DE19926068C1

DE19926068C1 - Muteine des Bilin-Bindungsproteins

Info

Publication number: DE19926068C1
Application number: DE19926068A
Authority: DE
Inventors: Arne Skerra; Steffen Schlehuber
Original assignee: Individual
Current assignee: Pieris Proteolab AG
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2001-01-11
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: US7001882B1; CA2376638A1; WO2000075308A1; AU5963900A; EP1181368A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf Muteine des Bilin-Bindungsproteins mit Bindungsfähigkeit für Digoxigenin sowie Fusionsproteine solcher Muteine, Verfahren zur Herstellung derartiger Muteine und ihrer Fusionsproteine sowie deren Verwendung zum Nachweis oder zur Bindung von mit Digoxigenin markierten Biomolekülen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen des Bilin-Bindungsproteins, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es (a) Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden vermag, (b) Ouabain, Testosteron und 4-Aminofluorescein nicht bindet und (c) an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 des Bilin-Bindungsproteins eine Aminosäuresubstitution aufweist. Aufgrund ihres einfachen molekularen Aufbaus weisen die erfindungsgemäßen Muteine bei Herstellung und Verwendung Vorteile im Vergleich zu Antikörpern gegen die Digoxigeningruppe auf.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Muteine des Bilin-Bindungs proteins mit Bindungsfähigkeit für Digoxigenin sowie Fusions proteine solcher Muteine, Verfahren zur Herstellung derartiger Muteine und ihrer Fusionsproteine sowie deren Verwendung zum Nachweis oder zur Bindung von mit Digoxigenin markierten Bio molekülen.

Die Digoxigeningruppe ist ein heute in der Molekularbiologie weit verbreitetes Instrument für den nichtradioaktiven Nach weis von Nukleinsäuren, Proteinen und anderen Biomolekülen. Zu diesem Zweck wird das Biomolekül mit einem reaktiven Derivat des Digoxigenins meist kovalent modifiziert, was den an schließenden Nachweis des Moleküls mit einem gegen die Digoxi geningruppe gerichteten Antikörper, bzw. einem Konjugat aus einem entsprechenden Antikörperfragment und einem Reporter enzym, gemäß in der Biochemie allgemein üblichen Methoden ge stattet.

Dem Fachmann sind eine ganze Reihe von reaktiven Digoxigenin derivaten bekannt, die teilweise auch kommerziell erhältlich sind. Beispielsweise eignen sich Digoxigenin-3-O-methyl carbonyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxy-succinimidester (DIG- NHS), Digoxigenin-3-O-succinyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxy succinimidester und 3-Amino-3-desoxydigoxigenin-hemisuccin amid-succinimidylester zur kovalenten Kopplung mit Proteinen, insbesondere mit den Aminogruppen von exponierten Lysinseiten ketten. Mit 3-Iodacetylamino-3-desoxydigoxigenin lassen sich vor allem Thiolgruppen in Proteinen oder anderen Biomolekülen selektiv mit der Digoxigeningruppe markieren. Synthetische Oligodesoxynukleotide können mit denselben reaktiven Digoxi geninderivaten gekoppelt werden, sofern sie im Verlauf der Synthese mit geeigneten freien Amino- oder Thiolgruppen verse hen wurden.

Zur direkten Markierung von Nukleinsäuren eignen sich zudem cis-Platinkomplexe von Digoxigeninderivaten (DIG Chem-Link Reagent) oder Carbodiimidgruppen enthaltende Digoxigeninderi vate (offenbart in der europäischen Patentveröffentlichung EP 0 806 431 A2). Alternativ ist es im Fall von Desoxyribo nukleinsäuren möglich, diese im Verlauf einer matrizenabhängi gen enzymatischen Synthese unter Zuhilfenahme einer DNA-Poly merase und eines mit der Digoxigeningruppe gekoppelten Desoxy nukleosidtriphosphats, z. B. Digoxigenin-11-dUTP, Digoxigenin- 11-ddUTP oder Digoxigenin-16-dATP, zu markieren. Analog eignet sich Digoxigenin-11-UTP zum Einbau in enzymatisch syntheti sierte RNA. Darüber hinaus können Oligodesoxynukleotide direkt bei der automatisierten DNA-Synthese unter Einsatz geeigneter aktivierter Bausteine, z. B. sogenannter "Virtual Nucleo tides", mit der Digoxigeningruppe markiert werden. Derartige mit der Digoxigeningruppe gekoppelte Nukleinsäuren eignen sich als nichtradioaktive Gensonden zum Nachweis komplementärer Nukleotidsequenzen durch Hybridisierung, z. B. in Northern oder Southern Blots (offenbart in der europäischen Patentver öffentlichung EP 0 324 474 A1).

Mit der Digoxigeningruppe markierte Proteine oder Glycoprotei ne sind insbesondere von Nutzen, um beispielsweise entspre chende Antigene bzw. dagegen gerichtete Antikörper in immun chemischen Testverfahren wie ELISA (Enzyme-Linked Immuno- Sorbent Assay) zu bestimmen. Der eigentliche Nachweis des mit der Digoxigeningruppe konjugierten Biomoleküls erfolgt norma lerweise mit einem gegen Digoxigenin gerichteten Antikörper, in der Regel in der Form eines Konjugats aus dem Fab-Fragment dieses Antikörpers mit einem geeigneten Enzym, wie z. B. der Alkalischen Phosphatase oder der Meerrettich-Peroxidase, als Markierung. Die enzymatische Aktivität dient anschließend zur Quantifizierung durch Katalyse einer chromogenen, fluorogenen oder chemolumineszenten Reaktion. Verschiedene Antikörper ge gen die Digoxigeningruppe sind bekannt (Mudgett-Hunter et al., J. Immunol. 129 (1982), 1165-1172; Jeffrey et al., J. Mol. Biol. 248 (1995), 344-360).

Die Verwendung von Antikörpern hat jedoch mehrere Nachteile. So ist die Herstellung von monoklonalen Antikörpern in Hybri domzellkulturen aufwendig, und die Proteolyse zum Fab-Fragment sowie die Produktion von Konjugaten mit Reporterenzymen erfor dert zusätzliche schwierige Verfahrensschritte. Aber selbst die gentechnische Gewinnung von Antikörpern ist nicht einfach, was hauptsächlich darin begründet ist, daß sich Antikörper wie auch deren antigenbindende Fragmente in strukturell kompli zierter Weise aus zwei verschiedenen Polypeptidketten zusam mensetzen. Bei der gentechnischen Manipulation von Antikörpern müssen deshalb zwei Gene gleichzeitig gehandhabt werden. Außerdem ist die Ausbeute an korrekt gefalteten Antikörper fragmenten bei deren gentechnischer Produktion häufig gering. Wie dem Fachmann bekannt ist, gilt dies umso mehr, wenn rekom binante Fusionsproteine aus Fab-Fragmenten von Antikörpern und Enzymen hergestellt werden sollen.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, alternative Polypeptid-Reagenzien zum Nachweis der Digoxigeningruppe zu entwickeln, welche sich auf einfache Weise produzieren lassen.

In einem evolutiven Forschungsansatz wurde nun überraschender weise festgestellt, daß sich Muteine des strukturell aus einer einzigen Polypeptidkette aufgebauten Bilin-Bindungsproteins (Schmidt und Skerra, Eur. J. Biochem. 219 (1994), 855-863) eignen, um die Digoxigeningruppe durch Bindung mit hoher Affi nität nachzuweisen, wobei die Erkennung des Digoxigenins er staunlich selektiv gegenüber anderen Steroiden erfolgt.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Poly peptid, ausgewählt aus Muteinen des Bilin-Bindungsproteins, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es

a) Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden ver mag,
b) Ouabain, Testosteron und 4-Aminofluorescein nicht bindet und
c) an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 des Bilin-Bindungsproteins eine Aminosäuresubstitution aufweist.

Außerhalb des Bereichs der Aminosäurepositionen 28, 31, 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 können die Muteine der vorliegenden Erfindung der Aminosäure sequenz des Bilin-Bindungsproteins aus Pieris brassicae ent sprechen. Andererseits kann die Aminosäuresequenz der erfin dungsgemäßen Polypeptide auch außerhalb der genannten Positio nen Unterschiede zum Bilin-Bindungsprotein aufweisen. Derar tige Varianten der Sequenz des Bilin-Bindungsproteins umfassen natürlich vorkommende sowie künstlich erzeugte Varianten, und unter den Abweichungen werden Substitutionen, Insertionen, De letionen von Aminosäureresten sowie N- und/oder C-terminale Additionen verstanden.

Z. B. können die erfindungsgemäßen Muteine des Bilin-Bindungs proteins Aminosäuresubstitutionen aufweisen, welche eine Oli gomerisierung des Bilin-Bindungsproteins vermeiden, wie die Substitution Asn(1) → Asp, oder um eine proteolytische Spaltung innerhalb der Polypeptidkette zu unterdrücken, die bei der Produktion in E. coli auftreten kann, z. B. durch die Substi tution Lys(87) → Ser. Weiterhin können in die für die Muteine des Bilin-Bindungsproteins kodierende Nukleinsäure die Muta tionen Asn(21) → Gln und Lys(135) → Met eingeführt werden, um beispielsweise die Klonierung eines Genabschnitts über zwei neue BstXI-Restriktionsschnittstellen an diesen Positionen zu erleichtern. Ebenso betrifft die vorliegende Erfindung die ge zielte Einführung von Aminosäuresubstitutionen innerhalb oder außerhalb der genannten Positionen, um ganz allgemein bestimm te Eigenschaften des erfindungsgemäßen Muteins zu verbessern, z. B. seine Faltungsstabilität oder -effizienz oder seine Wi derstandsfähigkeit gegenüber Proteasen.

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Polypeptide, Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden, kann durch übliche Verfahren, z. B. ELISA, Fluoreszenztitration, Titrationskalo rimetrie, Oberflächen-Plasmonresonanzmessungen oder Blotting- Verfahren, beispielsweise Western-Blotting, Southern-Blotting oder Northern-Blotting, bestimmt werden. Blotting-Methoden können verwendet werden, um Konjugate des Digoxigenins mit Proteinen oder Nukleinsäuren auf eine Membran zu transferieren und diese anschließend mit einem der erfindungsgemäßen Mutei ne, einem Konjugat dieses Muteins oder einem Fusionsprotein dieses Muteins nachzuweisen.

Eine quantitative Kenngröße für die Bindungsaffinität liefern etablierte thermodynamische Parameter, wie etwa die Affini tätskonstante oder die Dissoziationskonstante für den Komplex aus dem Mutein und dem gebundenen Liganden, z. B. Digoxigenin. Aber auch eine qualitative Bestimmung der Bindungsfähigkeit ist möglich, z. B. anhand der Intensität eines Bindungssignals aufgrund einer chromogenen Reaktion bzw. eines Farbnieder schlags, welcher mit Hilfe einer der genannten Blotting-Metho den erhalten wird.

Bevorzugte erfindungsgemäße Muteine werden in einem zweistufi gen evolutiven Prozeß erhalten. Die Zufallsmutagenese des Bilin-Bindungsproteins und wiederholte Selektion von Muteinen mit Affinität zur Digoxigeningruppe aus dieser Bibliothek, wo bei freies Digoxigenin zur kompetitiven Anreicherung verwendet wird, liefert Muteine des Bilin-Bindungsproteins, die die Digoxigeningruppe erkennen, wobei aber die Affinität noch ver gleichsweise niedrig ist. Die erneute Mutagenese eines solchen Muteins an den Aminosäurepositionen 28, 31, 34, 35, 36 und 37, nun gefolgt von einer wiederholten Anreicherung durch Komplex bildung mit der Digoxigeningruppe und anschließender Dissozia tion des gebildeten Komplexes im sauren Milieu, führt darauf hin zur Gewinnung von Muteinen mit wesentlich höherer Affini tät zur Digoxigeningruppe.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß die Affinitätskon stante zwischen solchen erfindungsgemäßen Polypeptiden und Digoxigenin mindestens 10⁷ M^-1 beträgt. Anders ausgedrückt heißt dies, daß die Dissoziationskonstante des Komplexes aus dem erfindungsgemäßen Polypeptid und Digoxigenin 100 nM oder kleiner ist. Einzelne Exemplare zeigen sogar Dissoziationskon stanten von 35 nM oder kleiner, wie in den Beispielen ausge führt ist.

Neben dem Digoxigenin können von den erfindungsgemäßen Mutei nen des Bilin-Bindungsproteins auch Derivate des Digoxigenins als Ligand gebunden werden, z. B. Digoxin, Digitoxin oder Digitoxigenin. Weiterhin können Konjugate dieser chemischen Verbindungen, d. h. mit Digoxigenin, Digoxin, Digitoxin oder Digitoxigenin kovalent oder über einen Metallkomplex verknüpf te Nukleinsäuren, Polypeptide, Kohlenhydrate, andere natürli che oder synthetische Biomoleküle, Makromoleküle oder nieder molekulare Verbindungen, von den erfindungsgemäßen Muteinen des Bilin-Bindungsproteins gebunden werden. Vorzugsweise wer den zur Herstellung solcher Konjugate die dem Fachmann bekann ten reaktiven Derivate von Digoxigenin, Digoxin, Digitoxin oder Digitoxigenin eingesetzt, wie sie beispielsweise weiter oben angegeben sind.

Bevorzugte erfindungsgemäße Muteine, welche durch den be schriebenen zweistufigen Prozeß gewonnen wurden, zeigen im Vergleich zu Digoxigenin eine noch höhere Affinität zu Digito xin oder Digitoxigenin, deren Steroidsystem sich bloß durch das Fehlen einer Hydroxygruppe von dem des Digoxigenins unter scheidet. Überraschenderweise zeigen diese Muteine eine ausge prägte Spezifität in Bezug auf die Digoxigenin- bzw. Digitoxi geningruppe, was sich darin ausdrückt, daß andere Steroide oder Steroidgruppen wie Ouabain oder Testosteron mit sehr viel geringerer Affinität, falls überhaupt, gebunden werden. Auch Derivate des Fluoresceins, wie 4-Aminofluorescein, werden of fensichtlich nicht gebunden. Damit ist gemeint, daß Ouabain, Testosteron oder 4-Aminofluorescein jeweils eine Dissozia tionskonstante von mindestens 10 µM, bevorzugt mindestens 100 µM, gegenüber den erfindungsgemäßen Muteinen des Bilin-Bin dungsproteins aufweisen.

In dieser Spezifitätseigenschaft unterscheiden sich diese Muteine erheblich von anderen Muteinen des Bilin-Bindungspro teins sowie von gegen die Digoxigeningruppe gerichteten Anti körpern, wie z. B. dem Antikörper 26-10 (Chen et al., Protein Eng. 12 (1999), 349-356), welcher Ouabain mit beträchtlicher Affinität bindet, was den erfindungsgemäßen Muteinen des Bilin-Bindungsproteins einen besonderen Vorteil verleiht. Es ist überraschend, daß gerade die zusätzlichen Aminosäuresub stitutionen an den Positionen 28, 31, 34, 35, 36 und 37 zu den bevorzugten Muteinen des Bilin-Bindungsproteins führen. Bevor zugt sind daher solche Muteine, die mindestens eine oder alle der Aminosäuresubstitutionen Glu(28) → Gln, Lys(31) → Ala, Asn(34) → Asp, Ser(35) → His, Val(36) → Ile und Glu(37) → Thr tra gen.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Muteine tragen minde stens eine der Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus Glu(28) → Gln, Lys(31) → Ala, Asn(34) → Asp, Ser(35) → His, Val(36) → Ile, Glu(37) → Thr, Asn(58) → Arg, His(60) → Ser, Ile(69) → Ser, Leu(88) → Tyr, Tyr(90) → Ile, Lys(95) → Gln, Asn(97) → Gly, Tyr(114) → Phe, Lys(116) → Ser, Gln(125) → Met und Phe(127) → Leu im Vergleich zum Bilin-Bindungsprotein. Bei der gewählten Schreibweise ist jeweils zunächst die Aminosäure in dem natürlichen Bilin-Bindungsprotein (SWISS-PROT Datenbank- Zugriffscode P09464) zusammen mit der Sequenzposition für das mature Polypeptid in Klammern angegeben, und die entsprechende Aminosäure in einem erfindungsgemäßen Mutein ist nach dem Pfeil genannt. Nochmals besonders bevorzugte Muteine gemäß dieser Erfindung tragen alle der genannten Aminosäuresubstitu tionen.

Es ist überraschend, daß die Position 93 des Bilin-Bindungs proteins in den erfindungsgemäßen Muteinen nicht verändert ist, obwohl auch diese Aminosäure von der Mutagenese zur Her stellung der Zufallsbibliothek betroffen war. Bevorzugte Mu teine des Bilin-Bindungsproteins tragen daher an dieser Posi tion die Aminosäure Val.

Für bestimmte Nachweisverfahren ist es günstig, die Muteine des Bilin-Bindungsproteins der vorliegenden Erfindung in mar kierter Form zu verwenden. Demgemäß ist ein weiterer Gegen stand dieser Erfindung ein erfindungsgemäßes Polypeptid, wel ches dadurch gekennzeichnet ist, daß es zumindest eine Markie rung trägt. Geeignete Markierungsgruppen sind dem Fachmann be kannt und umfassen Enzymmarkierung, radioaktive Markierung, Fluoreszenzmarkierung, Chromophormarkierung, (Bio)-Lumines zenzmarkierung oder Markierung mit Haptenen, Biotin, Metall komplexen, Metallen oder kolloidalem Gold. Ganz allgemein ist die Markierung mit Substanzen bzw. Enzymen möglich, die in einer chemischen oder enzymatischen Reaktion einen bestimmba ren Stoff erzeugen. Dabei können alle für Antikörper bekannten Markierungen auch an die erfindungsgemäßen Muteine gekoppelt werden.

Eine für die praktische Anwendung besonders vorteilhafte Mög lichkeit besteht darin, die erfindungsgemäßen Muteine des Bilin-Bindungsproteins in der Form von Fusionsproteinen zu verwenden. Techniken zur Herstellung solcher Fusionsproteine mittels gentechnischer Methoden sind dem Fachmann bekannt. Ge eignete Fusionspartner für die erfindungsgemäßen Muteine wären Enzyme und andere Polypeptide, Proteine oder Proteindomänen. Derartige Fusionen wären geeignet, um dem Mutein des Bilin- Bindungsproteins zusätzliche Eigenschaften zu vermitteln, wie z. B. enzymatische Aktivität oder Affinität zu anderen Molekü len, wie Proteinen, Makromolekülen oder niedermolekularen Li ganden.

Beispielsweise sind Fusionen mit Enzymen, welche chromogene oder fluorogene Reaktionen katalysieren oder zur Freisetzung von cytotoxischen Agenzien dienen können, möglich. Weitere Beispiele für Fusionspartner, die in der Praxis von Vorteil sein können, sind Bindungsdomänen wie die Albumin-Bindungsdo mäne oder die Immunglobulin-Bindungsdomäne von Protein G oder Protein A, Antikörperfragmente, Oligomerisierungsdomänen, To xine oder andere Bindungsproteine und deren funktionelle Be standteile sowie Affinitätspeptide, wie z. B. das Strep-Tag oder das Strep-Tag II (Schmidt et al., J. Mol. Biol. 255 (1996), 753-766). Auch Proteine mit besonderen chromogenen oder fluorogenen Eigenschaften, wie z. B. das grün fluoreszie rende Protein, eignen sich als Fusionspartner. Weiterhin käme das Hüllprotein III eines filamentösen Bakteriophagen, wie M13, f1 oder fd, oder ein Fragment dieses Hüllproteins als Fusionspartner in Frage.

Unter dem Begriff Fusionsproteine sollen hier ganz allgemein auch solche erfindungsgemäßen Muteine des Bilin-Bindungspro teins verstanden werden, die mit einer Signalsequenz ausge stattet sind. Signalsequenzen am N-Terminus des erfindungsge mäßen Polypeptids können dazu dienen, dieses bei der Biosyn these in ein bestimmtes Zellkompartiment, z. B. das Periplasma von E. coli oder das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums einer eukaryontischen Zelle, bzw. in das die Zelle umgebende Medium zu dirigieren. Dabei wird die Signalsequenz normaler weise von einer Signalpeptidase abgespalten. Außerdem können andere Signal- bzw. Targeting-Sequenzen verwendet werden, die nicht unbedingt am N-Terminus des Polypeptids angebracht sein müssen, und die dessen Lokalisierung in speziellen Zellkompar timenten ermöglichen. Eine bevorzugte Signalsequenz zur Sekre tion in das Periplasma von E. coli ist die OmpA-Signalsequenz. Weitere Signalsequenzen sowie Targeting-Sequenzen sind im Stand der Technik in großer Zahl bekannt.

Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Muteine des Bilin-Bindungs proteins besteht darin, daß sich sowohl deren N-Terminus als auch deren C-Terminus zur Herstellung von Fusionsproteinen eignet. Im Gegensatz zu Antikörpern, bei denen sich der N-Ter minus sowohl der leichten als auch der schweren Immunglobulin kette in räumlicher Nähe zur Antigenbindungsstelle befinden, können bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden beide Enden der Polypeptidkette zur Herstellung von Fusionsproteinen verwendet werden, ohne daß die Bindung des Liganden beeinträchtigt wird.

Ein Gegenstand der Erfindung sind deshalb auch Fusionsproteine von Muteinen des Bilin-Bindungsproteins, wobei ein Enzym, ein anderes Protein oder eine Proteindomäne, eine Signalsequenz und/oder ein Affinitätspeptid an den Aminoterminus des Poly peptids in operabler Weise fusioniert ist. Ein nochmals weite rer Gegenstand der Erfindung sind Fusionsproteine von Muteinen des Bilin-Bindungsproteins oder von Fusionsproteinen mit dem Aminoterminus von Muteinen des Bilin-Bindungsproteins, wobei ein Enzym, ein anderes Protein oder eine Proteindomäne, eine Targeting-Sequenz und/oder ein Affinitätspeptid an den Carb oxyterminus des Polypeptids in operabler Weise fusioniert ist.

Ein bevorzugtes Enzym zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Fusionsproteine ist die bakterielle Alkalische Phosphatase (Sowadski et al., J. Mol. Biol. 186 (1985) 417-433). Diese kann einerseits am N-Terminus eines Muteins des Bilin-Bin dungsproteins oder am C-Terminus eines Muteins des Bilin-Bin dungsproteins angebracht sein. Zusätzlich kann ein solches Fusionsprotein eine Signalsequenz tragen, wie z. B. OmpA oder PhoA, die dessen Sekretion in das Periplasma von E. coli be wirkt, wo sich die Disulfidbindungen in der Polypeptidkette effizient ausbilden können. Weiterhin kann es mit einem Affi nitätspeptid ausgestattet sein, wie z. B. dem Strep-Tag II, welches dessen einfache Reinigung erlaubt. Spezifische erfin dungsgemäße Fusionsproteine sind in den Beispielen beschrie ben. Ein Vorteil eines derartigen Fusionsproteins besteht darin, daß es direkt eine chromogene, fluorogene oder chemolu mineszente Nachweisreaktion katalysieren kann, was seinen Ein satz zur Detektion der Digoxigeningruppe vereinfacht.

Ein weiterer Vorteil der Verwendung der Alkalischen Phosphata se zur Konstruktion erfindungsgemäßer Fusionsproteine besteht darin, daß dieses Enzym zu einem stabilen Homodimer assoziiert und demzufolge dem Mutein des Bilin-Bindungsproteins als Be standteil des Fusionsproteins die Eigenschaft der Bivalenz verleiht. Auf diese Weise kann bei der Bindung der Digoxige ningruppe ein Aviditätseffekt resultieren, der die Nachweis empfindlichkeit steigert. Ein solcher Aviditätseffekt ist ins besondere zu erwarten, wenn das mit Digoxigenin markierte Mo lekül an einer festen Phase adsorbiert ist, in oligomerer bzw. membrangebundener Form vorliegt oder mit mehreren Digoxigenin gruppen konjugiert ist. Andere homodimere Enzyme eignen sich analog zur Herstellung bivalenter Fusionsproteine mit den er findungsgemäßen Muteinen des Bilin-Bindungsproteins.

Abgesehen von der bakteriellen Alkalische Phosphatase können auch Phosphatasen aus eukaryontischen Organismen, wie z. B. die kalbsintestinale Phosphatase (CIP), zur Herstellung erfin dungsgemäßer Fusionsproteine verwendet werden. Diese zeichnen sich oftmals durch höhere enzymatische Aktivität aus (Murphy und Kantrowitz, Mol. Microbiol. 12 (1994), 351-357), was eine größere Nachweisempfindlichkeit bewirken kann. Auch Mutanten der bakteriellen Alkalischen Phosphatase mit verbesserter ka talytischer Aktivität (Mandecki et al., Protein Eng. 4 (1991), 801-804) lassen sich zur Konstruktion erfindungsgemäßer Fusi onsproteine verwenden. Weiterhin eignen sich andere dem Fach mann bekannte Enzyme, welche chromogene, fluorogene oder che molumineszente Reaktionen katalysieren, wie z. B. die β-Galac tosidase oder die Meerrettich-Peroxidase, zur Herstellung er findungsgemäßer Fusionsproteine. All diese Enzyme können dar über hinaus ebenso zur Markierung von Muteinen des Bilin-Bin dungsproteins eingesetzt werden, indem sie z. B. unter Verwen dung üblicher Kopplungsreagenzien mit dem separat gewonnenen Mutein oder einem Fusionsprotein des Muteins konjugiert wer den.

Unter einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäure, die eine für ein Mutein oder ein Fusions protein eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins kodierende Sequenz umfaßt. Diese Nukleinsäure kann Bestandteil eines Vek tors sein, auf dem eine operativ funktionelle Umgebung zur Ex pression der Nukleinsäure gegeben ist. Geeignete Vektoren sind in großer Zahl aus dem Stand der Technik bekannt und werden hierin nicht ausführlich beschrieben. Unter einer operativ funktionellen Umgebung werden solche Elemente verstanden, die die Transkription und/oder nachfolgende Prozessierung einer mRNA ermöglichen, begünstigen, erleichtern und/oder erhöhen. Beispiele für derartige Elemente sind etwa Promotoren, Enhan cer, Transkriptionsinitiationsstellen und -terminationsstel len, Translationsinitiationsstellen, Polyadenylierungssignale etc.

Die erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ihre Umgebung kann da bei dergestalt sein, daß die Biosynthese des Polypeptids im Cytosol erfolgt, wobei der Polypeptidsequenz ggf. ein Start- Methionin vorangestellt wird. In einer bevorzugten Ausfüh rungsform wird dagegen eine N-terminale Signalsequenz verwen det, insbesondere die OmpA- oder die PhoA-Signalsequenz, um das erfindungsgemäße Polypeptid in das Periplasma von E. coli zu dirigieren, wo die Signalsequenz von der Signalpeptidase abgespalten wird und sich die Polypeptidkette unter oxidativer Ausbildung der Disulfidbindungen falten kann. Eukaryontische Signalsequenzen können Verwendung finden, um das erfindungsge mäße Polypeptid in einem eukaryontischen Wirtsorganismus zu sekretieren. Grundsätzlich kommen zur Expression der erfin dungsgemäßen Nukleinsäure sowohl prokaryontische, bevorzugt E. coli, als auch eukaryontische Zellen wie z. B. Hefen in Be tracht.

Unter einem nochmals weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsge mäßen Muteins oder Fusionsproteins eines Muteins des Bilin- Bindungsproteins, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für das Mutein oder das Fusionsprotein eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins kodierende Nukleinsäure in einer bakte riellen oder eukaryontischen Wirtszelle zur Expression ge bracht wird und das Polypeptid aus der Zelle oder dem Kultur überstand gewonnen wird. In der Regel wird dazu zunächst eine geeignete Wirtszelle mit einem Vektor, der eine für ein erfin dungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäure umfaßt, trans formiert. Die Wirtszelle wird dann unter Bedingungen kulti viert, bei denen eine Biosynthese des Polypeptids erfolgt, und das erfindungsgemäße Polypeptid wird gewonnen.

Bezüglich des Herstellungsverfahrens ist zu beachten, daß die erfindungsgemäßen Muteine des Bilin-Bindungsproteins zwei strukturelle Disulfidbindungen aufweisen, und daß in entspre chenden Fusionsproteinen ggf. zusätzliche Disulfidbindungen vorliegen. Die mit der Proteinfaltung einhergehende Ausbildung dieser Disulfidbindungen ist in der Regel gewährleistet, wenn das erfindungsgemäße Polypeptid mit Hilfe einer geeigneten Signalsequenz in ein Zellkompartiment mit oxidierendem Thiol/Disulfid-Redoxmilieu dirigiert wird, beispielsweise das bakterielle Periplasma oder das Lumen des Endoplasmatischen Retikulums einer eukaryontischen Zelle. Das erfindungsgemäße Polypeptid läßt sich dabei durch Zellfraktionierung freisetzen oder aus dem Kulturüberstand gewinnen. Ggf. läßt sich die Fal tungseffizienz durch Überproduktion von Protein-Disulfidiso merasen, wie z. B. dem DsbC-Protein von E. coli, oder von Fal tungs-Hilfsproteinen steigern.

Andererseits ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Polypeptid im Cytosol einer Wirtszelle, bevorzugt E. coli, zu produzie ren. Es kann dann z. B. in Form von Einschlußkörpern gewonnen und anschließend in vitro renaturiert werden. Je nach Verwen dungszweck kann das Protein mittels verschiedener dem Fachmann bekannter Methoden gereinigt werden. Zur Reinigung der erfin dungsgemäßen Muteine des Bilin-Bindungsproteins eignet sich z. B. die Affinitätschromatographie mit einem Säulenmaterial, welches Digoxigeningruppen trägt. Zur Reinigung von Fusions proteinen der Muteine des Bilin-Bindungsproteins können die aus dem Stand der Technik bekannten Affinitätseigenschaften des Fusionsproteins ausgenutzt werden, z. B. die des Strep- Tags oder des Strep-Tags II (Schmidt und Skerra, J. Chromatogr. A 676 (1994), 337-345; Voss und Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), die der Albumin-Bindungsdomäne (Nygren et al., J. Mol. Recogn. 1 (1988), 69-74) oder die der Alkalischen Phosphatase (McCafferty et al., Protein Eng. 4 (1991) 955-961). Bei den Verfahren zur Herstellung der erfin dungsgemäßen Polypeptide ist die Tatsache, daß die Muteine des Bilin-Bindungsproteins nur aus einer einzelnen Polypeptidkette bestehen, von Vorteil, da weder dafür zu sorgen ist, daß meh rere verschiedene Polypeptidketten gleichzeitig innerhalb einer Zelle synthetisiert werden müssen, noch, daß unter schiedliche Polypeptidketten in funktioneller Weise miteinan der assoziieren.

Die praktischen Anwendungsmöglichkeiten für die erfindungsge mäßen Muteine des Bilin-Bindungsproteins entsprechen im we sentlichen denjenigen herkömmlicher Antikörper oder Antikör perfragmente mit Bindungsaffinität zu Digoxigenin. Demnach be trifft die Erfindung auch die Verwendung eines erfindungsge mäßen Muteins oder eines Fusionsproteins eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins in einem Verfahren zum Nachweis, zur Bestimmung, zur Immobilisierung oder zur Abtrennung von Digo xigenin oder von Konjugaten des Digoxigenins mit Proteinen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, anderen biologischen oder syn thetischen Makromolekülen oder niedermolekularen chemischen Verbindungen.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Muteine des Bilin-Bin dungsproteins oder ihrer Fusionsproteine in Nachweisverfahren kann im wesentlichen analog zu den entsprechenden Nachweisver fahren erfolgen, die für Antikörper gegen Digoxigenin, sowie deren Fragmente und/oder Konjugate, bekannt sind. Unter einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung deshalb ein Verfahren zum Nachweis der Digoxigeningruppe, wobei ein Mutein des Bilin-Bindungsproteins oder ein Fusionsprotein eines Mu teins des Bilin-Bindungsproteins mit Digoxigenin oder mit Kon jugaten des Digoxigenins unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung des Muteins an die Digoxigeningruppe zu bewirken, in Kontakt gebracht und das Mutein oder das Fusionsprotein des Muteins bestimmt wird.

Zu diesem Zweck kann das Mutein direkt, z. B. durch kovalente Kopplung, markiert sein. Aber auch indirekte Markierungen, z. B. mittels markierter Antikörper gegen das Bilin-Bindungspro tein oder dessen Muteine oder gegen Domänen von Fusionsprotei nen dieser Muteine, können eingesetzt werden. Besonders vor teilhaft ist die Verwendung erfindungsgemäßer Fusionsproteine mit einem Enzym, z. B. der Alkalischen Phosphatase, anstelle eines markierten Muteins des Bilin-Bindungsproteins. In diesem Fall läßt sich das Bestimmungsverfahren mit einer besonders geringen Zahl von Verfahrensschritten gestalten, wobei z. B. die Fähigkeit zur Katalyse einer chromogenen, fluorogenen oder lumineszenten Nachweisreaktion durch das Enzym als Bestandteil des Fusionsproteins unmittelbar ausgenutzt werden kann. Die leichte Verfügbarkeit solcher Fusionsproteine stellt hierbei einen besonderen Vorteil im Vergleich zu entsprechenden Fusi onsproteinen herkömmlicher Antikörper dar. Die Ausnutzung des oben beschriebenen Aviditätseffekts im Fall eines oligomeren Fusionsproteins stellt einen weiteren Vorteil bei einem sol chen Verfahren dar.

Ein Bestimmungsverfahren für die Digoxigeningruppe kann z. B. qualitativ zum Nachweis von mit der Digoxigeningruppe konju gierten Nukleinsäuren in Southern- bzw. Northern-Blots oder von mit der Digoxigeningruppe konjugierten Proteinen in Western-Blots durchgeführt werden. Ein Bestimmungsverfahren kann auch quantitativ zum Nachweis von mit der Digoxigenin gruppe konjugierten Proteinen im ELISA durchgeführt werden. Zudem eignet sich ein erfindungsgemäßes Bestimmungsverfahren zum indirekten Nachweis von nicht mit Digoxigenin konjugierten Proteinen oder anderen Molekülen unter Verwendung eines gegen das Protein oder Molekül gerichteten Bindungsproteins, z. B. eines Antikörpers bzw. seines Fragments, welches mit der Digo xigeningruppe konjugiert ist. Auch der indirekte Nachweis von nicht mit Digoxigenin konjugierten Nukleinsäuren unter Verwen dung eines mit dieser Nukleinsäure hybridisierenden Gensonde, welche mit der Digoxigeningruppe konjugiert ist, ist möglich. Eine Anwendung in der medizinischen Diagnostik oder Therapie ergibt sich zudem bei der Bestimmung von Digoxigenin, Digoxin, Digitoxin oder Digitoxigenin, ohne daß diese Liganden mit einem anderen Molekül konjugiert sein müssen.

Die erfindungsgemäßen Muteine oder deren Fusionsproteine kön nen auch zur Immobilisierung eines mit der Digoxigeningruppe konjugierten Moleküls verwendet werden. Diese Immobilisierung erfolgt vorzugsweise an mit den Muteinen oder ihren Fusions proteinen beschichteten Festphasen, wie etwa Mikrotiterplat ten, Immunosticks, Mikrobeads aus organischen, anorganischen oder paramagnetischen Materialien oder Sensoroberflächen.

Dementsprechend können die erfindungsgemäßen Muteine oder de ren Fusionsproteine ebenfalls zur Abtrennung von Digoxigenin, Digoxin, Digitoxin oder Digitoxigenin oder eines mit einer dieser Verbindungen konjugierten Moleküls verwendet werden. In diesem Fall kommen neben den genannten Festphasen auch Säulen materialen zur Beschichtung mit den Muteinen oder ihren Fusi onsproteinen in Betracht. Vorzugsweise kann diese Beschichtung durch Kopplung mittels chemisch reaktiver Gruppen auf geeigne ten Säulenmaterialien erfolgen. Derartig beschichtete Säulen materialien können zur Abtrennung von mit Digoxigeningruppen konjugierten Substanzen sowie ggf. von Komplexen aus solchen Substanzen mit anderen Molekülen aus einer Lösung verwendet werden.

Beispielsweise können so Antigene aus einer Lösung abgetrennt werden, indem die Lösung mit Antikörpern versetzt wird, welche gegen die Antigene gerichtet und mit der Digoxigeningruppe konjugiert sind, und die erhaltene Lösung mit dem genannten Säulenmaterial unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, un ter denen eine Komplexbildung zwischen den Digoxigeningruppen und einem erfindungsgemäßen Mutein des Bilin-Bindungsproteins oder seinem Fusionsprotein erfolgt. Ggf. ist im Anschluß an eine solche Abtrennung auch eine Elution der mit Digoxigenin konjugierten Substanz möglich. Diese Elution kann durch Kompe tition mit Digoxin, Digoxigenin, Digitoxin oder Digitoxigenin erfolgen sowie z. B. durch Absenkung oder Erhöhung des pH- Werts der Lösung. Bei einer kompetitiven Elution kann dabei die höhere Bindungsaffinität der erfindungsgemäßen Muteine zu Digitoxigenin oder Digitoxin im Vergleich zur Digoxigenin gruppe in vorteilhafter Weise ausgenutzt werden. Auf diese Weise läßt sich eine mit Digoxigenin konjugierte Substanz iso lieren oder reinigen.

Die Erfindung wird weiter veranschaulicht durch die nachste henden Beispiele und die beigefügten Zeichnungen, in denen:

Fig. 1 jeweils eine Fluoreszenztitration des mit dem Strep tag II fusionierten Muteins DigA16 mit den Liganden Digoxigenin, Digitoxigenin und Ouabain wiedergibt;

Fig. 2 die Expressionsvektoren pBBP27 (A) und pBBP29 (B) zur Herstellung von Fusionsproteinen des Muteins DigA16 mit der Alkalischen Phosphatase schematisch darstellt;

Fig. 3 den quantitativen Nachweis von mit Digoxigeningruppen konjugierten Biomolekülen durch Fusionsproteine des Muteins DigA16 mit der Alkalischen Phosphatase in einem ELISA demonstriert;

Fig. 4 den qualitativen Nachweis von mit Digoxigeningruppen konjugierten Biomolekülen durch Fusionsproteine des Muteins DigA16 mit der Alkalischen Phosphatase auf einem Western-Blot zeigt.

Fig. 1 zeigt die graphische Darstellung von Ergebnissen aus Beispiel 3, bei der eine 1 µM Lösung des Muteins DigA16 mit unterschiedlichen Konzentrationen der Steroide Digoxigenin (Quadrate), Digitoxigenin (Kreise) und Ouabain (Rauten) ver setzt wurde. Die jeweiligen Proteinfluoreszenzintensitäten wurden bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm und einer Emissionswellenlänge von 345 nm gemessen und gegen die aktuel le Gesamtkonzentration des Steroids im jeweiligen Ansatz auf getragen. Die Datenpunkte wurden schließlich mittels nicht li nearer Regression durch eine Ausgleichskurve angepaßt.

Fig. 2 zeigt eine Zeichnung der Expressionsvektoren pBBP27 (A) und pBBP29 (B). pBBP27 kodiert für ein Fusionsprotein aus der bakteriellen Alkalischen Phosphatase mit ihrer eigenen Signalsequenz, einem Peptid-Linker mit der Sequenz Pro-Pro- Ser-Ala, dem Mutein DigA16 sowie dem Strep-tag II-Affinitäts anhängsel. Das entsprechende Strukturgen wird von dem dsbC- Strukturgen (einschließlich dessen ribosomaler Bindungsstelle) aus E. coli (Zapun et al., Biochemistry 34 (1995), 5075-5089) als zweitem Cistron gefolgt. Das dadurch gebildete künstliche Operon steht unter gemeinsamer Transkriptionskontrolle des Tetracyclin-Promotor/Operators (tet^p/o) und endet am Lipopro tein-Transkriptionsterminator (t_lpp). Weitere Elemente des Vektors sind der Replikationsursprung (ori), die intergenische Region des filamentösen Bakteriophagen f1 (f1-IG), das für die β-Lactamase kodierende Ampicillin-Resistenzgen (bla) und das Tetracyclin-Repressorgen (tetR). pBBP29 kodiert für ein Fusi onsprotein aus der OmpA-Signalsequenz, dem Mutein DigA16, dem Strep-tag II-Affinitätsanhängsel, einem Peptid-Verbindungs stück bestehend aus fünf Glycinresten und der bakteriellen Al kalischen Phosphatase ohne ihre N-terminale Aminosäure Argi nin. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereiches sind mit dem Vektor pBBP27 identisch.

Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Daten aus Bei spiel 4, in dem der quantitative Nachweis von Digoxigeningrup pen mit Hilfe der Fusionsproteine des Muteins DigA16 als Gen produkt der Vektoren pBBP27 (geschlossene Symbole) und pBBP29 (offene Symbole) geführt wurde. Hierbei waren die Digoxigenin gruppen einerseits an Rinder-Serumalbumin (BSA, Quadrate) oder andererseits an Albumin aus Hühner-Ei (Ovalbumin, Dreiecke) gekoppelt. Als Kontrolle sind die Daten dargestellt, die bei der Verwendung von underivatisiertem Rinder-Serumalbumin sowie dem Fusionsprotein kodiert von pBBP27 erhalten wurden (offene Kreise). Die dem jeweiligen gebundenen Fusionsprotein entspre chende enzymatische Aktivität wurde anhand der Hydrolyse von p-Nitrophenylphosphat spektrophotometrisch bei 405 nm ver folgt. Die Kurvenanpassung erfolgte durch nicht lineare Re gression mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Abel beck Software) mittels der Gleichung

[P . L] = [L]_t[P]_t/(K_d+ [P]_t).

Hierbei entspricht [P]_t der eingesetzten Gesamtkonzentration des Fusionsproteins in der jeweiligen Vertiefung der Mikro titerplatte. [P . L] wird anhand der enzymatischen Aktivität der Alkalischen Phosphatase bestimmt. Die innerhalb einer Konzen trationsreihe konstante Gesamtkonzentration der Digoxigenin gruppen [L]_t je Vertiefung sowie die Dissoziationskonstante K_d wurden durch nicht lineare Regression als Parameter angepaßt.

Fig. 4 zeigt das Ergebnis eines Western Blot-Experiments aus Beispiel 4 zum qualitativen Nachweis von mit Digoxigeningrup pen konjugierten Biomolekülen mittels der von pBBP27 (Spuren 1 und 2) sowie von pBBP29 (Spuren 3 und 4) kodierten Fusionspro teine des Muteins DigA16. Zum Vergleich ist ein mit Coomassie- Brilliantblau gefärbtes 15%iges SDS-Polyacrylamidgel der Bio moleküle ebenfalls dargestellt (Spuren 5 und 6). Hierbei wurde in den Spuren 1, 3 und 5 jeweils ein Gemisch aus 0,5 µg unde rivatisiertem BSA, underivatisiertem Ovalbumin und underivati sierter RNaseA aufgetrennt. In den Spuren 2, 4 und 6 wurde je weils ein Gemisch aus 0,5 µg mit Digoxigeningruppen gekoppel tem BSA, mit Digoxigeningruppen gekoppeltem Ovalbumin und mit Digoxigeningruppen gekoppelter RNaseA aufgetrennt.

Beispiele

Sofern nicht anders angegeben, wurden die dem Fachmann geläu figen gentechnischen Methoden, wie sie z. B. in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Press) beschrieben sind, verwendet.

Beispiel 1 Herstellung einer Bibliothek für Muteine des Bilin-Bindungsproteins, Phagemidpräsentation und Selektion eines Muteins mit Bindungsaffinität zu Digoxigenin

Zur Herstellung einer Bibliothek für Muteine des Bilin-Bin dungsproteins wurden dessen Aminosäure-Sequenzpositionen 34, 35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 93, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 einer konzertierten Mutagenese mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) in mehreren Schritten unterworfen. Die PCR-Reaktionen wurden zunächst in zwei getrennten Amplifizie rungsschritten in einem Volumen von je 50 µl durchgeführt, wo bei 10 ng pBBP20-Phasmid-DNA (SEQ ID NO: 1) als Matrize sowie jeweils 25 pmol zweier Primer (SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 in einem Ansatz und SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 5 in einem zweiten Ansatz), welche nach der allgemein bekannten Phosphoramidit- Methode synthetisiert worden waren, eingesetzt wurden.

Weiterhin enthielt der Reaktionsansatz 5 µl 10 × Taq-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,0, 500 mM KCl, 1% v/v Triton X-100), 3 µl 25 mM MgCl₂ und 4 µl dNTP-Mix (2,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Nach Auffüllen mit Wasser wurde der Ansatz mit Mineralöl über schichtet und in einem programmierbaren Thermostatisierblock für 2 min auf 94°C erhitzt. Anschließend wurden 2,5 u Taq DNA-Polymerase (5 u/µl, Promega) zugegeben und 20 Temperatur zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 60°C, 1,5 min bei 72 °C, gefolgt von einer Inkubation für 5 min bei 60°C, durchge führt. Die gewünschten Amplifizierungsprodukte wurden durch präparative Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung des Jetsorb DNA Extraction Kits (Genomed) nach den Angaben des Herstellers aus Low Melting Point Agarose (Gibco BRL) iso liert.

Ein relevanter Ausschnitt aus der Nukleinsäuresequenz von pBBP20 ist mit der kodierten Aminosäuresequenz im Sequenzpro tokoll als SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit einer Hexanukleotidsequenz, die durch Ligierung eines XbaI-Überhangs mit einem dazu komplementären SpeI-Überhang er halten wurde, und endet mit der HindIII-Schnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pASK75, dessen vollständige Nukleotidsequenz in der Offenlegungsschrift DE 44 17 598 A1 angegeben ist.

Der darauffolgende Amplifizierungsschritt wurde in einem 100 µl-Ansatz durchgeführt, wobei jeweils ca. 6 ng der beiden iso lierten Fragmente als Matrize, je 50 pmol der beiden Primer SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7 sowie 1 pmol des Oligodesoxy nukleotids SEQ ID NO: 8 eingesetzt wurden. Die restlichen Kom ponenten des PCR-Ansatzes wurden wie in den vorangegangenen Amplifizierungsschritten mit der doppelten Menge zugesetzt. Die PCR fand bei 20 Temperaturzyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 55°C, 1,5 min bei 72°C statt, gefolgt von einer ab schließenden Inkubation für 5 min bei 60°C. Das erhaltene Fragment wurde erneut durch präparative Agarose-Gelelektropho rese isoliert.

Zur Klonierung dieses Fragments, welches die Bibliothek der Muteine in Form einer Mischung von Nukleinsäuren repräsen tierte, wurde es zunächst mit dem Restriktionsenzym BstXI (New England Biolabs) nach den Angaben des Herstellers geschnitten. Die Reinigung des erhaltenen Nukleinsäurefragments (335 Basen paare, bp) erfolgte wiederum mittels präparativer Agarose-Gel elektrophorese. Analog wurde die DNA des Vektors pBBP20 mit BstXI geschnitten und das größere der beiden Fragmente (3971 bp) isoliert.

Zur Ligierung wurden 0,93 µg (4,2 pmol) des PCR-Fragments und 11 µg (4,2 pmol) des Vektorfragments in Gegenwart von 102 Weiss Units T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem Ge samtvolumen von 500 µl (50 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 µg/ml BSA) für zwei Tage bei 16 °C inku biert. Anschließend wurde die DNA gefällt, indem jeweils 24 µl des Ligierungsansatzes mit 10 µg tRNA aus Hefe (Boehringer Mannheim), 25 µl 5 M Ammoniumacetat und 100 µl Ethanol ver setzt wurden. Nach Inkubation bei -20°C für drei Tage wurde zentrifugiert (25 min, 16000 g, 4°C). Das Präzipitat wurde mit jeweils 200 µl Ethanol (70% v/v, -20°C) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wurde schließlich in 43,6 µl TE/10 (1 mM Tris/HCl pH 8,0, 0,1 mM EDTA) aufgenommen. Die DNA-Konzentration der erhaltenen Lösung wurde durch analyti sche Agarose-Gelelektrophorese anhand der Fluoreszenzintensi tät der mit Ethidiumbromid angefärbten Banden im Vergleich mit einem DNA-Größenstandard mit bekannter Konzentration abge schätzt.

Die Präparation elektrokompetenter Zellen des E. coli K12- Stamms XL1-Blue (Bullock et al., BioTechniques 5 (1987), 376- 379) erfolgte gemäß den von Tung und Chow (Trends Genet. 11 (1995), 128-129) und von Hengen (Trends Biochem. Sci. 21 (1996), 75-76) beschriebenen Methoden. 1 l LB-Medium wurde durch Zugabe einer stationären XL1-Blue Übernachtkultur auf eine optische Dichte bei 600 nm, OD₆₀₀ = 0,08 eingestellt und bei 200 Upm und 26°C in einem 3 l-Erlenmeyer-Kolben inku biert. Nach Erreichen von OD₆₀₀ = 0,6 wurde die Kultur für 30 min auf Eis gekühlt und anschließend für 15 min bei 4000 g und 4°C zentrifugiert. Das Zellsediment wurde zweimal mit jeweils 500 ml eiskaltem 10% w/v Glycerin gewaschen und schließlich in 2 ml eiskaltem GYT-Medium (10% w/v Glycerin, 0,125% w/v Hefeextrakt, 0,25% w/v Trypton) resuspendiert.

Zur Elektroporation wurde das Easyjec T Basic System (EquiBio) mit den dazugehörigen Küvetten (Elektrodenabstand 2 mm) ver wendet. Alle Arbeitsschritte wurden im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. Jeweils 5 bis 6 µl der oben beschriebenen DNA- Lösung (245 ng/µl) wurde mit 40 µl der Zellsuspension ge mischt, 1 min auf Eis inkubiert und anschließend in die Küvet te überführt. Nach der Elektroporation wurde die Suspension sofort in 2 ml frischem, eiskaltem SOC-Medium (2% w/v Tryp ton, 0,5% w/v Hefeextrakt, 10 mM NaCl, 10 mM MgSO₄, 10 mM MgCl₂) verdünnt und für 60 min bei 37°C und 200 Upm geschüt telt. Die Zellen wurden anschließend jeweils für 2 min bei 3600 g sedimentiert, in 1 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicil lin (LB/Amp) resuspendiert und zu je 200 µl auf Agar-Platten (140 mm Durchmesser) mit LB/Amp-Medium ausplattiert. Unter Einsatz von insgesamt 10,7 µg der ligierten DNA wurden auf diese Weise mit acht Elektroporationsansätzen 3,73.10⁸ Trans formanden erhalten, die auf 40 Agar-Platten verteilt waren.

Nach Inkubation für 14 h bei 32°C wurden die so erhaltenen Kolonien unter Zusatz von je 10 ml 2 × YT/Amp-Medium von den Agar-Platten abgeschabt, in einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt und zur vollständigen Resuspendierung für 20 min bei 37°C, 200 Upm geschüttelt. 50 ml auf 37°C vorgewärmtes 2 × YT/Amp-Medium wurden mit 2,88 ml dieser Suspension inoku liert, so daß die Zelldichte OD₅₅₀ bei 1,0 lag. Diese Kultur wurde für 6 h bei 37°C, 160 Upm bis zu einer stationären Zelldichte inkubiert und die Phasmid-DNA mit Hilfe des Plasmid Midi Kits (Qiagen) nach Angaben des Herstellers isoliert. Die DNA wurde schließlich in 100 µl TE (10 mM Tris/HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) aufgenommen und zur weiteren Verwendung bei 4°C ge lagert.

Zur Herstellung einer Bibliothek von rekombinanten Phagemiden (Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins - A Labo ratory Manual (1996), Academic Press), welche die Muteine des Bilin-Bindungsproteins als Fusion mit dem verkürzten Hüllpro tein pIII tragen, wurde die so gewonnene Phasmid-DNA zur Transformation elektrokompetenter Zellen von E. coli XL1-Blue eingesetzt. Die Elektroporation wurde wie oben beschrieben mit Hilfe des Easyjec T Basic Systems durchgeführt. In insgesamt 13 Ansätzen wurden je 40 µl der Zellsuspension elektrokompe tenter Zellen mit jeweils 2 µg der DNA in einem Volumen von 5 µl transformiert. Nach der Elektroporation wurde die erhaltene Zellsuspension aus jedem Ansatz sofort in 2 ml frischem, eis kaltem SOC-Medium verdünnt und für 60 min bei 37°C und 200 Upm geschüttelt.

Diese Ansätze wurden vereinigt (Volumen = 26 ml), mit 74 ml 2 × YT-Medium und mit 100 µl Ampicillin (Stammlösung 100 mg/ml, Endkonzentration 100 mg/l) versetzt. Durch Ausplattieren von 100 µl einer 1 : 10⁵-Verdünnung der erhaltenen Suspension auf Agar-Platten mit LB/Amp-Medium wurde die Gesamtzahl der erhal tenen Transformanden zu 1,1.10¹⁰ abgeschätzt. Nach Inkubation für 60 min bei 37°C und 160 Upm wurde die Kultur mit 500 µl VCS-M13 Helferphage (1,1.10¹² pfu/ml, Stratagene) infiziert und für weitere 60 min bei 37°C, 160 Upm geschüttelt. An schließend wurden 200 µl Kanamycin (Stammlösung 35 mg/ml, End konzentration 70 mg/l) zugegeben, die Inkubatortemperatur auf 26°C erniedrigt und nach 10 min zur Induktion der Genexpres sion Anhydrotetracyclin (50 µl einer 50 µg/ml-Stammlösung in Dimethylformamid, Endkonzentration 25 µg/l) zugesetzt. Zur Produktion der Phagemide wurde die Kultur schließlich für 7 h bei 26°C, 160 Upm inkubiert.

Zwecks Abtrennung der Zellen wurde die Kultur zentrifugiert (15 min, 12000 g, 4°C). Der Überstand, der die Phagemidparti kel enthielt, wurde sterilfiltriert (0,45 µm), mit 1/4 Volumen (25 ml) 20% w/v PEG 8000, 15% w/v NaCl versetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Zentrifugation (20 min, 18000 g, 4°C) wurden die präzipitierten Phagemidpartikel in insge samt 4 ml kaltem PBS (4 mM KH₂PO₄, 16 mM Na₂HPO₄, 115 mM NaCl, pH 7,4) gelöst. Die Lösung wurde für 30 min auf Eis inkubiert und zu gleichen Volumina auf vier 1,5 ml-Reaktionsgefäße ver teilt. Nach Abzentrifugieren ungelöster Bestandteile (5 min, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand jeweils in ein neues Reak tionsgefäß überführt.

Zur erneuten Fällung der Phagemidpartikel wurde mit 1/4 Volu men (jeweils 0,25 ml pro Reaktiongefäß) 20% w/v PEG 8000, 15% w/v NaCl gemischt und für 60 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (20 min, 18500 g, 4°C) wurde der Überstand entfernt, und die präzipitierten Phagemidpartikel wurden in jeweils 0,5 ml PBS gelöst. Nach Inkubation für 30 min auf Eis wurde die Lösung zur Klärung noch einmal zentrifugiert (5 min, 18500 g, 4°C). Der Überstand mit den Phagemidpartikeln (zwi schen 1.10¹² und 5.10¹² cfu/ml) wurde anschließend für die Affinitätsanreicherung eingesetzt.

Zur Affinitätsanreicherung der die Muteine des Bilin-Bindungs proteins präsentierenden rekombinanten Phagemide wurden Immu no-Sticks (NUNC) verwendet. Diese wurden über Nacht mit 800 µl eines Konjugats (100 µg/ml) aus Ribonuclease A (RNaseA) und Digoxigenin in PBS beschichtet.

Zur Herstellung des Konjugats wurden 1,46 µmol (0,96 mg) Digo xigenin-3-O-methylcarbonyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccin imidester (DIG-NHS, Boehringer Mannheim) in 25 µl DMSO µl- weise und unter stetiger Durchmischung zu 0,73 µmol (10 mg) RNaseA (Fluka) in 1 ml 5% w/v Natriumhydrogencarbonat gege ben. Der Ansatz wurde unter Rühren für 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Anschließend wurde überschüssiges Reagenz von dem RNaseA-Konjugat mittels einer PD-10 Gelfiltrationssäule (Pharmacia) gemäß den Angaben des Herstellers abgetrennt.

Unbelegte Bindungsstellen auf der Oberfläche des Immuno-Sticks wurden durch Inkubation mit 1,2 ml 2% w/v BSA in PBST (PBS mit 0,1% v/v Tween 20) für 2 h bei RT abgesättigt. Nach drei maligem kurzen Waschen mit jeweils 1,2 ml PBST wurde der Immu no-Stick in einer Mischung aus 250 µl der Phagemidlösung und 500 µl Blockierungspuffer (2% w/v BSA in PBST) für 1 h bei RT inkubiert.

Zur Entfernung nicht gebundener Phagemide wurde die Lösung ab gezogen und der Immuno-Stick achtmal mit jeweils 950 µl PBST für 2 min gewaschen. Adsorbierte Phagemide wurden schließlich im Verlauf einer 15minütigen Inkubation des Immuno-Sticks mit 950 µl einer 2 mM Lösung von Digoxigenin in PBS (0,742 mg Digoxigenin (Fluka) wurden hierzu in 19,2 µl DMF gelöst und zu 930,8 µl PBS gegeben) kompetitiv eluiert.

Zur Vermehrung der Phagemide wurden die 950 µl Lösung der er haltenen Elutionsfraktion (je nach Selektionszyklus zwischen 10⁶ und 10⁸ Colony-forming Units) kurz auf 37°C erwärmt, mit 4 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E. coli XL1-Blue (OD₅₅₀ = 0,5) gemischt und für 30 min bei 37°C, 200 Upm inku biert. Die mit den Phagemiden infizierten Zellen wurden an schließend sedimentiert (2 min, 4420 g, 4°C), in 800 µl fri schen 2 × xYT-Mediums resuspendiert und auf vier Agar-Platten mit LB/Amp-Medium (140 mm Durchmesser) ausplattiert. Nach Inkuba tion für 14 h bei 32°C wurden die erhaltenen Kolonien unter Zusatz von je 10 ml 2 × YT/Amp-Medium von den Agar-Platten abge schabt, in einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt und zur vollständigen Resuspendierung für 20 min bei 37°C, 200 Upm geschüttelt.

Zur wiederholten Produktion und Affinitätsanreicherung von Phagemidpartikeln wurde 50 ml auf 37°C vorgewärmtes 2 × YT/Amp- Medium mit 0,2 bis 1 ml dieser Suspension inokuliert, so daß die Zelldichte OD₅₅₀ bei 0,08 lag. Diese Kultur wurde bei 37 °C, 160 Upm bis zu einer Zelldichte von OD₅₅₀ = 0,5 inkubiert, mit 250 µl VCS-M13 Helferphage (1,1.10¹² pfu/ml, Stratagene) infiziert, und es wurde weiter verfahren wie bereits oben be schrieben.

Mit den aus der ersten Affinitätsanreicherung erhaltenen Pha gemiden wurden nacheinander acht weitere Anreicherungszyklen mit Immuno-Sticks, welche frisch mit dem Digoxigenin-RNaseA- Konjugat beschichtet waren, durchgeführt. Die nach dem letzten Anreicherungszyklus erhaltenen Phagemide wurden wiederum zur Infektion von E. coli XL1-Blue verwendet. Die Mischung der er haltenen Kolonien wurde, wie oben beschrieben, mit 2 × YT/Amp- Medium von den Agar-Platten abgeschabt und resuspendiert. Mit dieser Zellsuspension wurden 50 ml 2 × YT/Amp-Medium angeimpft und die Phasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (QIAGEN) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.

Um die Muteine des Bilin-Bindungsproteins als Fusionsprotein mit dem Strep-tag II sowie der Albumin-Bindungsdomäne produ zieren zu können, wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI-Schnittstellen aus dem Vektor pBBP20 in den Vektor pBBP22 subkloniert. Ein relevanter Ausschnitt aus der Nuklein säuresequenz von pBBP22 ist mit der kodierten Aminosäurese quenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 9 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der XbaI-Schnittstelle und endet mit der HindIII-Schnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pASK75.

Dazu wurde die aus der Mischung der E. coli-Kolonien isolierte DNA mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten und das klei nere der beiden Fragmente (335 bp) durch präparative Agarose- Gelelektrophorese wie oben beschrieben gereinigt. In gleicher Weise wurde die DNA des Vektors pBBP22 mit BstXI geschnitten und das größere der beiden Fragmente (3545 bp) isoliert.

Zur Ligierung wurden jeweils 50 fmol der beiden DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1,5 Weiss Units T4 DNA Ligase (Promega) versetzt und über Nacht bei 16°C inkubiert. Mit 5 µl dieses Ligierungsansatzes wurden 200 µl kompetente Zellen des Stamms E. coli TG1-F^- nach der CaCl₂-Methode transformiert (Sambrook et al., supra), wobei 2,2 ml einer Zellsuspension erhalten wurden.

Die Transformanden wurden anschließend mittels eines Colony Screening Assays auf die Produktion von Muteinen mit Bindungs aktivität für die Digoxigeningruppe durchgemustert. Dazu wurde auf eine LB/Amp-Agarplatte eine passend zurechtgeschnittene, an einer Stelle markierte hydrophile PVDF-Membran (Millipore, Typ GVWP, Porengröße 0,22 µm) aufgelegt. Auf dieser Membran wurden 150 µl der Zellsuspension aus dem Transformationsansatz gleichmäßig ausplattiert, wobei ca. 500 Kolonien erhalten wur den. Die Platte wurde für 7,5 h bei 37°C im Brutschrank inku biert, bis die Kolonien einen Durchmesser von ca. 0,5 mm er reicht hatten.

In der Zwischenzeit wurde eine ebenfalls passend zurechtge schnittene hydrophobe Membran (Millipore, Immobilon P, Poren größe 0,45 µm) nach den Angaben des Herstellers mit PBS ange feuchtet. Anschließend wurde sie für 4 h bei RT in einer Lö sung von 10 mg/ml Human-Serumalbumin (HSA, Sigma) in PBS ge schwenkt. Verbliebene Bindungsstellen auf der Membran wurden durch Inkubation mit 3% w/v BSA, 0,5% v/v Tween 20 in PBS für 2 h bei RT abgesättigt. Die Membran wurde zweimal für je weils 10 min mit 20 ml PBS gewaschen und danach für 10 min in 10 ml LB/Amp-Medium, dem 200 µg/l Anhydrotetracyclin zugesetzt worden war, geschwenkt. Anschließend wurde sie an einer Stelle markiert und auf eine Kulturplatte mit LB/Amp-Agar, der zu sätzlich 200 µg/l Anhydrotetracyclin enthielt, gelegt.

Die zuvor erhaltene, mit den Kolonien bewachsene hydrophile Membran wurde daraufhin so auf die hydrophobe Membran aufge legt, daß die beiden Markierungen zur Deckung kamen. Die Kul turplatte mit den beiden Membranen wurde bei 22°C für 15 h inkubiert. Während dieser Phase wurden die jeweiligen Muteine als Fusionsproteine von den Kolonien sekretiert und mittels Komplexbildung zwischen der Albumin-Bindungsdomäne und dem HSA auf der unteren Membran immobilisiert.

Danach wurde die obere Membran mit den Kolonien auf eine fri sche LB/Amp-Agarplatte transferiert und bei 4°C aufbewahrt. Die hydrophobe Membran wurde abgenommen, dreimal für jeweils 10 min mit 20 ml PBST gewaschen und anschließend für 1 h in 10 ml einer Lösung von 10 µg/ml eines Konjugates von BSA mit Digoxigenin in PBST inkubiert.

Zur Herstellung des Konjugates von BSA (Sigma) und Digoxigenin wurde eine Lösung von 3,0 µmol (1,98 mg) DIG-NHS in 25 µl DMSO µl-weise und unter stetiger Durchmischung zu 300 nmol (19,88 mg) BSA (Sigma) in 1,9 ml 5% w/v Natriumhydrogencarbonat ge geben. Der Ansatz wurde unter Rühren für 1 h bei RT inkubiert und überschüssiges Reagenz von dem BSA-Konjugat mittels einer PD-10 Gelfiltrationssäule nach den Angaben des Herstellers ab getrennt.

Um gebundenes Digoxigenin-BSA-Konjugat nachzuweisen, wurde die Membran nach zweimaligem Waschen in 20 ml PBST für 1 h mit 10 ml Anti-Digoxigenin Fab-Alkalische Phosphatase-Konjugat (Boehringer Mannheim, 1 : 1000 verdünnt in PBST) inkubiert. Die Membran wurde anschließend für jeweils 5 min zweimal mit 20 ml PBST und zweimal mit 20 ml PBS gewaschen und für 10 min in AP- Puffer (0,1 M Tris/HCl pH 8,8, 0,1 M NaCl, 5 mM Mg₂Cl) ge schwenkt. Zur chromogenen Nachweisreaktion wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer, dem 30 µl 5-Brom-4-chlor-3-indolylphos phat, p-Toluidinsalz (BCIP, Roth, 50 µg/ml in Dimethylform amid) und 5 µl Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma, 75 µg/ml in 70% v/v Dimethylformamid) zugesetzt waren, inkubiert, bis an den Positionen einiger der Kolonien deutliche Farbsignale zu erkennen waren. Auf diese Weise wurde die Bindungsaktivität der von diesen Kolonien produzierten Muteine des Bilin-Bin dungsproteins, in Form der Fusionsproteine mit dem Strep-tag und der ABD, für Digoxigenin nachgewiesen.

Vier der Kolonien von der oberen Membran, welche zu einem aus geprägten Farbsignal Anlaß gaben, wurden zur Herstellung von Kulturen in LB/Amp-Medium mit einem Volumen von 4 ml verwen det. Ihre Plasmid-DNA wurde mit Hilfe des JETquick Plasmid Miniprep Spin Kits (Genomed) nach den Angaben des Herstellers isoliert, und der für das Mutein kodierende Genabschnitt wurde einer Sequenzanalyse unterzogen. Die Sequenzanalyse erfolgte mit Hilfe des T7 Sequencing Kits (Pharmacia) nach Hersteller angaben unter Verwendung der Oligodesoxynukleotide SEQ ID NO: 10 und SEQ ID NO: 11. Dabei wurde gefunden, daß alle vier untersuchten Plasmide die gleiche Nukleotidsequenz trugen. Das entsprechende Genprodukt wurde als DigA bezeichnet (SEQ ID NO: 12). Die Nukleotidsequenz von DigA wurde in die Aminosäure sequenz übersetzt und ist im Sequenzprotokoll wiedergegeben.

Beispiel 2 Partielle Zufallsmutagenese des Muteins DigA und Selektion von Muteinen mit verbesserter Bindungsaffinität zu Digoxigenin

Zur Verbesserung der Affinität zwischen dem Mutein DigA und Digoxigenin, welche gemäß Beispiel 3 zu 295 ± 36 nM bestimmt wurde, wurden die 6 Aminosäurepositionen 28, 31 und 34-37 in DigA für eine weitergehende partielle Zufallsmutagenese ausge wählt.

Zur Mutagenese dieser Positionen wurde die PCR mit einem dege nerierten Oligodesoxynukleotid-Primer durchgeführt. Die Ampli fizierungsreaktion erfolgte in einem Gesamtvolumen von 100 µl, wobei 2 ng der für DigA (SEQ ID NO: 12) kodierenden Plasmid-DNA des Vektors pBBP22 als Matrize eingesetzt wurden. Der Reakti onsansatz enthielt 50 pmol der beiden Primer SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 7 sowie die restlichen Komponenten gemäß der in Bei spiel 1 beschriebenen Methode. Die PCR fand bei 20 Temperatur zyklen von 1 min bei 94°C, 1 min bei 65°C, 1,5 min bei bei 72°C statt, gefolgt von einer abschließenden Inkubation für 5 min bei 60°C. Das erhaltene DNA-Fragment wurde durch präpara tive Agarose-Gelelektrophorese isoliert und anschließend mit BstXI nach den Angaben des Herstellers geschnitten. Die Reini gung des resultierenden DNA-Fragmentes von 335 bp Länge er folgte wiederum durch präparative Agarose-Gelelektrophorese.

Entsprechend wurde die DNA des Vektors pBBP24 mit BstXI ge schnitten und das erhaltene Fragment von 4028 bp isoliert. Ein relevanter Ausschnitt aus der Nukleinsäuresequenz von pBBP24 ist mit der kodierten Aminosäuresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 14 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der XbaI-Schnittstelle und endet mit der HindIII-Schnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pASK75. pBBP24 ist weitestgehend identisch mit pBBP20 wobei das BBP-Gen mittels entsprechend eingeführter Stopp-Kodons inaktiviert ist.

Zur Ligierung wurden 1,3 µg des geschnittenen DNA-Fragmentes aus der PCR und 16,0 µg des Fragmentes von pBBP24 in Gegenwart von 120 Weiss Units T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) in einem Gesamtvolumen von 600 µl (50 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 50 µg/ml BSA) für 18 h bei 16°C inkubiert. Anschließend wurde die DNA gefällt, indem jeweils 24 µl des Ligierungsansatzes mit 10 µg tRNA aus Hefe (Boehrin ger Mannheim), 25 µl 5 M Ammoniumacetat und 100 µl Ethanol versetzt wurden. Nach Inkubation bei -20°C für zwei Wochen wurde zentrifugiert (20 min, 16000 g, 4°C). Das Präzipitat wurde mit jeweils 150 µl Ethanol (70% v/v, -20°C) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Die DNA wurde schließlich in 80 µl TE/10 aufgenommen.

Die Transformation von E. coli XL1-Blue Zellen mit der ligier ten DNA durch Elektroporation wurde gemäß der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise durchgeführt, wobei in 16 Ansät zen jeweils 40 µl Zellsuspension elektrokompetenter Zellen mit 5 µl der DNA-Lösung gemischt wurden. Nach der Elektroporation wurden die Zellen sofort in 2 ml frischem, eiskaltem SOC-Medi um verdünnt und für 60 min bei 37°C und 200 Upm geschüttelt.

Die vereinigten Suspensionen wurden mit 168 ml 2 × YT-Medium und mit 200 µl Ampicillin versetzt (Stammlösung 100 mg/ml, Endkon zentration 100 mg/l). Durch Ausplattieren von 100 µl einer 1 : 10⁴-Verdünnung der erhaltenen Zellsuspension auf Agar-Plat ten mit LB/Amp-Medium wurde die Gesamtzahl der erhaltenen Transformanden zu 1,48 . 10⁹ abgeschätzt. Nach Inkubation für 60 min bei 37°C und 160 Upm wurden die Transformanden mit 4 ml VCS-M13 Helferphage (6,3.10¹¹ pfu/ml, Stratagene) infiziert und für weitere 30 min bei 37°C und 160 Upm geschüttelt. An schließend wurden 400 µl Kanamycin (Stammlösung 35 mg/ml, End konzentration 70 mg/l) zugegeben, die Inkubatortemperatur auf 26°C erniedrigt und nach 10 min zur Induktion der Genexpres sion Anhydrotetracyclin (100 µl einer 50 µg/ml-Stammlösung in Dimethylformamid, Endkonzentration 25 µg/l) zugesetzt. Zur Produktion der Phagemide wurde die Kultur schließlich für 7 h bei 26°C und 160 Upm inkubiert. Die Abtrennung der Zellen und die Reinigung der Phagemide durch Fällung erfolgte wie in Bei spiel 1 beschrieben.

Zur Affinitätsanreicherung aus der Bibliothek der Phagemide, welche das partiell mutierte Mutein DigA präsentierten, wurden mit Streptavidin beschichtete paramagnetische Partikel (Dyna beads M-280 Streptavidin, Dynal) zusammen mit einem Doppel konjugat von BSA mit Digoxigenin und Biotin eingesetzt.

Zur Herstellung eines Doppelkonjugates von BSA mit Digoxigenin und Biotin wurden 1,5 µmol (0,99 mg) DIG-NHS in 12,5 µl DMSO und 1,5 µmol (0,68 mg) D-Biotinoyl-ε-aminocapronsäure-N- hydroxysuccinimidester (Boehringer Mannheim) in 12,5 µl DMSO µl-weise und unter stetiger Durchmischung zu 300 nmol (19,88 mg) BSA in 1,9 ml 5% w/v Natriumhydrogencarbonat gegeben. Der Ansatz wurde unter Rühren für 1 h bei RT inkubiert. Überschüs siges Reagenz wurde über eine PD-10 Gelfiltrationssäule nach den Angaben des Herstellers von dem Doppelkonjugat abgetrennt.

Zur Anreicherung Digoxigenin bindender Phagemide wurden 40 µl einer 0,5 µM Lösung des Doppelkonjugats (33,5 µg/ml) in PBS mit 260 µl einer Lösung der frisch präparierten Phagemide (zwischen 5.10¹¹ und 5.10¹² cfu/ml) gemischt und für 1 h bei RT inkubiert, so daß Komplexbildung zwischen der Digoxigenin gruppe und den von den Phagemiden präsentierten Muteinen ein treten konnte. Anschließend wurde 100 µl einer Lösung von 8% w/v BSA, 0,4% v/v Tween 20 in PBS zugegeben.

Parallel wurden 100 µl der kommerziell erhältlichen Suspension der paramagnetischen Partikel dreimal mit jeweils 100 µl PBS gewaschen. Hierbei wurden die Partikel durch Rotation des 1,5 ml Eppendorfgefäßes für 1 min in Suspension gehalten, an schließend mit Hilfe eines Magneten an der Wand des Eppendorf gefäßes gesammelt und der Überstand abgezogen. Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen wurden die paramagnetischen Partikel mit 100 µl 2% w/v BSA in PBST für 1 h bei RT inku biert. Nach Entfernung des Überstandes wurden die paramagneti schen Partikel mit der Mischung aus dem Doppelkonjugat und den Phagemiden versetzt, resuspendiert und für 10 min bei RT inku biert. Zur Absättigung freier Biotin-Bindungsstellen des Streptavidins wurde die Mischung schließlich mit 10 µl einer Lösung von 4 µM D-Desthiobiotin (Sigma) in PBS versetzt und für 5 min bei RT inkubiert. Auf diese Weise wurde auch verhin dert, das das Strep-tag II als Teil des Fusionsproteins aus den Muteinen und dem Fragment des Phagenhüllproteins pIII mit dem Streptavidin einen Komplex bilden konnte.

Zur Entfernung nicht gebundener Phagemide wurden die paramag netischen Partikel achtmal mit jeweils 1 ml frischem PBST un ter Zusatz von 1 mM D-Desthiobiotin gewaschen, die Partikel wurden mit Hilfe des Magneten gesammelt und der Überstand wurde abgezogen. Die Elution der gebundenen Phagemide erfolgte durch 15minütige Inkubation der resuspendierten Partikel in 950 µl 0,1 M Glycin/HCl pH 2,2. Nach Sammeln der Partikel am Magneten wurde der Überstand erneut abgezogen, und der pH-Wert dieser Lösung wurde im Anschluß daran sofort durch Zugabe von 140 µl 0,5 M Tris neutralisiert.

Zur Vermehrung der Phagemide wurde die erhaltene Elutionsfrak tion entsprechend der Vorgehensweise in Beispiel 1 mit 4 ml einer exponentiell wachsenden Kultur von E. coli XL1-Blue (OD₅₅₀ = 0,5) gemischt und für 30 min bei 37°C, 200 Upm inku biert. Die mit den Phagemiden infizierten Zellen wurden an schließend sedimentiert (2 min, 4420 g, 4°C), in 800 µl fri schem 2 × YT-Medium resuspendiert und auf vier Agar-Platten mit LB/Amp-Medium (140 mm Durchmesser) ausplattiert. Nach Inkuba tion für 14 h bei 32°C wurden die erhaltenen Kolonien unter Zusatz von je 10 ml 2 × YT/Amp-Medium von den Agar-Platten abge schabt, in einen sterilen Erlenmeyerkolben überführt und zur vollständigen Resuspendierung für 20 min bei 37°C, 200 Upm geschüttelt.

Zur wiederholten Produktion und Affinitätsanreicherung von Phagemidpartikeln wurde 50 ml auf 37°C vorgewärmtes 2 × YT/Amp- Medium mit 0,2 bis 1 ml dieser Suspension inokuliert, so daß die Zelldichte OD₅₅₀ bei 0,08 lag. Diese Kultur wurde bei 37 °C, 160 Upm bis zu einer Zelldichte von OD₅₅₀ = 0,5 inkubiert und mit 300 µl VCS-M13 Helferphage (6,3.10¹¹ pfu/ml, Strata gene) infiziert. Anschließend erfolgte eine erneute Affini tätsselektion mit den paramagnetischen Partikeln und dem Digo xigenin/Biotin-Doppelkonjugat unter den oben angegebenen Be dingungen. Auf diese Weise wurden insgesamt 4 Selektionszyklen durchgeführt.

Die nach dem letzten Anreicherungszyklus erhaltenen Phagemide wurden wiederum zur Infektion von E. coli XL1-Blue verwendet. Mit der Mischung der erhaltenen Kolonien, die, wie oben be schrieben, mit 2 × YT/Amp-Medium von den Agar-Platten abgeschabt und resuspendiert worden waren, wurden 50 ml 2 × YT/Amp-Medium angeimpft und die Phasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (QIAGEN) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.

Anschließend wurde die Genkassette zwischen den beiden BstXI- Schnittstellen wie in Beispiel 1 aus dem Vektor pBBP24 in den Vektor pBBP22 subkloniert und kompetente Zellen des Stamms E. coli TG1-F^- nach der CaCl₂-Methode transformiert. Die Trans formanden wurden schließlich wiederum gemäß Beispiel 1 auf die Produktion von Muteinen mit Bindungsaktivität für die Digoxi geningruppe mittels des Colony Screening Assays durchgemu stert.

Sieben der Kolonien, die im Colony Screening Assay eine starke Signalintensität aufwiesen, wurden kultiviert. Ihre Plasmid- DNA wurde mit Hilfe des Plasmid Miniprep Spin Kits (Genomed) nach den Angaben des Herstellers isoliert und der für das Mu tein kodierende Genabschnitt wurde wie in Beispiel 1 einer Se quenzanalyse unterzogen. Dabei wurde gefunden, daß alle unter suchten Plasmide unterschiedliche Sequenzen besaßen. Nach Übersetzung der Nukleotidsequenzen in Aminosäuresequenzen wie sen sechs der sieben untersuchten Varianten ein Amber Stopp- Kodon an der Aminosäureposition 28 auf. Dieses Stopp-Kodon wurde allerdings bei der Wahl geeigneter Amber-Suppressor stämme, wie zum Beispiel E. coli XL1-Blue oder TG1-F^-, zumin dest teilweise supprimiert und statt dessen als Glutamin translatiert. Somit wurde sowohl im Verlauf der Affinitäts anreicherung als auch beim Colony Screening Assay funktionel les Protein in voller Länge produziert.

Als einziges unter den gefundenen Muteinen wies das Mutein mit der SEQ ID NO: 15 kein Amber-Stoppkodon auf, so daß es sich zur bakteriellen Produktion besonders gut eignete. Dieses Mutein, auch als DigA16 bezeichnet, wurde demzufolge hinsichtlich sei ner Bindefähigkeit für die Digoxigeningruppe genauer charakte risiert.

Beispiel 3 Produktion der Muteine DigA und DigA16 und Ermitt lung ihrer Affinität für Digoxigenin und dessen Derivate durch Fluoreszenztitration

Zur präparativen Produktion der aus den vorangegangenen Bei spielen erhaltenen Muteine des Bilin-Bindungsproteins wurde der kodierende Genabschnitt zwischen den beiden BstXI-Schnitt stellen aus dem Vektor des Typs pBBP22 in das Expressions plasmid pBBP21 subkloniert. Das dabei erhaltene Plasmid ko dierte für ein Fusionsprotein aus der OmpA-Signalsequenz, ge folgt von dem Mutein und dem Strep-tag II-Affinitätsanhängsel.

Ein relevanter Ausschnitt aus der Nukleinsäuresequenz von pBBP21 ist mit der kodierten Aminosäuresequenz im Sequenzpro tokoll als SEQ ID NO: 16 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der XbaI-Schnittstelle und endet mit einem Hexanukleotid, das durch Ligierung eines stumpfen Strangendes mit einem auf gefüllten HindIII-Strangende erhalten wurde, wobei die ur sprüngliche HindIII-Schnittstelle verloren ging. Die Vektor elemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vek tor pASK75.

Zur Subklonierung wurde die für das jeweilige Mutein kodie rende Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BstXI geschnitten und das kleinere der beiden Fragmente (335 bp) durch präpara tive Agarose-Gelelektrophorese wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt. In gleicher Weise wurde die DNA des Vektors pBBP21 mit BstXI geschnitten und das größere der beiden Fragmente (4132 bp) isoliert.

Zur Ligierung wurden jeweils 50 fmol der beiden DNA-Fragmente in einem Gesamtvolumen von 20 µl (30 mM Tris/HCl pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP) mit 1,5 Weiss Units T4 DNA Ligase (Promega) versetzt und für 16 h bei 16°C inkubiert. Mit 5 µl des Ligierungsansatzes wurde dann E. coli JM83 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985), 103-119) nach der CaCl₂-Methode trans formiert, wobei 2,2 ml einer Zellsuspension erhalten wurden. Von dieser Suspension wurden 100 µl auf einer Agar-Platte mit LB/Amp-Medium ausplattiert und für 14 h bei 37°C inkubiert.

Zur Proteinproduktion wurde eine der erhaltenen Einzelkolonien ausgewählt, eine 50 ml-Vorkultur (LB/Amp-Medium) damit ange impft und bei 30°C und 200 Upm über Nacht inkubiert. 40 ml der Vorkultur wurden auf 2 l LB/Amp-Medium in einem 5 l-Erlen meyerkolben überimpft, woraufhin die Kultur bei 22°C und 200 Upm inkubiert wurde. Bei einer Zelldichte von OD₅₅₀ = 0,5 wur de die Genexpression durch Zugabe von 200 µg/l Anhydrotetra cyclin (200 µl einer 2 mg/ml-Stammlösung in DMF) induziert und für weitere 3 h bei 22°C, 200 Upm geschüttelt.

Die Zellen wurden abzentrifugiert (15 min, 4420 g, 4°C) und nach Entfernung des Überstands unter Kühlung auf Eis in 20 ml Periplasma-Aufschlußpuffer (100 mM Tris/HCl pH 8,0, 500 mM Saccharose, 1 mM EDTA) resuspendiert. Nach Inkubation für 30 min auf Eis wurden die Sphäroplasten in zwei aufeinanderfol genden Zentrifugationsschritten abgetrennt (15 min, 4420 g, 4 °C und 15 min, 30000 g, 4°C). Der so gewonnene periplasmati sche Proteinextrakt wurde gegen SA-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA) dialysiert, sterilfiltriert und zur chromatographischen Reinigung eingesetzt.

Die Reinigung erfolgte mittels des an den C-Terminus der Mu teine fusionierten Strep-tag II-Affinitätsanhängsels (Schmidt und Skerra, Protein Eng. 6 (1993), 109-122). Im vorliegenden Fall wurde das Streptavidinmutein "1" eingesetzt (Voss und Skerra, Protein Eng. 10 (1997), 975-982), welches (mit 5 mg/ml immobilisiertem Streptavidin, bezogen auf das Bettvolumen der Matrix) an eine aktivierte Sepharose gekoppelt war.

Eine mit 2 ml dieses Materials befüllte Chromatographiesäule wurde bei 4°C und einer Flußrate von 20 ml/h mit 10 ml SA- Puffer äquilibriert. Die Chromatographie wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm des Eluats in einem Durchfluß-Photo meter verfolgt. Nach dem Auftragen des periplasmatischen Pro teinextrakts wurde bis zum Erreichen der Basislinie mit SA- Puffer gewaschen. Gebundenes Mutein wurde anschließend mit 10 ml einer Lösung von 2,5 mM D-Desthiobiotin (Sigma) in SA-Puf fer eluiert. Die Fraktionen, die das gereinigte Mutein ent hielten, wurden mittels der SDS-Polyacrylamid-Gelelektropho rese (Fling und Gregerson, Anal. Biochem. 155 (1986), 83-88) überprüft und vereinigt. Die Proteinausbeuten lagen zwischen 200 µg und 800 µg je 2 l Kultur.

Die Liganden-Bindungseigenschaften der Muteine DigA, DigA16 sowie des rekombinanten Bilin-Bindungsproteins (SEQ ID NO: 16) wurden mittels der Methode der Fluoreszenztitration bestimmt.

Gemessen wurde dabei die Abnahme der intrinsischen Tyrosin- und/oder Tryptophan-Fluoreszenz des Proteins bei Komplexbil dung mit dem Liganden. Die Messungen erfolgten mit einem Fluoreszenzphotometer des Typs LS 50 B (Perkin Eimer) bei einer Anregungswellenlänge von 295 nm (Spaltbreite 4 nm) und einer Emissionswellenlänge von 345 nm (Spaltbreite 6 nm). Als Liganden wurden Digoxigenin (Fluka), Digoxin (Fluka), Digito xigenin (Fluka), Digitoxin (Fluka), Testosteron (Sigma), Ouabain (Fluka) sowie 4-Aminofluorescein (Fluka) eingesetzt. Die Liganden zeigten bei den angegebenen Wellenlängen keine signifikante Eigenfluoreszenz oder Absorption.

Als Puffersystem diente PBS unter Zusatz von 1 mM EDTA. Die Lösung des jeweiligen gereinigten Muteins wurde viermal gegen diesen Puffer dialysiert und durch Verdünnen auf eine Konzen tration von 1 µM eingestellt. Alle verwendeten Lösungen wurden sterilfiltriert (Filtropur S 0,45 µm, Sarstedt). Die Konzen trationsbestimmung erfolgte mittels der Absorption bei 280 nm unter Verwendung kalkulatorischer Extinktionskoeffizienten von 53580 M^-1cm^-1 für DigA und DigA16 (Wisconsin Software Package, Genetics Computer Group). Für Bbp wurde der nach Gill und von Hippel (Anal. Biochem. 182 (1989), 319-326) in Gegen wart von Guanidiniumchlorid korrigierte kalkulatorische Extinktionskoeffizient von 54150 M^-1cm^-1 verwendet.

Zur Messung wurden 2 ml der Muteinlösung in einer Quarzkü vette, die mit einem Rührfisch ausgestattet war, vorgelegt und im Probenhalter des Photometers auf 25°C temperiert. An schließend wurden insgesamt 40 µl einer 100 µM bis 500 µM Lö sung des Liganden in demselben Puffer in Schritten von 1 µl bis 4 µl zupipettiert. Die dabei stattfindende Verdünnung der vorgelegten Proteinlösung um insgesamt maximal 2% blieb bei der nachfolgenden Auswertung der Daten unberücksichtigt. Nach jedem Titrationsschritt wurde zur Gleichgewichtseinstellung für 1 min unter Rühren inkubiert und das Fluoreszenzsignal als Mittelwert über 10 s gemessen. Nach Abzug des Fluoreszenzwer tes für den Puffer wurden die Signale auf einen Anfangswert von 100% normiert.

Die so erhaltenen Meßwerte einer Titrationsreihe wurden gemäß folgender Formel durch nicht lineare Regression mit Hilfe des Computerprogramms Kaleidagraph (Abelbeck Software) angepaßt.

Dabei bedeuten F die normierte Fluoreszenzintensität und [L]_t die Gesamtkonzentration des Liganden bei dem jeweiligen Titra tionsschritt. [P]_t als die Konzentration des Muteins, f_PL als Fluoreszenzkoeffizient des Mutein-Ligandkomplexes und K_d als die thermodynamische Dissoziationskonstante dieses Komplexes wurden als freie Parameter an die normierten Daten angepaßt.

Das Ergebnis der Fluoreszenztitrationen des Muteins DigA16 mit den Liganden Digoxigenin, Digitoxigenin und Ouabain ist in Fig. 1 graphisch dargestellt. Es zeigt sich, daß Digitoxige nin noch stärker gebunden wird als Digoxigenin, während für Ouabain keine Bindung beobachtet wird.

Die aus den Fluoreszenztitrationen resultierenden Werte für die Dissoziationskonstanten der Komplexe aus den Muteinen des Bilin-Bindungsproteins und den verschiedenen Liganden sind in folgender Tabelle zusammengefaßt:

Beispiel 4 Herstellung von Fusionsproteinen aus dem Mutein DigA16 und der bakteriellen Alkalischen Phosphatase und Ver wendung zum Nachweis von Digoxigeningruppen in einem ELISA so wie im Western Blot

Um zwei verschiedene Fusionsproteine aus dem Mutein DigA16 und der bakteriellen Alkalischen Phosphatase (PhoA) mit unter schiedlicher Anordnung der Partner innerhalb der Polypeptid kette zu produzieren, wurden unter Einsatz der dem Fachmann geläufigen molekularbiologischen Methoden die beiden Expressi onsplasmide pBBP27 und pBBP29 konstruiert.

pBBP27 kodiert für ein Fusionsprotein aus PhoA einschließlich deren Signalsequenz, einem kurzen Peptid-Verbindungsstück mit der Aminosäuresequenz Pro-Pro-Ser-Ala, der dem maturen Mutein DigA16 entsprechenden Sequenz sowie dem Strep-tag II. Ein re levanter Ausschnitt aus der Nukleinsäuresequenz von pBBP27 ist mit der kodierten Aminosäuresequenz im Sequenzprotokoll als SEQ ID NO: 17 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der XbaI-Schnittstelle und endet mit der HindIII-Schnittstelle. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pBBP21.

pBBP29 kodiert für ein Fusionsprotein aus DigA16 mit vorange stellter OmpA-Signalsequenz, gefolgt von der Peptidsequenz für das Strep-tag II, einer Sequenz von 5 Glycinresten und der ma turen Sequenz der PhoA ohne die N-terminale Aminosäure Argi nin. Ein relevanter Ausschnitt aus der Nukleinsäuresequenz von pBBP29 ist mit der kodierten Aminosäuresequenz im Sequenzpro tokoll als SEQ ID NO: 18 wiedergegeben. Der Ausschnitt beginnt mit der XbaI-Schnittstelle und endet mit der HindIII-Schnitt stelle. Die Vektorelemente außerhalb dieses Bereichs sind identisch mit dem Vektor pBBP21.

Beide Plasmide kodieren zusätzlich für die bakterielle Pro tein-Disulfidisomerase DsbC auf einem separaten, in 3'-Rich tung gelegenen Cistron. Die Plasmide sind in Fig. 2 schema tisch dargestellt.

Die von den Plasmiden pBBP27 und pBBP29 kodierten Fusionspro teine wurden analog der in Beispiel 3 beschriebenen Methode zur Herstellung der einfachen Muteine produziert. Um nicht die Metallionen aus dem aktiven Zentrum der PhoA zu komplexieren, wurde der Aufschluß des bakteriellen Periplasmas mit EDTA- freiem Aufschlußpuffer durchgeführt. Als ein die äußere Zell membran destabilisierendes Agens wurde dem Puffer Polymyxin-B- sulfat (2 mg/ml, Sigma) zugegeben. Alle weiteren zur Reinigung eingesetzten Puffer waren ebenfalls EDTA-frei.

Die mittels des Strep-tag II durch Affinitätschromatographie gereinigten Fusionsproteine wurden über Nacht gegen PBS-Puffer dialysiert. Die Ausbeuten der Fusionsproteine lagen zwischen 100 und 200 µg je 2 l Kulturmedium. Die Reinheit der erhalte nen Fusionsproteine wurde durch SDS-Polyacrylamidgelektropho rese, entsprechend Beispiel 3, überprüft und zu 90-95% be stimmt. Anschließend wurden die Fusionsproteine zum direkten Nachweis von Konjugaten der Digoxigeningruppe mit verschie denen Proteinen sowohl in einem Sandwich-ELISA als auch im Western-Blot verwendet.

Während die verwendeten Konjugate von Digoxigenin mit RNaseA und BSA entsprechend Beispiel 1 hergestellt wurden, wurde ein Konjugat von Digoxigenin mit Ovalbumin (Sigma) hergestellt, indem 1,5 µmol (0,99 mg) DIG-NHS in 25 µl DMSO µl-weise und unter stetiger Durchmischung zu 300 nmol (13,5 mg) Ovalbumin in 1,9 ml 5% Natriumhydrogencarbonat gegeben wurden. Der An satz wurde unter Rühren für 1 h bei RT inkubiert. Überschüs siges Reagenz wurde über eine PD-10 Gelfiltrationssäule nach den Angaben des Herstellers von dem Ovalbumin-Konjugat abge trennt.

Zum Nachweis von Digoxigeningruppen in einem Sandwich-ELISA wurden die Vertiefungen von jeweils zwei Spalten einer Mikro titerplatte (ELISA-Strips, 2 × 8 Well mit hoher Bindekapazität, F-Form, Greiner) mit je 100 µl einer 100 µg/ml-Lösung des BSA- Digoxigenin-Konjugates bzw. des Ovalbumin-Digoxigenin-Konjuga tes in PBS gefüllt und über Nacht bei RT inkubiert. Als Kon trolle wurden die Vertiefungen einer fünften Spalte der Mikro titerplatte mit 100 µl einer 100 µg/ml Lösung von nicht konju giertem BSA (Sigma) in PBS befüllt und ebenfalls über Nacht bei RT inkubiert. Nach Entfernen der Lösung wurden unbelegte Bindungsstellen mit 200 µl einer Lösung von 2% w/v BSA in PBST für 2 h abgesättigt. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde jeweils in die erste Vertiefung einer Reihe 50 µl einer 1 µM Lösung des gereinigten Fusionsproteins gefüllt und die Tween-Konzentration durch Zugabe von 1 µl einer Lösung von 5% v/v Tween auf 0,1% v/v eingestellt. In den darauffolgenden Vertiefungen jeder Reihe wurden zunächst 50 µl PBST vorgelegt. Anschließend wurde jeweils in die zweite Vertiefung 50 µl des gereinigten Fusionsproteins pipettiert, gemischt und davon ausgehend in den weiteren Vertiefungen der Spalte schrittweise 1 : 2 Verdünnungen zubereitet. Nach 1 h Inkubation bei RT wurden die Vertiefungen zweimal mit PBST und zweimal mit PBS gewa schen. Der Nachweis der an die Digoxigeningruppen gebundenen Fusionsproteine erfolgte schließlich mittels der durch die Al kalische Phosphatase katalysierten Hydrolyse von p-Nitrophe nylphosphat. Dazu wurden 100 µl einer Lösung von 0,5 mg/ml p- Nitrophenylphosphat (Amresco) in AP-Puffer (100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 100 mM Tris/HCl pH 8,8) in die Vertiefungen gefüllt und die Produktbildung durch Messung der Absorption bei 405 nm in einem SpectraMax 250-Photometer (Molecular Devices) verfolgt.

Das Ergebnis dieser Messung ist in Fig. 3 wiedergegeben. Dementsprechend wird die Digoxigeningruppe sowohl als Konjugat mit BSA wie auch als Konjugat mit Ovalbumin erkannt, was dar auf schließen läßt, daß die Bindung durch das Mutein DigA16 kontextunabhängig erfolgt. Weiterhin sind beide Fusionsprotei ne sowohl hinsichtlich der Bindungsfunktion für die Digoxige ningruppe als auch enzymatisch aktiv, und sie geben trotz ihres unterschiedlichen Aufbaus Anlaß zu nahezu identischen Signalen.

Zur Verwendung der von den Vektoren pBBP27 und pBBP29 kodier ten Fusionsproteine im Western-Blot wurden 5 µl einer Protein mischung in PBS, deren Konzentration an Digoxigenin-BSA-Konju gat, Digoxigenin-Ovalbumin-Konjugat und Digoxigenin-RNaseA- Konjugat gleichzeitig jeweils 100 µg/ml betrug, sowie 5 µl einer Proteinmischung in PBS, deren Konzentration an nicht-de rivatisiertem BSA, Ovalbumin und RNaseA ebenfalls gleichzeitig jeweils 100 µg/ml betrug, zunächst durch SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennt. Anschließend wurde das Protein gemisch durch Elektrotransfer auf Nitrozellulose übertragen (Blake et al., Anal. Biochem. 136 (1984), 175-179). Die Mem bran wurde anschließend dreimal für 5 min in 10 ml PBST gewa schen und für 1 h mit 10 ml einer 0,5 µM Lösung jeweils eines der beiden Fusionsproteine inkubiert. Danach wurde die Membran zweimal für 5 min in 10 ml PBST und zweimal für 5 min in 10 ml PBS gewaschen und schließlich für 10 min in 10 ml AP-Puffer geschwenkt. Zur chromogenen Nachweisreaktion wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer, dem 30 µl BCIP (50 µg/ml in Dimethylform amid) und 5 µl NBT (75 µg/ml in 70% v/v Dimethylformamid) zu gesetzt waren, inkubiert und auf diese Weise gebundenes Fusi onsprotein nachgewiesen.

Das Ergebnis dieses Nachweisverfahrens ist in Fig. 4 wieder gegeben. Es zeigt sich wiederum, daß die Bindung der Digoxige ningruppe durch beide Fusionsproteine unabhängig vom Träger protein ist, und daß mit beiden Fusionsproteinen vergleichbare Signalintensitäten erzielt werden. Dieselben Trägerproteine führen zu keinerlei Signal, wenn sie nicht mit der Digoxige ningruppe konjugiert sind.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Polypeptid, ausgewählt aus Muteinen des Bilin-Bindungspro teins, dadurch gekennzeichnet, daß es

a) Digoxigenin oder Konjugate des Digoxigenins zu binden vermag,
b) Ouabain, Testosteron und 4-Aminofluorescein nicht bin det und
c) an mindestens einer der Sequenzpositionen 28, 31, 34,35, 36, 37, 58, 60, 69, 88, 90, 95, 97, 114, 116, 125 und 127 des Bilin-Bindungsproteins eine Aminosäuresubstitution aufweist.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dissoziationskonstante des Komplexes mit Digoxige nin 100 nm oder kleiner ist.

3. Polypeptid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine der Aminosäuresubstitutionen ausge wählt aus Glu(28) → Gln, Lys(31) → Ala, Asn(34) → Asp, Ser(35) → His, Val(36) → Ile, Glu(37) → Thr, Asn(58) → Arg, His(60) → Ser, Ile(69) → Ser, Leu(88) → Tyr, Tyr(90) → Ile, Lys(95) → Gln, Asn(97) → Gly, Tyr(114) → Phe, Lys(116) → Ser, Gln(125) → Met und Phe(127) → Leu im Vergleich zum Bilin- Bindungsprotein trägt.

4. Polypeptid nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens eine Markierungsgruppe, ausgewählt aus Enzymmarkierung, radioaktiver Markierung, Fluoreszenzmar kierung, Chromophormarkierung, (Bio)-Lumineszenzmarkierung oder Markierung mit Haptenen, Biotin, Metallkomplexen, Me tallen oder kolloidalem Gold, trägt.

5. Fusionsproteine von Polypeptiden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym, ein anderes Protein oder eine Proteindomä ne, eine Signalsequenz und/oder ein Affinitätspeptid an den Aminoterminus des Polypeptids in operabler Weise fu sioniert ist.

6. Fusionsproteine von Polypeptiden nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym, ein anderes Protein oder eine Proteindomä ne, eine Targeting-Sequenz und/oder ein Affinitätspeptid an den Carboxyterminus des Polypeptids in operabler Weise fusioniert ist.

7. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine für ein Mutein oder ein Fusionsprotein eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins nach einem oder mehre ren der Ansprüche 1 bis 6 kodierende Sequenz umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Muteins oder eines Fusi onsproteins eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die für das Mutein oder das Fusionsprotein eines Mute ins des Bilin-Bindungsproteins kodierende Nukleinsäure in einer bakteriellen oder eukaryontischen Wirtszelle zur Ex pression gebracht wird und das Polypeptid aus der Zelle oder dem Kulturüberstand gewonnen wird.

9. Verwendung eines Muteins oder eines Fusionsproteins eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins nach einem oder mehre ren der Ansprüche 1 bis 8 zur Bindung, zum Nachweis, zur Bestimmung, Immobilisierung oder zur Abtrennung von Digo xigenin oder von Konjugaten des Digoxigenins mit Protei nen, Nukleinsäuren, Kohlenhydraten, anderen biologischen oder synthetischen Makromolekülen oder niedermolekularen chemischen Verbindungen.

10. Verfahren zum Nachweis der Digoxigeningruppe, wobei ein Mutein des Bilin-Bindungsproteins oder ein Fusionsprotein eines Muteins des Bilin-Bindungsproteins nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 mit Digoxigenin oder mit Konjugaten des Digoxigenins unter geeigneten Bedingungen, um eine Bindung des Muteins an die Digoxigeningruppe zu bewirken, in Kontakt gebracht und das Mutein oder das Fu sionsprotein des Muteins bestimmt wird.