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DE19929363A1 - Gene aus Corynebacterium glutamicum für die Folsäurebiosynthese und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure - Google Patents

Gene aus Corynebacterium glutamicum für die Folsäurebiosynthese und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure

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DE19929363A1
DE19929363A1 DE19929363A DE19929363A DE19929363A1 DE 19929363 A1 DE19929363 A1 DE 19929363A1 DE 19929363 A DE19929363 A DE 19929363A DE 19929363 A DE19929363 A DE 19929363A DE 19929363 A1 DE19929363 A1 DE 19929363A1
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amino
amino acids
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hydroxy
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Matthias Mack
Karin Herbster
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BASF Lynx Bioscience AG
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Abstract

Die vorliegende Erfindung besteht in Nucleotidsequenzen von vier Genen (folE, folP, folB und folK) aus Corynebacterium glutamicum für die Folsäurebiosynthese und ihr Einsatz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure.

Description

Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit dem Herstellungsverfah­ ren für Folsäure durch Fermentation mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Organismus. Diese Erfindung besteht aus den Nucleo­ tidsequenzen von vier Genen (folE, folP, folB und folK) aus Cory­ nebacterium glutamicum für die Folsäurebiosynthese und deren Ein­ satz zur mikrobiellen Herstellung von Folsäure. Diese vier Gene bilden ein Operon und werden in der folgenden Reihenfolge trans­ kribiert: folB, folP, folB, folK.
Folsäure ist essentiell für tierische Organismen. Ihr Derivat Tetrahydrofolat ist in Zellen des tierischen Organismus ein sehr vielseitiger Carrier von aktivierten Einkohlenstoffeinheiten. Folsäure besteht aus drei Gruppen: einem substituierten Pteridin­ ring, p-Aminobenzoat und Glutamat. Säuger können einen Pteridin­ ring nicht synthetisieren. Sie nehmen Folsäure mit der Nahrung und von Mikroorganismen in ihrem Darmtrakt auf. Folsäuremangel führt hauptsächlich zu Läsionen in den Schleimhäuten.
Die kommerzielle Bedeutung der Folsäure liegt im Futtermittel- und Lebensmittelmarkt. Folsäure wird hauptsächlich als Nahrungs­ mittelzusatz eingesetzt.
Mikroorganismen können zur fermentativen Herstellung von Folsäure eingesetzt werden. Man kann sie durch gentechnische Veränderung des Biosynthesewegs der Folsäure in ihrer Folsäurebiosyntheselei­ stung optimieren. Gentechnische Veränderung bedeutet in diesem Zusammenhang, die Anzahl der Kopien und/oder die Transkriptions­ geschwindigkeit der Gene des Biosynthesewegs für die Folsäure zu erhöhen. Als Folge davon steigt der Anteil an Genprodukt und da­ mit auch die intrazelluläre Enzymaktivität. Erhöhte Enzym­ aktivität führt zu einer vermehrten Umwandlungsgeschwindigkeit der Nahrung (z. B. Glucose) zu Folsäure und damit auch zu einer erhöhten Produktkonzentration. Zur gentechnischen Veränderung müssen die Nucleotidsequenzen der Gene des Folsäurebiosynthese­ wegs identifiziert werden. Diese Erfindung befaßt sich mit vier neuen Gensequenzen für die Folsäurebiosynthese aus Corynebacte­ rium glutamicum und mit ihrem Einsatz zur mikrobiellen Herstel­ lung von Folsäure.
Ein Teil der Erfindung besteht im folE-Genprodukt. SEQ ID NR. 2 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folE-Genprodukt kodiert ein Polypeptid aus 202 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 22 029 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktio­ nellen Derivaten dieses Polypeptids, die man erhalten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 2 durch Deletion, Insertion oder Substitu­ tion oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Sub­ stitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 25% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 15% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzy­ matische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenord­ nung liegt wie die des Polypeptids mit der Sequenz SEQ ID NR. 2. Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem folP-Genprodukt. SEQ ID NR. 4 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folP-Genpro­ dukt kodiert ein Polypeptid aus 285 Aminosäuren mit einem Moleku­ largewicht von 29 520 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktionellen Derivaten dieses Polypeptids, die man er­ halten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 4 durch Deletion, Inser­ tion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 40% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 25% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzymatische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des POlypeptids mit der Se­ quenz SEQ ID NR. 4.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem folB-Genprodukt. SEQ ID NR. 6 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folR-Genpro­ dukt kodiert ein Polypeptid aus 131 Aminosäuren mit einem Moleku­ largewicht von 14 020 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktionellen Derivaten dieses Polypeptids, die man er­ halten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 6 durch Deletion, Inser­ tion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 30% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 20% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzymatische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des Polypeptids mit der Se­ quenz SEQ ID NR. 6.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem folK-Genprodukt. SEQ ID NR. 8 beschreibt eine Polypeptidsequenz. Das folK-Genpro­ dukt kodiert ein Polypeptid aus 160 Aminosäuren mit einem Moleku­ largewicht von 18 043 Da. Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit funktionellen Derivaten dieses Polypeptids, die man er­ halten kann, wenn man in der SEQ ID NR. 8 durch Deletion, Inser­ tion oder Substitution oder durch eine Kombination von Deletion, Insertion und Substitution eine oder mehrere Aminosäuren, vorzugsweise bis zu 40% der Aminosäuren ersetzt, am besten bis zu 30% der Aminosäuren. Mit dem Ausdruck funktionelles Derivat ist gemeint, daß die enzymatische Aktivität des Derivats noch in der gleichen Größenordnung liegt wie die des Polypeptids mit der Se­ quenz SEQ ID NR. 8.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in den Polynucleotidse­ quenzen, die die oben beschriebenen Polypeptide kodieren. Die Po­ lynucleotidsequenzen lassen sich ausgehend von Sequenzen, die man aus Corynebacterium glutamicum isoliert (d. h. SEQ ID NR. 1, 3, 5 und 7), erzeugen, in dem man diese Sequenzen durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert oder nach Rückübersetzung des entsprechen­ den Polypeptids mit dem genetischen Code eine chemische Total­ synthese ausführt.
Diese Polynucleotidsequenzen lassen sich vorzugsweise einsetzen zur Transformation von Wirtsorganismen, und hierbei vorzugsweise von Mikroorganismen, und zwar in Form von Genkonstrukten, die zu­ mindest eine Kopie eines dieser Polynucleotide zusammen mit min­ destens einer regulatorischen Sequenz enthalten. Regulatorische Sequenzen beinhalten Promotoren, Terminatoren, Verstärker und ri­ bosomale Bindungsstellen.
Bevorzugte Wirtsorganismen für die Transformation mit diesen Gen­ konstrukten sind Corynebacterium- und Bacillus-Arten. Auch jeden beliebigen eukaryontischen Mikroorganismus kann man einsetzen, vorzugsweise Hefestämme der Gattung Ashbya, Candida, Pichia, Sac­ charomyces und Hansenula.
Ein weiterer Teil der Erfindung besteht in dem Verfahren zur Her­ stellung von Folsäure durch Kultivierung eines Wirtsorganismus, der in der oben beschriebenen Art transformiert ist, und in der nachfolgenden Isolierung der Folsäure.
Die Verfahren und die Vorgehensweisen zur Kultivierung von Mikro­ organismen und zur Isolierung von Folsäure aus einer mikrobiellen Produktion sind dem geschulten Personal geläufig.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung genauer beschrie­ ben, ebenso ihre Anwendung zur gentechnischen Veränderung von Mi­ kroorganismen zur Steigerung der Syntheseleistung von Folsäure.
Beispiel 1 Darstellung einer Genombibliothek aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
DNA aus dem Genom von Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 läßt sich nach Standardmethoden gewinnen, die bereits beschrieben sind, z. B. von J. Altenbuchner und J. Cullum (1984, Mol. Gen. Genet. 195: 134-138). Die Genombibliothek läßt sich nach Standard­ vorschriften (z. B.: Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) mit je­ dem beliebigen Klonierungsvektor herstellen, z. B. pBluescript II KS-(Stratagene) oder ZAP Express™ (Stratagene). Dabei kann man jede beliebige Fragmentgröße benutzen, vorzugsweise Sau3AI-Frag­ mente mit einer Länge von 2-9 kb, die sich in Klonierungsvektoren mit verdautem BamHI einbinden lassen.
Beispiel 2 Analyse der Nucleinsäuresequenz der Genombibliothek
Einzelne E. coli-Klone kann man aus der im Beispiel 1 dargestell­ ten Genombibliothek auswählen. E. coli-Zellen werden nach Stan­ dardvorfahren in geeigneten Medien kultiviert (z. B. LB ergänzt mit 100 mg/l Ampicillin), danach läßt sich die Plasmid-DNA iso­ lieren. Klont man Genomfragmente aus der DNA von Corynebacterium glutamicum in pBluescript II KS- (siehe Beispiel 1), läßt sich die DNA mit Hilfe der Oligonucleotide 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' und 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' sequenzieren.
Beispiel 3 Computeranalyse der Sequenzen der isolierten Nukleinsäuren
Die Nucleotidsequenzen lassen sich z. B. mit Hilfe des BLASTX-Al­ gorithmus (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410) an­ einanderfügen. Auf diesem Weg kann man neuartige Sequenzen ent­ decken und die Funktion dieser neuartigen Gene aufklären.
Beispiel 4 Identifizierung eines E, coli-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die GTP-Cyclohydrolase I (EC 3.5.4.16) enthält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 1 beschrieben ist. Bei der Anwen­ dung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Se­ quenz Ähnlichkeit mit GTP-Cyclohydrolasen I (FolE; EC 3.5.4.16) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der GTP-Cyclohydrolase-I (FolE) aus Mycobacteriwn tuberculosis (NRDB O06273; 72% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 5 Identifizierung eines E. coli-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die Dihydropteroat-Synthase (EC 2.5.1.15) enthält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 3 beschrieben ist. Bei der Anwen­ dung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Se­ quenz Ähnlichkeit mit Dihydropteroat-Synthasen (FolP; EC 2.5.1.15) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der Dihydropteroat-Synthase (FolP) aus Mycobacterium tu­ berculosis (NRDB O06274; 53% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 6 Identifizierung eines E. coli-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die Dihydroneopterin-Aldolase (EC 4.1.2.25) enthält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 5 beschrieben ist. Bei der Anwen­ dung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Se­ quenz Ähnlichkeit mit Dihydroneopterin-Aldolasen (FolB; EC 4.1.2.25) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der Dihydroneopterin-Aldolase (FolB) aus Mycobacterium tuberculosis (NRDB O06275; 61% Übereinstimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 7 Identifizierung eines E. coli-Klons, der eine Nucleotidsequenz des Gens für die 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteri­ din-pyrophosphokinase (EC 2.7.6.3) enthält
Bei der Analyse der E. coli-Klone, wie sie im Beispiel 2 be­ schrieben wurde, an die sich die im Beispiel 3 beschriebene Analyse der dabei erhaltenen Sequenzen anschloß, ergab sich eine Sequenz, wie sie mit SEQ ID NR. 7 beschrieben ist. Bei der Anwen­ dung des BLASTX-Algorithmus (siehe Beispiel 3) ergab diese Se­ quenz Ähnlichkeit mit 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydrop­ teridin-pyrophosphokinasen (FolK; EC 2.7.6.3) aus verschiedenen Organismen. Die größte Ähnlichkeit war mit der 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki­ nase (FolK) aus Mycobacterium leprae (EMBL AL023093; 43% Überein­ stimmung auf der Stufe der Aminosäuren).
Beispiel 8 Einsatz der Gene für die GTP-Cyclohydrolase I, für die Dihydrop­ teroat-Synthase, für die Dihydroneopterin-Aldolase und für die 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki­ nase aus Corynebacterium glutamicum zur Herstellung von Folsäure
Die Gene für die GTP-Cyclohydrolase I, für die Dihydropteroat- Synthase, für die Dihydroneopterin-Aldolase und für die 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydropteridin-pyrophosphoki­ nase aus Corynebacterium glutamicum lassen sich mit Hilfe geei­ gneter Klonierungs- und Expressionssysteme in Corynebacterium glutamicum oder in jeden beliebigen anderen Mikroorganismus ein­ bringen. Man kann gentechnisch veränderte Mikroorganismen her­ stellen, die sich vom Wildtyp-Organismus hinsichtlich der Aktivität oder der Anzahl der Genkopien unterscheiden. Diese neu­ artigen, gentechnisch veränderten Stämme lassen sich zur Herstel­ lung von Folsäure einsetzen.
Sequenzliste

Claims (8)

1. Ein Polypeptid mit GTP-Cyclohydrolase-I-Aktivität, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
  • a) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 2 beschrieben ist
  • b) ein Polypeptid das im Vergleich zu dem in (a) durch Dele­ tion, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren verändert ist.
2. Ein Polypeptid mit Dihydropteroat-Synthaseaktivität, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
  • a) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 4 beschrieben ist;
  • b) ein Polypeptid das im Vergleich zu dem in (a) durch Dele­ tion, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren verändert ist.
3. Ein Polypeptid mit Dihydroneopterin-Aldolaseaktivität, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
  • a) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 6 beschrieben ist;
  • b) ein Polypeptid, das im Vergleich zu dem in (a) durch Deletion, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren verändert ist.
4. Ein Polypeptid mit 2-Amino-4-hydroxy-6-hydroxymethyldihydrop­ teridin-pyrophosphokinaseaktivität, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:
  • a) ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID NR. 8 beschrieben ist;
  • b) ein Polypeptid, das im Vergleich zu (a) durch Deletion, Insertion oder Substitution einer oder mehrerer Amino­ säuren verändert ist.
5. Ein Polynucleotid, das ein dem Anspruch 1, 2, 3 oder 4 ent­ sprechendes Polypeptid kodiert.
6. Ein Genkonstrukt mit mindestens einer Kopie eines dem An­ spruch 5 entsprechenden Polynucleotids zusammen mit minde­ stens einer regulatorischen Sequenz.
7. Ein Wirtsorganismus, der mit einem dem Anspruch 6 entspre­ chenden Genkonstrukt transformiert ist.
8. Verfahren zur Herstellung von Folsäure durch Kultivieren eines dem Anspruch 7 entsprechenden Wirtsorganismus mit nach­ folgender Isolierung der Folsäure.
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