DE19962904A1 - Verfahren zum Transfer von Molekülen in Zellen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zum Transfer von Molekülen in Zellen und Vorrichtung zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Abstract
Ein Medium, in welchem sich Zellen und in diese Zellen zu transferierende Moleküle befinden, wird relativ zu einem Bereich, in dem akustische Pulse fukussiert sind, bewegt.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß Oberbegriff von Anspruch 1 und eine
Vorrichtung gemäß Oberbegriff von Anspruch 8.
Aus der noch nicht veröffentlichten deutschen Anmeldung 19834612.3-41 ist eine
Vorrichtung und ein Verfahren bekannt, bei welchem der intrazelluläre Transfer von
Oligonukleotiden unter dem Einfluss von Stoßwellen beschrieben ist. Bei der dort
beschriebenen Erfindung wird jeweils ein Probenbehälter mit den zu transferierenden
Molekülen und den Zielzellen in eine Art Wasserbad gesetzt und einer vorgegebenen Anzahl
von Stoßwellen ausgesetzt. Die Moleküle und die Zielzellen befinden sich in einem Medium,
welches Schallwellen leitet und in welchem die Vitalfunktionen der Zielzellen erhalten
bleiben.
Anschließend wird der Probenbehälter gewechselt. Dies hat den Nachteil, dass relativ
aufwendig die zu transferierenden Moleküle und die Zielzellen in den Probenbehälter und
dieser dann in das Wasserbad gebracht werden muss. Dies resultiert in einer mengenmäßigen
Begrenzung der mit Molekülen dotierten Zielzellen, was den bekannten Stand der Technik für
einen kommerziellen Einsatz etwa in der Pharmaindustrie ungeeignet macht.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zu schaffen, womit
Moleküle in Zielzellen transferiert werden können und dabei die Nachteile des Standes der
Technik überwunden werden und insbesondere eine rationelle mengenmäßig stark erhöhte
Produktion ermöglicht wird.
Diese Aufgabe wird erfüllt durch die kennzeichnenden Merkmale der jeweiligen
Hauptansprüche.
Die jeweiligen Unteransprüche betreffen Weiterbildungen und/oder besonders vorteilhafte
Ausgestaltungen der Erfindung.
Die Überlegungen, die zur Entstehung der Erfindung führten, gingen davon aus, dass es für
den Transfer der Moleküle in die Zielzellen unerheblich ist, wie groß die gesamte Menge des
Mediums ist, in dem sich die zu transferierenden Moleküle und Zielzellen befinden, sofern
jeweils Teile aus der Gesamtmenge nacheinander in den Wirkbereich der akustischen Pulsen
gelangen und so die darin enthaltenen Zielzellen einer Behandlung ausgesetzt werden.
Um ein im Verhältnis zum Wirkbereich der fokussierten akustischen Pulse großes Volumen
dieses Mediums zu behandeln, ist es erfindungsgemäß vorgesehen, dass zwischen der Quelle
der fokussierten akustischen Pulse und dem zu behandelnden Medium eine Relativbewegung
stattfindet, wodurch stets neue zuvor noch nicht mit fokussierten akustischen Pulsen
behandelte Bereiche des Mediums behandelt werden.
Diese Relativbewegung kann nun durch Bewegen der Quelle relativ zu einem feststehenden
Flüssigkeitsbehälter oder durch Bewegen des Flüssigkeitsbehälters relativ zu einer
feststehenden Quelle erfolgen.
Entsprechend kann sich erfindungsgemäß das Medium mit den Zielzellen und den zu
transferierenden Molekülen auch durch ein Leitungssystem bewegen, während es sich im
Einfluss der fokussierten akustischen Pulse befindet.
Generell muss eine der räumlichen Ausdehnung des Wirkbereiches der akustischen Pulse und
der Wiederholfrequenz der akustischen Pulse angepasste Relativgeschwindigkeit zwischen
dem Medium und der Quelle akustischer Pulse herrschen. Die Parameter müssen so
aufeinander abgestimmt sein, dass die Zielzellen bei ihrer Bewegung durch das
Leitungssystem mindestens der vorgegebenen Anzahl von Pulsen ausgesetzt sind.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines möglichen Ausführungsbeispiels näher
erläutert.
Die Fig. 1 zeigt ein mögliches Ausführungsbeispiel der Erfindung. Mittels einer im
wesentlichen hohlzylinderförmigen Quelle 1 werden akustische Pulse erzeugt, durch welche
eine rohrförmige Leitung 2 geführt ist. In dieser Leitung 2 befindet sich das Medium. Im
gezeichneten Fall handelt es sich um eine Flüssigkeit F, welche eine Viskosität aufweist, die
ein Fließen durch die Leitung 2 ermöglicht.
Die Quelle 1 ist so beschaffen, dass sie die akustischen Pulse in ihrem Inneren und somit in
dem Bereich, in welchem die Leitung 2 verläuft fokussiert. Der Fokus verläuft hierbei im
wesentlichen axial. Der Bereich des Fokus ist der sogenannte Wirkbereich der akustischen
Pulse daher wird im folgenden Fokusbereich genannt. Die Quelle 1 ist im gezeigten Beispiel
rotationssymetrisch zylindrisch gestaltet. Die Wandung der Leitung 2 ist zumindest im
Bereich des Fokus für akustische Pulse durchlässig. Zwischen der Quelle 1 und der Leitung 2
befindet sich ein geeignetes Koppelmedium, das die akustischen Pulse von der Quelle 1 auf
die Leitung 2 überträgt.
Als Erregungsprinzip für die akustischen Pulse ist es vorgesehen, eine Vielzahl von
Piezoelementen zu verwenden, die alle konzentrisch in Richtung der Rotationsachse gerichtet
sind und zeitgleich angeregt werden. Auf diese Weise ist es möglich einen langgestreckten
Fokusbereich zu erzeugen.
Auch ist es möglich die zylindrische Quelle anstatt aus einer Vielzahl von konzentrisch auf
die Rotationsache ausgerichteten Piezoelementen durch eine Vielzahl von
nebeneinanderliegenden Piezoringen realisieren, deren Mittelpunkt auf der Rotationsachse
liegen.
Ebenso ist es auch möglich als Aktoren zur Erzeugung der akustischen Pulse magnetostriktive
Elemente zu verwenden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht vor, die Quelle 1 als Hohlkörper mit
elliptischen Querschnitt oder auch mit halbkreisförmigem Querschnitt als einen mehr
rinnenförmigen Körper auszubilden. Bei diesen Ausführungsformen ergibt sich ein
Fokusbereich, der sich etwa über die Länge der Quelle erstreckt. Durch diesen
langgestreckten Fokusbereich verläuft die Leitung, in der sich die Flüssigkeit F befindet.
Die Ausführung einer Quelle 1 gemäß der Fig. 2 mit halbkreisförmigem Querschnitt bietet
den Vorteil, dass die Quelle von der Seite her leicht an eine Leitung angesetzt werden kann,
ohne die Leitung durch das Innere der Quelle verlegt werden muß.
Auch ist es möglich den Hohlkörper - unabhängig ob nun mit zylindrischem oder
elliptischem Querschnitt - teilbar auszugestalten und dann von beiden Seiten her um die
Leitung zu legen.
Eine weitere Möglichkeit zur Realisierung der Quelle besteht darin, dass die Quelle
konzentrisch um eine Brennlinie eines elliptisch geformten Hohlrohres ausgebildet ist und das
Rohr, welches das Medium führt konzentrisch um die andere Brennlinie angeordnet ist.
Auch ist es möglich, als Quelle der akustischen Pulse einen explodierenden Draht
einzusetzen, wobei dieser Draht entlang der Brennlinie eines elliptisch oder parbol geformten
Hohlrohres gespannt ist.
Ebenso kann für die Erregung auch eine Spule verwendet werden, die auf eine sich innerhalb
der Spule befindliche Membran einwirkt und so einen nach innen gerichteten akustischen Puls
erzeugt.
Durch die Quelle 1 werden akustische Pulse auf die Flüssigkeit F abgestrahlt und erzeugen
dort Bedingungen (Druck bzw. Unterdruck mit ausreichender Intensität, Kavitation), um
einen Transfer der Moleküle in die Zielzellen zu bewerkstelligen.
Es hat sich gezeigt, dass innerhalb weiter Druck bzw. Unterdruckbereiche ein Transfer der
Moleküle in die Zellen möglich wird. Die Druckbereiche liegen hierbei zwischen 10 Mpa und
150 Mpa. Die Unterdruckbereiche liegen bei -5 Mpa bis -50 Mpa. Die Intensität liegt
zwischen 0,5 mJ/mm2 und 5,0 mJ/mm2.
Durch eine aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht gezeichnete Pumpe kann die
Fließgeschwindigkeit Vf der Flüssigkeit F veränderbar sein.
Die Quelle 1 wird von einer Einheit 3 pulsförmig angeregt. Beim Durchströmen der Leitung 2
werden die Zielzellen und die zu transferierenden Moleküle einer vorbestimmten Anzahl von
akustischen Pulsen einer vorbestimmten Intensität ausgesetzt.
Ebenso ist es auch möglich, die Flüssigkeit F pulsierend oder auch getaktet durch die Leitung
2 fließen zu lassen. Hierbei wird die Flüssigkeit F immer so gefördert, dass jeweils der
Bereich, der gerade vor der Quelle 1 in der Leitung stand, so weit weitergefördert wird, dass
dieser dann etwa am Ende der Quelle 1 zu stehen kommt. Während sich der
Flüssigkeitsbereich innerhalb der Quelle 1 also im Fokus der akustischen Pulse befindet wird
eine vorgegebene Anzahl von akustischen Pulsen abgegeben, durch welche der Transfer von
Molekülen in die Zielzellen angeregt wird.
Die akustischen Pulse, die auf die Flüssigkeit oder allgemein formuliert auf das Medium
einwirken, können aus Ultraschall Bursts oder aus einer oder mehrerer aufeinanderfolgenden
Stoßwellen bestehen.
Es hat sich gezeigt, dass der Transfer der Moleküle in die Zellen von der Anzahl der
Ultraschall Bursts bzw. Stoßwellen abhängt. Bei einer höheren Anzahl von Ultraschall Bursts
bzw. Stoßwellen steigt die Transferrate. Ebenso nimmt die Zahl der durch die Behandlung
geschädigten Zellen mit der Anzahl der Ultraschall Bursts bzw. Stoßwellen zu.
Auch die Intensität (Masseinheit mJ/mm2) der Ultraschall Bursts bzw. Stoßwellen hat einen
Einfluß sowohl auf die Anzahl der intrazellulär transferierten Moleküle als auch auf die
Schädigung der Zellen. Mit steigender Intensität ergibt sich sowohl für die Anzahl der
intrazellulär transferierten Moleküle als auch der geschädigten Zelle eine Zunahme.
Beim Einsatz einer Ultraschallquelle ergibt sich noch eine weitere Möglichkeit. Die
Ultraschallquelle wird kontinuierlich betrieben (cw mode, continuous wave mode) und das zu
behandelnde Medium wird an der Ultraschallquelle vorbei transportiert, wodurch die
Moleküle und die Zielzellen nur kurzzeitig den Ultraschallschwingungen ausgesetzt sind.
Vorausgesetzt, mehrere kontinuierlich betriebene Ultraschallquellen sind entlang der vom
Medium durchströmten Leitung angeordnet, so ergibt sich eine "burstartige" Behandlung.
Analog zu der beschriebenen Bewegung des Mediums durch die Leitung ist es auch möglich,
die erfindungsgemäße Relativbewegung zwischen der Quelle akustischer Pulse und dem
Medium in welchem sich die Moleküle und die Zielzellen befinden durch eine Bewegung
eines Behälters, in dem sich das Medium befindet, zu realisieren. Die Quelle der akustischen
Pulse steht hierbei fest und der Behälter wird bewegt.
Der Behälter kann hierbei beliebig geformt sein, entscheidend ist jedoch, dass die Bewegung
des Behälters so erfolgt, dass nacheinander das gesamte Volumen des Behälters in den
Wirkbereich der akustischen Pulse gelangt ist.
Es ist bei hochviskosen Medien durchaus von Vorteil, das Medium in einen Behälter
abzufüllen und anschließend diesen Behälter zu bewegen, da bei hochviskosen Medien ein
Pumpen oftmals schwierig ist. Auch ist es möglich, den Behälter an einem sterilen Ort zu
befüllen und zu versiegeln und anschließend diesen Behälter in einem "Nichtsteril-Bereich"
mit den akustischen Impulsen zu behandeln.
Ebenso ist es auch möglich, den Behälter feststehend auszubilden und eine oder auch mehrere
Quellen akustischer Pulse so zu bewegen, dass nacheinander das gesamte Volumen des
Behälters in den Wirkbereich der akustischen Pulse gelangt.
Sämtliche Bewegungen von Medium relativ zur Quelle akustischer Pulse können
kontinuierlich oder auch getaktet ablaufen.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist es vorgesehen, die zu transferierenden Moleküle erst
unmittelbar vor dem Fokusbereich dem Medium zuzuführen, in welchem sich die Zielzellen
befinden.
Es hat sich gezeigt, dass der Transfer der Moleküle in die Zellen von der Anzahl der
Ultraschall Bursts bzw. Stoßwellen abhängt. Bei einer höheren Anzahl von Ultraschall Bursts
bzw. Stoßwellen steigt die Transferrate. Ebenso nimmt die Zahl der durch die Behandlung
geschädigten Zellen mit der Anzahl der Ultraschall Bursts bzw. Stoßwellen zu.
Auch die Intensität (Masseinheit mJ/mm2) der Ultraschall Bursts bzw. Stoßwellen hat einen
Einfluß sowohl auf die Anzahl der intrazellulär transferierten Moleküle als auch auf die
Schädigung der Zellen. Mit steigender Intensität ergibt sich sowohl für die Anzahl der
intrazellulär transferierten Moleküle als auch der geschädigten Zelle eine Zunahme.
Claims (21)
1. Verfahren zum Transfer von Molekülen in Zellen, wobei ein Medium, in dem sich die zu
transferierenden Moleküle und die Zielzellen befinden einer vorgegebenen Anzahl von
akustischen Pulsen ausgesetzt werden
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium (F), in dem sich die zu transferierenden Moleküle und die Zielzellen befinden
relativ zu dem Bereich bewegt wird, in welchem die akustischen Pulse einen vorgegebenen
Druck oder Unterdruck und/oder eine vorgegebene Intensität überschreiten.
2. Verfahren nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium in einem Behältnis eingeschlossen ist und das Behältnis relativ zu dem Bereich
bewegt wird, in welchem die akustischen Pulse einen vorgegebenen Druck oder Unterdruck
und/oder eine vorgegebene Intensität überschreiten.
3. Verfahren nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium (F), in dem sich die zu transferierenden Molekülen und die Zielzellen befinden
in einer Leitung transportiert wird und die Leitung durch den Bereich verläuft, in welchem die
akustischen Pulse einen vorgegebenen Druck oder Unterdruck und/oder eine vorgegebene
Intensität überschreiten.
4. Verfahren nach Anspruch 1
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium (F), in der sich die zu transferierenden Moleküle und die Zielzellen befinden
während der Zeit in der sie sich in dem Bereich befindet, in welchem die akustischen Pulse
einen vorgegebenen Druck oder Unterdruck und/oder eine vorgegebene Intensität
überschreiten einer vorgegebenen Anzahl von Pulsen ausgesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium (F) kontinuierlich durch die Leitung bewegt wird.
6. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium (F) getaktet bewegt wird.
7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
das Medium (F) fest steht und die Quelle (1) der akustischen Pulse bewegt wird.
8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Druck im Fokusbereich zwischen 10 Mpa und 150 Mpa liegt.
9. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Unterdruck im Fokusbereich zwischen 5 Mpa und 50 Mpa liegt.
10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Intensität der akustischen Pulse im Fokusbereich zwischen 0,5 mJ/mm2 und 5,0 mJ/mm2
liegt.
11. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
zwischen 5 und 250 akustische Pulse auf das Medium (F) abgegeben werden.
12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass
die zu transferierenden Moleküle erst unmittelbar vor dem Fokusbereich dem Medium (F)
geführt werden, in welchem sich die Zielzellen befinden.
13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, wobei ein Medium (F),
in dem sich die zu transferierenden Moleküle und die Zielzellen befinden im Fokusbereich
einer Quelle akustischer Pulse vorgegebenen Anzahl von fokussierten akustischen Pulsen
aussetzbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass
eine Vorrichtung vorgesehen ist, durch welche eine Relativbewegung zwischen dem Medium
(F) und dem Bereich, in welchem die akustischen Pulse einen vorgegebenen Druck oder
Unterdruck und/oder eine vorgegebene Intensität überschreiten ausgeführt wird.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13
dadurch gekennzeichnet, dass
eine Leitung vorgesehen ist, durch welche das Medium (F) transportierbar ist und die Leitung
durch den Fokusbereich der Quelle (1) akustischer Pulse geführt ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Quelle (1) akustischer Pulse als im wesentlichen hohlzylindrischer Körper ausgebildet ist
und der Fokusbereich entlang der Mittelachse des hohlzylindrischen Körpers verläuft.
16. Vorrichtung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass
die Quelle (1) akustischer Pulse als ein im wesentlichen rinnenförmiger Körper mit
halbkreisförmigen Querschnitt ausgebildet ist und der Fokusbereich entlang der Mittellinie
des Halbkreises verläuft.
17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 16
dadurch gekennzeichnet, dass
die Quelle (1) aus einer Vielzahl von Piezo Elementen besteht.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 17
dadurch gekennzeichnet, dass
die Quelle (1) aus einer Vielzahl von nebeneinanderliegenden Piezoringen besteht.
19. Vorrichtung nach Anspruch 13,
dadurch gekennzeichnet, dass
wobei die Quelle (1) konzentrisch um eine Brennlinie eines elliptisch geformten Hohlrohres
ausgebildet ist und die das Medium (F) führende Rohr konzentrisch um die andere Brennlinie
angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach Anspruch 19,
dadurch gekennzeichnet, dass
als Quelle (1) der akustischen Pulse ein explodierender Draht dient, der entlang der Brennlinie
gespannt ist.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 20,
dadurch gekennzeichnet, dass
ein Zugang zu der Leitung (2) vorgesehen ist, durch welchen die zu transferierenden
Moleküle dem Medium (F), in welchem sich die Zielzellen befinden, zuführbar sind.
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|---|---|---|---|
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