DE19926041A1 - Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben mittels Gelpermeationschromatographie an hydrophilen Trägern.

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Entfernung oder Ab­ trennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben mittels Gelpermeations- Chromatographie.

Oft können wertvolle Substanzen nur aus Proben oder Quellen isoliert werden, die biologischen Ursprungs sind. Dazu gehören insbesondere auch Arzneimittel, die bei­ spielsweise Faktoren der Blutgerinnungskaskade enthalten. Zwar sind viele wirksame Proteine mittlerweile auch gentechnisch erhältlich, jedoch wird auch in diesen Fällen der entsprechende Wirkstoff durch transformierte Zellen gebildet. Der Wirkstoff wird dann durch Isolierungsverfahren aus den transformierten Organismen gewonnen. Dabei besteht ein Restrisiko, daß aus den biologischen Quellen infektiöse Partikel verschleppt werden.

Ein erheblich größeres Risiko besteht jedoch bei der Isolierung von Wirkstoffen direkt aus biologischen Quellen. So ist beispielsweise ein hohes Infektionsrisiko bei der Aufarbeitung von Blutprodukten, die aus gepoolten Spenden stammen, zu verzeich­ nen. Erinnert sei hier nur an die Infektion von Hämophilie-Patienten durch mit HIV kontaminierten Faktor VIII Präparaten.

Es hat in der Vergangenheit nicht an Versuchen gefehlt, das Infektionsrisiko durch solche Wirkstoffe zu verringern oder gar zu eliminieren. Zur Zeit durchgesetzt hat sich ein Verfahren, bei dem der zu isolierende Wirkstoff vor, während oder nach der Abtrennung mit Chemikalien behandelt wird, was zur Inaktivierung von möglicher­ weise in der Probe enthaltenen Viren führt. Eine diesbezügliche Methode ist in der EP-A-0 131 740 beschrieben.

Es ist wünschenswert, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben erlaubt, welche den zu isolierenden Wirkstoff nicht beschädigt. Desweiteren ist es wünschenswert, eine Me­ thode zur Verfügung zu stellen, die eine Abtrennung oder Entfernung von Viren auf schnellem Wege erlaubt. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß dies erfin­ dungsgemäß durch ein Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in po­ tentiell Viren enthaltenden Proben mittels Gelpermeationschromatographie an hydro­ philen Trägern möglich ist.

Die Gelpermeationschromatographie ist eine an sich bekannte Methode, mit deren Hilfe insbesondere Mischungen von Biopolymeren in Fraktionen aufgetrennt wer­ den können, in denen in der Mischung enthaltene Moleküle nach ihrer Größe ge­ trennt werden.

Bislang galt die Gelpermeationschromatographie als nicht geeignet, infektiöses Material wie Viren aus Biopolymere enthaltenden potentiell mit infektiösem Mate­ rial kontaminierten Quellen so abzutrennen, daß keine Infizierung durch Verabrei­ chung oder andere Nutzung des aus solchen Quellen erhaltenen Materials mehr erfolgen konnte.

Überraschenderweise hat sich gemäß der Erfindung gezeigt, daß zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben die Gelpermea­ tionschromatographie an hydrophilen Trägern eingesetzt werden kann.

Werden Plasmafraktionen zur Gewinnung von Komponenten der Blutgerinnungs­ kaskade gemäß Josic et al. J. Chromatogr. A 796 (1998) 289-298 eingesetzt, so erhält man beispielsweise Faktor IX Präparate, die frei von infektiösen Partikeln, insbesondere Viren, die durch Blut oder Blutprodukte übertragbar sind (blood borne virus). Allerdings reagieren die Faktor IX Präparate nach Verlassen der Säule mög­ licherweise positiv in PCR Kontrollen auf virale DNA. Dies beruht auf Nukleinsäu­ rekontaminationen durch virale aber nicht mehr infektiöse DNA/RNA, also Virus­ fragmente, wie sich durch einen DNA/RNA-Abbau zeigen läßt. Bei dem Abbau durch DNAse bzw. RNAse werden nur diese Virusfragmente abgebaut, während die intakten, möglicherweise infektiösen Viren in einer Fraktion noch detektiert werden können, die von Biopolymeren getrennt wurden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Abtrennung von infektiösen Parti­ keln und Viren in potentiell infektiöse Partikel enthaltenden Proben mittels Gelper­ meations-Chromatographie an hydrophilen Trägern. Vorzugsweise werden als hy­ drophile Träger Polysaccharide, insbesondere Dextrane, Cellulose, Agarose, modifizierte Polysaccharide, hydrophile, synthetische Polymere, vorzugsweise sogenannte Tentakel-Chromatographiematerialien, mit hydrophilen Gruppen modi­ fizierte Silicagele oder Kombinationen davon eingesetzt.

Polysaccharide werden beispielsweise als kommerziell erhältliche Träger, wie Se­ phadex, Sepharose, Agarose, etc. eingesetzt. Dextrane sind dem Fachmann bereits seit langem zur Trennung von Substanzen bekannt. Neben Cellulose, Agarose kommen auch modifizierte Polysaccharide in Betracht. Synthetische Polymere kön­ nen ebenfalls eingesetzt werden. Bevorzugte synthetische Polymere sind solche auf Polyglycidylmethacrylat-Basis, insbesondere mit hydrophilen Armen (Tentakeln) modifizierte. Zur weiteren Beschreibung wird auf die EP-A-0 337 144 und die EP- A-0 320 023 verwiesen, auf die ausdrücklich Bezug genommen wird. Als Tentakel- Chromatographiematerialien sind insbesondere für Trennung von Biopolymeren Trägermaterialien verwendet worden, die in der EP-A-0 337 144, auf die hier aus­ drücklich Bezug genommen wird, näher beschrieben sind. Neben den organischen hydrophilen Trägermaterialien kommen auch anorganische Materialien wie mit hydrophilen Gruppen modifizierte Silicagele in Betracht. Hier sind beispielsweise TSK-Gele sowie sogenannte SW-Serie (Silica wide pore, Toso Haas, Stuttgart) zu nennen.

Das im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende hydrophile Trägermaterial weist insbesondere eine großporige Struktur auf. Partikuläres Material weist insbe­ sondere eine Korngröße von 0,5 bis 350 µm auf.

Ebenfalls Verwendung finden können sogenannte kompakte Blockmaterialien, wie sie in EP-A-0 320 023, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrie­ ben sind. Das kompakte Blockmaterial besitzt den Vorteil, daß es aufgrund seiner mehr oder weniger monolithischen Struktur druckstabil ist sowie im radialen Fluß betrieben werden kann, was zu einer vorteilhaften Verringerung des Totvolumens führt.

Die Porengröße des hydrophilen Trägers, angegeben als Maximum der Porengrö­ ßenverteilung der Poren des Trägers, kann in bestimmten Grenzen in Abhängigkeit des Trennproblems gewählt werden. Die Porengröße ist in gewisser Weise nach oben dadurch begrenzt, daß die abzutrennenden Viren nicht oder nur teilweise in die Poren des hydrophilen Trägermaterials eindringen können und somit allenfalls eine vernachlässigbare Retardierung erfahren. Dies ist insbesondere abhängig von der aus der potentiell infektiöse Partikel enthaltenden Probe zu isolierenden Substanz. Ist dies eine Substanz, die sich durch ein geringes Molekulargewicht auszeichnet, ist wiederum der Größenabstand zwischen den infektiösen Partikeln und der zu tren­ nenden Substanz groß genug, so daß auch größerporige Chromatographiemateriali­ en verwendet werden können. Zwar kann dann das infektiöse Material auch eine gewisse Retardierung erfahren, welche jedoch im Vergleich zu dem abzutrennenden Molekül gering genug ist, um eine hinreichend sichere Abtrennung von infektiösem Material und zu trennender Substanz zu erreichen.

Ebenso ist die Wahl der Porengröße des hydrophilen Trägermaterials nach unten begrenzt. Dies hängt dabei im wesentlichen von der Größe oder dem Molekularge­ wicht der zu trennenden Substanz ab. Typischerweise ist die Porengröße des hydro­ philen Trägermaterials größer als 5 nm, insbesondere größer als 50 nm.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Abtrennung von Viren in potentiell Viren enthaltenden Proben, welche Biopolymere wie Proteine, Polypeptide, Oli­ gopeptide, Nucleinsäuren, Polynukleotide, Oligonucleotide und/oder Kohlenhydrate enthält. Es kommen insbesondere Proben wie Blutplasma oder Plasmafraktionen in Frage, welche Substanzen wie Faktor IX, Antithrombin III, Immunoglobuline G und A, Faktor VIII (ohne von Willebrand Faktor), Faktor VII, α₁-Antitrypsin, Prothrom­ bin, Thrombin, Faktor X, Protein C, Protein S und andere Faktoren der Blutgerin­ nungskaskade enthält. Diese Substanzen können auch in einer Probe enthalten sein, die bei der gentechnischen Herstellung dieser Substanzen anfällt.

Die durch Blut oder Blutprodukte übertragbaren Viren, die durch das erfindungsge­ mäße Verfahren abgetrennt werden können, sind insbesondere von durch Blut über­ tragbare Viren, wie Parvo Viren, Hepatitis A, B, C Viren, HIV und ähnliche.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden hydrophilen Träger werden insbesondere in konventionellen Chromatographie-Vorrichtungen bzw. -Verfahren eingesetzt. Dazu gehören beispielsweise die Säulenchromatographie in allen ihren Formen als diskontinuierliches oder kontinuierliches Verfahren. Auch die Chroma­ tographie an kompakten Blockmaterialien kann als diskontinuierliches oder konti­ nuierliches Verfahren eingesetzt werden. Annulare Chromatographie, Simulating- Moving-Bed (SMB) Chromatographie und/oder Truly-Moving-Bed-Chromato­ graphie kommen als kontinuierliche Verfahrensweisen in Betracht, sowie Kombi­ nationen dieser Chromatographieverfahren. Annulare Chromatographie oder Chro­ matographie an kompakten Blockmaterialien sind insbesondere in den Veröffentli­ chungen K. Reissner et al., J. of Chromatography A. 763 (1997), 49 bis 56 sowie WO-A-96/06158 näher erläutert. Auf diese Druckschriften wird ausdrücklich Bezug genommen.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt auch in der gleichzeitigen Ab­ reicherung von Begleitproteinen zur Herstellung von gereinigten Proteinkonzentra­ ten. Beispielsweise konnte durch die Gelpermeationschromatographie, welche auch Molekularausschlußchromatographie genannt wird, zur Abtrennung von vorher zugesetztem Testvirus in einer Gerinnungsfaktor IX enthaltenden Plasmafraktion aus gepooltem Humanplasma auch die weitere Reinigung des Gerinnungsfaktor IX erreicht werden. Überraschenderweise konnte als Verunreinigung Vitronektin quan­ titativ abgetrennt und identifiziert werden. Vitronektin wird nämlich durch das übli­ che Verfahren der Ionenaustauschchromatographie oder Affinitätschromatographie an Heparin mit Faktor IX angereichert. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde erstmals ein aus Plasma gewonnener Faktor IX erhalten, der sich nicht nur durch die Abwesenheit von infektiösen Partikeln, sondern auch durch die Abwesen­ heit von viralen Fragmenten und gleichzeitig die Freiheit von Vitronektin kenn­ zeichnet. Dieses humane Material ist damit frei von xenogenen Komponenten, wie murinen Antikörpern und artfremden Nukleinsäuren. Zwar konnte gegebenenfalls im Stand der Technik durch den Einsatz von murinen monoklonalen Antikörpern eine Abreicherung von Vitronektin aus einer Faktor IX enthaltenden Lösung be­ wirkt werden, jedoch mußten dann auch murine Verunreinigungen des erhaltenen Präparates in Kauf genommen werden, also der Gehalt an xenogenen Biopolymeren.

Die Erfindung wird anhand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.

Abtrennung von Viren in einer Präparation von Faktor IX

Faktor IX enthaltende Proben wurden in 5 ml Laupuffer, 200 mM NaCl, 20 mM Na­ trium Citrat Dihydrat, pH 7,4, gelöst und über eine XK-26-Säule der Firma Pharmacia (r = 13 mm, h = 680 mm) gegeben. Bei einer Flußrate von 1 ml/min wurden alle 4 min Fraktionen gesammelt. Die Trennung erfolgte an Fractogel EMD Bio SEC 650 (S) (Merck Darmstadt). Ein typisches Chromatogramm ist in der Figur wiedergege­ ben. Die gestrichelte Linie entspricht dabei Fraktionen, in denen DNA nachweisbar war. Dabei ist die etwa im Bereich der Fraktionen 16 bis 28 eluierende nachzuweisen­ de DNA auf intakte Viruspartikel zurückzuführen, wohingegen das scheinbare zweite Maximum im Bereich der Fraktionen 26 bis 44 auf virale Fragmente, die nicht infek­ tiös sind, zurückgeht. Die Viruspartikel selbst eluieren mithin vollständig in den Frak­ tionen 16 bis 28. Bei den gewählten Parametern erscheint die Faktor IX Fraktion im Bereich der Fraktionen 32 bis 40, so daß eine hinreichende Abtrennung von Viruspar­ tikeln zu beobachten ist.

Die viralen Fragmente wurden durch den Abbau mit DNAse vollständig entfernt und waren selbst mittels PCR-Verfahren unter der Nachweisgrenze. Gleichzeitig konnte das Begleitprotein Vitronektin abgetrennt werden, wodurch eine homogene Faktor IX Präparation erhalten wurde.

Claims (11)

1. Verfahren zur Entfernung oder Abtrennung von Viren in potentiell Viren ent­ haltenden Proben mittels Gelpermeationschromatographie an hydrophilen Trä­ gern.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophilen Trä­ ger Polysaccharide, insbesondere Dextrane, Cellulose, Agarose, modifizierte Polysaccharide, sogenannte Tentakel-Chromatographiematerialien, mit hydro­ philen Gruppen modifizierte Silicagele oder Kombinationen davon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die hydrophi­ len Träger eine großporige Struktur aufweisen, vorzugsweise in Form von parti­ kulärem Material mit einer Korngröße von 0,5 bis 350 µm oder aus kompaktem Blockmaterial bestehen.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeich­ net, daß die Porengröße des hydrophilen Trägers größer als 5 nm, insbesondere größer als 50 nm ist.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeich­ net, daß die Probe Biopolymere wie Proteine, Polypeptide, Oligopeptide, Nucleinsäuren, Polynukleotide, Oligonucleotide und/oder Kohlenhydrate ent­ hält.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Substanzen aus Blutplasma wie Faktor IX, Antithrombin III, Immunglobuline G und A, Faktor VIII, Faktor VII, α₁-Antitrypsin, Prothrombin, Thrombin, Faktor X, Protein C, Protein S, die genannten Substanzen auch aus Fraktion zu ihrer Her­ stellung auf gentechnischem Weg, enthält.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeich­ net, daß die Viren aus Blut übertragene Viren (blood borne virus) sind.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeich­ net, daß diskontinuierliche oder kontinuierliche Verfahren sowie Kombinationen davon eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als kontinuierliches Verfahren annulare Chromatographie, Simulating-Moving-Bed (SMB) Chro­ matographie und/oder Truly-Moving-Bed-Chromatographie eingesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Chromatographie an kompakten Blockmaterialien und/oder Säulenchromatographie als kontinu­ ierliches oder diskontinuierliches Chromatographieverfahren eingesetzt wird.

11. Pharmazeutisches Präparat enthaltend Faktor IX, erhältlich aus Blutplasma durch ein Verfahren nach Anspruch 6, welches Präparat frei ist von Viren, vi­ ralen Fragmenten und Vitronektin.