1-Promotor aus H. polymorpha verwendet.

Beispiel 5 Integrations-/Expressionsvektoren für die Expression eines Insulin- und eines Phytase- Gens unter der Kontrolle des TPS1- und des FMD-Promotors

In dem folgenden Beispiel sind weitere Expressionsvektoren beschrieben. Sie sind Deri vate von pM2 und pM2Δ und wurden, wie für die Beispiele 3 und 4 gezeigt, durch Inser tion eines geeigneten Fragmentes in die Polyklonierungsstelle der beiden Grundvektoren generiert. Sie enthalten Expressionskassetten für die Synthese von Insulin und Phytase. Neben TPS9 wurde der FMD-Promotor als Kontrollelement für die heterologe Gen expression eingesetzt. Es wurden folgende Vektoren generiert:
pB11 Derivat von pM2 mit heterologer Expressionskassette für Insulin (FMD- Promotor vor einem Insulin-Gen), H. polymorpha -rDNA-Integrations sequenz, HARS1, URA3 (S. cerevisiae), MOX-Terminator, ori, amp^R.
pB14 Wie pB11, jedoch mit synthetischem Phytase-Gen anstelle des Insulin- Gens.
pB14X M2Δ-Derivat mit heterologer Expressionskassette. Wie pB14, jedoch ohne amp^R

Beispiel 6 Generierung rekombinanter H. polymorpha-Stämme

Die Transformation von RB11 mit rDNA-Integrationsvektoren verlief nach einem gene rellen Prinzip, das für alle hier gezeigten Transformationen gilt. Durch die Restriktion mit einem Enzym, für das nur eine singuläre Schnittstelle innerhalb der Integrationssequenz vorliegt (z. B. Sacl oder Xhol), wurde die Integrationssequenz in zwei endständige Teil sequenzen geteilt, die mit entsprechenden Sequenzen auf der rDNA-Einheit homolog rekombinieren können. Für nicht-linearisierte Plasmide konnte bisher keine Integration in die rDNA nachgewiesen werden. Die rDNA-Integrationsvektoren enthielten als Selek tionsmarkergen das intakte URA3-Gen aus S. cerevisiae. Die Nutzung eines solchen intakten Genes führt, wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt wird, zu mitotisch sta bilen Stämmen, in denen die rekombinante integrierte DNA in 40-50 Kopien vorliegen kann.

Die Transformation wurde durch Elektroporation durchgeführt (s. Material und Metho den). Die Integration in das Genom erfolgt durch Wachstum unter Selektionsdruck über 30 Generationen (YNB-Platten oder Medien, die kein Uracil enthalten). Bei der her kömmlichen Methode zur Generierung rekombinanter H. polymorpha-Stämme mit zirku lären Plasmiden sind mindestens 80 Generationen Wachstum auf selektiven Medien notwendig (Gatzke et al. 1995). Damit steht bei Nutzung von rDNA-Integrationsvektoren eine gegenüber den etablierten Protokollen einfachere und schnellere Methode zur Ge nerierung rekombinanter H. polymorpha-Stämme zur Vertilgung.

Beispiel 7 Transformation mit einem Vektor - Generierung rekombinanter Stämme mit pB14 und deren Charakterisierung

Die rDNA in H. polymorpha besteht aus ca. 40 aufeinander folgenden Einheiten, die identisch aufgebaut sind (Beispiel 1). Die Länge einer Einheit beträgt ca. 8 Kb. Diese Länge kann durch Hybrisationsexperimente mit rDNA-Sonden ermittelt werden, falls in Restriktionen Enzyme genutzt werden, die nur einmal in einem rDNA-Repeat schneiden. Eines dieser Enzyme ist Bglll. Die Integration ist in eine oder mehrere dieser rDNA-Ein heiten möglich.

Der Uracil-auxotrophe Stamm RB11 wurde mit pB14 nach der oben beschriebenen Me thode transformiert. Die Linearisierung erfolgte durch Sacl. Dadurch wurde das rDNA- Fragment des Vektors auf etwa zwei gleich lange Randsequenzen verteilt. Von den ge nerierten rekombinanten Stämmen wird im folgenden ein repräsentatives Beispiel doku mentiert. Der Strukturnachweis der in die rDNA integrierten heterologen DNA basiert auf folgenden Vorüberlegungen: Wird ein Enzym verwendet, das im Vektor, aber nicht in der rDNA schneidet (BamHl), und wird dieses zusammen mit Bglll verwendet (schneidet in der rDNA-Einheit, aber nicht im Vektor), so müßten sich Fragmentgrößen identifizieren lassen, die den Übergang von einer rDNA-Repetitionseinheit in eine Vektorkopie anzei gen. Für den Fall, daß mehrere Kopien des Vektors an verschiedenen Positionen inte griert sind, müßten sich auch sehr lange Überbrückungsfragmente nachweisen lassen, da BamHI nur im Vektor und BgIII nur in der rDNA schneidet. Fig. 7 zeigt diese Ana lyse.

Die mit den angegebenen Restriktionsenzymen geschnittene DNA hybridisiert mit der Sonde, die aus der Markierungsreaktion der Integrationssequenz hervorgegangen ist (siehe Material und Methoden). In der Spur mit der BamHI-behandelten DNA ist ein star kes Signal bei 7,4 Kb zu erkennen. Dies entspricht dem Vektor-Fragment. In dieser Spur wird noch ein schwach erkennbares Signal bei über 21 Kb sichtbar. Dieses Fragment wird als Überbrückungsfragment interpretiert. In der Spur mit BgIII-behandelter DNA ist ein starkes Signal bei 8 Kb erkennbar, was der Länge einer rDNA-Einheit entspricht. In der Spur mit dem Doppelverdau sind sowohl die rDNA- als auch die Vektor-Signale er kennbar. Bei 8,8 Kb und bei 6,7 Kb sind schwache Signale zu sehen, die Übergangs fragmente von rDNA in Plasmid-DNA repräsentieren. In der ersten Spur wurde als DNA- Längenstandard die Kilobasenleiter, in der zweiten Spur EcoRI/HindIII-verdaute λ DNA aufgetragen.

Daraus ergibt sich folgender Befund: Die heterologe DNA liegt in mindestens zwei Clustern vor. Die Zahl der Plasmid-Kopienzahl pro Cluster muß erheblich mehr als zwei betragen. Zwischen den Plasmid-Clustern liegt mindestens eine intakte rDNA-Einheit. Fig. 8 zeigt die aus der Analyse abgeleitete Struktur.

Beispiel 8 Simultane Integration von drei Vektoren in den rDNA-Bereich des Genoms von H. polymorpha und Charakterisierung der resultierenden Stämme

Es sollte die Möglichkeit untersucht werden, mehrere Vektoren mit identischem Basis design gleichzeitig in unterschiedlichen Clustern in die rDNA zu integrieren. Dadurch er gibt sich die Option, mit geringem Aufwand rekombinante Stämme für die Koproduktion von zwei oder mehr Proteinen bereitzustellen. RB11 wurde deshalb mit den drei Vekto ren pM2, pB11 und pB14 (siehe Beispiele 2 und 5) transformiert und die 40 entstande nen rekombinanten Stämmen auf das Vorhandensein integrierter Vektoren untersucht. Die Vektoren pB11 und pB14 wurden durch Sacl-Restriktion, pM2 durch Xhol-Restriktion innerhalb der Integrationssequenz linearisiert und in einem Transformations-Ansatz in äquimolaren Mengen eingesetzt. Die drei Vektoren besitzen übereinstimmend die 2,4 Kb lange Integrationssequenz zur homologen Rekombination in den rDNA-Bereich des Ge noms von H, polymorpha und das URA3-Gen aus S. cerevisiae (s. Beispiel 1).

Die chromosomale DNA der aus dem Ansatz hervorgegangenen rekombinanten Stämme wurde mit Aatll (schneidet in jedem der drei Vektoren nur einmal) geschnitten, die Fragmente in einem Agarosegel aufgetrennt und einer Southern-Blot Analyse unter zogen. Als Sonde wurde die Digoxygenin-markierte Integrationssequenz eingesetzt. Durch die Restriktion der heterologen DNA mit einem "single cutter" wurde gewährleistet, das für die Vektoren Fragmente entstehen, die klar zugeordnet werden können, und die mit der Sonde hybridisieren. Fig. 9 zeigt eine Auswahl der analysierten Stämme.

Die fett gedruckten Ziffern kennzeichnen die Stämme, die zwei oder drei verschiedene Vektoren gleichzeitig integriert tragen. Bei den Stämmen RB3T-13, RB3T-17 und RB3T- 37 sind auf der Höhe von pM2 und pB14 Signale erkennbar, sie tragen beide Vektoren genomisch integriert. RB3T-19 zeigt für alle drei Vektoren ein Signal. Durch die Restrik tion mit AatII erscheint bei der Kontrolle RB11 ein Signal bei 6,5 Kb, welches die rDNA- Einheit repräsentiert und auch bei den rekombinanten Stämmen in Erscheinung tritt. Stamm RB3T-34 zeigt für pB14 eine starke, und für pM2 eine schwächere Bande. Bei diesem rekombinanten Stamm kam es zu einer anderen Kombination der Kointegration. In der letzten Spur ist der DNA-Längenstandard aufgetragen (KBL).

Der Vektor pM2 konnte in 20 Stämmen (No. 1-13, 17, 19, 22, 33-40), pB14 in sieben Stäm men (No. 4, 6, 11, 19, 21, 22,34) und pB11 in sieben Stämmen (No. 4, 6, 11, 19, 21, 22, 34) nachgewiesen werden. Es konnten vier rekombinante Stämmen identifiziert werden, in denen zwei verschiedene Vektoren integriert waren (No. 17, 13 und 37 mit pM2 und pB11; No. 34 mit pM2 und pB14). Ein Stamm (No. 19) enthält alle drei Vektoren. Die re kombinanten Stämme wurden nach folgender Nomenklatur bezeichnet: RB für H. polymorpha-Stamm RB11; 3T für Transformation von RB11 mit 3 verschiedenen Vektoren.

Beispiel 9 Kopienzahl-Bestimmung der integrierten Vektoren

Für alle generierten rekombinanten Stämme des in Beispiel 8 beschriebenen Transfor mationsansatzes wurden Kopienzahlen zwischen 40 und 50 nachgewiesen. Sie ent spricht demnach in etwa der Gesamtzahl der rDNA-Repetitionseinheiten in der rDNA bei H. polymorpha. Bei der Kointegration unterschiedlicher Vektoren teilt sich diese Gesamt zahl auf die Kopienzahlen der einzelnen Vektoren auf. Als Beispiel für die Kopienzahl bestimmung wurde der Stamm RB3T-19 mit drei verschiedenen integrierten Vektoren gewählt. Für die Hybridisation wurde eine MOX-Terminator Sonde verwendet. Die Se quenz für den MOX-Terminator kommt nur einmal im Genom von H, polymorpha vor und findet sich auf allen drei Vektoren. Somit wurde eine Sonde generiert, die sowohl mit den Vektorfragmenten, als auch mit der genuinen "single copy" MOX-Terminator-Sequenz des Wirtes hybridisiert. Die chromosomale DNA von RB3T-19 wurde mit Aatll geschnit ten und analysiert. Die geschnittene DNA wurde in definierten Verdünnungsstufen auf getragen. Die Stärke des Hybridisationssignals der heterologen Sequenz in den Verdün nungen kann mit der des genuinen Gens verglichen werden. Alle drei Signale für die in tegrierten Vektoren sind mit abnehmender Intensität in den jeweiligen Verdünnungen zu erkennen. Das Signal für das genuine MOX-Terminator-Fragment ist nur schwach zu erkennen. Die Signale für pB11 und pM2 in der 1/20-Verdünnung entsprechen ungefähr dem MOX-Terminator-Signal. Für pB14 zeigt sich in der 1/5-Verdünnung ein vergleich bar starkes Signal. Hieraus ergibt sich die im Text erwähnte Kopienzahl von jeweils 20 für die Vektoren pM2 und pB11, und fünf Kopien für pB14. Für die co-integrierten Vekto ren pB11 und pM2 konnte eine Kopienzahl von jeweils 20 ermittelt werden. Für pB14 ergibt sich eine Kopienzahl von 5. Somit wird eine Gesamtkopienzahl für alle drei kointe grierten Vektoren von 45 erreicht.

Beispiel 10 Mitotische Stabilität rekombinanter H. polymorpha-Stämme

Die mitotische Stabilität rekombinanter Stämme, die durch Transformation von H, polymorpha mit drei rDNA-Integrationsvektoren generiert worden waren, wurde bei spielhaft an den Stämmen RB3T-13, RB3T-17, RB3T-19 und RB3T-37 untersucht. Dazu wurden die Stämme über 27 Tage in einer 50 ml Flüssigkultur in nicht-selektivem (YPD) Medium kultiviert. In regelmäßigen Abständen wurden Proben entnommen und gesam melt. Die genomische DNA der gesammelten Proben wurde präpariert und nach der Re striktion mit Aatll einer Southern Blot-Analyse unterzogen. Als Sonde wurde das AatII/Bg/II MOX-Terminator-Fragment aus dem Vektor pM2 verwendet. Für alle vier re kombinanten Stämme konnte die mitotische Stabilität in Southern Blot-Analysen nach gewiesen werden. Fig. 11 zeigt das Ergebnis der Southern Blot-Analysen exemplarisch für den Stamm RB3T-19. Die unveränderte Intensität aller Signale für die Vektor-Frag mente über den gesamten Zeitraum zeigt die mitotische Stabilität des analysierten Stamms.

Beispiel 11 Transformation von RB11 mit fünf unterschiedlichen Vektoren

Ziel dieses Experimentes war es, die Zahl der gleichzeitig bei einer Transformation ge nutzten Vektoren zu steigern und so eine Obergrenze für eine Kointegration zu bestim men. RB11 wurde mit den Vektoren pB11 (10,7 Kb), pB14 (9,7 Kb), pB14X (8,7 Kb), pM2 (8,2 Kb) und pM2X (6,7 Kb) kotransformiert. Die rekombinanten Stämme wurden in Southem Blot-Analysen überprüft. 80 rekombinante Stämme wurden analysiert. Die ge nomische DNA der rekombinanten Stämme wurde mit NcoI geschnitten, für das eben falls in allen Vektoren nur eine einzige Restriktionsstelle existiert. Als Sonde wurde die Digoxygenin-markierte MOX-Terminator Sequenz eingesetzt. In 66 Fällen war nur eine Vektor-Spezies integriert, in sieben Fällen waren zwei, in sechs Fällen drei und in einem Fall vier der insgesamt fünf Vektoren. Ein Stamm, der alle fünf Vektoren genomisch inte griert trug, konnte unter den 80 analysierten rekombinanten Stämmen nicht entdeckt werden. Die Fig. 12 zeigt die Southern Blot-Analyse für vier ausgewählte Stämme, wobei drei dieser Stämme Sequenzen von mindestens einem Integrationsvektor enthal ten. Die chromosomale DNA wurde mit Xhol geschnitten. Die Analyse der geschnittenen DNA erfolgte wie in Fig. 11. Stamm RB5T-31 enthält vier unterschiedliche Vektor-Spe zies (pM2, pM2X, pB14X und pB11). Das Signal für pBl4 bei 9,7 Kb fällt besonders stark aus. Dies spricht für eine im Vergleich zu den anderen Vektoren wesentlich höhere Ko pienzahl.

Beispiele 12-15 Expression verschiedener Reportergene in rekombinanten H. polymorpha-Stämmen, die durch Integration von mindestens einem rDNA-Vektor generiert wurden

Nachdem in den vorausgegangenen Beispielen gezeigt wurde, daß eine Kointegration mehrerer verschiedener Vektoren in die rDNA von H. polymorpha zu mitotisch stabilen rekombinanten Stämmen führt, wird in den folgenden Beispielen die Exprimierbarkeit von vier verschiedenen Reporter-Genen nachgewiesen. Als Reporter-Gene wurden GFP, lacZ, ein Gen für eine Insulin-Variante und ein Phytase-Gen gewählt, weil die Detektion der Genprodukte leicht durchzuführen ist. Die Reporter-Gene sind auf den Vektoren pM2GT (GFP) pM2TZ (lacZ), pB11 (Insulin) und pB14 (Phytase) enthalten. Die vier Vektoren wurden jeweils durch Sacl-Restriktion innerhalb der Integrationssequenz linea risiert und in äquimolaren Mengen in einen Kotransformationsansatz gegeben. 132 re sultierende rekombinante Stämme wurden auf das Vorhandensein der Genprodukte analysiert.

Beispiel 12 Expression von lacZ unter der Kontrolle des TPSI-Promotors

Das lacZ-Gen liegt bei dem hier verwendeten Vektor pM2ZT hinter dem TPS1-Promotor aus H. polymorpha. Dieser Promotor wird durch höhere Kultivierungstemperaturen akti viert. Bei Wachstum bei 40°C auf YNB-Platten mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle wird der Promotor hinreichend aktiviert. Die Zellen wurden 6 Std. lang bei 40°C in Selek tionsmedium kultiviert und dann jeweils 5 µl der Kulturen auf Selektions-Platten getropft. Nach 24 Std. Wachstum wurden die Kolonien mit Hilfe eines X-Gal Overlay-Assay (siehe Material und Methoden) auf β-Galactosidase-Aktivität untersucht. Nach Sstündiger Inku bation wurde das Ergebnis dokumentiert (Fig. 13). Eine Schwärzung der Kolonie ent spricht einer starken β-Galactosidase Aktivität. Graue Kolonien zeigen mittlere oder schwache Aktivität. 61 der 132 rekombinanten Stämme zeigten p-Galaktosidase-Aktivi tät. Dieses Ergebnis wurde in einem Wiederholungsexperiment bestätigt.

Beispiel 13 Expression des Insulin-Gens unter der Kontrolle des FMD-Promotors

Der eingesetzte Vektor pB14 trägt eine Expressionskassette mit dem Gen für eine Insu lin-Variante unter der Kontrolle des FMD-Promotors. Hierfür wurden die Zellen in einer Vorkultur (YNB, 5% Glycerin) 6 Std. bei 37°C inkubiert und je 5 µl davon auf YNB-Platten (2% Glycerin) aufgetropft. Als Kohlenstoffquelle wurde in diesem Fall Glycerin verwen det, da das Insulin-Gen unter der Kontrolle des FMD-Promotors steht. Dieser Promotor wird durch Glucose reprimiert und durch Glycerin dereprimiert. Zur Identifikation der In sulin-produzierenden Stämme wurde ein immunologischer Filtertest verwendet (siehe Material und Methoden). Nach Entwicklung des Filters zeigen sich Färbungen an den Positionen Insulin-positiver Kolonien (siehe Fig. 14). Die Färbung des Filters ist propor tional zur sezernierten Insulin-Menge. Bei 17 der 132 rekombinanten Stämme konnte Sekretion von Insulin gezeigt werden. Auf Filter A in Fig. 14 zeigen vier Stämme eine mäßig starkes Signal. Stamm Nr. 51 und Stamm Nr. 56 zeigen eine schwache Färbung. Stamm Nr. 126 zeigt ein mit der Positivkontrolle vergleichbar starkes Signal. Die Stämme Nr. 80, 94 und 114 zeigen schwache Färbungen.

Beispiel 14 FMD-Promotor-kontrollierte Expression eines Phytase-Gens

Der Vektor pB11 trägt das Gen für die con-Phytase unter der Kontrolle des FMD-Pro motors. Bei dieser Phytase handelt es sich um ein Mutein (Hoffman La Roche, Basel). Zur Bestimmung der Phytase-Aktivität wurden die Stämme in 3 ml-Übernachtkulturen (YPD, 37°C) herangezogen, und im Kulturüberstand wurde anschließend die Phytase- Aktivität photometrisch bestimmt (siehe Material und Methoden). 20 Stämme zeigten Phytase-Aktivität.

Beispiel 15 TPS1-Promotor kontrollierte Expression des GFP-Gens

Der Vektor pM2GT trägt das yEGFP-Gen unter der Kontrolle des TPS1-Promotors aus H. polymorpha. Ist das Reporter-Protein in der rekombinanten Zelle in ausreichenden Mengen akkumuliert, so erfolgt nach Anregung mit Licht der Wellenlänge von 395 nm eine Fluoreszenz mit dem Emmissionsmaximum bei 510 nm (Morise et al., 1974); die Zellen leuchten intensiv grün (siehe Material und Methoden). Die Stämme wurden für 24 Stunden in YNB-Medium bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden unter dem Fluo reszenz-Mikroskop Stämme mit GFP-Signal identifiziert. Das Experiment wurde insge samt dreimal wiederholt und solche Stämme als positiv determiniert, die in allen drei Analysen ein Signal zeigten. Bei 36 der 132 Stämme wurde GFP nachgewiesen.

Beispiel 16 Koexpression von unterschiedlichen Reportergenen

Durch Cotransformation mit vier verschiedenen Vektoren wurden die in den Beispielen 12 bis 15 dokumentierten 132 rekombinante Stämme generiert. Alle Stämme wurden auf die Expression der oben beschriebenen Reporter-Gene hin untersucht. 28 zeigten keine Expression. Bei den verbleibenden H. polymorpha-Stämmen scheint eine zufällige Ver teilung der Vektoren stattgefunden zu haben. 52 Stämme weisen eine Expression von lacZ auf, das hinter dem in H. polymorpha sehr starken TPS1-Promotor liegt. In 36 Fällen wurde das GFP Gen exprimiert. Auf dem verwendeten Vektor liegt das GFP-Gen ebenfalls hinter dem TPSI-Promotor. Bei 20 Stämme wurde eine Expression des Phytase-Gens, in 17 eine Expression des Insulin-Gens beobachtet. 24 Stämme weisen eine Koexpression von zwei Reportergenen auf. In diesen Fällen wurde das Auftreten aller Kombinationen der vier Reporter-Gene beobachtet. Es wurden zwei rekombinante Stämme entdeckt, die eine Koexpression von drei Reportergenen zeigen: In Stamm RB4T-75 konnte eine Kombination von GFP, lacZ und Insulin, in Stamm RB4T-81 lacZ, Phytase und Insulin nachgewiesen werden.

Tabelle 1 zeigt eine Übersicht der Expression von vier Reporter-Genen in rekombinanten H. polymorpha Stämmen. 132 rekombinante Stämme wurden analysiert. Die Stämme, die eine Koexpression mehrerer Reporter Gene zeigen, sind grau unterlegt, Stämme mit der Koexpression von drei Genen durch Rahmung hervorgehoben (+ = starke Expression O = mittlere Expression - = schwache Expression).

Tabelle 1

Beispiel 17 Stabile Phytase-Produktion

Ein rekombinanter Stamm, der durch Transformation mit dem Vektor pB14 (FMD-Pro motor-kontrollierte Phytase-Produktion) erzeugt worden war, enthielt ca. 40 Kopien der rekombinanten DNA. Die mitotische Stabilität wurde über 100 Generationen Wachstum überprüft. Kulturaliquots zu Beginn der Stabilitätsuntersuchungen und nach 100 Genera tionen dienten zum Beimpfen von 3 ml Medium, das 2% Glyzerin als Kohlkenstoffquelle enthielt. Die sezemierte Phytase wurde nach 30stündiger Kultivierung quantifiziert. Die Konzentration wurde in beiden Fällen mit ca. 60 mg/l, bestimmt.

Literatur

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Integrationsvektor für die Expression von mindestens einem Protein in einem Wirtsorganismus, insbesondere in einem Pilz, welcher

umfaßt, wobei die Expressionskassette ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Promotorelement, einen für ein gewünschtes Protein kodierenden Bereich eines heterologen Genes und ein im Wirtsorganismus funktionsfähiges Terminatorelement umfaßt.

2. Integrationsvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirtsorga nismus eine methylotrophe Hefe ist.

3. Integrationsvektor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die methylotro phe Hefe der Gattung Hansenula angehört.

4. Integrationsvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die methylotro phe Hefe Hansenula polymorpha ist.

5. Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine rDNA-Sequenz aus einem Bereich der rDNA einer methylotrophen Hefe stammt, der ein 400 bp langes Fragment des 3'-Bereichs des 25S rDNA-Gens und ein 600 bp langes Fragment des 5'-Bereichs des 18S-rDNA-Gens sowie die dazwischen liegenden Sequenzen einschließlich der 5S-rDNA-Sequenz umfaßt.

6. Integrationsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die methylotro phe Hefe Hansenula polymorpha ist.

7. Integrationsvektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die methylotro phe Hefe Pichia pastoris ist.

8. Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine rDNA-Sequenz aus folgenden Sequenzen ausgewählt wird:

a) eine Sequenz nach SEQ ID NO 1;
b) ein Fragment der Sequenz nach a), das für die stabile Integration von Se quenzen des Vektors in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorga nismus, insbesondere einer Hefe geeignet ist;
c) eine Sequenz, die mit einer Sequenz nach a) oder b) zu mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90% identisch ist;
d) eine Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach a) oder b) hybridisiert;
e) ein durch Substitution, Addition, Inversion und/oder Deletion einer oder mehreren Basen erhaltenes Derivat einer Sequenz nach einer der Grup pen a) bis c), das für die stabile Integration von Sequenzen des Vektors in hoher Kopienzahl in das Genom eines Wirtsorganismus, insbesondere einer Hefe geeignet ist, und
f) eine komplementäre Sequenz zu einer Sequenz nach einer der Gruppen a) bis e).

9. Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß er ein zusätzliches Selektionsmarkergen für E. coli umfaßt.

10. Integrationsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einer Länge zwischen 7 und 12 Kb.

11. Wirtsorganismus, der mindestens einen Integrationsvektor nach einem der Ansprü che 1 bis 10 stabil im Genom integriert umfaßt.

12. Wirtsorganismus nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Hefe ist.

13. Wirtsorganismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe eine methylotrophe Hefe ist.

14. Wirtsorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die methylotro phe Hefe der Gattung Hansenula angehört.

15. Wirtsorganismus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die methylotro phe Hefe Hansenula polymorpha ist.

16. Wirtsorganismus, der durch stabile Integration von einem oder mehreren Integra tionsvektoren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 in das Genom einer Hefe erhält lich ist.

17. Wirtsorganismus nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß er durch Integra tion mehrerer Vektoren, die voneinander unterschiedliche Expressionkassetten um fassen, erhältlich ist.

18. Verfahren zur Herstellung von einem oder mehreren Proteinen, dadurch gekenn zeichnet, daß ein Wirtsorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 17 in an sich bekannter Weise kultiviert und das erzeugte Protein gewonnen wird.

19. Verwendung eines Integrationsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Her stellung von einem oder mehreren Proteinen in einem Wirtsorganismus, vorzugs weise in einer Hefe.

20. Verwendung eines Wirtsorganismus nach einem der Ansprüche 11 bis 17 zur Her stellung von einem oder mehreren Proteinen.