DE19951154A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Probeneigenschaften über zeitaufgelöste Lumineszenz - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezeichnet ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Probeneigenschaften (Fluoreszenzlebensdauer oder Diffusionszeit) über zeitaufgelöste Lumineszenz, bei welcher als spezieller Detektor ein elektrisch moduliertes photonisches Mischelement (PMD) zur Analyse der emittierten elektromagnetischen Welle verwendet und aus den beiden Meßgrößen des PMD die Intensität und Lebensdauer der emittierten Strahlung berechnet wird.

Description

Die Erfindung bezeichnet ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von Probeneigenschaften über zeitaufgelöste Lumineszenz (Phosphoreszenz, Fluoreszenz), insbesondere im Bereich der biologi­ schen und physiko-chemischen Fluoreszenzanalytik und Fluoreszenzkor­ relationsspektroskopie (FCS).

Ein Großteil chemischer, biochemischer und biologischen Verbindungen aber auch lebende Systeme emittieren Licht infolge von Bestrahlung. Lumineszenzemission dieser Art beinhaltet Phosphoreszenz und Fluoreszenz. Die Photonenemission fällt exponential nach einer Anregung mit einer charakteristischen Zeit ab. Der Abfall auf 1/e bezogen auf das Maximum nennt man Fluoreszenzlebensdauer und im Falle der Phosphoreszenz heißt sie Phosphoreszenzlebensdauer. Im nachhinein soll anhand der Fluoreszenz der Hintergrund der Erfindung und der Stand dargestellt werden. Diese bezieht sich dabei analog auf die Phosphoreszenz.

Die Fluoreszenz hängt stark von der unmittelbaren Umgebung des Fluorophores (dem fluoreszierenden Farbstoff) ab. Änderungen dieser, z. B. infolge einer Reaktion, bewirkt nicht nur eine Intensitätsände­ rung des Fluoreszenz sondern auch eine Veränderung der Fluoreszenz­ lebensdauer. Des weiteren ist bei vielen Experimenten die genaue Konzentration der Fluorophore im Beobachtungsvolumen nicht bekannt. So daß aus der bloßen Intensitätsänderung nicht zwischen einer qualitativen oder einer quantitativen Veränderung unterschieden werden kann, ob z. B. die Reaktion stattgefunden hat oder der Fluoreszenzfarbstoff sich zersetzt hat. In der Fluoreszenzanalytik verzichtet man zweckmäßigerweise auf ratiometrische Verfahren und mißt die Fluoreszenzlebensdauer.

Derartige Verfahren und Vorrichtungen sind aus der IPC (Internatio­ nale Patentklassifikation) unter G01N und C09K vorbekannt. Eine fluoreszierende Probe wird von einer modulierten Lichtquelle (gepulst oder sinusförmig) oder im Falle der FCS mit gleichmäßiger Intensität geeigneter Frequenz angeregt und die erzeugte Lumineszenzemission registriert. Vorher kann die Emission spektral aufgetrennt oder in einem Intensifier, Multichannelplate (MCP)ect. verstärkt oder moduliert worden sein.

Die Verfahren unterteilen sich grob in time-domain oder frequency­ domain Methoden. Bei den time-domain Methoden wie der zeitkorrelier­ ten Einzelphotonzählung (TCSPC) finden ultrakurze Lichtimpulse Verwendung. Durch die endliche Länge des Anregungsimpulses und die Trägheit der Detektion tritt die Fluoreszenzemission gefaltet in Erscheinung und bedarf der computerunterstützen Entfaltung, um die Fluoreszenzlebensdauer exakt zu bestimmen. Bei den frequencydomain Methoden wird die Probe mit intensitätsmodulierten Licht angeregt. Das Fluoreszenzlicht hat dieselbe Frequenz, ist aber demoduliert. Die Modulationstiefe verringert sich und die Phase verschiebt sich aufgrund der endlichen Lebensdauer der Fluoreszenz. Man kann das Anregungslicht auch multifrequent modulieren. Zur Analyse und die Bestimmung der Fluoreszenzlebensdauer aus diesen Phasen- bzw. Modul­ ationstiefenshift wird auf LAKOWICZ: "Prinziples of Fluorescence Spectroskopy", Plenum Press, New York, verwiesen. Vorteil dieser Phasenfluorometrie ist, daß keine ultrakurzen Lichtimpulse gebraucht werden und keine aufwendige Entfaltung berechnet werden muß. Aller­ dings muß man in der Lage sein, daß Anregungslicht zwischen 10 und 1000 MHz und mehr zu modulieren. Die meisten kommerziellen Geräte arbeiten auf dem Prinzip der Kreuzkorrelation wozu auf SPENCER, WEBER: äMeasurement of Sub-nanosecond Fluorescence Lifetime with Cross-Correlation Phase Fluorometer" Ann. New York Acad. Sci. (1969), p. 361 verwiesen wird. Nachteilig sind die dazu erforderli­ chen aufwendigen und kostenintensiven Detektoren, bestehend aus ultraschnellen Schaltungen und Photodioden. Die Fluorescence Corre­ lations Spectroscopy (FCS)als Methode und in Anwendungen wird verwiesen auf RIEGLER R. "Fluorescence correlations, single molecule detection and large number screening. Applications in biotechnology." J Biotechnol. 1995 Jul 31; 41(2-3): 177-86.

Die Technik vereinfacht sich, wenn man die Phosphoreszenz nutzt, da hier das Anregungslicht mitunter nur noch im kHz-Bereich moduliert werden muß. In letzter Zeit gibt es Arbeiten, die Phosphoreszenz und Fluoreszenzemission miteinander mischen, um die empfindlichere Fluoreszenzlebensdaueränderung über die Phosphoreszenz mit einer weniger aufwendigen und damit kostengünstigeren Technologie zu bestimmen. Eine derartige Methode unter Anwendung der Phasenmodula­ tionstechnik mit Frequenzen im kHz-Bereich wird in der Druckschrift WO 9906821 beschrieben, wodurch die sonst aufwendige Messung von Abklingzeiten im unteren Nanosekundenbereich, welche instrumentell sehr aufwendig und damit kostenintensiv ist, entfällt. Nachteilig ist, daß mit Hilfe von Phasenmodulationstechniken bei Frequenzen im kHz-Bereich bei dieser Art von Sensoren immer nur eine mittlere Phasenverschiebung ermittelt werden kann. Ein Aufsplitten in beide Abklingzeitkomponenten ist zwar prinzipiell möglich, durch die benötigten hohen Frequenzen aber messtechnisch aufwendig.

um zweidimensionale Fluoreszenzlebensdauerverteilungen (fluorescence lifetime imageing) zu messen, werden bisher Lösungen auf CCD-Kamera Basis beschrieben. (T. French et al "Fluorescence lifetime imaging techniques for microscopy" Methods in Cell Biology Vol 56 1998, 277-309) Die Auslesezeit einer CCD ist langsam (zeilenweises Ausle­ sen der am Pixel generierten Ladungen zu einem Verstärker) und daher gibt es FLI-Lösungen vor allem z. B. für die sehr langlebige Phosphoreszenz. Das CCD-Pixel kann keine Phase direkt messen, sondern nur die Amplitude und damit die Veränderung der Modulations­ tiefe. Dazu wird der Auslesetakt einer ganzen Zeile mit der Modula­ tion der Anregung gekoppelt. Man erhält sozusagen, zwei Bilder eines vom Maximum und eines vom Minimum. Aus der Veränderung des Kontras­ tes kann man im Nachhinein die Lumineszenzlebensdauer berechnen. Die Phasenverschiebung kann nur bestimmt werden, wenn die Fluoreszenzmo­ dulation über abschnittseises Messen der Intensität (Amplitude) verfolgt wird. Das kann mit einer zusätzlichen Frequenzmodulation - in der Regel moduliert man den Bildverstärker - erreicht werden. Damit ist die CCD sehr langsam und keine Echtzeitmessung der Korre­ lation. Nachteilig ist auch, daß die Intensitätsmessung immer nur sehr kurz erfolgt, was ein schlechtes Signal/Rauschverhältnis bewirkt und eine aufwendige und teure Bildverstärkung benötigt oder entsprechend intensive Lumineszenzereignisse nur detektierbar sind.

Die fehlende Eignung der CCD-Arrays zur Bestimmung einer Korrelationsfunktion mit einem Modulationssignal in Echtzeit ist durch die prinzipiell damit verbundene wesentliche Frequenzbeschrän­ kung bei der Verwendung von CCD-Arrays für die FLI nachteilig. Die technisch mögliche Frequenzbandbreite des CCD-Arrays, welche ansons­ ten nutzbar ist, kann daher zur zeitaufgelösten Lumineszenz nicht ausgeschöpft werden.

Weiterhin ist aus der Druckschrift WO 9810255 ein komplexes photoni­ sches Mischelement (PMD) vorbekannt, welches durch eine von Außen modulierte Ladungsschaukel in der Lage ist, Amplitude und Phase einer elektromagnetischen Welle zu ermitteln, um damit in einfacher und kostengünstiger Weise einen 3d-Scann durchführen zu können. Das Photoelement am PMD ist zweigeteilt, beide Teile werden über die Ladungsschaukel direkt korreliert mit der elektrisch am PMD angeleg­ ten Modulation der elektromagnetischen Welle.

Beim PMD handelt sich um ein elektrooptisches Mischelement. Der PMD ist ein in Standard CMOS Technologie hochintegrierbare OE-ASIC, welcher zusätzlich zur Detektion auch die Mischung eines einfallen­ den Lichtsignals mit einer elektronischen Referenz on-chip ermög­ licht und ist damit physikalisch und technologisch nicht mit der CCD-Technik verwandt. Das Pixel stellt zugleich einen breidbandigen Schalter, einen Multiplizierer und OE-Mikromischer dar. Die Applika­ tionen der PMD reichen von ein- und mehrdimensionalen Phasen- und Laufzeitmessung übertragener oder reflektierter elektromagnetischer Wellen zum optischen 3d-Scann bis hin zur Anwendung in optischen Kommunikationssystemen.

Beim PMD liegen über einer Siliziumschicht zwei Modulationsgates, welche elektrisch leitend und für das einfallende Licht transparent sind. Die beiden Gates werden im Gegentakt angesteuert. Durch diese Gatespannungsmodulation ändert sich der Potentialverlauf synchron. Neben den Gates ist jeweils eine Photodiode plaziert (auch Avelange Dioden). Diese Dioden saugen abhängig von der Lichtintensität die Ladungsträger, welche auf der Potentialschaukel nach links oder rechts laufen, ab. Somit hängt deren Bewegungsrichtung von der Polung der modulierenden Spannung an den Gates ab. Die Ladungsträger werden beidseitig in Speicherelementen aufsummiert und stehen als Meßsignale zur Verfügung. Das Differenzausgangsignal an einem PMD-Pixel, stellt die Korrelationsfunktion des modulierten Lichtes mit dem angelegten Gegentakt Gatespannung dar. D. h., nur im Falle eines zeitlichen Zusammenhangs zwischen der Pixel- und der Lichtmo­ dulation fließen im Mittel unterschiedliche Ströme aus den beiden Pixelausgängen. Das Summensignal ist proportional zur Amplitude der in das Pixel eingestrahlten Lichtleistung. Somit ist aus den Meßwer­ ten des PMD der Meßwert einer herkömmlichen CMOS Kamera nachbildbar.

Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Ermittlung beider Parameter der Lumineszenz (Intensität und Lebensdauer) in Echtzeit, vorteil­ haft bis hinein in den unteren Nanosekundenbereich der Fluoreszenz, auf einfache und kostengünstige Weise.

Die Aufgabe wird durch die unabhängigen Patentansprüche gelöst.

Das Wesen der Erfindung besteht im Einsatz eines PMD anstelle der auf dem Gebiet der Lumineszenzspektroskopie üblicherweise verwende­ ten Photodioden, insbesondere bei den Anwendungen der Phasenfluoro­ metrie bzw. Phosphorometrie, der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) bzw. Fluoreszenzkorrelationsspektro­ skopie (FCS). Dadurch wird die Applikation von PMD auf die Messung von emittierten elektromagnetischen Wellen erweitert und erlaubt damit, ganz neue Meßprinzipien zu verwirklichen, wie die zweidimen­ sionale FCS in Verbindung mit PMD-Arrays.

Die Vorteile des PMD liegen in der inhärenten Mischeigenschaft des Bauelementes, was die ansonsten diskret aufgebaute Empfangskette verkürzt und damit Fehlereinflüsse, Drift- und Temperatureffekte deutlich verringert. Außerdem stellt der PMD das Meßsignal direkt zur Verfügung wodurch ein einfacher und kostengünstiger Detektor für Lumineszenzspektroskopie bis in den unteren Nanosekundenbereich realisiert werden kann. Die über das PMD erfolgende Amplituden- und Phasenmessung elektromagnetischer Wellen in Echtzeit ermöglicht dadurch eine Messung der Fluoreszenzlebensdaueränderung.

Die Modulation der anregenden elektromagnetischen Welle, welche vorteilhaft mit der Modulation der anregenden Strahlenquelle (z. B. Laser, Laserdiode) identisch ist, wird elektrisch am PMD angelegt. Der PMD wird ausgelesen und das Verhältnis der beiden pro PMD-Pixel anfallenden Ladungen (Q1 und Q2) rechnerisch ausgewertet wodurch sich eine Korrelation (Q2 zu Q1) zwischen elektrischer und optischer Modulation ergibt. Die Gesamtladungszahl (Q1 + Q2 ∼ I^s) entspricht der einfallenden Photonenzahl und wird als Intensitätssignal I^s ausgewer­ tet. Das Signal (Q2 zu Q1) entspricht einer Phasenû bzw. Zeitverzö­ gerung des Fluoreszenzlichtes. Bewegt sich ein Fluorophor durch ein Beobachtungsvolumen (Diffusion) oder umgedreht wird das Beobach­ tungsvolumen über ein vermutliches Fluorphor bewegt, kann auch die dafür benötigte Zeit bzw. die effektive Beobachtungszeit (Diffusi­ onszeit) über eine zweckmäßige Zeittaktung am PMD bestimmt werden. Somit wird angezeigt, ob einzelne Fluoreszenzereignisse miteinander korreliert sind und ermöglicht somit eine FCS. Die Auslesefrequenz der Signale (Q1 und Q2) am PMD ûPixel wird vorteilhaft als eigenständiger Parameter an das Meßproblem angepaßt.

Diese PMD-Lumineszenzspektroskopie ist in Weiterbildungen sehr gut geeignet, zweidimensionale Fluoreszenzlebensdauerverteilungen (fluorescence lifetime imageing) zu messen, wofür es bisher nur einige Lösungen auf CCD-Kamera Basis gibt. Sie arbeiten phasenflu­ orimetrisch. Preiswerte Lösungen gibt es vor allem für die langle­ bige Phosphoreszenz.

Die Gerätelösungen sollen Anwendung finden in der molekularen Analy­ tik von Biomolekülwechselwirkung, (z. B. Fluoreszenz Immuno-Assays), Biochipauswertung, aber auch für Sensoren wie Optoden, Sensoren mit umgebungsabhängige Farbstoffe oder Sensoren die mit Farbstoffen und mit Quenchern arbeiten.

Vorteilhafte Ausführungsformen für Geräte und Sensoren die den PMD zur zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung oder zur Phasenfluoreme­ trie (Veränderung im Kontrast und in der Phase einer modulierten Fluoreszenz/Phosphoreszenz) benutzen bestehen aus einer Anregungs­ lichtquelle und -optik (wie Laser, LED oder Lampen), die frequenzmo­ duliert (KHz-10 GHz) oder gepulsed (Pulsbreite Millisekunde bis Femtosekunde) arbeitet oder bei der die Modulation oder Pulsierung nach der Emittierung erzeugt wird.

Vorteilhaft ist weiterhin eine Optik zur Anregung der Probe, sowie Probenhalterung beliebiger Bauform und Funktionalität je nach Aggre­ gatzustand der Probe (Optoden, Küvetten, Mikrotitterplatten, Biochips, optisch Detektierbare Flußsysteme (Mikrokanäle), Kapillaren).

Es kann zur optischen Abbildung auf den PMD, je nach Zweck mit einer optischen Trennung von Anregungs- und Lumineszenzlicht, einer spektralen Aufspaltung des Lumineszenzlichtes und einer Vorverstär­ kung desselben gearbeitet werden. Es ist wahlfrei welche Steuer­ elektronik eingesetzt oder welches Format der PMD besitzt (einzelne PMD, PMD-Zeile oder PMD-Array) oder welche Spezifikation der Modula­ tion oder der Pulsfolge als elektrisches Signal dem PMD zur Verfü­ gung steht (einheitliches elektrisches Signal bei allen PMD (Zeile oder Array) oder zusätzliche Signale für die spezielle Korrelation von einzelnen PMD in der Zeile oder im Array).

Die Auswerteeinheit besteht aus Rechnerhardware und Software (Verrechnungs- oder Rückkopplungs- oder Anzeige-, Auswertungssoftwa­ re, Bildverarbeitung). Der Gesamtaufbau ist bedingt durch Verwen­ dungszweck (Mikroskopaufbau (Fluorescence lifetime imageing), offene oder geschlossene, kompakte, miniaturisiert Spekrometeraufbau, paralleler Scanner oder Reader von Mikrotitterplatten oder Chips, Optoden, Meßsonden, Küvetten, Mikrokanäle

Die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie mit PMD besteht vorteilhaft aus einer Anregungslichtquelle und -optik (z. B. konfokale Optik) im cw oder quasi cw. Die Steuerelektronik erzeugt vorteilhaft eine Modulation, die mit zeitlich verschiedenen Fluoreszenzereignissen korreliert (Diffusion eines fluoreszierenden Moleküles) und als elektrisches Signal dem PMD zur Verfügung steht oder eine Multifre­ quenzmodulation um eine Autokorrelation der Photonenstatistik zu erhalten.

Claims (10)

1. Vorrichtung zur Bestimmung von Probeneigenschaften über zeitauf­ gelöste Lumineszenz, bestehend aus
einer Strahlenquelle zur Erzeugung einer anregenden elektromagneti­ schen Welle, welche geeignet fokussiert auf eine Probe trifft,
einen Detektor, welcher die von der geeignet gehaltenen Probe emittierte Strahlung geeignet fokussiert empfängt
und dem Detektor zugeordneten Steuer- und Auswerteeinheiten, dadurch gekennzeichnet,
daß die anregende elektromagnetische Welle moduliert ist,
daß der Detektor als photonisches Mischelement (PMD) ausgeführt ist und
daß der PMD durch die Steuereinheit elektrisch mit der Modulation der anregenden elektromagnetischen Welle moduliert ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß über die Steuereinheit eine elektrische Modulation des PMD frequenzmoduliert im Bereich von 1 kHz bis 60 GHz oder gepulst im Bereich 1 ms bis 100 fs erfolgt,
daß die Vorrichtung optional Teil eines optischen Spektrometers ist,
daß optional über einen optischen Strahlteiler die Trennung von Anregungslicht und Lumineszenzlicht erfolgt,
daß optional über einen spektralen Strahlteiler eine spektrale Aufspaltung des Lumineszenzlichts erfolgt und
daß optional über einen Lichtverstärker eine Vorverstärkung des Lumineszenzlichts erfolgt.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet,
daß der PMD als ein- oder mehrdimensionales Array ausgeführt ist,
daß optional alle PMD mit einer einheitlichen elektrischen Modula­ tion betrieben werden und
daß optional einzelne PMD zusätzliche Modulationssignale für spezi­ elle Korrelationen erhalten.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß mit geeigneten Abbildungsmitteln ein optisches Bild der Probe erzeugt wird und
daß eine ein- oder zweidimensionale Verteilung der Probeneigenschaf­ ten über der Probe bestimmt wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, die Vorrichtung Teil eines Mikroskopaufbaus, oder Teil eines Scanners ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Halterung der Probe für deren Aggregatzustand geeignete Probenhalterungen einschließlich Optoden, Küvetten, Mirkotitteplat­ ten, Chips, optisch detektierbare Flußsysteme und Kapillaren zugeordnet sind.

7. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) oder zur Phasenfluoremetrie oder zur Fluoreszenzkorrelati­ onsspektroskopie (FCS) verwendet wird.

8. Verfahren zur Bestimmung von Probeneigenschaften über zeitaufge­ löste Lumineszenz, bei welcher
in einem ersten Schritt eine geeignet modulierte elektromagnetische Welle geeignet fokussiert eine geeignet gehaltene Probe anregt,
in einem weiteren Schritt die Modulation der anregenden elektromag­ netische Welle durch eine Steuereinheit in eine elektrische Modula­ tion transformiert ein photonisches Mischelement (PMD) ansteuert,
in einem weiteren Schritt die angeregte Probe elektromagnetische Strahlung emittiert,
in einem weiteren Schritt die emittierte elektromagnetische Strah­ lung geeignet fokussiert auf den PMD trifft,
in einem weiteren Schritt die beiden Meßsignale des PMD in Echtzeit ausgelesen werden und
in einem letzten Schritt über die Auswerteeinheit daraus die Inten­ sität und die Lebensdauer der emittierten Strahlung berechnet wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zeitlich nach dem ersten bis vorletzten Schritt eine Wiederholung desselben Zyklus erfolgt, optional mit unterschiedlichen anregenden elektromagnetischen Wellen oder mit Zyklen, welche mit unterschiedlichen Probenzuständen korrelieren, daß optional diese Korrelation zusätzliche elektrische Signale für einzelne PMD erzeugt.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß dieses Verfahren Bestandteil eines Verfahrens der Lumineszenz­ spektroskopie einschließlich der Phasenfluorometrie, der Phasenphos­ phorometrie, der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC), der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), der Floureszenzlebens­ dauerverteilung, der Biomolekülwechselwirkung, der Biochipauswertung sowie der Dynamischen Lichtsteuung in der Bioanalytik ist.