DE19931834A1 - Identifizierung und Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase in Pflanzen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen durch Überexpression eines Gens codierend für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase.

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA kodierend für ein Polypeptid mit 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase Aktivität. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für ein Polypeptid mit 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-Methyltrans­ ferase Aktivität zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen, speziell die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder mit dieser hybri­ disierende oder zur Gesamtsequenz oder zu Teilsequenzen homologen DNA-Sequenzen, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen, sowie die der­ art hergestellte Pflanze selbst.

Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bis­ her die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitami­ nen, wie z. B. der Erhöhung des Tocopherol- und Tocotrienolgehal­ tes.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak­ tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell­ schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die erste Gruppe (1a-d) stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a-d):

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol (14101-61-2): R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol.

Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Gehalt an Toco­ pherolen und Tocotrienolen durch klassische Züchtungsmethoden sind Grenzen gesetzt.

Eine sinnvolle Alternative ist das gentechnische Vorgehen, beispielsweise die für die Tocopherol Syntheseleistung kodieren­ den, essentiellen Biosynthesegene zu isolieren und in Kultur­ pflanzen gezielt zu übertragen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflussen, identifiziert werden.

Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus C₅-Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z. B. Carotinoide) bestehen aus C-Gerüsten, die ausschließlich auf Iso­ pren-Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z. B. Chlorophylle, Tocopherole und Vitamin K) eine Isoprenoid-Seiten­ kette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.

Ausgangspunkt der Biosynthese von Prenyllipiden sind 3 × Acetyl- CoA Einheiten, die über β-Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) und Mevalonat in die Ausgangs-Isopren-Einheit (C5), dem Isopentenyl­ pyrophosphat (IPP), umgewandelt werden. Kürzlich wurde durch in vivo Fütterungsexperimente mit C¹³ gezeigt, daß in verschiedenen Eubakterien, Grünalgen und pflanzlichen Chloroplasten ein Mevalo­ nat-unabhängiger Weg zur Bildung von IPP beschritten wird. Dabei werden Hydroxyethylthiamin, das durch Decarboxylierung von Pyru­ vat entsteht, und Glycerinaldehyd-3-Phosphat (3-GAP) in einer durch die 1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Synthase vermittelten "Transketolase"-Reaktion zunächst in 1-Deoxy-D-Xylu­ lose-5-phosphat umgewandelt (Lange et al. 1998; Schwender et al. 1997; Arigoni et al. 1997; Lichtenthaler et al. 1997; Sprenger et al. 1997). Dieses wird dann durch eine intramolekulare Umordnung in 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und im weiteren zu IPP um­ gesetzt (Arigoni et al. 1997; Zeidler et al. 1998). Biochemische Daten deuten darauf hin, daß der Mevalonat-Weg im Zytosol ope­ riert und zur Bildung von Phytosterolen führt. Das Antibiotikum Mevinolin, ein spezifischer Inhibitor der Mevalonat-Bildung, führt lediglich zur Inhibition der Sterol-Biosynthese im Zyto­ plasma, während die Prenyllipid-Bildung in den Plastiden unbeein­ flußt ist (Bach & Lichtenthaler, 1993). Der Mevalonat-unabhängige Weg ist dagegen plastidär lokalisiert und führt vornehmlich zur Bildung von Carotinoiden und plastidären Prenyllipiden (Schwender et al. 1997; Arigoni et al, 1997).

IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer, dem Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz Anlagerung ergibt das Monoterpen (C10) Geranyl-Pyro­ phosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen (C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP). Die Verknüpfung zweier GGPP Moleküle führt zur Bildung der C40-Vorläufer für Carotinoide.

Bei gemischten Prenyllipiden ist die Isopren-Seitenkette ver­ schiedener Länge mit Nicht-Isopren Ringen verbunden wie beispielsweise ein Porphyrin-Ring bei Chlorophyll a und b. Die Chlorophylle und Phylloquinone enthalten eine C20 Phytyl-Kette, in der nur die erste Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält. GGPP wird durch die Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase (GGPPOR) zum Phytyl-Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangs­ stoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.

Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aroma­ tischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy­ phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo­ gentisinsäure überführt wird. Das Chorismat wird ausgehend von Erythrose-4-Phosphat und Phosphoenolpyruvat (PEP) durch deren Kondensation zu 3-deoxy-D-Arabino-heptulosonat-7-Phosphat (DAHP) über die Zwischenstufen des Shikimatweges 3'-Dehydroquinat, 3'-Dehydroshikimat, Shikimat, Shikimat-3-Phosphat und 5'-Enolpy­ ruvylshikimat-3-Phosphat gebildet. Dabei wird das Eryt­ hrose-4-Phosphat vom Calvinzyklus gebildet und das PEP von der Glykolyse bereitgestellt. Die oben beschriebene Homogentisinsäure wird anschließend an Phytylpyrophosphat (PPP) bzw. Geranylgera­ nylpyrophosphat gebunden, um die Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocotrienol, das 2-Methyl-6-phytylhydrochinon bzw. das 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon zu bilden. Durch Methylier­ ungsschritte mit 5-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylquinol, dann durch Zyklisierung α-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α- Tocopherol (Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1996).

In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Mani­ pulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflußen kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phy­ toen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen mit­ einander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Carotino­ id-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray und Grierson, Plant Mol.Biol. 22(4), 589-602 (1993); Fray et al., Plant J., 8, 693-701 (1995)). Wie zu erwarten, zeigen transgene Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin-Ammonium Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenylalanin- Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenylalanin, entzieht es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bate et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112. 1617-1624 (1996)).

Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco­ pherol- bzw. Tocotrienolgehaltes in Pflanzen durch Überexpression einzelner Biosynthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 beschreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch verstärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des En­ zyms p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD). WO 99/04622 be­ schreibt eine Gensequenz codierend für eine γ-Tocopherolmethyl­ transferase aus einem photosynthetisch aktiven Organismus. WO 99/23231 zeigt, daß die Expression einer Geranylgeranyl-Reduc­ tase in transgenen Pflanzen eine gesteigerte Tocopherolbiosynt­ hese zur Folge hat.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Toco­ trienolen.

Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Über­ expression eines 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase Gens in Pflanzen.

Zu diesem Zweck wurde in transgenen Pflanzen die Aktivität der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase (MPMT) durch Überexpression des MPMT-Gens aus Synechocystis spec. PCC 6803 er­ höht. Dies kann prinzipiell durch Expression homologer oder hete­ rologer MPMT-Gene erreicht werden.

In Beispiel 2 wird erstmals die Klonierung einer MPMT-DNA-Sequenz (SEQ-ID Nr. 1) aus Synechocystis spec, PCC 6803 beschrieben. Um eine Plastidenlokalisation zu gewährleisten wird der MPMT- Nukleotidsequenz aus Synechocystis eine Transitsignalsequenz (Abb. 3, Abb. 4) vorangestellt. Auch geeignet als Expressionskas­ sette ist eine DNA-Sequenz, die für ein MPMT-Gen codiert, das mit SEQ-ID Nr. 1 hybridisiert, bzw. zur Gesamtsequenz oder zu Teil­ sequenzen homolog ist und das aus anderen Organismen bzw. aus Pflanzen stammt.

Das durch die zusätzliche Expression des MPMT-Gens nun vermehrt zur Verfügung stehende 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon wird wei­ ter in Richtung Tocopherole und Tocotrienol umgesetzt (Abb. 1).

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transforma­ tion der Pflanzen mit einem das MPMT-Gen enthaltenden Konstrukt. Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocopherolen und Toco­ trienolen wurden Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum eingesetzt.

Messungen an MPMT-Synechocystis knock out Mutanten ergaben bezüg­ lich des Gehaltes an Tocopherolen und Tocotrienolen eine drasti­ sche Abnahme. Dies belegt den direkten Einfluß der plastidären pflanzlichen MPMT auf die Synthese von Tocopherolen und Tocotrie­ nolen.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 aus Synechocystis spec. PCC 6803, die für eine MPMT oder deren funktionelle Äquivalente kodiert, zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrieno­ len. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z. B. eine DNA- oder cDNA- Sequenz sein. Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine MPMT kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Tocopherolen und Tocotrienolen verleihen.

Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein­ säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden ko­ dierenden Sequenz für das MPMT-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anord­ nung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. wei­ terer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Ele­ mente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targe­ ting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in ein De­ rivat des Transformationsvektors pBin-19 mit 35 s Promotor (Bevan, M., Nucleic Acids Research 12: 8711-8721 (1984)) eingebaut wer­ den. Abb. 4 zeigt ein Derivat des Transformationsvektors pBin-19 mit samenspezifischen Legumin B4-Promotor.

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvi­ rus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen MPMT- Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert wer­ den kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizyl­ säure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesul­ fonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin­ induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u. a. verwendet werden.

Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstu­ fen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd­ protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten lösli­ chen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen expri­ miert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor (US 5504200), den USP-(Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten MPMT-DNA Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und MPMT-DNA-Sequenz in­ serierten DNA, die für ein chloroplastenspezifisches Transitpep­ tid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. En­ quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labora­ tory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Plastiden gewährleisten.

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA- Sequenz für ein MPMT-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezi­ fische Transitpeptide, welche nach Translokation des MPMT-Gens in die Chloroplasten vom MPMT-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plasti­ dären Nicotiana tabacum Transketolase oder einem anderen Transit­ peptid (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubi­ sco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) oder dessen funktio­ nellem Äquivalent abgeleitet ist.

Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Tabak in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:

Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine MPMT kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen ent­ halten, sowie aus verschiedenen heterologen MPMT-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthe­ tische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert wer­ den. Bei der Präparation einer Expressionskassette können ver­ schiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Se­ quenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Rich­ tung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regio­ nen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion die­ ser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions­ stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatori­ schen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkrip­ tionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein MPMT-Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt­ stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti­ onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans­ versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre­ pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffül­ len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny­ lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, ins­ besondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.

Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein MPMT-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Ex­ pression eines MPMT-Gens enthalten.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine MPMT ko­ dierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzli­ che funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Bio­ technology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrie­ ben.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E, coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobak­ terien replizieren können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend eine DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder eine mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz zur Trans­ formation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen und Tocotrienolen der Pflanze.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen, Blütenblättern oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermeh­ rungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transforma­ tion von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Tocophero­ len und Tocotrienolen eingesetzt werden.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genann­ ten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Phy­ siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschie­ denen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein MPMT-Gen kodieren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquiva­ lente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze ange­ paßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine MPMT kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit um­ faßt, welche man durch Modifikation der MPMT-Nukleotidsequenz er­ hält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Ein­ grenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.

Beispiel 8 beschreibt einen Deletionsklon des MPMT-Gens, siehe SEQ-ID Nr. 7)

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funk­ tion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge­ schwächt oder verstärkt ist.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Über­ expression eines MPMT-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber­ setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die MPMT-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spe­ zifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Be­ standteil des Fusionsproteins ein MPMT-Polypeptid oder ein funk­ tionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusion­ sproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf MPMT-Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine re­ gulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Transitpeptid, das das MPMT-Protein in die Plastiden leitet.

Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen und Tocotrienolen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung dieser Verbindungen durch funktionelle Überexpression eines MPMT-Gens SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzenge­ neration.

Dabei kann sowohl der Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen gesteigert werden. Vorzugsweise wird der Gehalt an Tocopherolen gesteigert. Aber es ist auch möglich unter bestimmten Bedingungen vorzugsweise den Gehalt an Tocotrienolen zu steigern.

Der Biosyntheseort von Tocopherolen beispielsweise ist unter an­ derem das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des MPMT-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - besonders in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen MPMT- Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten MPMT- Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Ex­ pression des MPMT-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol- Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen gete­ stet werden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, trans­ formiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder eine mit dieser hybridisie­ rende bzw. zur Gesamtsequenz oder zu Teilsequenzen homologen DNA- Sequenz, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kul­ turpflanzen, wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Tagetes, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin photosynthetisch aktive Organismen transformiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder eine mit dieser hybridisierende bzw. zur Gesamtsequenz oder zu Teilsequenzen ho­ mologen DNA-Sequenz. Photosynthetisch aktive Organismen sind ne­ ben Pflanzen, beispielsweise Cyanobakterien, Moose und Algen.

Da es sich bei diesem Biosyntheseweg um einen ausschließlich pla­ stidär-lokalisierten Stoffwechselweg handelt, bietet er optimale Targetenzyme für die Entwicklung von Inhibitoren. Da sich nach heutigem Stand der Technik kein mit der Synechocystis MPMT iden­ tisches oder ähnliches Enzym in humanen und tierischen Organismen befindet, ist davon auszugehen, daß Inhibitoren sehr spezifisch auf Pflanzen wirken sollten.

Wie bereits erwähnt ist die MPMT ein potentielles Target für Herbizide. Um effiziente Hemmstoffe der MPMT finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-En­ zym-Bindungsstudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die komplette cDNA-Sequenz der MPMT aus Synechocystis in einen Expressionsvektor (pQE, Qia­ gen) kloniert und in E. coli überexprimiert.

Das mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassette expri­ mierte MPMT-Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die MPMT spezifischen Hemmstoffen.

Dazu kann die MPMT beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der MPMT in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Sub­ stanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Herbizide, die mit dem oben beschriebenen Testsystem identifizierbar sind.

Durch Überexpression der für eine MPMT kodierenden Gensequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der MPMT erreicht. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Das unter Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 hergestellte MPMT-Protein eignet sich auch zur Durchführung von Biotransformationen zur Bereitstellung größerer Mengen 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon. Dabei wird 2-Methyl-6-phytylhy­ drochinon in Gegenwart des Enzyms MPMT und des Cosubstrats S-Ade­ nosyl-L-Methionin zu 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon umgesetzt. Die Biotransformation läßt sich prinzipiell mit ganzen Zellen, die das Enzym MPMT exprimieren oder Zellextrakten aus diesen Zel­ len oder aber mit aufgereinigter oder hochreiner MPMT in Gegen­ wart von S-Adenosyl-L-Methionin durchführen.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:

• - Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine DNA- Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder eine mit dieser hybridisierende, bzw. zur Gesamtsequenz oder zu Teilsequenzen homologen DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle oder Protoplasten von Pflanzen einbringt und diese zu ganzen Pflanzen regene­ riert.
• - Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder eine mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz zur Herstel­ lung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und To­ cotrienolen durch Expression einer MPMT DNA-Sequenz in Pflan­ zen.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1

Identifizierung einer 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransfe­ rase aus Synechocystis spec. PCC 6803.

Die Klonierung und Identifizierung der 2-Methyl-6-phytylhydro­ chinon-methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 er­ folgte folgendermaßen:

Unter Verwendung eines in S-Adenosyl-L-Methionin Methyltransfera­ sen konservierten Sequenzmotivs, welches für die Bindung des S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) verantwortlich ist (C. P. Joshi und V. L. Chiang. PMB. 37: 663-374, 1998), wurde eine genomische DNA Datenbank von Synechocystis spec. PCC 6803 durchmustert (Kaneko et al., DNA Res. 34: 109-136, 1996). Die bei der Durchmusterung identifizierten hypothetischen Proteine, welche über das SAM-Bin­ demotiv verfügten, wurden mit den Primärsequenzen der Synechocy­ stis spec. PCC 6803 γ-Tocopherol-methyltransferase (bezeichnet als slr0089) sowie der Arabidopsis thaliana γ-Tocopherol-methyltrans­ ferase (David Shintani und Dean DellaPenna. Sience. 282 : 2098-2100, 1998) verglichen.

Dabei konnte ein hypothetisches Protein identifiziert werden (be­ zeichnet sll0418 SEQ.-ID Nr. 2), welches geringe Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz mit den γ-Tocopherolmethyltransferasen aus Synechocystis spec. PCC 6803 und Arabidopsis thaliana aufwies (36% bzw. 28% Identität).

Weitere Untersuchungen der Primärsequenz des hypothetischen Pro­ teins sll0418 belegten das Vorkommen einer putativen prokaryonti­ schen Signalsequenz innerhalb der ersten 20 Aminosäuren (PSIGNAL, PC/GENET^TM IntelliGenetics, Inc©1991). Eine solche Sequenz konnte ebenfalls in der Synechocystis spec. PCC 6803 γ-Tocopherolmethyl­ transferase (slr0089) identifiziert werden (D. Shintani und D. DellaPenna. Sience. 282 : 2098-2100, 1998) und deutet auf eine iden­ tische Lokalisation der beiden Proteine hin.

Das vorhergesagte Molekulargewicht des unprozessierten Proteins beträgt 34,9 kDa und liegt damit in einem Bereich der auch für die Synechocystis spec. PCC 6803 γ-Tocopherolmethyltransferase (David Shintani und Dean DellaPenna, Sience. 282 : 2098-2100, 1998) und der aus Paprikafrüchten gereinigten γ-Tocopherolmethyltrans­ ferase (d'Harlingue and Camara, Plastid enzymes of terpenoid bio­ synthesis: Purification of γ-Tocopherol Methyltransferase from Capsicum Chromoplasts. Journal of Biological Chemistry, Vol. 269 No. 28, 15200-152003, 1985) ermittelt wurde.

Unter Berücksichtigung der Fakten, schlußfolgerten wir, daß es sich bei dem hypothetischen Protein sll0418 um eine Tocopherolme­ thyltransferase handeln könnte.

Beispiel 2

Amplifikation und Klonierung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-me­ thyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803

Die DNA kodierend für den ORF (open reading frame) sll0418 wurde mittels polymerase chain reaction (PCR) aus Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Crispin A. Howitt (BioTechniques 21 : 32-34, July 1996) unter Verwendung eines sense spezifischen Primers (sll04185' Seq. Nr. 5) und eines antisense spezifischen Primers (sll04183' Seq. Nr. 6) amplifiziert.

Die PCR Bedingungen waren die folgenden:

Die PCR erfolgte in einem 50 µ Reaktionsansatz in dem enthalten war:

• - 5 µl einer Synechocystis spec. PCC 6803 Zellsuspension
• - 0,2 mM dATP, dTTP, dGTP, dCTP
• - 1,5 mM Mg(OAc)₂
• - 5 µg Rinderserum-Albumin
• - 40 pmol sll04185'
• - 40pmol sll04183'
• - 15 µl 3,3 × rTth DNA Polymerase XLPuffer (PE Applied Biosystems)
• - 5U rTth DNA Polymerase XL (PE Applied Biosystems)

Die PCR wurde unter folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt:
Schritt 1: 5 Minuten 94°C (Denaturierung)
Schritt 2: 3 Sekunden 94°C
Schritt 3: 2 Minuten 58°C (Annealing)
Schritt 4: 2 Minuten 72°C (Elongation)
40 Wiederholungen der Schritte 2-4
Schritt 5: 10 Minuten 72°C (Post-Elongation)
Schritt 6: 4°C (Warteschleife)

Das Amplikon wurde unter Verwendung von Standardmethoden in den PCR Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) kloniert. Die Identität des erzeugten Amplikons wurde durch Sequenzierung unter Verwendung des M13F (-40) Primers bestätigt.

Beispiel 3 Erzeugung einer sll0418 Knock out Mutante

Ein DNA Konstrukt zur Erzeugung einer Deletionsmutante des ORF sll0418 in Synechocystis spec. PCC 6803 wurde unter Anwendung von Standard Klonierungstechniken erzeugt.

Der Vektor pGEM-T/sll0418 wurde unter Verwendung des Restrikti­ onsenzyms Bal1 verdaut. Das Vorhandensein von zwei Bal1 Schnitt­ stellen innerhalb der sll0418 Sequenz (Position Bp 109 bzw Bp 202) hatte den Verlust eines 93 Bp umfassenden internen Fragmen­ tes zur Folge. In die Bal1 Schnittstellen des sll0418 ORF wurde die Aminoglycosid-3'Phosphotransferase des Transposons Tn903 klo­ niert. Dazu wurde das Tn903 als EcoR1 Fragment aus dem Vektor pUC4k (Vieira, J und Messing, J Gene: 19, 259-268, 1982) isoliert, die überstehenden Enden des Restriktionsverdaus nach Standard­ methoden in glatte Enden überführt und in den Ball geschnittenen Vektor pGEM-T/sll0418 ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von E.coli Xl1 blue Zellen verwendet. Transforman­ den wurden durch Verwendung von Kanamycin und Ampicillin selek­ tioniert. Ein rekombinantes Plasmid (pGEM-T/sll0418::tn903) wurde isoliert und zur Transformation von Synechocystis spec. PCC 6803 gemäß der Methode nach Williams (Methods Enzymol. 167 : 776-778, 1987) eingesetzt.

Synechocystis spec. PCC 6803 Transformanden wurden selektioniert auf Kanamycin haltigem (kan) BG-11 Festmedium (Castenholz, Methods in Enzymology, Seite 68-93, 1988) bei 28°C und 30 µmol Photonen × (m² × s)^-1. Vier unabhängige Knock out Mutanten konnten nach fünf Selektionsrunden (Passagen von Einzelkolonien auf fri­ sches BG-11kn Medium) erzeugt werden.

Der vollständige Verlust des sll0418 Endogens bzw. der Austausch gegen die rekombinante sll0418::tn903 DNA, wurde durch PCR Analy­ sen bestätigt.

Beispiel 4

Vergleich der Tocopherolproduktion in Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen und den erzeugten Knock out Mutanten des ORF sll0418.

Die auf den BG-11kan Agarmedium kultivierten Zellen der vier un­ abhängigen Synechocystis spec. PCC 6803 Knock out Mutanten des ORF sll0418 sowie untransformierte Wildtypzellen wurden zum Animpfen von Flüssigkulturen verwendet. Diese Kulturen wurden bei 28°C und 30 µmol Photonen × (m² × s)^-1 (30 µE) für ca. 3 Tage kulti­ viert. Nach Bestimmung der OD₇₃₀ der einzelnen Kulturen, wurde die OD₇₃₀ aller Kulturen durch entsprechende Verdünnungen mit BG-11 (Wildtypen) bzw. BG-11kan (Mutanten) synchronisiert. Diese auf Zelldichte synchronisierten Kulturen wurden zum Animpfen von drei Kulturen pro Mutante bzw. der Wildtypkontrollen verwendet. Die biochemischen Analysen konnten somit unter Verwendung von jeweils drei unabhängig gewachsenen Kulturen einer Mutante und der ent­ sprechenden Wildtypen durchgeführt werden. Die Kulturen wurden bis zu einer optischen Dichte von OD₇₃₀ = 0,3 angezogen. Das Medium der Zellkultur wurde durch zweimalige Zentrifugation bei 14000 rpm in einer Eppendorf Tischzentrifuge entfernt. Der daran anschließende Aufschluß der Zellen erfolgte durch viermalige In­ kubation im Eppendorfschüttler bei 30°C, 1000 rpm in 100% Methanol für 15 Minuten, wobei die jeweils erhaltenen Überstände vereinigt wurden. Weitere Inkubationsschritte ergaben keine weitere Frei­ setzung von Tocopherolen oder Tocotrienolen.

Um Oxidation zu vermeiden, wurden die erhaltenen Extrakte direkt nach der Extraktion mit Hilfe einer Waters Allience 2690 HPLC-An­ lage analysiert. Tocopherole und Tocotrienole wurden über eine reverse Phase Säule(ProntoSil 200-3-C30, Bischoff) mit einer mo­ bilen Phase von 100% Methanol getrennt und anhand von Standards (Merck) identifiziert. Als Detektionssystem diente die Fluores­ zenz der Substanzen (Anregung 295 nm, Emmision 320 nm), die mit Hilfe eines Jasco Fluoreszensdetektors FP 920 nachgewiesen wurde.

In den Synecchocystis spec. PCC 6803 knock out Mutanten des ORF sll0418 konnten keine Tocopherole und Tocotrienole gefunden wer­ den. Tocopherole und Tocotrienole wurden jedoch in den Syneccho­ cystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen gemessen.

Der Verlust der Fähigkeit zur Produktion von Tocopherolen und To­ cotrienolen innerhalb der knock out Mutanten des ORF sll0418 im Vergleich zu den Synechocystis spec. PCC 6803 Wildtypzellen zeigt, daß das Gen sll0418 für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon- methyltransferase kodiert.

Beispiel 5

Funktionelle Charakterisierung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon­ methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 durch hetero­ loge Expression in E.coli.

Das hypothetische Protein sll0418 aus Synechocystis spec. PCC 6803 konnte durch funktionelle Expression in E.coli als 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase identifiziert wer­ den.

Das aus Synechocystis spec. PCC 6803 amplifizierte Gen sll0418 wurde im korrekten Leserahmen in den Expressionsvektor pQE-30 (Qiagen) subkloniert. Die zur Amplifikation des OFR sll0418 aus Synechocystis spec. PCC 6803 verwendeten Primer sll04185' bzw. sll04183' (Sequenz ID Nr. 5 und 6) waren so konstruiert, daß an das 5' Ende und das 3' Ende des Amplikons BamH1 Restriktions­ schnittstellen addiert wurden, siehe Sequenz ID Nr. 3. Das sll0418 Fragment wurde unter Verwendung dieser flankierenden BamH1 Restriktionschnittstellen aus dem rekombinanten Plasmid pGEM-T/sll0418 isoliert und unter Anwendung von Standardmethoden in einen BamHI geschnittenen pQE-30 ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation von M15 E.coli Zellen verwendet und Kanamycin und Ampicillin resistente Transformanden wurden analy­ siert. Die Kanamycin Resistenz wird durch das in den M15 Zellen enthaltene pREP-4 Plasmid vermittelt. Ein rekombinantes Plasmid (pQE-30/sll0418) welches das sll0418 Fragment in der richtigen Orientierung trug, wurde isoliert. Die Identität und Orientie­ rung des Inserts wurde durch Sequenzierung bestätigt.

Das rekombinante Plasmid pQE-30/sll0418 wurde zur Transformation von M15 E.coli Zellen verwendet, um rekombinantes sll0418 Pro­ tein zu erzeugen. Unter Verwendung einer aus der Transformation hervorgegangenen Kolonie wurde eine Übernachtkultur in Luria Broth Medium mit 200 µg/ml Ampicillin (Amp) und 50 µg/ml Kanamycin (Kan) angeimpft. Ausgehend von dieser Kultur wurde am nächsten Morgen eine 100 ml Luria Broth Kultur (Amp/Kan) angeimpft. Diese Kultur wurde bei 28°C auf einem Schüttelinkubator bis zum errei­ chen einer OD₆₀₀ : 0,35-0,4 inkubiert. Anschließend wurde die Pro­ duktion des rekombinanten Proteins durch Zugabe von 0,4 mM Iso­ propyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) induziert. Die Kultur wurde für weitere 3 Stunden bei 28°C geschüttelt und die Zellen anschließend durch Zentrifugation bei 8000 g pelletiert.

Das Pellet wurde in 600 µl Lysispuffer (ca. 1-1,5 ml/g Pellet Naßgewicht, 10 mM HEPES KOH pH 7,8, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 0,24 M Sorbitol) resuspendiert. Anschließend wurde PMSF (Phe­ nylmethylsulfonat) zu einer Endkonzentration von 0,15 mM beige­ fügt und der Ansatz für 10 Minuten auf Eis gestellt. Der Auf­ schluß der Zellen erfolgte durch einen 10 Sekunden Ultraschall- Puls unter Verwendung eines Ultraschallstabes. Nach Zugabe von Triton X100 (Endkonzentration 0,1%) wurde die Zellsuspension für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde anschließend für 30 Minuten bei 25000xg abzentrifugiert und der Überstand zum Assay eingesetzt.

Die Aktivitätsbestimmung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyl- transferase erfolgt durch Nachweis des radioaktiv markierten Re­ aktionsproduktes 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon.

Dazu wurden 135 µl des Enzyms (ca. 300-600 µg) zusammen mit 20 µl Sub­ strat (2-Methyl-6-phytylhydrochinon) und 15 µl (0,46 mM SAM ¹⁴C) Methylgruppendonor in folgendem Reaktionspuffer: 200 µl (125 mM) Tricine-NaOH pH 7,6, 100 µl (1,25 mM) Sorbitol, 10 µl (50 mM) MgCl₂ und 20 µl (250 mM) Ascorbat für 4 Stunden bei 25°C im Dunkeln inkubiert.

Das Abstoppen der Reaktion erfolgte durch Zugabe von 750 µl Chlo­ roform/Methanol (1 : 2) + 150 µl 0,9% NaCl. Der gemischte Ansatz wurde kurz zentrifugiert und die obere Phase wurde verworfen. Die untere Phase wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und unter Stickstoff eingedampft. Die Rückstände wurden in 20 µl Ether auf­ genommen und auf eine Dünnschicht-Platte zur chromatographischen Trennung der Substanzen aufgetragen (feste Phase: HPTLC-Platten : Kieselgel 60 F₂₅₄ (Merk), flüssige Phase: Toluol). Der Nachweis des radioaktiv markierten Reaktionsproduktes erfolgt durch Verwendung eines Phosphoimagers.

Diese Experimente bestätigten, daß es sich bei dem durch das Gen sll0418 (SEQ-ID Nr. 1) aus Synechocystis spec. PCC 6803 kodierte Protein um eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase handelt, da es die enzymatische Aktivität zur Umwandlung von 2-Methyl-6-phytylhydrochinon in 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon besitzt.

Abb. 2 zeigt einen Sequenzvergleich auf Aminosäureebene zwi­ schen den γ-Tocopherolmethyltransferasen aus Synechocystis spec. PCC Synechocystis spec. PCC 6803 (slr0089) und A.thaliana (aratmt) mit der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase (sll04189) aus Synechocystis spec. PCC 6803. Die Übereinstimmung mit den γ-Tocopherolmethyltransferasen aus Synechocystis spec. PCC 6803 und Arabisopsis thaliana beträgt 36 bzw. 28% Identität.

Beispiel 6 Substratspezifität der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltrans­ ferase

Enzymatische Untersuchungen wie in Beispiel 5 durchgeführt bele­ gen, daß das Enzym MPMT - kodiert durch das Gen sll0418 (SEQ-ID Nr. 1) aus Synechocystis spec. PCC 6803 - 2-Methyl-6-phytylhydro- chinon in 2,3-Dimethyl-6-phytylhydrochinon umwandelt.

Zusätzlich besitzt das Enzym MPMT eine 2-Methyl-6-geranylgeranyl­ hydrochinon-methyltransferase Aktivität, wohingegen eine γ-Toco­ pherolmethyltransferase Aktivität nicht nachgewiesen werden konnte. Somit ist belegt, daß das Enzym 2-Methyl-6-phytylhydro­ chinon-methyltransferase an der Biosynthese der Tocotrienole be­ teiligt ist, da es 2-Methyl-6-geranylgeranylhydrochinon zu 2,3-Dimethyl-6-geranylgeranylhydrochinon umwandelt. Dies zeigt deutlich die Verschiedenheit der Enzymaktivität der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase im Vergleich zur γ-Tocopherolmethyltransferase.

Beispiel 7 Herstellung von Expressionskassetten enthaltend das MPMT-Gen

Transgene Pflanzen wurden erzeugt, die die 2-Methyl-6-phytylhy­ drochinon-methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC6803 zum einen unter Kontrolle des konstitutiven 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., Cell 21: 285-294, 1980) und zum anderen unter Kontrolle des samenspezifischen Promotors des Legumin Gens aus Vicia faba (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res.,14(6): 2707-2720; 1986) exprimieren. Die Grundlage des zur konstitutiven Expression der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyl­ transferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 erzeugten Plasmides war der pBinAR-TkTp-9 (Ralf Badur, Dissertation Universität Göt­ tingen, 1998). Dieser Vektor ist ein Derivat des pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Sci. 66: 221-230, 1990) und enthält den 35S-Promotor des CaMV (Blumenkohlmosaikvirus) (Franck et al., 1980), das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens (Gielen et al., EMBO J. 3: 835-846, 1984) sowie die für das Transitpeptid der plastidären Nicotiana tabacum Transketolase kodierende DNA Sequenz (Ralf Badur, Dissertation Universität Göttingen, 1998). Die unter Berücksichtigung des korrekten Leserasters erfolgte Klonierung der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC6803 in diesen Vektor, erzeugt eine Translationsfusion der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltrans­ ferase mit dem plastidären Transitpeptid. Dadurch erfolgt ein Transport des Transgens in die Plastiden.

Zur Erstellung dieses Plasmides wurde das Gen sll0418 unter Verwendung der flankierenden BamHI Restriktionsschnittstellen aus dem Plasmid pGEM-T/sll0418 isoliert. Dieses Fragment wurde unter Anwendung von Standardmethoden in einen BamHI geschnittenen pBi­ nAR-TkTp-9 ligiert (siehe Abb. 3). Dieses Plasmid (pBinAR- TkTp-9/sll0418) wurde zur Erzeugung transgener Arabidopsis tha­ liana, Brassica napus und Nicotiana tabacum verwendet. Fragment A (529 bp) in Abb. 3 beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus), Fragment B (245 bp) kodiert für das Transitpeptid der Nicotiana tabacum Transketolase, Fragment C (977 Bp) kodiert ORF sll0418 aus Syn­ echocystis spec. PCC 6803, Fragment D (219 Bp) kodiert für das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.

Zur Erzeugung eines Plasmides, welches die samenspezifische Ex­ pression der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 in Pflanzen ermöglicht, wurde der samenspeziliche Promotor des Legumin B4 Gens (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res.,14(6): 2707-2720, 1986) verwendet. Aus dem Plasmid pCR-Script/lePOCS wurde das 2,7 Kb Fragment des Legumin B4 Gen Promotors unter Verwendung der den Promotor 5' flankierenden EcoR1 und der 3' flankierenden Kpn1 Schnittstellen isoliert. Das Plasmid pBinAR-TkTp-9/sll0418 wurde ebenfalls mit den Restrikti­ onsenzymen EcoR1 und Kpn1 behandelt. Dies hatte zur Folge, daß der 35S-Promotor des CaMV aus diesem Plasmid herausgetrennt wurde. Der Promotor des Legumin Gens wurde anschließend als EcoR1/Kpn1 Fragment in diesen Vektor kloniert, wodurch ein Plasmid erzeugt wurde, welches die Expression des Gen sll0418 unter die Kontrolle dieses samenspezifischen Promotors stellte, siehe Abb. 4. Dieses Plasmid (pBinARleP-TkTp-9/sll0418) wurde zur Erzeugung transgener Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum Pflanzen verwendet.

Fragment A (2700 bp) in Abb. 4 beinhaltet den Promotor des Legumin B4 Gens aus Vicia faba, Fragment B (245 bp) kodiert für das Transitpeptid der Nicotina tabacum Transketolase, Fragment C (977 Bp) kodiert für das ORF sll0418 aus Synechocystis spec. PCC 6803., Fragment D (219 Bp) für das Terminationssignal des Octopin- Synthase Gens.

Beispiel 8 Herstellung von Expressionskassetten enthaltend einen Deletions­ klon des MPMT-Gens

Auf Grundlage einer Computeranalyse wurde in der Primärsequenz des ORF sll0418 ein putatives prokaryontisches Sekretionssignal identifiziert. Um sicherzustellen, daß dieses bei der Expression in Pflanzen keinen negativen Einfluß auf den Import des Proteins in die Plastiden nimmt, wurde ein Derivat der Sequenz des sll0418 erzeugt, bei dem das putative Sekretionssignal deletiert wurde (Sequenz-ID Nr. 7). Diese Deletion wurde unter Anwendung der PCR Technologie durchgeführt. Durch die dabei verwendeten Primer (sll0418DSp5', Sequenz-ID Nr. 9 und sll0418DSp3',Sequenz-ID Nr. 10) wurde an das 5' Ende der Sequenz eine EcoRV Restriktions­ schnittstelle und an das 3' Ende eine SalI Restriktionsschnitt­ stelle addiert, durch die eine gerichtete Klonierung in den Vek­ tor pBinAR-TkTp-9 ermöglicht wurde. Das entstandene Plasmid pBi­ nAR-TkTp-9/sll0418ΔSP ist in Abb. 5 beschrieben. Fragment A (529 bp) in Abb. 5 beinhaltet den 35S-Promotor des CaMV (Nukleotide 6909 bis 7437 des Blumenkohlmosaikvirus), Fragment B (245 bp) Fragment kodiert für das Transitpeptid der Nicotiana tabacum Transketolase, Fragment C (930 Bp) ORF sll0418ΔSP aus Syn­ echocystis spec. PCC 6803 Fragment D (219 Bp) für das Terminati­ onssignal des Octopin-Synthase Gens.

Zur Erzeugung eines Plasmides, welches die samenspezifische Ex­ pression des Deletionsklons der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-me­ thyltransferase aus Synechocystis spec. PCC6803 in Pflanzen er­ möglicht, wurde ebenfalls der bereits beschriebene samenspezifische Promotor des Legumin B4 Gens (Kafatos et al., Nuc. Acid. Res.,14(6): 2707-2720, 1986) verwendet. Aus dem Plasmid PCR- Script/lePOCS wurde das 2,7 Kb Fragment des Legumin B4 Gen Promotors unter Verwendung der den Promotor 5' flankierenden EcoR1 und der 3' flankierenden Kpn1 Schnittstellen isoliert. Das Plasmid pBinAR-TkTp-9/sll0418ΔSP wurde ebenfalls mit den Restrik­ tionsenzymen EcoR1 und Kpn1 behandelt. Dies hatte zur Folge, daß der 35S-Promotor des CaMV aus diesem Plasmid herausgetrennt wurde. Der Promotor des Legumin Gens wurde anschließend als EcoR1/Kpn1 Fragment in diesen Vektor kloniert, wodurch ein Plasmid erzeugt wurde, welches die Expression des Deletionsklons des Gen sll0418 unter die Kontrolle dieses samenspezifischen Promotors stellte, siehe Abb. 6. Fragment A (2700 bp) in Abb. 6 beinhaltet den Promotor des Legumin B4 Gens aus Vicia faba, Fragment B (245 bp) Fragment kodiert für das Transitpeptid der Nicotiana tabacum Transketolase, Fragment C (930 Bp) ORF sll0418ΔSP aus Synechocystis spec. PCC 6803 Fragment D (219 Bp) für das Terminationssignal des Octopin-Synthase Gens.

Dieses Plasmid (pBinARleP-TkTp-9/sll0418ΔSP) wurde zur Erzeugung transgener Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum Pflanzen verwendet.

Auch durch Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 7 in transgenen Pflanzen wurde eine Steigerung des Gehaltes an Tocopherol und To­ cotrienol gemessen.

Beispiel 9 Herstellung transgener Arabidopsis thaliana Pflanzen

Wildtyp Arabidopsis thaliana Pflanzen (Columbia) wurden mit dem Aqrobacterium tumefaciens Stamm (EHA105) auf Grundlage einer modifizierten Vacuum Infiltrationsmethode transformiert (Steve Clough und Andrew Bent, Floral dip: a simplified method for Agro­ bacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43, 1998; Bechtold, N., Ellis, J. und Pelltier, G., in: Planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. CRAcad Sci Paris, 1993. 1144(2): 204-212). Die verwendeten Agrobacterium tumefaciens Zel­ len waren im Vorfeld mit den Plasmiden pBinARleP-TkTp-9/sll0418 bzw. pBinAR-TkTp-9/sll0418 (Abb. 3 und 4) transformiert wor­ den.

Samen der Primärtransformanden wurden auf Grundlage der Antibio­ tikaresistenz selektioniert. Antibiotika resistente Keimlinge wurden in Erde gepflanzt und als vollentwickelte Pflanzen zur biochemischen Analyse verwendet.

Beispiel 10 Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen

Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Ma­ nual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.

Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105. Zur Transformation wurden die Plasmide pBinARleP- TkTp-9/sll0418 bzw. pBinAR-TkTp-9/sll0418 verwendet. Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) oberflä­ chensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser für jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 15 ml Kei­ mungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verblei­ benden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml Basal­ medium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zu­ gabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.

Vom Agrobacterium Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu­ ria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0,3 eingestellt.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit ste­ rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe­ trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten ent­ fernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petri­ schalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kana­ mycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wur­ den die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Re­ generation ganzer Pflanzen wurden wie von Bade, J.B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrie­ ben durchgeführt.

Beispiel 11 Herstellung transgener Nicotiana tabacum Pflanzen

Zehn ml YEB-Medium mit Antibiotikum (5 g/l Rinder-Extrakt, 1 g/l Hefe-Extrakt, 5 g/l Pepton, 5 g/l Saccharose und 2 mM MgSo₄) wur­ den mit einer Kolonie von Agrobacterium tumefaciens beimpft und über Nacht bei 28°C kultiviert. Die Zellen wurden 20 min bei 4°C, 3500 U/min in einer Tischzentrifuge pelletiert und danach in fri­ schem YEB-Medium ohne Antibiotika unter sterilen Bedingungen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde für die Transformation eingesetzt.

Die Wildtyp-Pflanzen aus Sterilkultur wurden durch vegetative Re­ plikation erhalten. Dazu wurde nur die Spitze der Pflanze abge­ schnitten und auf frisches 2MS-Medium in ein steriles Einweckglas überführt. Vom Rest der Pflanze wurden die Haare auf der Blatto­ berseite und die Mittelrippen der Blätter entfernt. Die Blätter wurden mit einer Rasierklinge in etwa 1 cm² große Stücke geschnit­ ten. Die Agrobakterienkultur wurde in eine kleine Petrischale überführt (Durchmesser 2 cm). Die Blattstücke wurden kurz durch die Lösung gezogen und mit der Blattunterseite auf 2MS-Medium in Petrischalen (Durchmesser 9 cm) gelegt, so daß sie das Medium be­ rührten. Nach zwei Tagen im Dunkeln bei 25°C wurden die Explantate auf Platten mit Kallusinduktionsmedium überführt und in der Kli­ makammer auf 28°C temperiert. Das Medium mußte alle 7-10 Tage ge­ wechselt werden. Sobald sich Kalli bildeten, wurden die Explan­ tate in sterile Einweckgläser auf Sproßinduktionsmedium mit Cla­ foran (siehe oben) überführt. Nach etwa einem Monat trat Organo­ genese ein und die gebildeten Sprossen konnten abgeschnitten wer­ den. Die Kultivierung der Sprosse wurde auf 2MS-Medium mit Clafo­ ran und Selektionsmarker durchgeführt. Sobald sich ein kräftiger Wurzelballen gebildet hatte, konnte die Pflanzen in Pikiererde getopft werden.

Beispiel 12 Charakterisierung der transgenen Pflanzen

Um zu bestätigen, daß durch die Expression der 2-Methyl-6-phytyl­ hydrochinon-methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 die Vitamin E Biosynthese in den transgenen Pflanzen gesteigert wird, wurden die Tocopherol- und Tocotrienol-Gehalte in Blätter und Samen der mit den Konstrukten pBinARleP-TkTp-9/sll0418 bzw. pBinAR-TkTp-9/sll0418 Pflanzen (Arabidopsis thaliana, Brassica napus und Nicotiana tabacum) analysiert. Dazu wurden die trans­ genen Pflanzen im Gewächshaus kultiviert und Pflanzen die das Gen kodierend für die 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase aus Synechocystis spec. PCC 6803 exprimieren auf Northern-Ebene analysiert. In Blättern und Samen dieser Pflanzen wurde der Toco­ pherolgehalt und der Tocotrienolgehalt ermittelt. In allen Fällen war die Tocopherol- bzw. Tocotrienol-Konzentration in transgenen Pflanzen, die zusätzlich eine DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 exprimieren, im Vergleich zu nicht transformierten Pflanzen erhöht.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (10)

1. DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 und mit dieser hy­ bridisierende oder zur Gesamtsequenz oder zu Teilsequenzen homologen DNA-Sequenz kodierend für eine 2-Methyl-6-phytylhy­ drochinon-methyltransferase aus Synechocystis.

2. Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase zur Herstel­ lung von Pflanzen und photosynthetisch aktiven Organismen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen.

3. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder einer mit dieser hybridisierenden DNA-Sequenz kodierend für eine 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyltransferase zur Herstellung von Pflanzen und photosynthetisch aktiven Orga­ nismen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen.

4. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen und photosynthetisch aktiven Organismen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder eine mit dieser hybridi­ sierende oder zur Gesamtsequenz oder zu Teilsequenzen homolo­ gen DNA-Sequenz in Pflanzen und photosynthetisch aktiven Or­ ganismen exprimiert wird.

5. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man eine Expressionskassette enthaltend einen Promotor, eine Signalsequenz, eine DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 und einen Terminator oder eine mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, in Kallus­ gewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzenzel­ len einbringt.

6. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe des Stammes Agrobacterium tumefaciens, der Elektroporation oder der particle bombardment Methode erfolgt.

7. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen und Tocotrienolen enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 5.

8. Pflanze nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Ca­ nola, Gerste. Hafer, Weizen, Raps, Mais, Roggen, Tagetes oder Sonnenblume.

9. Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder einer mit dieser hybridisierende DNA-Sequenz gemäß An­ spruch 1 zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizie­ rung von Inhibitoren der 2-Methyl-6-phytylhydrochinon-methyl- transferase.

10. Testsystem basierend auf der Expression der DNA-Sequenz SEQ-ID Nr. 1 oder SEQ-ID Nr. 7 oder einer mit dieser hybridi­ sierende DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung von Inhibitoren der 2-Methyl-6-phytylhydrochinonmethyltransfe­ rase.