DE19962409A1 - DELTA6-Acetylenase und DELTA6-Desaturase aus Ceratodon purpureus - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von DNA Sequenzen codierend für DELTA6-Acetylenase/DELTA6-Desaturasen bzw. DELTA6-Desaturasen zur Herstellung eines transgenen Organismus bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikroorganismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit DELTA6-Dreifachbindungen und/oder DELTA6-Doppelbindungen. DOLLAR A Außerdem betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäuresequenz; eine Expressionskassette, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, einen Vektor und Organismen, enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz bzw. eine Expressionskassette. Außerdem betrifft die Erfindung ungesättigte Fettsäuren sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren sowie ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von DNA Sequenzen codierend für Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturasen bzw. Δ6-Desaturasen zur Herstellung eines transgenen Organismus, bevorzugt einer transgenen Pflanze oder eines transgenen Mikro­ organismus mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Dreifachbindungen und/oder Δ6-Doppelbindungen.

Außerdem betrifft die Erfindung eine isolierte Nukleinsäure­ sequenz; eine Expressionskassette enthaltend eine Nukleinesäure­ sequenz, einen Vektor und Organismen enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz bzw. eine Expressionskassette. Außerdem be­ trifft die Erfindung ungesättigte Fettsäuren sowie Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren und deren Verwendung.

Fettsäuren und Triglyceride haben eine Vielzahl von Anwendungen in der Lebensmittelindustrie, der Tierernährung, der Kosmetik und im Pharmabereich. Je nachdem ob es sich um freie gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren oder um Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren handelt, sind sie für die unterschiedlichsten Anwendungen geeignet, so werden beispielsweise mehrfach ungesättigte Fettsäuren Babynahrung zur Erhöhung des Nährwertes zugesetzt. Hauptsächlich werden die ver­ schiedenen Fettsäuren und Triglyceride aus Mikroorganismen wie Mortierella oder aus Öl-produzierenden Pflanzen wie Soja, Raps, Sonnenblume und weiteren gewonnen, wobei sie in der Regel in Form ihrer Triacylglyceride anfallen. Sie können aber auch aus Tieren wie Fischen gewonnen werden. Die freien Fettsäuren werden vor­ teilhaft durch Verseifung hergestellt.

Je nach Anwendungszweck sind Öle mit gesättigten oder ungesättig­ ten Fettsäuren bevorzugt, so sind z. B. in der humanen Ernährung Lipide mit ungesättigten Fettsäuren speziell mehrfach ungesättig­ ten Fettsäuren bevorzugt, da sie einen positiven Einfluß auf den Cholesterinspiegel im Blut und damit auf die Möglichkeit einer Herzerkrankung haben. Sie finden in verschiedenen diätischen Lebensmitteln oder Medikamenten Anwendung.

Aufgrund ihrer positiven Eigenschaften hat es in der Ver­ gangenheit nicht an Ansätzen gefehlt, Gene, die an der Synthese von Fettsäuren bzw. Triglyceriden beteiligt sind, für die Her­ stellung von Ölen in verschiedenen Organismen mit geändertem Gehalt an ungesättigten Fettsäuren verfügbar zu machen. So wird in WO 91/13972 und seinem US-Äquivalent eine Δ-9-Desaturase beschrieben. In WO 93/11245 wird eine Δ-15-Desaturase in WO 94/11516 wird eine Δ-12-Desaturase beansprucht. Δ-6-Desatura­ sen werden in WO 93/06712, US 5,614,393, WO 96/21022 und WO 99/27111 beschrieben. Weitere Desaturasen werden beispiels­ weise in EP-A-0 550 162, WO 94/18337, WO 97/30582, WO 97/21340, WO 95/18222, EP-A-0 794 250, Stukey et al., J. Biol. Chem., 265, 1990: 20144-20149, Wada et al., Nature 347, 1990: 200-203 oder Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659 beschrieben. In WO 96/13591 wird eine Δ-6-Palmitoyl-ACP-Desaturase beschrieben und beansprucht. Die biochemische Charakterisierung der ver­ schiedenen Desaturasen ist jedoch bisher nur unzureichend erfolgt, da die Enzyme als membrangebundene Proteine nur sehr schwer zu isolieren und charakterisieren sind (McKeon et al., Methods in Enzymol. 71, 1981: 12141-12147, Wang et al., Plant Physiol. Biochem., 26, 1988: 777-792).

In WO 97/37033 wird eine Δ-12-Acetylenase beschrieben. Durch dieses Enzym lassen sich ungesättigte C₁₈-Fettsäuren mit einer Dreifachbindung herstellen. Derartige Fettsäuren können neben der Anwendung in Nahrungsmittel aufgrund ihrer Reaktivität auch zur Herstellung von Polymeren verwendet werden. Sperling et al. be­ richtete auf einer Tagung (South Lake Tahoe, Canada, June 9-13, 1999) über die Klonierung eines Enzyms, das ebenfalls Dreifach­ bindungen in Fettsäuren einführt. Wobei sich die Substrate dieses Enzyms von denen der Δ-12-Acetylenase unterscheiden und die Drei­ fachbindung an anderer Position durch das Enzym in die Fettsäuren eingeführt wird.

In Hefen konnte sowohl eine Verschiebung des Fettsäurespektrums zu ungesättigten Fettsäuren hin als auch eine Steigerung der Produktivität nachgewiesen werden (siehe Huang et al., Lipids 34, 1999: 649-659, Napier et al., Biochem. J., Vol. 330, 1998: 611-614). Die Expression der verschiedenen Desaturasen in trans­ genen Pflanzen zeigte allerdings nicht den gewünschten Erfolg. Eine Verschiebung des Fettsäurespektrum zu ungesättigten Fett­ säuren hin konnte gezeigt werden, gleichzeitig zeigte sich aber, daß die Syntheseleistung der transgenen Pflanzen stark nachließ, das heißt gegenüber den Ausgangspflanzen konnten nur geringere Mengen an Ölen isoliert werden.

Nach wie vor besteht daher ein großer Bedarf an neuen Genen, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese ungesättigter Fettsäuren beteiligt sind und es ermöglichen, diese in einem technischen Maßstab herzustellen.

Es bestand daher die Aufgabe weitere Enzyme für die Synthese ungesättigter konjugierter Fettsäuren zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wurde durch eine isolierte Nukleinsäuresequenz gelöst, die für ein Polypeptid mit Δ-6-Acetylenase- und/oder Δ-6-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

• a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz,
• b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degenerier­ ten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz ab­ leiten,
• c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenzen codieren und mindestens 75% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß Mess die enzymatische Wirkung der Poly­ peptide wesentlich reduziert ist.

Unter Derivate(n) sind beispielsweise funktionelle Homologe der von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 kodierten Enzyme oder deren enzymatischer Aktivität, das heißt Enzyme, die dieselben enzymatischen Reaktionen wie die von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 kodierten Enzyme katalysieren, zu verstehen. Diese Gene ermöglichen ebenfalls eine vorteilhafte Herstellung von ungesättigten Fettsäuren mit Dreifachbindungen und/oder Doppelbindungen in Δ6-Position. Unter ungesättigten Fettsäuren sind im folgenden einfach oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren, die Dreifachbindungen und/oder Doppelbindungen aufweisen, zu verstehen. Die Dreifach- und/oder Doppel­ bindungen können konjugiert oder nicht konjugiert sein. Die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 genannten Sequenzen kodieren für ein neue Enzyme, die eine Acetylenase- und/oder Δ6-Desaturase-Aktivität aufweisen.

Das erfindungsgemäße Enzym Δ⁶-Acetylenase/Δ⁶-Desaturase führt vor­ teilhaft in Fettsäurereste von Glycerolipiden eine cis-Doppel­ bindung in Position C₆-C₇ ein und/oder konvertiert eine bereits vorhandene cis-Doppelbindung in Position C₆-C₇ in eine Dreifach­ bindung (siehe SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3). Das Enzym hat außerdem eine Δ6-Desaturase-Aktivität, die vorteilhaft in Fett­ säurereste von Glycerolipiden ausschließlich eine cis-Doppel­ bindung in Postion C₆-C₇ einführt. Diese Aktivität hat auch das Enzym mit der in SEQ ID NO: 11 genannten Sequenz. Bei dem es sich um eine monofunktionelle Δ6-Desaturase handelt.

Die erfindungsgemäße(n) Nukleinsäuresequenz(en) (für die Anmeldung soll der singular den plural umfassen und umgekehrt) oder Fragmente davon können vorteilhaft zur Isolierung weiterer genomischer Sequenzen über Homologiescreening verwendet werden.

Die genannten Derivate lassen sich beispielsweise aus anderen Organismen eukaryontischen Organismen wie Pflanzen wie speziell Moosen, Dinoflagellaten oder Pilze isolieren.

Weiterhin sind unter Derivaten bzw. funktionellen Derivaten der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 genannten Sequenzen beispielsweise Allelvarianten zu verstehen, die min­ destens 70% Homologie auf der abgeleiteten Aminosäureebene, vor­ teilhaft mindestens 75% Homologie, bevorzugt mindestens 80% Homologie, besonders bevorzugt mindestens 85% Homologie, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie aufweisen. Die Homologie wurde über den gesamten Aminosäurebereich berechnet. Es wurde das Programm PileUp, BESTFIT, GAP, TRANSLATE bzw. BACKTRANSLATE (= Bestandteil des Programmpaketes UWGCG, Wisconsin Package, Version 10.0-UNIX, January 1999, Genetics Computer Group, Inc., Deverux et al., Nucleic. Acid Res., 12, 1984: 387-395) verwendet (J. Mol. Evolution., 25, 351-360, 1987, Higgins et al., CABIOS, 5 1989: 151-153). Die von den genannten Nukleinsäuren abgeleitete Aminosäuresequenzen sind Sequenz SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 12 zu entnehmen. Unter Homologie ist Identität zu ver­ stehen, das heißt die Aminosäuresequenzen sind zu mindestens 70% identisch. Die erfindungsgemäßen Sequenzen sind auf Nukleinsäure­ ebene mindestens 65% Homolog, bevorzugt mindestens 70%, be­ sonders bevorzugt 75%, ganz besonders bevorzugt mindesten 80%.

Allelvarianten umfassen insbesondere funktionelle Varianten, die durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestell­ ten Sequenz erhältlich sind, wobei die enzymatische Aktivität der abgeleiteten synthetisierten Proteine erhalten bleibt.

Solche DNA-Sequenzen lassen sich ausgehend von den in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 beschriebenen DNA-Sequenzen oder Teilen dieser Sequenzen, beispielsweise mit üblichen Hybridisierungsverfahren oder der PCR-Technik aus anderen Eukaryonten wie beispielsweise den oben genannt isolieren. Diese DNA-Sequenzen hybridisieren unter Standard­ bedingungen mit den genannten Sequenzen. Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide beispielsweise der konser­ vierten Bereiche, die über Vergleiche mit anderen Acetylenase- und/oder Desaturasegenen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Vorteilhaft werden die Histidin-Box-Sequenzen verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die voll­ ständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen bei­ spielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca. 10°C niedriger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäu­ re Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Puffer­ lösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs­ bedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit ein­ er Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford. Uni­ versity Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Bio­ logy: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Weiterhin sind unter Derivaten Homologe der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 beispielsweise eukaryontische Homologe, verkürzte Sequenzen, Einzelstrang-DNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz oder RNA der codierenden und nichtcodierenden DNA-Sequenz zu verstehen.

Außerdem sind unter Homologen der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 Derivate wie beispielsweise Promotorvarianten zu verstehen. Diese Varianten können durch ein oder mehrere Nukleotidaustausche, durch Insertion(en) und/oder Deletion(en) verändert sein, ohne daß aber die Funktionalität bzw. Wirksamkeit der Promotoren beeinträchtigt sind. Des weiteren können die Promotoren durch Veränderung ihrer Sequenz in ihrer Wirksamkeit erhöht oder komplett durch wirksamere Promotoren auch artfremder Organismen ausgetauscht werden.

Unter Derivaten sind auch vorteilhaft Varianten zu verstehen, deren Nukleotidsequenz im Bereich -1 bis -2000 vor dem Startkodon so verändert wurden, daß die Genexpression und/oder die Protein­ expression verändert, bevorzugt erhöht wird. Weiterhin sind unter Derivaten auch Varianten zu verstehen, die am 3'-Ende verändert wurden.

Unter Derivaten sind auch die Antisense-DNAs zu verstehen, die zur Hemmung der Proteinbiosynthese der erfindungsgemäßen Proteine verwendet werden können. Diese Antisense-DNAs gehören zu den erfindungsgemäßen nichtfunktionellen Derivaten, wie Derivate, die keine enzymatische Aktivität aufweisen. Weitere dem Fachmann be­ kannte Methoden der Herstellung von nichtfunktionellen Derivaten sind die sogenannte Cosuppression, die Verwendung von Ribozymen und Introns. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribo­ nukleaseaktivität, die Einzelstrang Nukleinsäuren wie mRNA, zu denen sie eine Komplementarität aufweisen, schneiden können. Dadurch können mit Hilfe dieser Ribozyme (Haselhoff and Gerlach, Nature, 334, 1988: 585-591) mRNA-Transkripte katalytisch ges­ palten werden und so die Translation dieser mRNA unterdrückt werden. Derartige Ribozyme können speziell auf ihre Aufgaben hin zugeschnitten werden (US 4,987,071; US 5,116,742 und Bartel et al., Science 261, 1993: 1411-1418). Mit Hilfe der Antisense-DNA können dadurch Fettsäuren, Lipide oder Öle mit einem erhöhten Anteil an gesättigten Fettsäuren hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen, die für eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase und/oder Δ6-Desaturase kodieren, können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase und/oder Δ6-Desaturase-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthetische Nukleo­ tid-Sequenzen mit Codons erzeugt, die von den entsprechenden Wirtsorganismen beispielsweise Pflanzen bevorzugt werden. Dies führt in der Regel zu einer optimalen Expression der heterologen Gene. Diese von Pflanzen bevorzugten Codons können aus Codons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Ein Bei­ spiel für Corynebacterium glutamicum ist gegeben in: Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118. Die Durchführung solcher Experimente sind mit Hilfe von Standardmethoden durchführbar und sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für das Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gen kodieren, sind solche Derivate der erfindungsgemäßen Sequenzen, welche trotz abweichen­ der Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen, das heißt die enzymatische Aktivität der Proteine besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Codon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Gehaltes von Δ6-Dreifachbindungen oder Δ6-Doppelbindungen in Fettsäuren, Ölen oder Lipiden in der Pflanze durch Überexpression des Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Deasaturase-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber­ setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Mög­ liche Techniken zur in vitro-Evolution von DNA zur Veränderung bzw. Verbesserung der DNA-Sequenzen sind beschrieben bei Patten, P. A. et al., Current Opinion in Biotechnology 8, 724-733 (1997) oder bei Moore, J. C. et al., Journal of Molecular Biology 272, 336-347 (1997). Besonders geeignet sind codierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten werden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Polypeptid oder ein funktionell äqui­ valenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signalsequenz für das ER, das das Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.

Vorteilhaft können die Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- bzw. Δ6-Desaturase-Gene im erfindungsgemäßen Verfahren mit weiteren Genen der Fettsäurebiosynthese kombiniert werden. Beispiele für derartige Gene sind die Acetyltransferasen, weitere Desaturasen oder Elongasen. Für die in-vivo und speziell in-vitro Synthese ist die Kombination mit z. B. NADH-Cytochrom B5 Reduktasen vorteilhaft, die Reduktionsäquivalente aufnehmen oder abgeben können.

Unter den erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen sind Proteine zu verstehen, die eine in den Sequenzen SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 12 dargestellte Aminosäuresequenz oder eine daraus durch Substitution, Inversion, Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Aminosäureresten erhältliche Sequenz ent­ halten, wobei die enzymatische Aktivität des in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 12 dargestellten Proteins erhalten bleibt bzw. nicht wesentlich reduziert wird. Unter nicht wesent­ lich reduziert sind alle Enzyme zu verstehen, die noch mindestens 10%, bevorzugt 20%, besonders bevorzugt 30% der enzymatischen Aktivität des Ausgangsenzyms aufweisen. Dabei können beispiels­ weise bestimmte Aminosäuren durch solche mit ähnlichen physiko­ chemischen Eigenschaften (Raumerfüllung, Basizität, Hydrophobizi­ tät etc.) ersetzt werden. Beispielsweise werden Argininreste ge­ gen Lysinreste, Valinreste gegen Isoleucinreste oder Asparagin­ säurereste gegen Glutaminsäurereste ausgetauscht. Es können aber auch ein oder mehrere Aminosäuren in ihrer Reihenfolge ver­ tauscht, hinzugefügt oder entfernt werden, oder es können mehrere dieser Maßnahmen miteinander kombiniert werden.

Unter Derivaten sind auch funktionelle Äquivalente zu verstehen, die insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase codierende Sequenz beinhalten, welche weiterhin die gewünschte Funktion, das heißt deren enzymatische Aktivität nicht wesentlich reduziert ist, zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vor­ liegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der D6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase Nukleotid­ sequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen codierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnitt­ stellen sein.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt (= nicht wesentlich reduziert) oder verstärkt ist (= Enzymaktivität stärker als die Aktivität des Ausgangsenzym, das heißt Aktivität ist höher als 100%, bevorzugt höher als 110%, besonders bevorzugt höher als 130%).

Die Nukleinsäuresequenz kann dabei vorteilhaft beispielsweise eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine er­ findungsgemäßen Expressionskassette geeignete codierende Se­ quenzen sind beispielsweise solche, die für eine Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase und/oder Δ6-Desaturase mit den oben beschriebenen Sequenzen kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Über­ produktion von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Dreifach­ bindungen und/oder Doppelbindungen in Δ6-Position verleihen. Diese Sequenzen können homologen oder heterologen Ursprungs sein.

Unter der erfindungsgemäßen Expressionskassette (= Nukleinsäure­ konstrukt oder -fragment) sind die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 genannten Sequenzen, die sich als Ergebnis des genetischen Codes und/oder deren funktionellen oder nicht funktionellen Derivate zu verstehen, die mit einem oder mehreren Regulationssignalen vorteilhafterweise zur Erhöhung der Gen­ expression funktionell verknüpft wurden und welche die Expression der codierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Diese regu­ latorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, daß das Gen erst nach Induktion exprimiert und/oder überexprimiert wird, oder daß es sofort ex­ primiert und/oder überexprimiert wird. Beispielsweise handelt es sich bei diesen regulatorischen Sequenzen um Sequenzen an die Induktoren oder Repressoren binden und so die Expression der Nukleinsäure regulieren. Zusätzlich zu diesen neuen Regulations­ sequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so daß die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es wurden keine zusätzlichen Regulationssignale vor die Nukleinsäuresequenz oder dessen Deri­ vate inseriert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wurde nicht entfernt. Stattdessen wurde die natürliche Regu­ lationssequenz so mutiert, daß keine Regulation mehr erfolgt und/­ oder die Genexpression gesteigert wird. Diese veränderten Promo­ toren können in Form von Teilsequenzen (= Promotor mit Teilen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen) auch allein vor das natürliche Gen zur Steigerung der Aktivität gebracht werden. Das Genkonstrukt kann außerdem vorteilhafterweise auch eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die Δ6-Acetylenase-/Δ6-Desaturase und/oder Δ6-Desaturase-Gene können in einer oder mehreren Kopien in der Expressionskassette (= Genkonstrukt) enthalten sein.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei wie oben beschrieben vorzugsweise die Genexpression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Ver­ stärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem bei­ spielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Als Promotoren in der Expressionskassette sind grundsätzlich alle Promotoren geeignet, die die Expression von Fremdgenen in Orga­ nismen vorteilhaft in Pflanzen oder Pilzen steuern können. Vor­ zugsweise verwendet man insbesondere ein pflanzliche Promotoren oder Promotoren, die aus einem Pflanzenvirus entstammen. Vor­ teilhafte Regulationssequenzen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, lacI^q-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-P_R- oder im λ-P_L-Promotor enthalten, die vorteil­ hafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SPO2, in den Hefe- oder Pilz­ promotoren ADC1, MFα, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH oder in den Pflanzenpromotoren wie CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], SSU, OCS, lib4, STLS1, B33, nos (= Nopalin Synthase Promotor) oder im Ubiquitin-Promotor enthalten. Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Δ6-ACETYLENASE/Δ6-DESATURASE- und/oder Δ6-DESATURASE-Gens in den Organismen vorteilhaft in den Pflanzen zu einem bestimmten Zeit­ punkt gesteuert werden kann. Derartige vorteilhafte Pflanzen­ promotoren sind beispielsweise deer PRP1-Promotor [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366], ein durch Benzensulfonamid- induzierbarer (EP 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Abscisinsäure- induzierbarer (EP 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclo­ hexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor. Weitere Pflanzen­ promotoren sind beispielsweise der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel, der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245), der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nummer U87999) oder ein Nodien­ spezifischen Promotor wie in EP 249676 können vorteilhaft verwandt werden. Vorteilhaft sind insbesonders solche pflanz­ liche Promotoren, die die Expression in Geweben oder Pflanzen­ teilen/-organen sicherstellen, in denen die Fettsäurebiosynthese bzw. dessen Vorstufen stattfindet wie beispielsweise im Endosperm oder im sich entwickelnden Embryo. Insbesondere zu nennen sind vorteilhafte Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewährleisten wie beispielsweise der USP-Promotor oder Derivate davon, der LEB4-Promotor, der Phaseolin-Promotor oder der Napin- Promotor. Der besonders vorteilhafte USP-Promotor oder dessen Derivate vermitteln in der Samenentwicklung eine sehr früh Gen­ expression (Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67). Weitere vorteilhafte samenspezifische Promotoren, die für monokotyle und dikotyle Pflanzen verwendet werden können, sind die für Dikotyle geeignete Promotoren wie der Napingen- Promotor aus Raps (US 5,608,152), der Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (WO 98/45461), der Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), der Bce4-Promotor aus Brassica (WO 91/13980) oder der Leguminosen B4-Promotor (LeB4, Baeumlein et al., Plant J., 2, 2, 1992: 233-239) oder für Monokotyle geeignete Promotoren wie die Promotoren die Promotoren des lpt2- oder lpt1-Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230) oder die Promotoren des Gersten Hordein-Gens, des Reis Glutelin-Gens, des Reis Oryzin-Gens, des Reis Prolamin-Gens, des Weizen Gliadin- Gens, des Weizen Glutelin-Gens, des Mais Zein-Gens, des Hafer Glutelin-Gens, des Sorghum Kasirin-Gens oder des Roggen Secalin- Gens, die in WO 99/16890 beschrieben werden.

Weiterhin sind insbesondere solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen und Lipiden bzw. deren Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine samenspezifische Expression gewähr­ leisten. Zu nennen sind der Promotor des Napin-Gens aus Raps (US 5,608,152), des USP-Promotor aus Vicia faba (USP = unbekanntes Samenprotein, Baeumlein et al., Mol Gen Genet, 1991, 225 (3): 459-67), des Oleosin-Gens aus Arabidopsis (WO 98/45461), des Phaseolin-Promotors (US 5,504,200) oder der Promotor des Legumin B4-Gens (LeB4; Baeumlein et al., 1992, Plant Journal, 2 (2): 233-9). Weiterhin sind zu nennen Promotoren, wie der des lpt2 oder lpt1-Gens aus Gerste (WO 95/15389 und WO 95/23230), die in monokotylen Pflanzen samenspezifische Expression vermitteln.

In der Expressionskassette (= Genkonstrukt, Nukleinsäure­ konstrukt) können wie oben beschrieben noch weitere Gene, die in die Organismen eingebracht werden sollen, enthalten sein. Diese Gene können unter getrennter Regulation oder unter der gleichen Regulationsregion wie die Gene der Δ6-ACETYLENASE/Δ6-DESATURASE- und/oder Δ6-DESATURASE liegen. Bei diesen Genen handelt es sich beispielsweise um weitere Biosynthesegene vorteilhaft der Fettsäurebiosynthese, die eine gesteigerte Synthese ermög­ lichen. Beispielsweise seien die Gene für die Δ15-, Δ12-, Δ9-, Δ6-, Δ5-Desaturase, die verschiedenen Hydroxylasen, die Δ12-Acetylenase, die Acyl-ACP-Thioesterasen, β-Ketoacyl-ACP- Synthasen oder β-Ketoacyl-ACP-Reductasen genannt. Vorteilhaft werden die Desaturasegene im Nukleinsäurekonstrukt verwendet.

Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen wie die oben genannten für die erfindungs­ gemäße Expressionskassette und das erfindungsgemäße Verfahren, wie unten beschrieben, verwendet werden. Darüberhinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente (= erfindungsgemäße Nukleinsäuren) miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker ange­ setzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zum Wirtsorganismus beispielsweise zur Wirtspflanze sein. Die Ex­ pressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz, die für ein Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase und/oder Δ6-Desaturase-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminations­ bereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt­ stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrik­ tionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans­ versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, -primer- repair-, Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeig­ neten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, -chewing-back- oder Auffüllen von Überhängen für -bluntends-, können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Von Bedeutung für eine vorteilhafte hohe Expression kann u. a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natür­ licherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Poly­ adenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J.3 (1984), 835 ff) oder entsprechende funktionelle Äquivalente.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-DNA-Sequenz sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben werden.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein D6-Acetylenase/Desaturase-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminations­ bereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator- Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- oder Δ6-Desaturase-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Die DNA Sequenz codierend für eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase aus Ceratodon purpureus beinhaltet alle Sequenzmerkmale, die notwendig sind, um eine dem Ort der Fett­ säure-, Lipid- oder Ölbiosynthese korrekte Lokalisation zu erreichen. Daher sind keine weiteren Targetingsequenzen per se notwendig. Allerdings kann eine solche Lokalisation wünschenswert und vorteilhaft sein und daher künstlich verändert oder verstärkt werden, sodaß auch solche Fusionskonstrukte eine bevorzugte vor­ teilhafte Ausführungsform der Erfindung sind.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in Plastiden gewährleisten. Unter bestimmten Umständen kann auch ein Targeting in andere Kompartimente (referiert: Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423) z. B. in in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER), Peroxisomen, Lipidkörper oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen ein Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, wünschenswert sein.

Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäure­ sequenzen zusammen mit mindestens einem Reportergen in eine Expressionskassette kloniert, die in den Organismus über einen Vektor oder direkt in das Genom eingebracht wird. Dieses Reportergen sollte eine leichte Detektierbarkeit über einen wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenz­ assay oder über eine photometrische Messung ermöglichen. Bei­ spielhaft seien als Reportergene Antibiotika-oder Herbizi­ dresistenzgene, Hydrolasegene, Fluoreszenzproteingene, Bio­ lumineszenzgene, Zucker- oder Nukleotidstoffwechselgene oder Bio­ synthesegene wie das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das Luciferasegen, das β-Galactosidasegen, das gfp-Gen, das 2-Desoxyglucose-6- phosphat-Phosphatasegen, das β-Glucuronidase-Gen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotrans­ ferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz)-Gen genannt. Diese Gene ermöglichen eine leichte Meßbarkeit und Quantifizier­ barkeit der Transcriptionsaktivität und damit der Expression der Gene. Damit lassen sich Genomstellen identifizieren, die eine unterschiedliche Produktivität zeigen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressions­ kassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der codierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadeny­ lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Ele­ mente, welche mit der dazwischenliegenden codierenden Sequenz für die Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase und/oder Δ6-Desaturase DNA se­ quenz operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, codierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente der­ art, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der codierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokali­ sation in Plastiden. Aber auch Targeting-Sequenzen zur Gewähr­ leistung der subzellulären Lokalisation im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (= ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten sind bei Bedarf einsetzbar sowie Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak- Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den USP- oder Napin-Promotor), das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.

Die Expressionskassette wird zur Expression in einem prokaryon­ tischen oder eukaryontischen Wirtsorganismus beispielsweise einem Mikroorganismus wie einem Pilz oder einer Pflanze vorteilhafter­ weise in einen Vektor wie beispielsweise einem Plasmid, einem Phagen oder sonstiger DNA inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirtsorganismus ermöglicht. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR-Serie wie z. B. pBR322, pUC-Serie wie pUC18 oder pUC19, M113mp-Serie, pKC30, pRep4, pHS1, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN-III¹¹³-B1, λgt11 oder pBdCI, in Streptomyces pIJ101, pIJ364, pIJ702 oder pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Corynebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1, pIL2 oder pBB116, weitere vorteilhafte Pilzvektoren werden von Romanos, M. A. et al., [(1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8: 423-488] und von von den Hondel, C. A. M. J. J. et al. [(1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi] sowie in More Gene Manipulations in Fungi [J. W. Bennet & L. L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego] und in "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi" [von den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge] beschrieben. Vorteilhafte Hefe­ promotoren sind beispielsweise 2 µM, pAG-1, YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23. Beispiele für Algen- oder Pflanzenpromotoren sind pLGV23, pGHlac⁺, pBIN19, pAK2004, pVKH oder pDH51 (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988). Die oben genannten Vektoren oder Derivate der vorstehend genannten Vektoren stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam- New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Geeignete pflanzliche Vektoren werden unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 beschrieben. Vorteilhafte Vektoren sind sog. shuttle-Vektoren oder binäre Vektoren, die in E. coli und Agro­ bacterium replizieren.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fach­ mann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Expressionskassette auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus der Expressionskassette als Vektor oder den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen bestehen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform kann die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.

Sollen neben der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen mit einem Reportergen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen mit einem Reportergen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.

Der Vektor enthält vorteilhaft mindestens eine Kopie der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungs­ gemäßen Expressionskassette.

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Tabak-Transformationsvektor pBinAR eingebaut werden. Fig. 1 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-mit 35S-Promotor (C) bzw. pBin-USP mit dem USP-Promotor (D). Die Ausgangsvektoren sind in Fig. 1A) und B) dargestellt.

Alternativ kann ein rekombinanter Vektor (= Expressionsvektor) auch in-vitro transkribiert und translatiert werden, z. B. durch Nutzung des T7 Promotors und der T7 RNA Polymerase.

In Prokaryoten verwendete Expressionsvektoren nutzen häufig induzierbare Systeme mit und ohne Fusionsproteinen bzw. Fusions­ oligopeptiden, wobei diese Fusionen sowohl N-terminal als auch C-terminal oder anderen nutzbaren Domänen eines Proteins erfolgen können. Solche Fusionsvektoren dienen in der Regel dazu: i.) die Expressionsrate der RNA zu erhöhen ii.) die erzielbare Protein­ syntheserate zu erhöhen, iii.) die Löslichkeit des Proteins zu erhöhen, iv.) oder die Reinigung durch einen für die Affinitäts­ chromatographie nutzbare Bindesequenz zu vereinfachen. Häufig werden auch proteolytische Spaltstellen über Fusionsproteine eingeführt, was die Abspaltung eines Teils des Fusionsproteins auch der Reinigung ermöglicht. Solche Erkennungssequenzen für Proteasen erkennen sind z. B. Faktor Xa, Thrombin und Entero­ kinase.

Typische vorteilhafte Fusions- und Expressionsvektoren sind pGEX [Pharmacia Biotech Inc. Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A.

Weitere Beispiele für E. coli Expressionsvektoren sind pTrc [Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315] und pET Vektoren [Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89; Stratagene, Amsterdam, Niederlande].

Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES-Derivate (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in fila­ mentösen Pilzen sind beschrieben in: von den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressions­ vektoren genutzt werden z. B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z. B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).

Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzen­ zellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzen­ expressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cyto­ megalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in Organismen beispiels­ weise in Pflanzen kann prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular bio­ logy, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genann­ ten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen mit Agrobacterium tumefaciens wird beispielsweise von Höfgen und Willmitzer in Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 be­ schrieben oder ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38.

Mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Trans­ formation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, insbesondere von Ölhaltigen Kultur­ pflanzen, wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnenblume, Mais, Baum­ wolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne verwendet werden, z. B. indem ver­ wundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Als Organismen bzw. Wirtsorganismen für die erfindungsgemäße Nukleinsäure, die Expressionskassette oder den Vektor eignen sich prinzipiell vorteilhaft alle Organismen, die in der Lage sind Fettsäuren speziell ungesättigte Fettsäuren zu synthetisieren bzw. für die Expression rekombinanter Gene geeignet sind. Beispielhaft seien Pflanzen wie Arabidopsis, Asteraceae wie Calendula oder Kulturpflanzen wie Soja, Erdnuß, Rizinus, Sonnen­ blume, Mais, Baumwolle, Flachs, Raps, Kokosnuß, Ölpalme, Färber­ saflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikroorganismen wie Pilze beispielsweise die Gattung Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Cyanobakterien, Ciliaten, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevor­ zugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen synthetisieren können wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokosnuß, Öl­ palme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuß, Kakaobohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Calendula oder Saccharomyces cerevisiae. Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.

Nutzbare Wirtszellen sind weiterhin genannt in: Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Verwendbare Expressionsstämme z. B. solche, die eine geringere Proteaseaktivität aufweisen sind beschrieben in: Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen codierend für ein Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gen oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzenzellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Ziel der Verwendung ist die Erhöhung des Gehaltes an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit erhöhtem Gehalt an Dreifachbindungen und Doppelbindung in Δ6-Position.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression des Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gens spezifisch in den Blättern, in den Samen, den Knollen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche Fettsäuren, Öle oder Lipide mit Δ6-Dreifachbindungen oder Δ6-Doppelbindungen über­ produzierenden transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile, sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ein bevorzugter er­ findungsgemäßer Gegenstand sind transgene Pflanze enthaltend eine erfindungsgemäße funktionelle oder nicht funktionelle (= Antisense-DNA oder enzymatische inaktives Enzym) Nuklein­ säuresequenz oder eine funktionelle oder nicht funktionelle Expressionskassette.

Die Expressionskassette oder die erfindungsgemäßen Nuklein­ säuresequenzen enthaltend eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturasegensequenz kann darüber hinaus auch zur Transformation der oben beispielhaft genannten Organismen wie Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen, Ciliaten und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Fett­ säuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Dreifachbindungen oder Δ6-Doppelbindungen eingesetzt werden.

Erhöhung des Gehaltes von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Δ6-Dreifachbindungen oder Δ6-Doppelbindungen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielsweise die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung durch funktionelle tiberexpression des Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gens in den erfindungsgemäßen Organismen vor­ teilhaft in den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gegenüber den nicht gentechnisch modifizierten Ausgangspflanzen zumindest für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Der Biosyntheseort von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden beispiels­ weise ist im allgemeinen der Samen oder Zellschichten des Samens, so daß eine samenspezifische Expression des Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Biosynthese von Fettsäuren, Ölen oder Lipiden nicht auf das Samengewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in Epidermiszellen oder in den Knollen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des Transgens Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gens und deren Auswirkung auf die Fettsäure-, Öl- oder Lipidbiosyntheseleistung an Test­ pflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer Expressionskassette enthaltend eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gensequenz oder mit dieser hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Soja, Reis, Baum­ wolle, Zuckerrübe, Raps und Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies. Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.

Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung sind wie oben beschriebenen transgene Pflanzen, die eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder eine funktionelle oder nicht funktionelle erfindungsgemäße Expressionskassette enthalten. Unter nicht funktionell ist zu verstehen, daß kein enzymatisch aktives Protein mehr syn­ thetisiert wird. Außerdem ist unter nicht funktionellen Nuklein­ säuren oder Nukleinsäurekonstrukten auch eine sogenannte Anti­ sense-DNA zu verstehen, die zu transgenen Pflanzen führt, die eine Reduktion der enzymatischen Aktivität oder keine enzy­ matischen Aktivität aufweisen. Mit Hilfe der Antisense-Technik, speziell wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz mit anderen Fettsäuresynthesegene in der Antisense-DNA kombiniert wird, ist es möglich Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren bzw. gesättigte Fettsäuren zu synthetisieren. Unter transgenen Pflanzen sind einzelne Pflanzenzellen und deren Kulturen auf Festmedien oder in Flüssigkultur, Pflanzenteile und ganze Pflanzen zu verstehen.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:

• - Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-Gen­ sequenz oder mit dieser hybridisierende DNA'-Sequenzen in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.
• - Verwendung einer Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase- und/oder Δ6-Desaturase-DNA-Gensequenz oder mit dieser hybridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Fettsäuren, Ölen oder Lipiden mit Dreifach­ bindungen oder delta-6-Doppelbindungen durch Expression dieser D6-Acetylenase/Desaturase DNA-Sequenz in Pflanzen.
• - Protein enthaltend die in SEQ ID NO: 8 dargestellte Amino­ säuresequenz.
• - Protein enthaltend die in SEQ ID NO: 10 dargestellte Amino­ säuresequenz.
• - Verwendung der Proteine mit den Sequenzen SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 10 zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine oben beschriebene erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt in einen bevorzugt Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die im Öl enthaltenden Fettsäuren freisetzt. Diese ungesättigten Fettsäuren enthalten vorteilhaft Δ6-Dreifach- und/oder Δ6-Doppelbindungen. Die Fett­ säuren können aus den Ölen bzw. Lipiden beispielsweise über eine basische Hydrolyse z. B. mit NaOH oder KOH freigesetzt werden.

Auch ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man mindestens eine oben beschriebene erfindungs­ gemäße Nukleinsäuresequenz oder mindestens eine erfindungsgemäße Expressionskassette in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert, gehört zu den Erfindungsgegenständen.

Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand ist ein Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an unge­ sättigten Fettsäuren, indem man Triglyceride mit gesättigten oder ungesättigten oder gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit mindestens einem der Protein, das durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 oder SEQ ID NO: 11 kodiert wird, inkubiert. Vorteilhaft wird das Verfahren in Gegenwart von Verbindungen durchgeführt, die Reduktionsäquivalente aufnehmen oder abgeben können. Anschließend können die Fettsäuren aus den Triglyceriden freigesetzt werden.

Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäuren aus den Triglyceriden freigesetzt werden.

Die oben genannten Verfahren ermöglichen vorteilhaft die Synthese von Fettsäuren oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an Fettsäuren mit Δ6-Dreifach- und/oder Δ6-Doppelbindungen.

Mit Hilfe der sogenannten Antisense-Technologie können in einem Verfahren auch Fettsäuren oder Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an gesättigten Fettsäuren hergestellt werden.

Als Organismen für die genannten Verfahren seien beispielhaft Pflanzen wie Arabidopsis, Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Raps und Canola, Sonnen­ blume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Alfalfa, Erdnuß, Rizinus, Kokosnuß, Ölpalme, Färbersaflor (Carthamus tinctorius) oder Kakaobohne, Mikro­ organismen wie Pilze Mortierella, Saprolegnia oder Pythium, Bakterien wie die Gattung Escherichia, Cyanobakterien, Hefen wie die Gattung Saccharomyces, Algen oder Protozoen wie Dinoflagellaten wie Crypthecodinium genannt. Bevorzugt werden Organismen, die natürlicherweise Öle in größeren Mengen syn­ thetisieren können wie Mikroorganismen wie Pilze wie Mortierella alpina, Pythium insidiosum oder Pflanzen wie Soja, Raps, Kokos­ nuß, Ölpalme, Färbersaflor, Rizinus, Calendula, Erdnuß, Kakao­ bohne oder Sonnenblume oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae, besonders bevorzugt werden Soja, Raps, Sonnenblume, Carthamus oder Saccharomyces cerevisiae.

Die in den Verfahren verwendeten Organismen werden je nach Wirts­ organismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. ge­ züchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoffquelle meist in Form von organischen Stickstoff­ quellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spuren­ elemente wie Eisen-, Mangan-, Magnesiumsalze und gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0°C und 100°C, bevor­ zugt zwischen 10°C bis 60°C unter Sauerstoffbegasung angezogen. Dabei kann der pH der Nährflüssigkeit auf einen festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann batch weise, semi batch weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuier­ lich nach gefüttert werden.

Pflanzen werden nach Transformation zunächst wie oben beschrieben regeneriert und anschließend wie üblich angezüchtet bzw. ange­ baut.

Aus den Organismen werden nach Anzucht die Lipide in üblicher­ weise gewonnen. Hierzu können die Organismen nach Ernte zunächst aufgeschlossen werden oder direkt verwendet werden. Die Lipide werden vorteilhaft mit geeigneten Lösungsmitteln wie apolare Lösungsmittel wie Hexan oder Ethanol, Isopropanol oder Gemischen wie Hexan/Isopropanol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol bei Temperaturen zwischen 0°C bis 80°C, bevorzugt zwischen 20°C bis 50°C extrahiert. Die Biomasse wird in der Regel mit einem Über­ schuß an Lösungsmittel extrahiert beispielsweise einem Überschuß von Lösungsmittel zu Biomasse von 1 : 4. Das Lösungsmittel wird anschließend beispielsweise über eine Destillation entfernt. Die Extraktion kann auch mit superkritischem CO₂ erfolgen. Nach Extraktion kann die restliche Biomasse beispielsweise über Filtration entfernt werden.

Das so gewonnene Rohöl kann anschließend weiter aufgereinigt werden, beispielsweise in dem Trübungen über das Versetzen mit polaren Lösungsmittel wie Aceton oder Chloroform und anschließender Filtration oder Zentrifugation entfernt werden. Auch eine weitere Reinigung über Säulen ist möglich.

Zur Gewinnung der freien Fettsäuren aus den Triglyceriden werden diese in üblicherweise verseift.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind ungesättigte Fett­ säuren sowie Trigylceride mit einem erhöhten Gehalt an unge­ sättigten Fettsäuren, die nach den oben genannten Verfahren hergestellt wurden, sowie deren Verwendung zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tierfutter, Kosmetika oder Pharmazeutika. Hierzu werden diese den Nahrungsmitteln, dem Tierfutter, den Kosmetika oder Pharmazeutika in üblichen Mengen zugesetzt.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:

Beispiele Beispiel 1 Allgemeine Klonierungsverfahren

Die Klonierungsverfahren wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Ver­ knüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von Escherichia coli Zellen, Anzucht von Bakterien und die Sequenzanalyse rekombi­ nanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durch­ geführt.

Beispiel 2 Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Ketten­ reaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu expri­ mierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.

Beispiel 3 Erzeugung transgener Rapspflanzen (verändert nach Moloney et al., 1992, Plant Cell Reports, 8: 238-242)

Zur Erzeugung transgener Rapspflanzen wurden binäre Vektoren in Agrobacterium tumefaciens C58C1 : pGV2260 oder Escherichia coli genutzt (Deblaere et al. 1984, Nucl. Acids. Res. 13, 4777-4788). Zur Transformation von Rapspflanzen (Var. Drakkar, NPZ Nor­ deutsche Pflanzenzucht, Hohenlieth, Deutschland), wurde eine 1 : 50 Verdünnung einer Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie in Murashige-Skoog Medium (Murashige und Skoog 1962 Physiol. Plant. 15, 473) mit 3% Saccharose (3MS- Medium) benutzt. Petiolen oder Hypokotyledonen frisch gekeimter steriler Rapspflanzen (zu je ca. 1 cm²) wurden in einer Petri­ schale mit einer 1 : 50 Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgt eine 3-tägige Conkubation in Dunkelheit bei 25°C auf 3MS-Medium mit 0,8% Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 3 Tagen mit 16 Stunden Licht / 8 Stunden Dunkelheit weiter­ geführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 500 mg/l Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50 mg/l Kanamycin, 20 mikroM Benzylaminopurin (BAP) und 1,6 g/l Glukose weitergeführt. Wachsende Sprosse wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt. Bildeten sich nach drei Wochen keine Wurzeln, so wurde als Wachstums­ hormon 2-Indolbuttersäure zum Bewurzeln zum Medium gegeben.

Beispiel 4 Erzeugung transgener Arabidopsis thaliana Pflanzen

Die Transformation von Arabidopsis thaliana Var. Columbia Col 0 (Lehle Seeds, Round Rock, Texas, USA) erfolgte mittels Blüten­ infiltrationsmethode wie beschrieben bei: Bechtold, N., Ellis, J. and Pelletier, G. in Planta, Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences 316 (1993), 1194-119 oder mittels Wurzeltransformationsmethode.

Beispiel 5

Die Transformation von Maispflanzen erfolgte wie bei Pareddy, D., Petolino, J., Skokut, T., Hopkins, N., Miller, M., Welter, M., Smith, K., Clayton, D., Pescitelli, S., Gould, A., Maize Trans­ formation via Helium Blasting. Maydica. 42 (2): 143-154, 1997, beschrieben.

Beispiel 6 Isolierung und Klonierung der Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase und Δ6-Desaturase aus Ceratodon purpureus

Um DNA-Sequenzen aus Ceratodon purpureus zu isolieren, die für eine Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase und eine Δ6-Desaturase kodieren, wurden verschiedene degenerierte Oligonukleotidprimer von DNA- Sequenzen abgeleitet, die für Δ5- (EMBL Accession-Nr. Z81122) und Δ6-Fettsäure-Desaturasen (U79010, AJ222980, AF031477 kodieren:
Primer A: 5'-TGG TGG AA(A/G) TGG A(A/C)I CA(C/T) AA-3', forward Primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz WWKW(N/T/K)H(N/K)
Primer B: 5'-(T/G)GI TGG AA(A/G) (T/G)(G/A)I (A/C)AI CA(C/T) AA-3', forward Primer, abgeleitet von der Aminosäuresequenz (G/W)WK(E/D/W)(N/Q/K)H(N/K)
Primer C: 5'-AT (A/T/G/C)T(T/G) (A/T/G/C)GG (A/G)AA (A/T/G/C)A(A/G) (A/G)TG (A/G)TG -3', reverse primer, abge­ leitet von der Aminosäuresequenz (I/M)(H/Q/N)PF(L/F)HH

Mittels Polymerasekettenreaction (PCR) mit Einzelstrang-cDNA aus C. purpureus wurden mit Primer A und Primer C zwei DNA-Fragmente von 557 bp (Cer3) und 575 bp (Cer16) Länge und mit Primer B und Primer C ein DNA-Fragment von 560 bp (Cer1) Länge amplifiziert. Es wurde folgendes Programm für die Amplifizierung benutzt: 10 min bei 94°C, Pause für "hot start" bei 72°C, gefolgt von 32 Zyklen von 20 s bei 94°C, 1 min bei 45°C (Bindungstemperatur, T_m) und 1 min bei 72°C, 1 Zyklus von 10 min bei 72°C und Stop bei 4°C. Für die Amplifikation wurde die Taq-DNA-Polymerase (Gibco BRL) verwendet.

Die oben genannten doppelsträngigen DNA-Fragmente aus den zwei PCR-Amplifikationen wurden in den pGEM-T Vektor (Promega) legiert, in E. coli XLlblue MRF' Kan (Stratagene) transformiert und mit dem ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt) sequenziert. Die DNA- Teilsequenzen von Cer1 und Cer3 zeigten 70% Identität. Die oben genannten DNA-Teilsequenzen kodierten ohne Primer für offene Leserahmen bei Cer1 von 173 Aminosäuren (SEQ ID NO: 5 = Partielle Nukleotidsequenz ohne Primer von Cer1 und SEQ ID NO: 6 = Partielle deduzierte Aminosäuresequenz von Cer1), bei Cer 3 von 172 Aminosäuren (SEQ ID NO: 7 = Partielle Nukleotidsequenz ohne Primer von Cer3 und SEQ ID NO: 8 = Partielle deduzierte Amino­ säuresequenz von Cer3) und bei Cer16 von 178 Aminosäuren (SEQ ID NO: 9 = Partielle Nukleotidsequenz ohne Primer von Cer16 und SEQ ID NO: 10 = Partielle deduzierte Aminosäuresequenz von Cer16). Die abgeleitete Proteinsequenz von Cer1 wies 64% zu Cer3 und 28% identische Aminosäuren zu Cer16 auf; Cer 3 und Cer16 wiesen wiederum 27% identische Aminosäuren auf.

Die höchste Ähnlichkeit der Cer1- und Cer3-Proteine besteht zu der Δ6-Acyllipid-Desaturase aus Physcomitrella patens (Girke et al., Plant J., 15, 1998: 39-48), während Cer16 die höchste Ähnlichkeit zu der Δ6-Acyllipid-Desaturase und der Δ8-Sphingolipid-Desaturase aus höheren Pflanzen aufweist.

Eine gerichtete λZAP-cDNA-Bank von Ceratodon purpureus wurde von Fritz Thummler, Botanisches Institut der Universität München, zur Verfügung gestellt (Pasentsis et al., Plant J., 13, 1, 1998: 51-61). Es wurde ein PCR-Test dieser Ceratodon-Bank durch­ geführt, bei dem spezifische Primer von den oben genannten DNA- Teilsequenzen Cer1, Cer3 und Cer16 abgeleitet wurden:
Spezifische forward und reverse Primer:

Eine Restriktionsanalyse (Hind III bzw. EcoR V) der aus der cDNA- Bank mittels PCR amplifizierten Produkte zeigte in allen drei Fällen das gleiche Restriktionsmuster wie das der PCR-Amplifikate aus der ss-cDNA, d. h. die Ceratodon-cDNA-Bank enthält die drei Klone Cer1, Cer3 und Cer16.

Beispiel 7 cDNA-Bank Screening und Sequenzierung der "full length" Klone

DNA-Minipräparationen, der drei aus ss-cDNA amplifizierten PCR- Fragmente Cer1, Cer3, Cer16 von ~570 bp Länge in pGEM-T (siehe Beispiel 6) wurden für das weitere Screening der vollständigen Klone aus einer λ ZAP-cDNA-Bank von Ceratodon purpureus an M. Lee und S. Stymne abgegeben. Dieses cDNA-Bank-Screening führte bisher zu zwei vollständigen Klonen von Cer1 und Cer3 mit Inserts von ca. 2,2 kb, die als EcoR I/Kpn I-Fragmente aus dem λ ZAP- Vektor in die EcoR I/Kpn I-Schnittstellen des puc19-Vektors (New England Biolabs) subkloniert und in E. coli JM105 trans­ formiert wurden.

Ein weiteres Screening der cDNA-Bank mit Cer1 und Cer3 als Hybridisierungsproben unter niedriger Stringenz zeigte, daß mindestens ein weiterer Cer1-homologer Klon existiert, der evtl. für die Δ5-Desaturase kodieren könnte.

Zwei E. coli-Klone, Cer1-50 und Cer3-50, wurden vollständig sequenziert. Cer1-50 hat eine Länge von 2003 bp (SEQ ID NO: 1 = Nukleotidsequenz der Δ6-Acetylenase/Δ6-Desaturase aus Ceratodon purpureus mit 5'- und 3'-untranslatierten Regionen und polyA) und kodiert für ein offenes Leseraster von 483 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2 = deduzierte Aminosäuresequenz der Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase aus Ceratodon purpureus). Cer3-50 besitzt eine Länge von 2142 bp (SEQ ID NO: 11 = Nukleotidsequenz [2142 bp] der Δ6-Desaturase aus Ceratodon purpureus mit 5'- und 3'-untrans­ latierten Regionen) mit einen offenen Leserahmen von 520 Amino­ säuren (SEQ ID NO: 12 = deduzierte Aminosäuresequenz der Δ6-Desaturase aus Ceratodon purpureus). Beide Proteinsequenzen weisen N-terminal das hochkonservierte HPGG-Motiv des Cytochrom b₅ auf (Lederer F., Biochimie 76, 1994: 674-692) und C-terminal die für Desaturasen charakteristischen drei Histidin-Boxen auf (Shanklin et al., Biochemistry, 33, 1994: 12787-12794). Sie stellen somit weitere Mitglieder der wachsenden Familie der Cytochrom b₅-Fusionsproteine dar (Napier et al., Trends in PLant Science, 4, 1, 1999: 2-4). Das erste Histidin der dritten Box ist gegen Glutamin ausgetauscht, einem weiterem Charakteristikum von Δ5- und Δ6-Acyllipid-Desaturasen sowie Δ8-Sphingolipid- Desaturasen.

Beispiel 8 Klonierung der gesamten funktionellen aktiven Δ6-Acetylenase/Δ6- Desaturase- und Δ6-Desaturase-Sequenz mittels PCR und die Bereitstellung dieser Sequenz für die Klonierung in Vektoren sowie funktionelle Expression in Hefe

Es wurde eine cDNA hergestellt, die für Enzyme mit Δ6-Acetylen­ ase/Δ6-Desaturase-Aktivität aus Ceratodon purpureus codiert. Ana­ log zu dem hier beschriebenen Beispiel wurde die Δ6-Desaturase kloniert (siehe SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 12).

Hierzu wird zunächst anhand der Cer1-cDNA für die Δ6-Acetylenase/Desaturase aus Ceratodon purpureus die Oligonukleotide für eine Polymerase Kettenreakion (PCR) abgeleitet.

Die folgenden Primer wurden abgeleitet von Cer1 für die Expression in Hefe angepaßt:

In einer PCR Reaktion wird eine Δ6-Acetylenase/Desaturase cDNA aus Ceratodon purpureus als Matrize verwendet. Mithilfe der Primer wird eine BamHI-Restriktionsschnittstelle vor dem Start­ codon der Δ6-Acetylenase/Desaturase cDNA eingeführt. Für eine gerichtete Klonierung wird hinter das Stopcodon eine SalI- Restriktionsschnittstelle eingeführt. Die Reaktionsgemische enthielten ca. 1 ng/micro l Matrizen DNA, 0,5 microM der Oligo­ nukleotide und, 200 microM Desoxy-Nukleotide (Pharmacia), 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C, 1,5 mM MgCl₂) und 0,02 U/micro l Pwo Polymerase (Boehringer Mannheim) und werden in einer PCR-Maschine der Firma Perkin Elmer mit folgendem Temperatur­ programm inkubiert:

Anlagerungstemperatur:	50°C, 52 sec
Denaturierungstemperatur:	95°C, 52 sec
Elongationstemperatur:	72°C, 90 sec
Anzahl der Zyklen:	30

Das erhaltene Fragment von 1467 Basenpaaren wird in den mit EcoRV gespaltenen Vektor pBluescript SK- (Stratagene) ligiert. Durch Kontrollspaltung wird ein Klon identifiziert pBS-Cer1, dessen Insert durch BamHI/SalI in voller Länge exzisierbar ist (1452 Basenpaare plus 15 Nukleotide Restriktionsschnittstellen) und folgende Sequenz aufweist (das Start- und Stopcodon ist unter­ strichen, die Schnittstellen sind kursiv dargestellt). Analog kann auch eine cDNA Sequenz des Klones Cer50 genutzt werden. Dabei handelt es sich um eine monofunktionelle delta-6-Desaturase (siehe SEQ ID NO: 3). Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist SEQ ID NO: 4 zu entnehmen.

Zur Überprüfung der Funktionalität des codierten Enzyms in einem Mikroorganismus, wird das 1467 bp BamHI/SalI-Fragment aus pBS- Cer1 in den BamHI/XhoI geschnittenen Expressionsvector pYES2 (Invitrogen, Groningen, Niederlande) ligiert und Hefe nach Standardprotokollen mit dem neu entstandenen Plasmid pYES2-Cer1 transformiert (siehe Transformationsprotokoll Invitrogen, Groningen, Niederlande). Erhaltene Kolonien werden auf Raffinose­ haltigen Medium angezogen und mittels Galaktose die Genexpression der Δ6-Acetylenase/Desaturase induziert (siehe unten).

Beispiel 9 Lipidanalyse von transformierten Hefen

Hefen können neben den eigenen Fettsäuren (16 : 0, 16 : 1, 18 : 0 und 18 : 1) auch exogene Fettsäuren in ihre Membranlipide in­ korporieren. Um die Substratspezifität der jeweils exprimierten Desaturase zu testen, wird dem CM - 2% Raffinose-Medium zur Solubilisierung exogener Fettsäuren 1% Tergitol NP-40 (w/v, Sigma) und 0,003% der entsprechenden Fettsäure (Stammlösung: 0,3% bzw. 3% Fettsäure in 5% Tergitol NP-40, w/v) vor der Inokulation zugegeben. Die Vorkultur erfolgte durch Inokulation von 3 ml CM - 2% Raffinose-Medium/1% Tergitol NP-40 mit einer transgenen Hefekolonie und anschließender Inkubation für 2 d bei 30°C im Roller bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm (OD₆₀₀) von 4,0 bis 4,3. Für die Hauptkultur werden 10 ml CM - 2% Raffinose/1% Tergitol NP-40-Medium ± 0,003% Fettsäure mit einem Aliquot der Vorkultur (200 fache Verdünnung) ad OD₆₀₀ 0,02 angeimpft und 24 h bei 30°C, 250 rpm im Schüttler inkubiert. Die Induktion der Testkulturen erfolgte in der logarithmischen Wachs­ tumsphase (OD₆₀₀ 0,5 bis 0,6) durch Zugabe von Galaktose ad 1,8%. Die Ernte der induzierten Zellen erfolgte nach weiteren 24 h aeroben Wachstums bei 30°C bei einer OD₆₀₀ von 4,0 bis 4,3.

Die induzierten Hefezellen werden durch 10 min Zentrifugation bei 2000 g geerntet, in 3 ml Aqua dest. resuspendiert, 10 min bei 100°C abgekocht und nach dem Abkühlen auf Eis erneut sedimentiert. Das Zellsediment wird mit 1 N methanolischer Schwefelsäure und 2% Dimethoxypropan 1 h bei 90°C hydrolysiert und die Lipide trans­ methyliert. Die resultierenden Fettsäuremethylester (FAME) werden in Petrolether extrahiert. Die extrahierten FAME werden durch Gasflüssigkeitschromatographie mit einer Kapillarsäule (Chrom­ pack, WCOT Fused Silica, CP-Wax-52 CB, 25 m, 0,32 mm) und einem Temperaturgradienten von 170°C auf 240°C in 20 min und 5 min bei 240°C analysiert. Die Identität der Mono-, Di-, Tri- und Tetraen­ säuremethylester wird durch Vergleich mit entsprechenden FAME- Standards (Sigma) bestätigt. Für die Tri- und Tetraynsäuren sind keine Referenzsubstanzen erhältlich. Ihre Identität und die Position der Dreifachbindung wird durch geeignete chemische Derivatisierung der FAME-Gemische z. B. zu 4,4-Dimethoxyoxazolin- Derivaten (Christie, 1998) mittels GC-MS von analysiert. Die GC- Analysen der Fettsäuremethylester aus den transgenen Hefen, die mit dem Leervektor pYES2, mit pYES2-Cer1 (Δ6-Acetylenase) transformiert werden, ist in Tab. 1 dargestellt. Die transgenen Hefezellen werden ohne exogenen Fettsäuren oder nach Zugabe von Linolsäure (18 : 2), γ-Linolensäure (γ-18 : 3), α-Linolensäure (α-18 : 3) oder ω3-Octadecatetraensäure (18 : 4) analysiert.

Tabelle 1 gibt die GC-Analysen der Fettsäuremethylester aus transgenen Hefen, die mit dem Leervektor pYES2, der Δ6-Acetylenase (Cer1/pYES2) und der Δ6-Desaturase (Cer3/pYES2) transformiert wurden, wieder. Die transgenen Hefezellen wurden ohne exogenen Fettsäuren (-) oder nach Zugabe von Linol­ säure (18 : 2), γ-Linolensäure (γ-18 : 3), α-Linolensäure (α-18 : 3) oder ω3-Octadecatetraensäure (18 : 4) analysiert. Fettsäure­ zusammensetzung in [mol %] der Gesamtfettsäuren, wobei die Inkorporation der gefütterten Fettsäuren (schwarzer Fettdruck), die Desaturierungsprodukte (in roter Farbe) und die Summe der Desaturierungsprodukte (letzte Zeile) bei den einzelnen Fütterungsversuchen angegeben sind.

Beispiel 10 Erzeugung transgener Pflanzen, welche ein Enzym mit D6-Acetylenase/Desaturase-Aktivität überexprimieren

Für die Transformation von Pflanzen wird ein Transformations­ vektor erzeugt, der das BamHI/SalI-Fragment aus pBS-Cer1 in den mit BamHl/Sall gespaltenen Vektor pBin-USP oder in pBinAR ligiert wird. pBin-USP und pBinAR sind Derivate des Plasmides pBin19. pBinAR entstand aus pBin19, indem in pBin19 (Bevan et al. (1980) Nucl. Acids Res. 12, 8711) ein 35S CaMV Promotor als EcoRI-KpnI- Fragment (entsprechend den Nukleotiden 6909-7437 des Cauliflower- Mosaik-Virus (Franck et al. (1980) Cell 21, 285) inseriert wird. Das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3, 835), Nukleotide 11749-11939 wird als PvuII-HindIII-Fragment isoliert und nach Addition von SphI-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SpHI-HindIII Schnittstelle des Vektors kloniert. Es entstand das Plasmid pBinAR (Höfgen und Willmitzer (1990) Plant Science 66, 221-230), wobei durch Umklonierung aus pBluescript mehrere Restriktionschnittstellen zwischen Promotor und Terminator zur Verfügung stehen. Der USP-Promotor entspricht den Nukleotiden 1-684 (Genbank Accession X56240), wobei ein Teil der nicht- codierenden Region des USP-Gens im Promotor enthalten ist. Das 684 Basenpaar große Promotorfragment wurde mittels käuflichen T7-Standardprimer (Stratagene) und mit Hilfe eines synthetisier­ ten Primers über eine PCR-Reaktion nach Standardmethoden ampli­ fiziert. (Primersequenz:
5'-GTCGACCCGCGGACTAGTGGGCCCTCTAGACCCGGGGGATCCGGATCTGCTGGCTATGAA-3'). Das PCR-Fragment wurde mit EcoRI/SalI nachgeschnitten und in den Vektor pBinAR eingesetzt. Es entsteht das Plasmid mit der Bezeichnung pBinUSP.

Das Konstrukt wird zur Transformation von Arabidopsis thaliana und Rapspflanzen eingesetzt.

Regenerierte Sprosse werden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten, nach Bewurzelung in Erde überführt und nach Kultivierung für zwei Wochen in einer Klimakammer oder im Gewächshaus angezogen, zur Blüte gebracht, reife Samen geerntet und auf D6-Acetylenase/Desaturase-Expression mittels Lipid­ analysen untersucht. Linien mit erhöhten Gehalten an Acetylen­ fettsäuren oder Doppelbindungen an der delta-6-position werden identifiziert. Es läßt sich in den stabil transformierten trans­ genen Linien, die das Transgen funktionell exprimieren, ein erhöhter Gehalt von Acetylenfettsäuren und Doppelbindungen an der delta-6-position im Vergleich zu untransformierten Kontroll­ pflanzen feststellen.

Beispiel 11 Lipidextraktion aus Samen

Die Analyse von Lipiden aus Pflanzensamen verläuft analog der Analyse von Hefelipiden. Jedoch wird Pflanzenmaterial zunächst mechanisch durch Mörsern homogenisiert, um es einer Extraktion zugänglich zu machen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (23)

1. Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein Polypeptid mit Δ6-Acetylenase- und/oder Δ-6-Desaturaseaktivität codiert, ausgewählt aus der Gruppe:

• a) einer Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Sequenz,
• b) Nukleinsäuresequenzen, die sich als Ergebnis des degene­ rierten genetischen Codes von der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nuklein­ säuresequenz ableiten,
• c) Derivate der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellten Nukleinsäuresequenz, die für Polypeptide mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Amino­ säuresequenzen codieren und mindestens 75% Homologie auf Aminosäureebene aufweisen, ohne daß die enzymatische Wirkung der Polypeptide wesentlich reduziert ist.

2. Aminosäuresequenz codiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1.

3. Aminosäuresequenz nach Anspruch 2, codiert durch die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 11 dargestellte Sequenz.

4. Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einem oder mehreren Regulationssignalen verknüpft ist.

5. Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4.

6. Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz ge­ mäß Anspruch 1 oder mindestens ein Expressionskassette gemäß Anspruch 4 oder mindestens einen Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Organismus nach Anspruch 6, wobei es sich bei dem Organismus um eine Pflanze, einen Mikroorganismus oder ein Tier handelt.

8. Transgene Pflanze enthaltend eine funktionelle oder nicht funktionelle Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine funktionelle oder nicht funktionelle Expressionskassette gemäß Anspruch 4.

9. Verfahren zur Herstellung von ungesättigten Fettsäuren dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäure­ sequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens eine Expressions­ kassette gemäß Anspruch 4 in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus enthaltene Öl isoliert und die im Öl enthaltenden Fettsäuren freisetzt.

10. Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder mindestens eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4 in einen Öl produzierenden Organismus bringt, diesen Organismus anzieht und daß in dem Organismus ent­ haltene Öl isoliert.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die ungesättigten Fettsäuren einen erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren mit einer Dreifachbindung oder mit einer Doppelbindung in Δ-6-Position oder einer Dreifach­ bindung und Doppelbindung in Δ-6-Position aufweisen.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 9 bis 11, dadurch gekennzeich­ net, daß es sich bei dem Organismus um eine Pflanze oder einen Mikroorganismus handelt.

13. Protein enthaltend die in SEQ ID NO: 8 dargestellte Amino­ säuresequenz.

14. Protein enthaltend die in SEQ ID NO: 10 dargestellte Amino­ säuresequenz.

15. Verwendung von Proteinen nach Anspruch 13 oder 14 zur Her­ stellung von ungesättigten Fettsäuren.

16. Verfahren zur Herstellung von Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fettsäuren, indem man Triglyceride mit gesättigten oder ungesättigten oder ge­ sättigten und ungesättigten Fettsäuren mit mindestens einem der Proteine gemäß Anspruch 2, 13 oder 14 inkubiert.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Triglyceride in Gegenwart einer Verbindung hergestellt wer­ den, die Reduktionsäquivalente aufnehmen oder abgeben können.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäuren aus den Triglyceriden freigesetzt werden.

19. Ungesättigte Fettsäuren hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 18.

20. Triglyceride mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten Fett­ säuren hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 10, 16 oder 17.

21. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Expressionskassette gemäß Anspruch 4 zur Herstellung von transgenen Pflanzen.

22. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 oder eines Fragmentes davon zur Isolierung einer genomischen Sequenz über Homologiescreening.

23. Verwendung von ungesättigten Fettsäuren gemäß Anspruch 19 oder Triglyceriden mit einem erhöhten Gehalt an ungesättigten gemäß Anspruch 20 zur Herstellung von Nahrungsmitteln, Tier­ futter, Kosmetika oder Pharmazeutika.