DE19921940A1 - Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomerhybriden - Google Patents
Verfahren zur elektrochemischen Detektion von NukleinsäureoligomerhybridenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen. Dabei dienen DNA-/RNA-/PNA-Oligomer-Einzelstränge, die mit einem Ende kovalent auf einer Trägeroberfläche angebunden und am anderen, freien Ende kovalent mit einem Redoxpaar verknüpft sind, als Hybridisierungsmatrix ("Sonde"). Durch Behandlung mit der zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung ("Target") wird die ursprünglich nicht oder nur schwach vorhandene elektrische Kommunikation zwischen der leitfähigen Trägeroberfläche und dem über Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar verändert. Im Falle der Hybridisierung wird die elektrische Kommunikation zwischen der Trägeroberfläche und dem nunmehr über hybridisiertes Doppelstrang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar verstärkt. Somit wird die Detektion eines Hybridisierungsereignisses durch elektrochemische Verfahren wie cyclische Voltametrie, Amperometrie oder Leitfähigkeitsmessung ermöglicht.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer, sowie ein
Verfahren zur elektrochemischen Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure-
Oligomer-Hybridisierungsereignissen.
Zur Sequenzanalyse von DNA und RNA, z. B. in der Krankheitsdiagnose, bei
toxikologischen Testverfahren, in der genetischen Forschung und Entwicklung,
sowie auf dem Agrar- und pharmazeutischen Sektor, werden im allgemeinen gel
elektrophoretische Verfahren mit autoradiographischer oder optischer Detektion
verwendet.
Zur Veranschaulichung des wichtigsten gel-elektrophoretischen Verfahrens mit
optischer Detektion (Sanger-Verfahren) ist in Fig. 1b ein DNA-Fragment mit Primer
dargestellt. Bei dem Sanger-Verfahren wird eine DNA enthaltende Lösung in vier
Ansätze aufgeteilt und der Primer jedes Ansatzes mit je einem bei verschiedener
Wellenlänge emittierenden Fluoreszenzfarbstoff kovalent modifiziert. Wie in Fig. 1b
dargestellt wird zu jedem Ansatz Desoxyribonucleosid-Triphosphat der Basen A
(Adenin), T (Thymin), C (Cytosin), und G (Guanin), also dATP, dTTP, dCTP und
dGTP, gegeben, um den Einzelstrang, ausgehend vom Primer, durch DNA-
Polymerase I enzymatisch zu replizieren. Zusätzlich zu den vier
Desoxyribonucleosid-Triphosphaten enthält jedes Reaktionsgemisch noch genügend
des 2',3'-Didesoxyanalogons (Fig. 1a) eines dieser Nukleosidtriphosphate als
Stopbase (je eine der 4 möglichen Stoppbasen pro Ansatz), um die Replikation an
allen möglichen Bindungsstellen zu stoppen. Nach Vereinigung der vier Ansätze
entstehen replizierte DNA-Fragment aller Längen mit stopbasenspezifischer
Fluoreszenz, die gel-elektrophoretisch der Länge nach sortiert und durch
Fluoreszenz-Spektroskopie charakterisiert werden können (Fig. 1c).
Ein anderes optisches Detektionsverfahren basiert auf der Anlagerung von
Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Ethidiumbromid an Oligonukleotide. Die
Fluoreszenz solcher Farbstoffe steigt im Vergleich zur freien Lösung des Farbstoffs
um etwa das 20-fache an, wenn sie sich an doppelsträngige DNA oder RNA
anlagern und kann deshalb zum Nachweis hybridisierter DNA oder RNA verwendet
werden.
Bei der radioaktiven Markierung wird 32P in das Phosphatgerüst der Oligonukleotide
eingebaut, wobei 32P gewöhnlich am 5'-Hydroxylende durch Polynukleotid-Kinase
addiert wird. Die markierte DNA wird anschließend an jeweils einem der vier
Nukleotidtypen bevorzugt gespalten und zwar unter definierten Bedingungen, so daß
pro Kette durchschnittlich eine Spaltung erfolgt. Damit liegen im Reaktionsgemisch
für einen bestimmten Basentyp Ketten vor, die sich von der 32P-Markierung bis zur
Position dieser Base erstrecken (bei mehrfachem Auftreten der Base erhält man
entsprechend Ketten unterschiedlicher Länge). Die vier Fragmentgemische werden
anschließend auf vier Bahnen gel-elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wird vom
Gel ein Autoradiogramm angefertigt, an dem die Sequenz unmittelbar abgelesen
werden kann.
Vor einigen Jahren wurde ein weiteres, auf optischer (oder autoradiographischer)
Detektion beruhendes Verfahren zur DNA-Sequenzierung entwickelt, nämlich die
Sequenzierung durch Oligomerhybridisierung (vgl. z. B. Drmanac et al., Genomics 4,
(1989), S. 114-128 oder Bains et al., Theor. Biol. 135, (1988), S. 303-307). Bei
diesem Verfahren wird ein vollständiger Satz kurzer Oligonukleotide bzw. Oligomere
(Sonden-Oligonukleotide), z. B. alle 65 536 möglichen Kombinationen der Basen A,
T, C und G eines Oligonukleotid-Oktamers auf ein Trägermaterial gebunden. Die
Anbindung geschieht in einem geordneten Raster aus 65 536 Test-Sites, wobei
jeweils eine größere Menge einer Oligonukleotid-Kombination ein Test-Site
definieren und die Position jeder einzelnen Test-Site (Oligonukleotid-Kombination)
bekannt ist. Auf solch einer Hybridisierungsmatrix, dem Oligomerchip, wird ein DNA-
Fragment, dessen Sequenz man ermitteln will, das Target, mit Fluoreszenz-Farbstoff
(oder 32P) markiert und unter Bedingungen, die nur eine spezifische
Doppelstrangbildung erlauben, hybridisiert. Dadurch bindet das Target DNA-
Fragment nur an die Oligomere (im Beispiel an die Oktamere), deren komplementäre
Sequenz exakt einem Teil (einem Oktamer) seiner eigenen Sequenz entspricht.
Durch optische (oder autoradiographische) Detektion der Bindungsposition des
hybridisierten DNA-Fragments werden damit alle im Fragment vorhandenen
Oligomersequenzen (Oktamersequenzen) bestimmt. Aufgrund der Überlappung
benachbarter Oligomersequenzen kann durch geeignete mathematische
Algorithmen die fortlaufende Sequenz des DNA-Fragments bestimmt werden. Die
Vorteile dieses Verfahrens liegen unter anderem in der Miniaturisierung der
Sequenzierung und damit in der enormen Datenmenge, die gleichzeitig in einem
Arbeitsgang erfaßt wird. Daneben kann auf Primer und auf das gel
elektrophoretische Auftrennen der DNA-Fragmente verzichtet werden. Beispielhaft
ist dieses Prinzip in Fig. 2 für ein 13 Basen langes DNA-Fragment gezeigt.
Die Verwendung radioaktiver Markierungen bei der DNA-/RNA-Sequenzierung ist
mit mehreren Nachteilen verbunden, wie z. B. aufwendige, gesetzlich
vorgeschriebene Sicherheitsvorkehrungen beim Umgang mit radioaktiven
Materialien, die Strahlenbelastung, das begrenzte räumliche Auflösungsvermögen
(maximal 1 mm2) und eine Sensitivität, die nur dann hoch ist, wenn die Strahlung der
radioaktiven Fragmente entsprechend lange (Stunden bis Tage) auf einen
Röntgenfilm einwirkt. Es kann zwar die räumliche Auflösung durch zusätzliche Hard-
und Software erhöht und die Detektionszeit durch die Verwendung von β-Scannern
verkürzt werden, beides ist jedoch mit erheblichen zusätzlichen Kosten verbunden.
Die Fluoreszenzfarbstoffe, die üblicherweise zur Markierung der DNA verwendet
werden, sind zum Teil (z. B. Ethidiumbromid) mutagen und erfordern, ebenso wie die
Anwendung der Autoradiographie, entsprechende Sicherheitsvorkehrungen. In fast
allen Fällen erfordert die Verwendung optischer Detektion den Gebrauch von einem
oder mehreren Lasersystemen und somit geschultes Personal und entsprechende
Sicherheitsvorkehrungen. Die eigentliche Detektion der Fluoreszenz erfordert
zusätzliche Hardware, wie z. B. optische Bauelemente zur Verstärkung und, bei
verschiedenen Anregungs- und Abfragewellenlängen wie im Sanger-Verfahren, ein
Kontrollsystem. Abhängig von den benötigten Anregungswellenlängen und der
gewünschten Detektionsleistung können somit erhebliche Investitionskosten
entstehen. Bei der Sequenzierung durch Hybridisierung auf dem Oligomerchip ist die
Detektion noch (kosten)aufwendiger, da, neben dem Anregungssystem, zur 2-
dimensionalen Detektion der Fluoreszenzspots hochauflösende CCD-Kameras
(Charge Coupled Device Kameras) benötigt werden.
Obwohl es also quantitative und extrem sensitive Methoden zur DNA-/RNA-
Sequenzierung gibt, sind diese Methoden zeitaufwendig, bedingen aufwendige
Probenpräparation und teure Ausstattung und sind im allgemeinen nicht als
transportable Systeme verfügbar.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung und ein
Verfahren zur Detektion von Nukleinsäureoligomerhybriden zu schaffen, welche die
Nachteile des Standes der Technik nicht aufweisen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das modifizierte Oligonukleotid gemäß
unabhängigem Patentanspruch 1, durch das Verfahren zur Herstellung eines
modifizierten Oligonukleotids gemäß unabhängigem Anspruch 9 und 10, durch die
modifizierte leitfähige Oberfläche gemäß unabhängigem Patentanspruch 11, das
Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche gemäß
unabhängigem Patentanspruch 21, sowie durch das Verfahren zur
elektrochemischen Detektion von Oligomerhybridisierungsereignissen gemäß
unabhängigem Patentanspruch 27 gelöst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen und
Begriffe benutzt:
DNA: Desoxyribonukleinsäure
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH-(CH2
RNA: Ribonukleinsäure
PNA: Peptidnukleinsäure (synthetische DNA oder RNA, bei der die Zucker-Phosphat-Einheit durch eine Aminosäure ersetzt ist. Bei Ersatz der Zucker-Phosphat-Einheit durch die -NH-(CH2
)2
-
N(COCH2
-Base)-CH2
CO-Einheit hybridisiert PNA mit DNA).
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
Base: A, G, T oder C
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA,- PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
dATP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des A (DNA-Einheit mit der Base A und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dGTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des G (DNA-Einheit mit der Base G und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dCTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des C (DNA-Einheit mit der Base C und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dTTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des T (DNA-Einheit mit der Base T und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
Primer: Start-Komplementär-Fragment eines Oligonukleotids, wobei die Basenlänge des Primers nur ca. 4-8 Basen beträgt. Dient als Ansatzpunkt für die enzymatische Replikation des Oligonukleotids.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, daß die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ds: double strand (Doppelstrang)
ss: single strand (Einzelstrang)
A: Adenin
G: Guanin
C: Cytosin
T: Thymin
Base: A, G, T oder C
Bp: Basenpaar
Nukleinsäure: wenigstens zwei kovalent verbundene Nukleotide oder wenigstens zwei kovalent verbundene Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder Guanin). Der Begriff Nukleinsäure bezieht sich auf ein beliebiges "Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der PNA oder auf analoge Strukturen (z. B. Phosphoramid-, Thio-Phosphat- oder Dithio-Phosphat-Rückgrat). Wesentliches Merkmal einer Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann.
Nukleinsäure-Oligomer: Nukleinsäure nicht näher spezifizierter Basenlänge (z. B. Nukleinsäure-Oktamer: eine Nukleinsäure mit beliebigem Rückgrat, bei dem 8 Pyrimidin- oder Purin-Basen kovalent aneinander gebunden sind).
Oligomer: Äquivalent zu Nukleinsäure-Oligomer.
Oligonukleotid: Äquivalent zu Oligomer oder Nukleinsäure-Oligomer, also z. B. ein DNA,- PNA- oder RNA-Fragment nicht näher spezifizierter Basenlänge.
Oligo: Abkürzung für Oligonukleotid.
dATP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des A (DNA-Einheit mit der Base A und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dGTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des G (DNA-Einheit mit der Base G und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dCTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des C (DNA-Einheit mit der Base C und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
dTTP: Desoxyribonucleosid-Triphosphat des T (DNA-Einheit mit der Base T und zwei weiteren Phosphaten zum Aufbau eines längeren DNA-Fragments bzw. eines Oligonukleotids).
Primer: Start-Komplementär-Fragment eines Oligonukleotids, wobei die Basenlänge des Primers nur ca. 4-8 Basen beträgt. Dient als Ansatzpunkt für die enzymatische Replikation des Oligonukleotids.
Mismatch: Zur Ausbildung der Watson Crick Struktur doppelsträngiger Oligonukleotide hybridisieren die beiden Einzelstränge derart, daß die Base A (bzw. C) des einen Strangs mit der Base T (bzw. G) des anderen Strangs Wasserstoffbrücken ausbildet (bei RNA ist T durch Uracil ersetzt). Jede andere Basenpaarung bildet keine Wasserstoffbrücken aus, verzerrt die Struktur und wird als "Mismatch" bezeichnet.
ds: double strand (Doppelstrang)
ss: single strand (Einzelstrang)
R: beliebiger, nicht näher spezifizierter organischer Rest als Substituent
oder Seitenkette.
Redox: redoxaktive Substanz
Alkyl: Der Begriff "Alkyl" bezeichnet ein gesättigtes Kohlenwasserstoffradikal, das geradkettig oder verzweigt ist (z. B. Ethyl, Isopropyl oder 2,5-Dimethylhexyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. -CH2
Redox: redoxaktive Substanz
Alkyl: Der Begriff "Alkyl" bezeichnet ein gesättigtes Kohlenwasserstoffradikal, das geradkettig oder verzweigt ist (z. B. Ethyl, Isopropyl oder 2,5-Dimethylhexyl etc.). Wenn "Alkyl" benutzt wird, um auf einen Linker oder Spacer zu verweisen, bezeichnet der Begriff eine Gruppe mit zwei verfügbaren Valenzen für die kovalente Verknüpfung (z. B. -CH2
CH2
-, -CH2
CH2
CH2
- oder
-CH2
C(CH3
)2
CH2
CH2
C(CH3
)2
CH2
- etc.). Bevorzugte Alkylgruppen als
Substituenten oder Seitenketten R sind solche der Kettenlänge 1-30
(längste durchgehende Kette von aneinandergebundenen Atomen).
Bevorzugte Alkylgruppen als Linker oder Spacer sind solche der
Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die
Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen
den Linker oder Spacer verbundenen Strukturen darstellt.
Alkenyl: Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl: Alkyl- oder Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C∼C Dreifachbindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl: Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl: Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl: Alkinylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C∼C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
(n × HS-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n × R-S-S-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfidfunktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure- Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo: zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die über eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure-Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure- Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.
PQQ: Pyrrolo-Chinolino-Chinon, entspricht: 4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H pyrrolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarboxylsäure)
TEATFB: Tetraethylammonium-tetrafluoroborat
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
Cystamin: (H2
Alkenyl: Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfachbindungen durch C=C Doppelbindungen ersetzt sind.
Alkinyl: Alkyl- oder Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C∼C Dreifachbindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkyl: Alkylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen oder C-C Einfachbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkenyl: Alkenylgruppen bei denen eine oder mehrere C-H Bindungen, C-C Einfach- oder C=C Doppelbindungen durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Hetero-Alkinyl: Alkinylgruppen bei denen eine oder mehrere der C-H Bindungen, C-C Einfach-, C=C Doppel- oder C∼C Dreifachbindung durch C-N, C=N, C-P, C=P, C-O, C=O, C-S oder C=S Bindungen ersetzt sind.
Linker: molekulare Verbindung zwischen zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül. In der Regel sind Linker als Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Hetero-Alkyl-, Hetero-Alkenyl- oder Heteroalkinylkette käuflich zu erwerben, wobei die Kette an zwei Stellen mit (gleichen oder verschiedenen) reaktiven Gruppen derivatisiert ist. Diese Gruppen bilden in einfachen/bekannten chemischen Reaktionen mit den entsprechenden Reaktionspartner eine kovalente chemische Bindung aus. Die reaktiven Gruppen können auch photoaktivierbar sein, d. h. die reaktiven Gruppen werden erst durch Licht bestimmter oder beliebiger Wellenlänge aktiviert. Bevorzugte Linker sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge hier die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen, also zwischen den zwei Molekülen bzw. zwischen einem Oberflächenatom, Oberflächenmolekül oder einer Oberflächenmolekülgruppe und einem anderen Molekül, darstellt.
Spacer: Linker, der über die reaktiven Gruppen an eine oder beide der zu verbindenden Strukturen (siehe Linker) kovalent angebunden ist. Bevorzugte Spacer sind solche der Kettenlänge 1-20, insbesondere der Kettenlänge 1-14, wobei die Kettenlänge die kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt.
(n × HS-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Thiolfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei die Spacer jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Thiolfunktion und Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein und "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
(n × R-S-S-Spacer)-oligo: Nukleinsäure-Oligomer, an das n Disulfidfunktionen über jeweils einen Spacer angebunden sind, wobei ein beliebiger Rest R die Disulfidfunktion absättigt. Der Spacer zur Anbindung der Disulfidfunktion an das Nukleinsäure-Oligomer kann jeweils eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidfunktion und Nukleinsäure- Oligomer) aufweisen, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14. Diese Spacer können wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure-Oligomer vorhandene oder an diesem durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein. Der Platzhalter "n" ist eine beliebige ganze Zahl, insbesondere eine Zahl zwischen 1 und 20.
oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo: zwei gleiche oder verschiedene Nukleinsäure-Oligomere, die über eine Disulfid-Brücke miteinander verbunden sind, wobei die Disulfidbrücke über zwei beliebige Spacer an die Nukleinsäure-Oligomere angebunden ist und die beiden Spacer eine unterschiedliche Kettenlänge (kürzeste durchgehende Verbindung zwischen Disulfidbrücke und dem jeweiligen Nukleinsäure-Oligomer) aufweisen können, insbesondere jeweils eine beliebige Kettenlänge zwischen 1 und 14 und diese Spacer wiederum an verschiedene natürlich am Nukleinsäure- Oligomer vorhandene oder an diese durch Modifikation angebrachte reaktive Gruppen gebunden sein können.
PQQ: Pyrrolo-Chinolino-Chinon, entspricht: 4,5-Dihydro-4,5-dioxo-1H pyrrolo-[2,3-f]-chinolin-2,7,9-tricarboxylsäure)
TEATFB: Tetraethylammonium-tetrafluoroborat
sulfo-NHS: N-Hydroxysulfosuccinimid
EDC: (3-Dimethylaminopropyl)-carbodiimid
HEPES: N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N'-[2-ethansulfonsäure]
Tris: Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
EDTA: Ethylendiamin-Tetraacetat (Natriumsalz)
Cystamin: (H2
N-CH2
-CH2
-S-)2
Mica: Muskovit-Plättchen, Trägermaterial zum Aufbringen dünner
Schichten.
Au-S-ss-oligo-PQQ: Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem 12Bp Einzelstrang Oligonukleotid (Sequenz: TAGTCGGAAGCA). Hierbei ist die endständigen Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3'-Ende mit (HO-(CH2
Au-S-ss-oligo-PQQ: Gold-Film auf Mica mit kovalent aufgebrachter Monolayer aus derivatisiertem 12Bp Einzelstrang Oligonukleotid (Sequenz: TAGTCGGAAGCA). Hierbei ist die endständigen Phosphatgruppe des Oligonukleotids am 3'-Ende mit (HO-(CH2
)2
-S)2
zum P-O-
(CH2
)2
-S-S-(CH2
)2
-OH verestert, wobei die S-S Bindung
homolytisch gespalten wird und je eine Au-S-R Bindung bewirkt.
Die endständige Base Thymin am 5'-Ende des Oligonukleotids ist
am C-5 Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH2
-CH2
-NH2
modifiziert
und dieser Rest wiederum ist über seine freie Aminogruppe durch
Amidbildung mit einer Carbonsäuregruppe des PQQ verbunden.
Au-S-ds-oligo-PQQ: Au-S-ss-oligo-PQQ, welches mit dem zu ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA) komplementären Oligonukleotid hybridisiert vorliegt.
Au-S-ds-oligo-PQQ: Au-S-ss-oligo-PQQ, welches mit dem zu ss-oligo (Sequenz: TAGTCGGAAGCA) komplementären Oligonukleotid hybridisiert vorliegt.
E: Elektrodenpotential, das an der Arbeitselektrode anliegt.
E0
E0
: Halbstufenpotential, Potential in der Mitte zwischen den Strom-
Maxima für Oxidation und Reduktion einer in der Cyclovoltametrie
reversiblen Elektrooxidation oder -reduktion.
i: Stromdichte (Strom pro cm2
i: Stromdichte (Strom pro cm2
Elektrodenoberfläche)
Cyclovoltametrie: Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Cyclovoltametrie: Aufzeichnung einer Strom/Spannungskurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig linear verändert, ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder -reduktion stattfindet bis zu einem Potential bei dem eine gelöste oder an die Elektrode adsorbierte Spezies oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw. Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden Strom und nach Erreichen eines Maximums einen allmählich abfallenden Strom erzeugt, wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Amperometrie: Aufzeichnung einer Strom/Zeitkurve. Hierbei wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode z. B. durch einen Potentialsprung auf ein Potential gesetzt, bei dem die Elektrooxidation oder -reduktion einer gelösten oder adsorbierten Spezies stattfindet und der fließende Strom wird in Abhängigkeit von der Zeit aufgezeichnet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäure-Oligomer, das durch chemische
Anbindung einer redoxaktiven Substanz modifiziert ist. Als Nukleinsäure-Oligomer
wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Verbindung aus wenigstens zwei
kovalent verbundenen Nukleotiden oder aus wenigstens zwei kovalent verbundenen
Pyrimidin- (z. B. Cytosin, Thymin oder Uracil) oder Purin-Basen (z. B. Adenin oder
Guanin), bevorzugt ein DNA-, RNA- oder PNA-Fragment, verwendet. In der
vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff Nukleinsäure auf ein beliebiges
"Rückgrat" der kovalent verbundenen Pyrimidin- oder Purin-Basen, wie z. B. auf das
Zucker-Phosphat Rückgrat der DNA, cDNA oder RNA, auf ein Peptid-Rückgrat der
PNA oder auf analoge Rückgrat-Strukturen, wie z. B. ein Thio-Phosphat-, ein Dithio-
Phosphat- oder ein Phosphoramid-Rückgrat. Wesentliches Merkmal einer
Nukleinsäure im Sinne der vorliegenden Erfindung ist, daß sie natürlich
vorkommende cDNA oder RNA sequenzspezifisch binden kann. Alternativ zu dem
Begriff "Nukleinsäure-Oligomer" werden die Begriffe "(Sonden-) Oligonukleotid",
"Nukleinsäure" oder "Oligomer" verwendet.
Die redoxaktive Substanz ist bei einem Potential cp selektiv oxidierbar und
reduzierbar, wobei ϕ der Bedingung 2,0 V < ϕ < -2,0 V genügt. Das Potential bezieht
sich hierbei auf die freie, unmodifizierte, redoxaktive Substanz in einem geeigneten
Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung ist der Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧ -1,7 V bevorzugt, wobei
der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧ -1,2 V besonders bevorzugt ist und der Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧
-0,7 V, in dem die redoxaktive Substanz des Anwendungsbeispiels reduziert und
reoxidiert wird, ganz besonders bevorzugt ist. Daneben betrifft die vorliegende
Erfindung eine leitfähige Oberfläche, an die direkt oder indirekt (über einen Spacer)
ein Nukleinsäure-Oligomer mit angebundener redoxaktiver Substanz chemisch
gebunden ist. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche, wobei ein modifiziertes
Nukleinsäure-Oligomer auf eine leitfähige Oberfläche aufgebracht wird. Gemäß
einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das die
elektrochemische Detektion molekularer Strukturen, insbesondere die
elektrochemische Detektion von DNA-/RNA-IPNA- Fragmenten in einer
Probenlösung durch sequenzspezifische Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierung
ermöglicht. Die Detektion der Hybridisierungsereignisse durch elektrische Signale ist
eine einfache und kostengünstige Methode und ermöglicht in einer
batteriebetriebenen Variante eines Sequenziergeräts den Einsatz vor Ort.
Bindung einer redoxaktiven Substanz an ein Nukleinsäure-Oligomer
Voraussetzung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Bindung einer
redoxaktiven Substanz an ein Nukleinsäure-Oligomer. Erfindungsgemäß kann dazu
jede redoxaktive Substanz verwendet werden, solange sie bei einem Potential ϕ, das
der Bedingung 2,0 V ≧ ϕ ≧ -2,0 V genügt, selektiv oxidierbar und reduzierbar ist.
Das Potential bezieht sich hierbei auf die freie, unmodifizierte, redoxaktive Substanz
in einem geeigneten Lösungsmittel, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist der Potentialbereich 1,7 V ≧ ϕ ≧ -1,7 V
bevorzugt, wobei der Bereich 1,4 V ≧ ϕ ≧ -1,2 V besonders bevorzugt ist und der
Bereich 0,9 V ≧ ϕ ≧ -0,7 V, in dem die redoxaktive Substanz des
Anwendungsbeispiels reduziert und reoxidiert wird, ganz besonders bevorzugt ist.
Unter dem Begriff "selektiv oxidierbar und reduzierbar" wird im Rahmen der
vorliegenden Erfindung eine Redoxreaktion, also Abgabe oder Aufnahme eines
Elektrons, verstanden, welche selektiv am Ort der redoxaktiven Substanz stattfindet.
Durch das angelegte Potential wird also letztendlich kein anderer Teil des
Nukleinsäure-Oligomers reduziert oder oxidiert, sondern ausschließlich die an das
Nukleinsäure-Oligomer gebundene redoxaktive Substanz.
Unter redoxaktiver Substanz wird erfindungsgemäß jedes beliebige Molekül
verstanden, daß im elektrochemisch zugänglichen Potentialbereich der jeweiligen
Trägeroberfläche (Elektrode) durch Anlegen einer äußeren Spannung an dieser
Elektrode elektrooxidiert/-reduziert werden kann. Neben üblichen organischen und
anorganischen redoxaktiven Substanzen wie z. B. Hexacyanoferraten, Ferrocenen,
Acridinen oder Phtalocyaninen eignen sich zur Anbindung an das Sonden-
Oligonukleotid insbesondere redoxaktive Farbstoffe wie z. B. (Metallo-)Porphyrine
der allgemeinen Formel 1, (Metallo-)Chlorophylle der allgemeinen Formel 2 oder
(Metallo-)Bakteriochlorophylle der allgemeinen Formel 3, (farbige) natürlich
vorkommende Oxidations-Agentien wie z. B. Flavine der allgemeinen Formel 4,
Pyridin-Nukleotide der allgemeinen Formel 5 oder Pyrrolo-Chinolin-Chinone (PQQ)
der allgemeinen Formel 6 oder sonstige Chinone wie z. B 1,4-Benzochinone der
allgemeinen Formel 7, 1,2-Benzochinone der allgemeinen Formel 8, 1,4-
Naphtochinone der allgemeinen Formel 9, 1,2-Naphtochinone der allgemeinen
Formel 10 oder 9,10-Anthrachinone der allgemeinen Formel 11.
M = 2H, Mg, Zn, Cu, Ni, Pd, Co, Cd, Mn, Fe, Sn, Pt etc.; R1 bis R12 sind unabhängig
voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder
Heteroalkinyl-Substituenten.
R1 bis R8 sind unabhängig voneinander H oder beliebige Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-,
Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder Heteroalkinyl-Substituenten.
Erfindungsgemäß wird eine redoxaktive Substanz an ein Oligonukleotid kovalent
durch die Reaktion des Oligonukleotids mit der redoxaktiven Substanz gebunden.
Diese Bindung kann auf drei verschiedene Arten durchgeführt werden:
a) Als reaktive Gruppe zur Bindungsbildung am Nukleinsäure-Oligomer wird eine
freie Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe des
Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere eine Gruppe an einem der beiden Enden
des Oligonukleotid-Rückgrats, verwendet. Die freien, endständigen Phosphorsäure-,
Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen eine erhöhte
Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B. Amidbildung mit
(primären oder sekundären) Aminogruppen bzw. mit Säuregruppen, Esterbildung mit
(primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw. mit Säuregruppen,
Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkoholen bzw. mit
Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit anschließender
Reduktion der entstandenen CH=N-Bindung zur CH2NH-Bindung ein. Die zur
kovalenten Anbindung der redoxaktiven Substanz nötige Kopplungsgruppe (Säure-,
Amin-, Alkohol-, Thioalkohol- oder Aldehydfunktion) ist entweder natürlicherweise an
der redoxaktiven Substanz vorhanden oder wird durch chemische Modifikation der
redoxaktiven Substanz erhalten.
b) Das Nukleinsäure-Oligomer ist über einen kovalent angebundenen Molekülteil
(Spacer) beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge (kürzeste durchgehende
Verbindung zwischen den zu verbindenden Strukturen darstellt), insbesondere der
Kettenlänge 1 bis 14, am Oligonukleotid-Rückgrat bzw. an einer Base mit einer
reaktiven Gruppe modifiziert. Die Modifikation erfolgt bevorzugt an einem der Enden
des Oligonukleotid-Rückgrats bzw. an einer terminalen Base. Als Spacer kann z. B.
ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder
Heteroalkinylsubstituent verwendet werden. Mögliche einfache Reaktionen zur
Ausbildung der kovalenten Bindung zwischen redoxaktiver Substanz und des so
modifizierten Nukleinsäure-Oligomers sind wie unter a) beschrieben, die Amidbildung
aus Säure- und Amino-Gruppe, die Esterbildung aus Säure- und Alkohol-Gruppe, die
Thioesterbildung aus Säure- und Thio-Alkohol-Gruppe oder die Kondensation von
Aldehyd und Amin mit anschließender Reduktion der entstandenen CH=N-Bindung
zur CH2NH-Bindung.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäure-Oligomer durch
eine redoxaktive Substanz modifiziert, die Bereiche mit einem überwiegend
planaren, in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbital-System aufweist, wie z. B. das
PQQ des Beispiels 1 oder die Chinone der Formel 5 oder 7-12 oder die porphinoiden
Strukturen der Formeln 1-4 bzw. die Pyridin-Nukleotide der allgemeinen Formel 6
bzw. Derivate dieser redoxaktiven Substanzen. In diesem Fall kann der Spacer, über
den die redoxaktive Substanz an das Nukleinsäure-Oligomer gebunden ist, so
gewählt werden, daß sich die Ebene der π-Orbitale der redoxaktiven Substanz
parallel zu den p-π-Orbitalen der an die redoxaktive Substanz angrenzenden Basen
des Nukleinsäure-Oligomers anordnen kann. Diese räumliche Anordnung von
redoxaktiver Substanz mit teilweise planarem in einer Ebene ausgedehnten p-π-
Orbitalen erweist sich als besonders günstig.
c) Bei der Synthese des Nukleinsäure-Oligomers wird eine terminale Base durch die
redoxaktive Substanz ersetzt.
Erfindungsgemäß kann die Bindung der redoxaktiven Substanz an das
Oligonukleotid wie unter a) und b) beschrieben vor oder nach der Bindung des
Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche erfolgen. Die Anbindung der
redoxaktiven Substanz an das auf der leitfähigen Oberfläche gebundene
Oligonukleotid erfolgt dann ebenfalls wie unter a) und b) beschrieben.
Bei mehreren verschiedenen Oligonukleotid-Kombinationen (Test-Sites) auf einer
gemeinsamen Oberfläche ist es vorteilhaft, die (kovalente) Anbindung der
redoxaktiven Substanz an die Sonden-Oligonukleotide durch geeignete Wahl der
reaktiven Gruppe an den freien Sonden-Oligonukleotidenden der verschiedenen
Test-Sites für die gesamte Oberfläche zu vereinheitlichen.
Unter dem Begriff "leitfähige Oberfläche" wird erfindungsgemäß jeder Träger mit
einer elektrisch leitfähigen Oberfläche beliebiger Dicke verstanden, insbesondere
Oberflächen aus Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber, Nickel, Zink,
Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium und Mangan. Im Rahmen der
vorliegenden Erfindung werden die Begriffe "Elektrode" und "leitfähige (Träger-)
Oberfläche" alternativ zu "leitfähige Oberfläche" gebraucht.
Daneben können auch beliebige dotierte oder nicht dotierte Halbleiteroberflächen
beliebiger Dicke verwendet werden. Sämtliche Halbleiter können als Reinsubstanzen
oder als Gemische Verwendung finden. Als nicht einschränkend gemeinte Beispiele
seien an dieser Stelle Kohlenstoff, Silizium, Germanium, α-Zinn, Cu(I)- und Ag(I)-
Halogenide beliebiger Kristallstruktur genannt. Geeignet sind ebenfalls sämtliche
binären Verbindungen beliebiger Zusammensetzung und beliebiger Struktur der
Elemente der Gruppen 14 und 16, der Elemente der Gruppen 13 und 15, sowie der
Elemente der Gruppen 15 und 16. Daneben können ternäre Verbindungen beliebiger
Zusammensetzung und beliebiger Struktur der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16
oder der Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 verwendet werden. Die
Bezeichnungen der Gruppen des Periodensystems der Elemente beziehen sich auf
die IUPAC-Empfehlung von 1985.
Erfindungsgemäß wird ein Oligonukleotid direkt oder über einen Linker/Spacer mit
den Trägeroberflächenatomen oder -molekülen einer leitfähigen Trägeroberfläche
der oben beschriebenen Art verknüpft. Diese Bindung kann auf drei verschiedene
Arten durchgeführt werden:
a) Die Oberfläche wird so modifiziert, daß eine reaktive Molekül-Gruppe zugänglich
ist. Dies kann durch direkte Derivatisierung der Oberflächenmoleküle, z. B. durch
naßchemische oder elektrochemische Oxidation/Reduktion geschehen. So kann z. B. die Oberfläche von Graphitelektroden durch Oxidation naßchemisch mit Aldehyd-
oder Carbonsäure-Gruppen versehen werden. Elektrochemisch besteht z. B. die
Möglichkeit durch Reduktion in Gegenwart von Aryl-Diazoniumsalzen das
entsprechende (funktionalisierte, also mit einer reaktiven Gruppe versehene) Aryl-
Radikal oder durch Oxidation in Gegenwart von R'CO2H das (funktionalisierte) R'-
Radikal auf der Graphit-Elektrodenoberfläche anzukoppeln. Ein Beispiel der direkten
Modifikation von Halbleiteroberflächen ist die Derivatisierung von Siliziumoberflächen
zu reaktiven Silanolen, d. h. Silizium-Träger mit Si-OR"-Gruppen an der Oberfläche,
wobei R" ebenso wie R' einen beliebigen, funktionalisierten, organischen Rest
darstellt (z. B. Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Heteroalkyl-, Heteroalkenyl- oder
Heteroalkinylsubstituent). Alternativ kann die gesamte Oberfläche durch die
kovalente Anbindung einer reaktiven Gruppe eines bifunktionalen Linkers modifiziert
werden, so daß auf der Oberfläche eine monomolekulare Schicht beliebiger
Moleküle entsteht, die, bevorzugt endständig, eine reaktive Gruppe enthalten. Unter
dem Begriff "bifunktionaler Linker" wird jedes Molekül beliebiger Kettenlänge,
insbesondere der Kettenlängen 2-14, mit zwei gleichen (homo-bifunktional) oder
zwei verschiedenen (hetero-bifunktional) reaktiven Molekül-Gruppen verstanden.
Sollen mehrere verschiedene Test-Sites auf der Oberfläche durch Ausnutzen der
Methodik der Photolithographie gebildet werden, so ist mindestens eine der
reaktiven Gruppen des homo- oder hetereo-bifunktionalen Linkers eine
photoinduzierbar reaktive Gruppe, d. h. eine erst durch Lichteinstrahlung bestimmter
oder beliebiger Wellenlänge reaktiv werdende Gruppe. Dieser Linker wird so
aufgebracht, daß die/eine photoaktivierbare reaktive Gruppe nach der kovalenten
Anbindung des Linkers auf der Oberfläche zur Verfügung steht. An die so
modifizierte Oberfläche werden die Nukleinsäure-Oligomere kovalent angebunden,
wobei diese selbst über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und
Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, mit einer reaktiven Gruppe
modifiziert sind, bevorzugt in der Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers.
Bei der reaktiven Gruppe des Oligonukleotids handelt es sich um Gruppen, die direkt
(oder indirekt) mit der modifizierten Oberfläche unter Ausbildung einer kovalenten
Bindung reagieren. Daneben kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres
zweiten Endes eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive
Gruppe wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger
Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14,
angebunden ist. Desweiteren kann die redoxaktive Substanz alternativ zu dieser
weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Nukleinsäure-Oligomers
angebunden sein.
b) Das Nukleinsäure-Oligomer, das auf die leitfähige Oberfläche aufgebracht werden
soll, ist über einen kovalent angebundenen Spacer beliebiger Zusammensetzung
und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, mit einer oder mehreren
reaktiven Gruppe modifiziert, wobei sich diese reaktiven Gruppen bevorzugt in der
Nähe eines Endes des Nukleinsäure-Oligomers befinden. Bei den reaktiven Gruppen
handelt es sich um Gruppen, die direkt mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren
können. Beispiele hierfür sind: (i) Thiol- (HS-) oder Disulfid- (S-S-) derivatisierte
Nukleinsäure-Oligomere der allgemeinen Formel (n × HS-Spacer)-oligo, (n × R-S-S-
Spacer)-oligo oder oligo-Spacer-S-S-Spacer-oligo, die mit einer Goldoberfläche unter
Ausbildung von Gold-Schwefelbindungen reagieren oder (ii) Amine, die sich durch
Chemi- oder Physisorption an Platin- oder Silizium-Oberflächen anlagern. Daneben
kann an die Nukleinsäure-Oligomere in der Nähe ihres zweiten Endes eine weitere
reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe wiederum, wie oben
beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger Zusammensetzung und
Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14, angebunden ist. Desweiteren
kann die redoxaktive Substanz alternativ zu dieser weiteren reaktiven Gruppe, an
diesem zweiten Ende des Oligonukleotids angebunden sein. Insbesondere
Nukleinsäure-Oligomere die mit mehreren Spacer-verbrückten Thiol oder
Disulfidbrücken modifiziert sind ((n × HS-Spacer)-oligo bzw. (n × R-S-S-Spacer)-
oligo) haben den Vorteil, daß solche Nukleinsäure-Oligomere unter einem
bestimmten Anstellwinkel gegen die leitfähige Oberfläche (Winkel zwischen der
Oberflächennormalen und der Helixachse eines doppelsträngigen helikalen
Nukleinsäure-Oligomers bzw. zwischen der Oberflächennormalen und der Achse
senkrecht zu den Basenpaaren eines doppelsträngigen nicht-helikalen Nukleinsäure-
Oligomers) aufgebracht werden können, wenn die die Thiol- bzw. Disulfid-
Funktionen an das Nukleinsäure-Oligomer anbindenden Spacer, von einem Ende
der Nukleinsäure her betrachtet, eine zunehmende bzw. abnehmende Kettenlänge
besitzen.
c) Als reaktive Gruppe am Sonden-Nukleinsäure-Oligomer werden die
Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen des
Oligonukleotid-Rückgrats, insbesondere endständige Gruppen, verwendet. Die
Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppen weisen
eine erhöhte Reaktivität auf und gehen daher leicht typische Reaktionen wie z. B.
Amidbildung mit (primären oder sekundären) Amino- bzw. Säuregruppen,
Esterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Alkoholen bzw.
Säuregruppen, Thioesterbildung mit (primären, sekundären oder tertiären) Thio-
Alkoholen bzw. Säuregruppen oder die Kondensation von Amin und Aldehyd mit
anschließender Reduktion der entstandenen CH=N Bindung zur CH2-NH Bindung
ein. Die nötige Kopplungs-Gruppe zur kovalenten Anbindung an die Phosphorsäure-,
Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe ist in diesem Fall ein Teil der
Oberflächenderivatisierung mit einer (monomolekularen) Schicht beliebiger
Moleküllänge, wie unter a) in diesem Abschnitt beschrieben, oder die
Phosphorsäure-, Zucker-C-3-Hydroxy-, Carbonsäure- oder Amin-Gruppe kann direkt
mit der unmodifizierten Oberfläche reagieren, wie unter b) in diesem Abschnitt
beschrieben. Daneben kann an die Oligonukleotide in der Nähe ihres zweiten Endes
eine weitere reaktive Gruppe gebunden sein, wobei diese reaktive Gruppe
wiederum, wie oben beschrieben, direkt oder über einen Spacer beliebiger
Zusammensetzung und Kettenlänge, insbesondere der Kettenlänge 1-14,
angebunden ist. Desweiteren kann die redoxaktive Substanz alternativ zu dieser
weiteren reaktiven Gruppe, an diesem zweiten Ende des Nukleinsäure-Oligomers
angebunden sein.
Die Bindung des Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche kann alternativ vor oder
nach der Anbindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid bzw. vor oder
nach Anbinden des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der
redoxaktiven Substanz erfolgen. Die Bindung des bereits modifizierten
Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche, d. h. die Bindung an die Oberfläche
nach der Anbindung der redoxaktiven Substanz an das Oligonukleotid bzw. nach der
Anbindung des mit einer reaktiven Gruppe versehenen Spacers zur Bindung der
redoxaktiven Substanz, erfolgt ebenfalls wie unter a) bis c) (Abschnitt "Bindung
eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche") beschrieben.
Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei der Anbindung der Einzelstrang-
Oligonukleotide an die Oberfläche darauf geachtet werden, daß zwischen den
einzelnen Oligonukleotiden ein genügend großer Abstand verbleibt, um den für eine
Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid nötigen Freiraum zur Verfügung zu
stellen. Dazu bieten sich unter anderem zwei verschiedene Vorgehensweisen an:
1) Herstellung einer modifizierten Trägeroberfläche durch Anbindung eines
hybridisierten Oligonukleotids, also eine Trägeroberflächen-Derivatisierung mit
hybridisiertem Sonden-Oligonukleotid statt mit Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid.
Der zur Hybridisierung verwendete Oligonukleotidstrang ist unmodifiziert (die
Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a) - c) im Abschnitt "Bindung
eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche" beschrieben). Anschließend wird
der hybridisierte Oligonukleotid-Doppelstrang thermischer dehybridisiert, wodurch
eine Einzelstrang-Oligonukleotid modifizierte Trägeroberfläche mit größerem
Abstand zwischen den Proboligonukleotiden hergestellt wird.
2) Herstellung einer modifizierten Trägeroberfläche durch Anbindung eines
Einzelstrang- oder Doppelstrang-Oligonukleotids, wobei während der
Trägeroberflächen-Derivatisierung ein geeigneter monofunktionaler Linker zugesetzt
wird, der neben dem Einzelstrang- oder Doppelstrang-Oligonukleotid auch an die
Oberfläche gebunden wird (die Oberflächenanbindung wird durchgeführt wie unter a)
- c) im Abschnitt "Bindung eines Oligonukleotids an die leitfähige Oberfläche"
beschrieben). Erfindungsgemäß hat der monofunktionale Linker eine Kettenlänge,
die der Kettenlänge des Spacers zwischen Trägeroberfläche und Oligonukleotid
identisch ist oder um maximal acht Kettenatome abweicht. Bei der Verwendung von
Doppelstrang-Oligonukleotid zur Trägeroberflächen-Derivatisierung wird nach der
Anbindung des Doppelstrang-Oligonukleotids und des Linkers an die
Trägeroberfläche der hybridisierte Oligonukleotid-Doppelstrang thermischer
dehybridisiert, wie oben unter 1.) beschrieben. Durch die gleichzeitige Anbindung
eines Linkers an die Oberfläche wird der Abstand zwischen den ebenfalls an die
Oberfläche gebundenen Einzel- oder Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomeren
vergrößert. Im Falle der Verwendung von Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomer wird
dieser Effekt durch die anschließende thermische Dehybridisierung noch verstärkt.
Vorteilhafterweise werden gemäß dem Verfahren zur elektrochemischen Detektion
mehrere Sonden-Oligonukleotide unterschiedlicher Sequenz, idealerweise alle
nötigen Kombinationen des Nukleinsäure-Oligomers, auf einem Oligomer- oder
DNA-Chip aufgebracht, um die Sequenz eines beliebigen Target-Oligomers oder
einer (fragmentierten) Target-DNA sicher zu detektieren bzw. um Mutationen im
Target aufzuspüren und sequenzspezifisch nachzuweisen. Dazu werden auf einer
leitfähigen Trägeroberfläche die Trägeroberflächenatome oder -moleküle eines
definierten Bereichs (einer Test-Site) mit DNA-IRNA-IPNA-Oligonukleotiden
bekannter, aber beliebiger Sequenz, wie oben beschrieben, verknüpft. In einer
allgemeinsten Ausführungsform kann aber der DNA-Chip auch mit einem einzigen
Sonden-Oligonukleotid derivatisiert werden. Als Sonden-Oligonukleotide werden
Nukleinsäure-Oligomere (DNA-, RNA- oder PNA-Fragmente) der Basenlänge 3 bis
50, bevorzugt der Länge 5 bis 30, besonders bevorzugt der Länge 7 bis 25
verwendet. Erfindungsgemäß wird an die Sonden-Oligonukleotide entweder vor oder
nach deren Bindung an die leitfähige Oberfläche eine redoxaktive Substanz
gebunden.
Erfolgt die Modifikation der Sonden-Oligonukleotide vor der Bindung an die leitfähige
Oberfläche, so werden die bereits modifizierten Sonden-Oligonukleotide wie oben
beschrieben an die leitfähige Oberfläche gebunden. Alternativ werden die nicht
modifizierten, an die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Oligonukleotide am
zweiten, freien Ende der Oligonukleotidkette direkt oder indirekt über einen Spacer
mit einer redoxaktive Substanz modifiziert.
In beiden Fällen entsteht ein Oberflächen-Hybrid der allgemeinen Struktur Elek-
Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox (Fig. 3). Die elektrische Kommunikation zwischen
der (leitfähigen) Trägeroberfläche und dem über ein Einzelstrang-Oligonukleotid
verbrückten redoxaktiven Substanz ("Redox") in der allgemeinen Struktur Elek-
Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox ist schwach oder gar nicht vorhanden. Die
Verbrückungen können natürlich auch ohne Spacer oder mit nur einem Spacer
(Elek-ss-oligo-Spacer-Redox bzw Elek-Spacer-ss-oligo-Redox) durchgeführt werden.
In einem nächsten Schritt werden die Test-Sites mit der zu untersuchenden
Oligonukleotid-Lösung (Target) in Kontakt gebracht. Dabei kommt es nur in dem Fall
zur Hybridisierung, in dem die Lösung Oligonukleotid-Stränge enthält, die zu den an
die leitfähige Oberfläche gebundenen Sonden-Oligonukleotiden komplementär, oder
zumindest in weiten Bereichen komplementär sind. Im Falle der Hybridisierung
zwischen Sonden- und Target-Oligonukleotid kommt es zu einer verstärkten
Leitfähigkeit zwischen der Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz, da
diese nunmehr über das aus einem Doppelstrang bestehende Oligonukleotid
verbrückt sind (in Fig. 3 an einem Beispiel der Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox
schematisch gezeigt).
Durch die Veränderung der elektrischen Kommunikation zwischen der (leitfähigen)
Trägeroberfläche und der redoxaktiven Substanz aufgrund der Hybridisierung von
Sonden-Oligonukleotid und dem dazu komplementären Oligonukleotid-Strang
(Target) kann somit ein sequenzspezifisches Hybridisierungsereignis durch
elektrochemische Verfahren wie z. B. Cyclovoltametrie, Amperometrie oder
Leitfähigkeitsmessungen detektiert werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird
eine redoxaktive Substanz verwendet, die Bereiche mit einem überwiegend
planaren, in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbital-System aufweist, wie z. B. das
PQQ des Beispiels 1 (vgl. Fig. 3), oder die Chinone der Formel 5 oder 7-12 oder
die porphinoiden Strukturen der Formeln 1-4, die Pyridin-Nukleotide der
allgemeinen Formel 6 sowie Derivate dieser redoxaktiven Substanzen. In diesem
Fall wird der Spacer zwischen Nukleinsäure-Oligomer und der redoxaktiven
Substanz so gewählt, daß sich die Ebene der π-Orbitale der redoxaktiven Substanz
parallel zu den p-π-Orbitalen des an die redoxaktive Substanz angrenzenden
Basenpaars des mit Komplementärstrang hybridisierten Nukleinsäure-Oligomers
anordnen kann. Diese räumliche Anordnung von redoxaktiver Substanz mit teilweise
planarem in einer Ebene ausgedehnten p-π-Orbitalen erweist sich für die elektrische
Leitfähigkeit der Doppelstrang-Nukleinsäure-Oligomere als besonders günstig.
Bei der Cyclovoltametrie wird das Potential einer stationären Arbeitselektrode zeitabhängig
linear verändert. Ausgehend von einem Potential bei dem keine Elektrooxidation oder
-reduktion stattfindet, wird das Potential solange verändert bis die redoxaktive Substanz
oxidiert oder reduziert wird (also Strom fließt). Nach Durchlaufen des Oxidations- bzw.
Reduktionsvorgangs, der in der Strom/Spannungskurve einen zunächst ansteigenden
Strom, einen Maximalstrom (Peak) und dann einen allmählich abfallenden Strom erzeugt,
wird die Richtung des Potentialvorschubs umgekehrt. Im Rücklauf wird dann das Verhalten
der Produkte der Elektrooxidation oder -reduktion aufgezeichnet.
Eine alternative elektrische Detektionsmethode, die Amperometrie, wird dadurch
ermöglicht, daß die redoxaktive Substanz durch Anlegen eines geeigneten, konstant
gehaltenen Elektrodenpotentials zwar elektrooxidiert (elektroreduziert) wird, die
Rereduktion (Reoxidation) der redoxaktiven Substanz in den ursprünglichen Zustand
aber nicht durch Änderung des Elektrodenpotentials erreicht wird, wie in der
Cyclovoltametrie, sondern durch ein der Targetlösung zugesetztes geeignetes
Reduktionsmittel (Oxidationsmittel), wodurch der Stromkreis des Gesamtsystems
geschlossen wird. Solange Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) vorhanden ist bzw.
solange verbrauchtes Reduktionsmittel (Oxidationsmittel) an der Gegenelektrode
rereduziert (reoxidiert) wird, fließt Strom, der amperometrisch detektiert werden kann
und der proportional zur Zahl der Hybridisierungsereignisse ist.
Die Erfindung soll nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels im
Zusammenhang mit den Zeichnungen näher erläutert werden. Es zeigen
Fig. 1 Schematische Darstellung des Sanger-Verfahrens der Oligonukleotid-
Sequenzierung;
Fig. 2 Schematische Darstellung der Oligonukleotid-Sequenzierung durch
Hybridisierung auf einem Chip;
Fig. 3 Schematische Darstellung des Oberflächen-Hybrids der allgemeinen
Struktur Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox mit einem 12 Bp Sonden-
Oligonukleotid der exemplarischen Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3'
(links) und Au-S-ss-oligo-PQQ im hybridisierten Zustand als
Ausführungsbeispiel einer Elek-Spacer-ss-oligo-Spacer-Redox, wobei
nur ein Teil des Sonden-Oligonukleotids mit hybridisierten
Komplementärstrang gezeigt ist (rechts) und die Anbindung des
Oligonukleotids an die Oberfläche über einen -S-CH2CH2-Spacer sowie
die Anbindung der redoxaktiven Substanz PQQ über den Spacer -CH2-
CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH- erfolgte;
Fig. 4 Cyclovoltagramm einer Test-Site aus Au-S-ss-oligo-PQQ (gepunktet)
im Vergleich zu einer identischen Test-Site mit vollständig
hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ, durchgezogene Linie);
Fig. 5 Cyclovoltagramm einer Test-Site mit vollständig hybridisiertem Target
(Au-S-ds-oligo-PQQ) (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer Test-
Site mit hybridisiertem Target, das 2 Basenpaar Mismatches aufweist
(Au-S-ds-oligo-PQQ mit 2 Bp Mismatches, gestrichelt).
Eine exemplarische Test-Site mit hybridisiertem Target (Au-S-ds-oligo-PQQ) der
allgemeinen Struktur Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox ist in Fig. 3 dargestellt. In
dem Beispiel der Fig. 3 ist die Trägeroberfläche eine Gold-Elektrode. Die
Verbindung zwischen Gold-Elektrode und Sonden-Oligonukleotid wurde mit dem
Linker (HO-(CH2)2 S)2 aufgebaut, der mit der endständigen Phosphatgruppe am 3'-Ende
zu P-O-(CH2)2 S-S-(CH2)2 OH verestert wurde und nach homolytischer Spaltung der S-S
Bindung an der Gold-Oberfläche je eine Au-S Bindung bewirkte, womit 2-Hydroxy
mercaptoethanol und Mercaptoethanol-verbrücktes Oligonukleotid auf der Oberfläche
koadsorbiert wurde. Die redoxaktive Substanz im Beispiel der Fig. 3 ist
tricarboxylisches Pyrrolo-Chinolin-Chinon (PQQ), wobei eine der drei
Carbonsäurefunktionen des PQQ (im Beispiel die C-7-CO2H-Funktion) zur
kovalenten Anbindung des PQQ an das Sonden-Oligonukleotid verwendet wurde
(Amidbildung unter Wasserabspaltung mit der terminalen Aminofunktion des an die
C-5-Position des 5'-Thymins angebundenen -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2-Spacers).
Sowohl freies, unmodifiziertes PQQ als auch über einen kurzen Spacer der
Kettenlänge 1-6, wie z. B. -S-(CH2)2 NH-, oder über (modifiziertes) Doppelstrang-
Oligonukleotid mit der Trägeroberfläche verbrücktes PQQ wird, z. B. in HEPES
Puffer mit 0.7molarem Zusatz von TEATFB (siehe Abkürzungen), im Potentialbereich
0,7 V ≧ ϕ ≧ 0,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, selektiv reduziert
und reoxidiert.
Die elektrische Kommunikation zwischen der (leitfähigen) Trägeroberfläche und dem
über Einzelstrang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar in der allgemeinen Struktur
Elek-Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox ist schwach oder gar nicht vorhanden. Für die
exemplarische Test-Site Au-S-ss-oligo-PQQ (mit 12-Bp Sonden-Oligonukleotiden) ist
dies anhand der Cyclovoltametrie (Fig. 4) gezeigt. Ohne an eine theoretische
Beschreibung gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß die negativen
Ladungen des Phosphatgerüsts eine gegenseitig Abstoßung der Oligonukleotid-
Einzelstränge bedingen und so einen Aufbau der -Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox
Kette (in Richtung Helixachse) unter einem Winkel ϕ = 70° zur Normalen der
Trägeroberfläche ("stehende Röhren") erzwingen. Die (hybridisierte) Test-Site Au-S
ds-oligo-PQQ der Fig. 3 weist einen Aufbau mit ϕ = 30° auf. Aufgrund der Länge
der -Spacer-ds-oligo-Spacer-Redox Kette (z. B. ca. 40 Å Länge eines 12-Basenpaar-
Oligonukleotids; die Spacer und das angebundene PQQ sind rund 10 Å lang)
entsteht bei ϕ = 70° zwischen Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz ein
Abstand von < 17 Å. Dadurch kann ein direkter Elektron- oder Lochtransfer zwischen
Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz ausgeschlossen werden. Durch
Behandlung der Test-Site(s) mit einer zu untersuchenden Oligonukleotid-Lösung,
kommt es, im Falle der Hybridisierung zwischen Sonde und Target zu einer
verstärkten Leitfähigkeit zwischen der Trägeroberfläche und dem über das
Doppelstrang-Oligonukleotid verbrückten Redoxpaar. Die Änderung der Leitfähigkeit
äußert sich cyclovoltametrisch in einem deutlichen Stromfluß zwischen
Trägeroberfläche und redoxaktiver Substanz (Fig. 4). Damit ist es möglich, die
sequenzspezifische Hybridisierung des Targets mit den Sonden-Oligonukleotiden
durch elektrochemische Verfahren wie z. B. cyclische Voltametrie zu detektieren.
Daneben können fehlerhafte Basenpaarungen (Basenpaar Mismatches) durch eine
geänderte cyclovoltametrische Charakteristik erkannt werden (Fig. 5). Ein
Mismatch äußert sich in einem größeren Potentialabstand zwischen den
Strommaxima der Elektoreduktion und der Elektroreoxidation (Umkehrung der
Elektroreduktion bei umgekehrter Potentialvorschubrichtung) bzw. der
Elektrooxidation und Elektrorereduktion in einem cyclovoltametrisch reversiblen
Elektronenübertragungsprozess zwischen der elektrisch leitenden Trägeroberfläche
und der redoxaktiven Substanz. Dieser Umstand wirkt sich vor allem in der
amperometrischen Detektion günstig aus, da dort der Strom bei einem Potential
getestet werden kann, bei dem zwar das perfekt hybridisierende Oligonukleotid-Target
signifikant Strom liefert, nicht aber das fehlerhaft gepaarte Oligonukleotid-Target. Im
Beispiel der Fig. 5 ist dies bei einem Potential E-E0 von ca. 0,03 V möglich.
Die Herstellung von Au-S-ds-oligo-PQQ gliedert sich in 4 Teilabschnitte, nämlich
Darstellung der Trägeroberfläche, Hybridisierung des Sonden-Oligonukleotids mit
dem komplementären Doppelstrang (Hybridisierungsschritt), Derivatisierung der
Trägeroberfläche mit dem Doppelstrang-Oligonukleotid (Inkubationsschritt) und
Anbindung der redoxaktiven Substanz (Redoxschritt).
Das Trägermaterial für die kovalente Anbindung der Doppelstrang-Oligonukleotide
bildet ein ca. 100 nm dünner Gold-Film auf Mica (Muskovit Plättchen). Dazu wurde in
einer elektrischen Entladungskammer frisch gespaltenes Mica mit einem Argon
lonenplasma gereinigt und durch elektrische Entladung Gold (99,99%) in einer
Schichtdicke von ca. 100 nm aufgebracht. Anschließend wurde der Gold-Film mit 30%
H2O2/70% H2SO4 von Oberflächenverunreinigungen befreit (Oxidation
organischer Ablagerungen) und für ca. 20 Minuten in Ethanol getaucht, um an der
Oberfläche adsorbierten Sauerstoff zu verdrängen. Nach Abspülen der
Trägeroberfläche mit bidestilliertem Wasser wird auf die horizontal gelagerte
Trägeroberfläche eine vorher bereitete 1 × 10-4molare Lösung des (modifizierten)
Doppelstrang-Oligonukleotids aufgetragen, so daß die komplette Trägeroberfläche
benetzt wird (Inkubationsschritt, siehe auch unten).
Zur Bereitung der ds-Oligonukleotid Lösung wurde ein doppelt modifiziertes 12 Bp
Einzelstrang-Oligonukleotid der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' verwendet, das an
der Phosphatgruppe des 3'-Endes mit (HO-(CH2)2-S)2 zum P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH
verestert ist. Am 5'-Ende ist die endständige Base des Oligonukleotids, Thymin, am C-5
Kohlenstoff mit -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2 modifiziert. Eine 2 × 10-4molare
Lösung dieses Oligonukleotids im Hybridisierungspuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH
7,5 mit 0,7molarem Zusatz von TEATFB, siehe Abkürzungen) wurde mit einer 2 × 10-4
molaren Lösung des (unmodifizierten) komplementären Strang im
Hybridisierungspuffer bei Raumtemperatur für ca. 2 h hybridisiert
(Hybridisierungsschritt). Während einer Reaktionszeit von ca. 12-24 h wurde der
Disulfidspacer P-O-(CH2)2-S-S-(CH2)2-OH des Oligonukleotids homolytisch gespalten.
Dabei bildet der Spacer mit den Au-Atomen der Oberfläche eine kovalente Au-S-
Bindung aus, wodurch es zu einer 1 : 1-Koadsorption des ds-Oligonukleotids und des
2-Hydroxymercaptoethanols kommt (Inkubationsschritt).
Die so mit einer dichten (1 : 1)-Monolayer aus ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy
mercaptoethanol modifizierte Goldelektrode wurde mit bidestilliertem Wasser
gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 3 × 10-3molarem Chinon PQQ,
10-2molarem EDC und 10-2molarem sulfo-NHS in HEPES Puffer benetzt. Nach einer
Reaktionszeit von ca. 1 h bindet der -CH=CH-CO-NH-CH2-CH2-NH2-Spacer das PQQ
kovalent an (Amidbildung zwischen der Aminogruppe des Spacers und einer
Säurefunktion des PQQ, Redoxschritt).
Die Aufklärung der Oberflächenbeschaffenheit mit XPS (X-Ray Photoelektronen
spektroskopie) ergab eine maximal dicht gepackte Monolayer aus 1 : 1
koadsorbiertem ds-Oligonukleotid und 2-Hydroxy-mercaptoethanol (4,7 × 1012 ds-
Oligonukleotide/cm2), wobei die lange Achse (Richtung der Helixachse) der ds-
Oligonukleotide mit der Flächennormalen der Goldoberfläche einen Winkel von ϕ ≈
30° bildet.
Analog zur
Darstellung des Systems Au-S-ds-oligo-PQQ wird die Trägeroberfläche mit
modifiziertem Einzelstrang-Oligonukleotid derivatisiert, wobei lediglich auf die
Hybridisierung des modifizierten Oligonukleotids der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-
3' mit seinem komplementären Strang verzichtet wurde und im Inkubationsschritt nur
das doppelt modifizierte 12 Bp Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid (siehe Beispiel 1)
als 1 × 10-4molare Lösung in Wasser und in Gegenwart von 10-2molarem Tris, 10-3
molarem EDTA und 0.7molarem TEATFB (oder 1molarem NaCl) bei pH 7,5 verwendet
wurde. Der Redoxschritt wurde, wie in Beispiel 1 angegeben, durchgeführt.
Die Herstellung einer Trägeroberfläche derivatisiert mit modifiziertem
Doppelstrang-Oligonukleotid wurde analog zur Darstellung des Systems Au-S-ds
oligo-PQQ durchgeführt, wobei lediglich bei der Hybridisierung des modifizierten
Oligonukleotids der Sequenz 5'-TAGTCGGAAGCA-3' ein komplementärer Strang
verwendet wurde (Sequenz: 5'-ATCAGATTTCGT-3'), bei dem die eigentlich
komplementären Basen Nr. 6 und 7 (vom 5'-Ende gezählt) von C nach A bzw. von C
nach T modifiziert wurden, um so zwei Basenpaar Mismatches einzuführen.
Bei der Herstellung der Test-Sites muß bei
der Derivatisierung der Trägeroberfläche mit Einzelstrang-Sonden-Oligonukleotid
darauf geachtet werden, daß zwischen den angebundenen Einzelsträngen
genügend Platz verbleibt, um eine Hybridisierung mit dem Target-Oligonukleotid zu
ermöglichen. Dazu bieten sich drei verschiedene Vorgehensweisen an: (a)
Herstellung einer Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode wie in Beispiel 1 beschrieben mit
anschließender thermischer Dehybridisierung der Doppelstränge bei Temperaturen
von T < 40°C. (b) Herstellung einer Au-ss-oligo-PQQ Elektrode wie unter Beispiel 2
beschrieben, aber im Inkubationsschritt zur Derivatisierung der Goldoberfläche mit
(doppelt derivatisiertem) Einzelstrang-Oligonukleotid wird 2-Hydroxy
mercaptoethanol oder ein anderer Thiol- oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge
10-5- bis 10-1molar zugesetzt (je nach gewünschtem Inter-Oligonukleotid-Abstand),
das gemeinsam mit dem Einzelstrang Oligonukleotid an die Goldoberfläche
koadsorbiert. (c) Herstellung einer Au-ss-oligo-PQQ Elektrode wie unter Beispiel 2
beschrieben, aber unter Weglassen des 0,7molaren Zusatzes an Elektrolyten (im
Beispiel TEATFB) im Inkubationsschritt zur Derivatisierung der Goldoberfläche mit
(doppelt derivatisiertem) Einzelstrang-Oligonukleotid. Die Phosphatgruppen und
Basen-Sickstoffatome des Oligonukleotids sind durch die Abwesenheit des Salzes
elektrostatisch nicht abgeschirmt und wechselwirken stark mit der Goldoberfläche.
Dadurch kommt es zu einer flachen Anlagerung der Oligonukleotide auf der
Elektrodenoberfläche (ϕ < 60°) und es werden pro Flächeneinheit deutlich weniger
Oligonukleotide gebunden. Anschließend können die Oligonukleotide wieder in die
gewünschte Position gebracht werden, indem in einem 2. Inkubationsschritt (vor
oder nach Anbringen des PQQ) 2-Hydroxy-mercaptoethanol oder ein anderer Thiol-
oder Disulfid-Linker geeigneter Kettenlänge kovalent an die noch freien Oberflächen-
Goldatome angebunden wird. Dazu wird die weniger dicht mit Einzelstrang-
Oligonukleotid belegte Elektrode vor oder nach Modifikation mit PQQ (Au-S-ss-oligo
bzw. Au-S-ss-oligo-PQQ) mit einer ca. 5 × 10-2molaren Lösung des 2-Hydroxy
mercaptoethanols oder eines anderen Thiol- oder Disulfid-Linkers geeigneter
Kettenlänge in Ethanol oder HEPES-Puffer (bzw. einem Gemisch daraus, abhängig
von der Löslichkeit des Thiols) benetzt und 2-24 h inkubiert.
Die cyclovoltametrischen Messungen wurden mit einem Computer-kontrolliertem
Bipotentiostaten (CH Instruments, Model 832) bei Raumtemperatur in einer Standard
Zelle mit 3-Elektroden-Anordung vermessen. Die modifizierte Goldelektrode wurde
als Arbeitselektrode verwendet, als Hilfselektrode (Gegenelektrode) diente ein
Platindraht und als Referenzelektrode zur Potentialbestimmung wurde eine über eine
Luggin Kapillare vom Probenraum abgetrennte Ag/AgCl-Elektrode mit interner
gesättigter KCl Lösung verwendet. Als Elektrolyt diente 0,7molares TEATFB oder 1
molares NaCl. Ein Cyclovoltagramm der Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode im Vergleich
zu einer Au-S-ss-oligo-PQQ Elektrode ist in Fig. 4 gezeigt, die Auswirkung der 2 Bp
Mismatches auf das Cyclovoltagramm der Au-S-ds-oligo-PQQ Elektrode ist in
Abb. 5 dargestellt. Die Potentiale sind jeweils als E-E0, also relativ zum
Halbstufenpotential angegeben.
Aus Fig. 4 ist ein deutlich erhöhter Stromfluß bei Vorliegen eines Doppelstrang-
Oligonukleotids gegenüber der nicht hybridisierten Form zu erkennen. Dadurch
können sequenzspezifische Hybridisierungsereignisse detektiert werden. Aus Fig. 5
wird deutlich, daß bei Hybridisierung mit einem Target-Oligonukleotid-Strang, der 2
Basenpaar-Mismatches aufweist zum einen ein geringerer Strom fließt, zum anderen
die Differenz der Strommaxima vergrößert wird.
Claims (28)
1. Durch Anbindung einer redoxaktiven Substanz modifiziertes Nukleinsäure-
Oligomer, dadurch gekennzeichnet, daß die redoxaktive Substanz bei einem
Potential cp selektiv oxidierbar und reduzierbar ist, wobei ϕ der Bedingung 2,0 V
≧ ϕ ≧ -2,0 V, gemessen gegen Normalwasserstoffelektrode, genügt.
2. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 1, wobei als redoxaktive
Substanz ein Farbstoff verwendet wird, insbesondere ein Flavin-Derivat, ein
Porphyrin-Derivat, ein Chlorophyl-Derivat oder ein Bakteriochlorophyl-Derivat.
3. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 1, wobei als redoxaktive
Substanz ein Chinon, insbesondere ein Pyrrolo-Chinolin-Chinon (PQQ), ein
1,4-Benzochinon, ein 1,2-Naphtochinon, ein 1,4-Naphtochinon oder ein 9,10-
Anthrachinon verwendet wird.
4. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei die redoxaktive Substanz kovalent alternativ an eine der
Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der Zucker-
Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers angebunden ist,
insbesondere an eine endständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.
5. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
die redoxaktive Substanz kovalent an einen verzweigten oder unverzweigten
Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge angebunden ist und
der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil alternativ an eine der
Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der Zucker-
Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers angebunden ist,
insbesondere an eine enständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.
6. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 5, wobei die redoxaktive
Substanz kovalent an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil
angebunden ist, dessen kürzeste durchgehende Verbindung zwischen den
verbundenen Strukturen 1 bis 14 Atome umfaßt.
7. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, wobei das modifizierte Nukleinsäure-Oligomer sequenzspezifisch
Einzelstrang-DNA, RNA und/oder PNA binden kann.
8. Modifiziertes Nukleinsäure-Oligomer nach Anspruch 7, wobei das modifizierte
Nukleinsäure-Oligomer ein Desoxyribonukleinsäure-, Ribonukleinsäure-, ein
Peptidnukleinsäure-Oligomer oder ein Nukleinsäure-Oligomer mit strukturell
analogem Rückgrat ist.
9. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers gemäß
den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die redoxaktive Substanz
an ein Nukleinsäure-Oligomer gebunden wird, wobei die Anbindung an eine
Phosphorsäure- oder Carbonsäure-Gruppe des Nukleinsäure-Oligomers durch
Amidbildung mit (primären oder sekundären) einer Aminogruppe der redoxaktiven
Substanz, durch Esterbildung mit einer (primären, sekundären oder tertiären)
Alkohol-Gruppe der redoxaktiven Substanz, oder durch Thioesterbildung mit
einer (primären, sekundären oder tertiären) Thio-Alkohol-Gruppe der
redoxaktiven Substanz bzw. durch Kondensation einer Amin-Gruppe des
Nukleinsäure-Oligomers mit einer Aldehyd-Gruppe der redoxaktiven Substanz
erfolgt.
10. Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Nukleinsäure-Oligomers gemäß
den Ansprüchen 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die redoxaktive
Substanz an einen verzweigten oder unverzweigten Molekülteil beliebiger
Zusammensetzung und Kettenlänge kovalent angebunden wird, wobei die
Anbindung an eine Phosphorsäure- oder Carbonsäure-Gruppe des verzweigten
oder unverzweigten Molekülteils durch Amidbildung mit (primären oder
sekundären) einer Aminogruppe der redoxaktiven Substanz, durch Esterbildung
mit einer (primären, sekundären oder tertiären) Alkohol-Gruppe der
redoxaktiven Substanz, oder durch Thioesterbildung mit einer (primären,
sekundären oder tertiären) Thio-Alkohol-Gruppe der redoxaktiven Substanz
bzw. durch Kondensation einer Amin-Gruppe des verzweigten oder
unverzweigten Molekülteils mit einer Aldehyd-Gruppe der redoxaktiven
Substanz erfolgt.
11. Modifizierte leitfähige Oberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder
mehrere Arten von modifizierten Nukleinsäure-Oligomeren gemäß den
Ansprüchen 1 bis 8 an eine leitfähige Oberfläche angebunden sind.
12. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 11, wobei die Oberfläche aus
einem Metall oder einer Metallegierung besteht, insbesondere einem Metall
ausgewählt aus der Gruppe Platin, Palladium, Gold, Cadmium, Quecksilber,
Nickel, Zink, Kohlenstoff, Silber, Kupfer, Eisen, Blei, Aluminium, Mangan und
deren Mischungen.
13. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 11, wobei die Oberfläche aus
einem Halbleiter besteht, insbesondere einem Halbleiter ausgewählt aus der
Gruppe Kohlenstoff, Silizium, Germanium und α-Zinn.
14. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 11, wobei die Oberfläche aus
einer binären Verbindung der Elemente der Gruppen 14 und 16, einer binären
Verbindung der Elemente der Gruppen 13 und 15, einer binären Verbindung
der Elemente der Gruppen 15 und 16, oder einer binären Verbindung der
Elemente der Gruppen 11 und 17 besteht, insbesondere aus einem Cu(I)-
Halogenid oder einem Ag(I)-Halogenid.
15. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 11, wobei die Oberfläche aus
einer ternären Verbindung der Elemente der Gruppen 11, 13 und 16 oder einer
ternären Verbindung Elemente der Gruppen 12, 13 und 16 besteht.
16. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach den Ansprüchen 11 bis 15, wobei die
modifizierten Nukleinsäure-Oligomere an die leitfähige Oberfläche kovalent
oder durch Physisorption angebunden sind.
17. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 16, wobei alternativ eine der
Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, eine der Zucker-Einheiten
oder eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers kovalent oder durch
Physisorption an die leitfähige Oberfläche angebunden ist, insbesondere eine
endständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.
18. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei
an die leitfähige Oberfläche verzweigte oder unverzweigte Molekülteile
beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge kovalent oder durch
Physisorption angebunden sind und die modifizierten Nukleinsäure-Oligomere
kovalent an diese Molekülteile angebunden sind.
19. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach Anspruch 18, wobei das verzweigte oder
unverzweigte Molekülteil eine kürzeste durchgehende Verbindung zwischen
den verbundenen Strukturen von 1 bis 14 Atome umfaßt.
20. Modifizierte leitfähige Oberfläche nach den Ansprüchen 18 und 19, wobei der
verzweigte oder unverzweigte Molekülteil alternativ an eine der Phosphorsäure-
Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der Zucker-Einheiten oder an eine
der Basen des Nukleinsäure-Oligomers kovalent gebunden ist, insbesondere
an eine endständige Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.
21. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach den
Ansprüchen 11 bis 20, wobei ein oder mehrere Arten von modifizierten
Nukleinsäure-Oligomeren gemäß den Ansprüchen 1 bis 8 auf eine leitfähige
Oberfläche aufgebracht werden.
22. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach den
Ansprüchen 11 bis 20, wobei eine oder mehrere Arten von Nukleinsäure-
Oligomeren auf eine leitfähige Oberfläche gebunden werden und ausschließlich
die an die leitfähige Oberfläche gebundenen Nukleinsäure-Oligomere durch
Anbindung einer redoxaktiven Substanz an die Nukleinsäure-Oligomere
modifiziert werden.
23. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach
Anspruch 22, wobei die Anbindung der redoxaktiven Substanz an das
Nukleinsäure-Oligomer durch Reaktion der redoxaktiven Substanz mit einer
Phosphorsäure-Einheit, einer Zucker-Einheit oder einer der Basen des
Nukleinsäure-Oligomers erfolgt, insbesondere durch Reaktion mit einer
endständigen Einheit des Nukleinsäure-Oligomers.
24. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach
Anspruch 22, wobei die redoxaktive Substanz kovalent an einen verzweigten
oder unverzweigten Molekülteil beliebiger Zusammensetzung und Kettenlänge
angebunden wird und der verzweigte oder unverzweigte Molekülteil alternativ
an eine der Phosphorsäure-, Carbonsäure- oder Amin-Einheiten, an eine der
Zucker-Einheiten oder an eine der Basen des Nukleinsäure-Oligomers
angebunden wird, insbesondere an eine endständige Einheit des Nukleinsäure-
Oligomers.
25. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach den
Ansprüchen 21 bis 24, wobei das Nukleinsäure-Oligomer oder das modifizierte
Nukleinsäure-Oligomer mit dem dazu komplementären Nukleinsäure-
Oligomerstrang hybridisiert wird und in Form des Doppelstranghybrids auf die
leitfähige Oberfläche aufgebracht wird.
26. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten leitfähigen Oberfläche nach den
Ansprüchen 21 bis 25, wobei das Nukleinsäure-Oligomer oder das modifizierte
Nukleinsäure-Oligomer in Gegenwart von weiteren chemischen Verbindungen,
die ebenfalls an die leitfähige Oberfläche angebunden werden, auf die
leitfähige Oberfläche aufgebracht wird.
27. Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäure-Oligomer-
Hybridisierungsereignissen, dadurch gekennzeichnet, daß eine leitfähige
Oberfläche, wie in den Ansprüchen 11 bis 20 definiert, mit Nukleinsäure-
Oligomeren in Kontakt gebracht wird mit Nukleinsäure-Oligomeren in Kontakt
gebracht werden und anschließend eine Detektion der elektrischen
Kommunikation zwischen der redoxaktiven Einheit und der jeweiligen
leitfähigen Oberfläche erfolgt.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Detektion cyclovoltametrisch,
amperometrisch oder durch Leitfähigkeitsmessung erfolgt.
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