DE19919148A1

DE19919148A1 - Von Interleukin 12 abgeleitete Peptid-Homodimere und Peptid-Heterodimere

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Publication number: DE19919148A1
Application number: DE19919148A
Authority: DE
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 1999-04-27
Publication date: 2000-11-16
Also published as: WO2000064938A3; WO2000064938A2; EP1171464A2; CA2370298A1; AU5388600A; JP2002543091A

Abstract

Beschrieben werden Homodimere oder Heterodimere aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenz KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben oder Varianten davon, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und gegebenenfalls ein zelluläres Signal auslösen können. Diese Dimere eignen sich einerseits zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erhöhten oder erniedrigten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen, andererseits zum Nachweis von Erkrankungen, die beispielsweise mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten IL12 Rezeptor in Verbindung stehen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Homodimere oder Heterodimere aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenz KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben oder Varianten davon, wobei die Homodimere oder Hetero dimere an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und gegebenenfalls ein zelluläres Signal auslösen können. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus diese Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Zusammensetzungen bzw. Diagnoseverfahren, bei denen die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere oder gegen diese gerichtete Antikörper eingesetzt werden.

Die Tumortherapie stützt sich bisher im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo- und Radiotherapie. In den letzten Jahren hat sich jedoch die Erkenntnis durchgesetzt, daß eine primäre (d. h. ausschließliche) oder adjuvante (unterstützende) Behandlung mit Cytokinen in vielen Fällen eine Verlängerung der Lebenserwartung bewirkt, oftmals sogar eine vollständige Heilung. Bei den Cytokinen handelt es sich um körpereigene Botenstoffe, die von unterschiedlichen Zellen synthetisiert und anschließend sezerniert werden. Die biologischen Aufgaben dieser Cytokine sind sehr vielfältig, werden jedoch bisher nur zum Teil verstanden. In der Hauptsache besitzen Cytokine jedenfalls fundamentale immunregulatorische Wirkungen. Eines dieser Cytokin, das Interleukin 12 (IL12), wird zunehmend in der Therapie verschiedener Tumore eingesetzt. IL12 wird in vivo hauptsächlich von B-Zellen, weniger von T-Zellen hergestellt (D'Andrea et al., J. Exp. Med. 176 (1992), 1387- 1398) und hat eine Vielzahl biologischer Effekte. Besonders hervorzuheben sind folgende Wirkungen, da sie unmittelbar für den therapeutischen Effekt eine wichtige Rolle spielen: Stimulation der Proliferation humaner Lymphoblasten (Gateley et al., J. Immunol. 147 (1991), 874), Aktivierung von NK-Zellen (Manetti et al., J. Exp. Med. 177 (1999), 1199) und Induktion der Synthese von IFN-gamma, IL2 und TNF (Chan et al., J. Exp. Med. 173 (1991), 869). Durch einen Synergie-Effekt mit IL2 kann die Dosis von IL2 in Gegenwart von IL12 bei einer adoptiven Immuntherapie zur Erzeugung von Lymphokin aktivierten Killerzellen drastisch gesenkt werden, so daß die gravierenden Nebenwirkungen von IL2 deutlich reduziert werden können.

IL12 ist ein Heterodimer, das aus einer p40- und p35-Kette besteht (Stern et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6808). p40 weist gewisse Homologien zu der extrazellulären Domäne des IL6-Rezeptors auf (Gearing und Cosman, Cell 66 (1991), 9), während p35 ein Homologes von IL6 zu sein scheint (Mersberg et al., Immunol. Today 13 (1992), 77). Die p35-Kette ist offenbar für die Signalauslösung am IL12-Rezeptor verantwortlich, während die p40-Untereinheit wahrscheinlich die Species-Spezifität bestimmt. Offenbar gibt es aber auch Rezeptor-Isoformen, die durch die p40-Kette alleine stimuliert werden können (Presky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 14002). Da bisher keine Röntgenstrukturanalysen der beiden IL12-Untereinheiten vorliegen, kann über die IL-12- Tertiärstruktur nur spekuliert werden.

Wie bei anderen Cytokinen oder Wachstumsfaktoren gibt es auch bei den IL12-Untereinheiten bestimmte kurze Domänen, die mit dem Rezeptor interagieren. Die Verabreichung einer kurzen IL12-Domäne, die mit dem Rezeptor interagiert, könnte eventuell völlig ausreichen, um die gewünschten zellulären Effekte (z. B. immunstimulatorische Wirkung) zu erzielen. Allerdings gibt es bisher zu IL12 keine Untersuchungen, beispielsweise mit synthetisierten Peptiden, die Aufschluß über geeignete IL12-Domänen geben könnten.

Da Cytokine allgemein nur in äußerst geringen Konzentrationen im Serum vorkommen, ist eine Isolierung therapeutisch einsetzbarer Mengen aus diesem Medium nicht möglich. Daher wurden bisher die therapeutisch eingesetzten Cytokine rekombinant, in Bakterien oder Hefe, hergestellt. Diese Vorgehensweise weist jedoch eine Reihe von gravierenden Nachteilen auf.

Die rekombinante Herstellung von Cytokinen erfordert einen hohen Aufwand beim "set-up". So muß beispielsweise geklärt werden, ob die Wirtszelle das Protein genau bzw. in der exakten nativen Konformation exprimiert, welches überhaupt die beste Wirtszelle bzw. der beste Expressionsvektor ist und unter welchen Bedingungen das Protein nicht proteolytisch abgebaut wird. Hier ist festzuhalten, daß allgemein rekombinant hergestellte Proteine eine vom nativen Protein ab weichende Tertiärstruktur aufweisen und deswegen vom mensch lichen Immunsystem als "fremd" erkannt werden. Die dadurch induzierten Antikörper neutralisieren das Protein, beispielsweise das Cytokin, und führen so zu einem Verlust von dessen Wirksamkeit.

Die Isolierung und Reinigung rekombinanter Proteine gestaltet sich schwierig, da sich prinzipiell immer die gleichen, für jedes neue Produkt spezifischen Fragen stellen, nämlich wie kann verhindert werden, daß das Protein proteolytisch abgebaut wird und/oder nach der Isolierung ausfällt. Allgemein zeigen rekombinant hergestellte Proteine eine auffällige Labilität gegenüber Proteasen. Dies erfordert eine häufige und/oder hochdosierte Verabreichung, die einerseits den Patienten sehr belastet, andererseits aber auch die Therapie sehr kostspielig gestaltet.

Da die Cytokine normalerweise bei der Therapie in regelmäßiger Folge verabreicht werden müssen, muß gewährleistet sein, daß sie absolut frei von Kontaminationen, d. h. vor allem von Bestandteilen der Wirtszelle, sind. Dadurch müssen komplexe Verfahren eingesetzt werden, die sich ungünstig auf die Preisgestaltung auswirken.

Inzwischen hat sich weitgehend die Erkenntnis durchgesetzt, daß Botenstoffe (z. B. Cytokine) nicht nur eine Bindungsstelle für den Rezeptor besitzen, sondern daß weitere - z. Zt. noch nicht vollständig verstandene - Domänen vorhanden sind, die möglicherweise andere Signalwege induzieren können als die, die eigentlich beabsichtigt sind. Damit könnten unter anderem auch die häufig auftretenden Nebenwirkungen der bisher eingesetzten Cytokinen erklärt werden, die teilweise eine Behandlung mit diesen unmöglich machen.

Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Verbindungen mit einer biologischen Aktivität von Interleukin 12 (IL12) in einer Weise bereitzustellen, daß die bisherigen Nachteile des Stands der Technik vermieden werden, d. h. bei Verabreichung als Arzneimittel geringere Nebenwirkungen, eine höhere Halbwertszeit und hohe biologische Aktivität erhalten werden.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erreicht.

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein synthetisches Homodimer oder Heterodimer aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenz KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben, wobei das Homodimer oder Heterodimer an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und ggf. ein zelluläres Signal auslösen kann. Diese erfindungsgemäßen Peptide stellen die Bindungsregionen der IL12-Untereinheiten p40 und p35 dar und machen sich die Erkenntnis zunutze, daß für eine biologische Wirkung der Einsatz der Peptide aus p35 und p40 in dimerisierter Form erfolgen muß, da auch die Rezeptoren zweifach zusammenliegen müssen, um zur Auslösung der intrazellulären Signale fähig zu sein. Die Monomere I-III umfassen 3 Schleifen, die an der Kontaktstelle von p35 mit dem Interleukin 12-Rezeptor liegen, während analog die Monomere IV-VI die Kontaktstellen für p40 mit dem Rezeptor darstellen. Die erfindungsgemäßen Dimere weisen folgende Vorteile auf: Sie sind über standardisierte Verfahren einfach zu synthetisieren und zu reinigen und können unmittelbar den erforderlichen Tests (z. B. strukturelle Untersuchungen, biologische Tests, präklinische und klinische Studien) zugeführt werden. Diese Peptide stellen die minimalen Strukturen des jeweiligen Cytokins dar, die für seine biologische Wirksamkeit erforderlich sind. Dadurch ist höchste Spezifität und hohe biologische Aktivität in Verbindung mit geringsten Nebenwirkungen gewährleistet. Aufgrund der geringen Größe der Peptide können sie mikrokapsuliert werden, wodurch sich Depotformen mit unterschiedlich langer Wirkungsdauer - abhängig von der jeweiligen Porengröße der Kapseln - ergeben. Die Depotform kann lokal appliziert werden, so daß an der gewünschten Stelle (z. B. Krebsherd) die höchste Konzentration des Wirkstoffs über einen langen Zeitraum gewährleistet ist.

Erfindungsgemäß sind alle Kombinationen der Monomere I-VI untereinander zur Bildung von Dimeren befähigt und die entstehenden Dimere lösen die Aufgabe.

Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide erfolgt üblicherweise nach bekannten Festphasen-Syntheseverfahren, beispielsweise wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben. Die Untersuchung der biologischen Aktivität (Bindung an den Rezeptor, Auslösung eines zellulären Signals und proliferationsstimulierende Wirkung) erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren, z. B. gemäß Lewis, J. Immunol. Methods 185 (1995), 9-17; Grander et al., Eur. J. Cancer 28A (1992), 815- 818 oder beispielsweise auch gemäß den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den vorstehend beschriebenen Peptiden um Homodimere oder Heterodimere, bei denen die Monomere über ihre C-Termini oder N-Termini verknüpft sind oder der N-Terminus eines Monomers mit dem C-Terminus des anderen Monomers verknüpft ist. Vorzugsweise ist der C-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II, oder der N-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II verknüpft. Dabei wird beispielhaft das gewünschte N-terminale Peptid in Seitenfunktion-geschützter Form nach Entfernen der Schutzgruppe (bevorzugt Fmoc) durch Behandlung mit z. B. Piperidin mit einem Crosslinker aktiviert und das Produkt über HPLC gereinigt. Ein anderes zuvor synthetisiertes Monomer wird ebenfalls (entweder am C- oder N-Terminus - je nach gewünschtem Dimer) in Seitenfunktion-geschützter Form mit einer Gruppe versehen, die ausschließlich mit der N-terminalen Gruppe des gebundenen Peptids reagiert. Nach Zugeben dieses Monomers zum aktivierten Monomer werden die Dimere, die sich im Elutionsverhalten deutlich von den Monomeren unterscheiden, nach Entfernen der Seitenschutzgruppen nach Standardverfahren über Umkehrphasen-HPLC gereinigt und isoliert. Falls es die Aminosäurenzusammensetzung zuläßt, können die Aktivierungsgruppen und Crosslinker auch so ausgewählt werden, daß eine Dimerisierung an freien Monomeren nach Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen direkt in Lösung durchgeführt werden kann. Alternativ kann die Synthesestrategie wie im Beispiel beschrieben am HYCHRON-Anker durchgeführt werden, sodaß die Seitenketten-Schutzgruppen erhalten bleiben und eine Dimerisierung in wässriger Lösung durchgeführt werden kann.

Diese Verknüpfung kann beispielsweise mittels dem in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren oder anderen Standardverfahren durchgeführt werden, wobei darauf geachtet werden muß, daß die Dimerisierung so erfolgt, daß eine Bindung an das Rezeptorpaar noch wirksam möglich ist. So kann z. B. die Dimerisierung an einem Lysin-Rest als Verzeigungspunkt (Wrighton et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 1261-1265) durchgeführt werden. Vorzugsweise sind die Homomere der erfindungsgemäßen Dimere über Linker, wie Polyäthylenglykol, Peptid(e), aktivierte Benzodiazepine, Oxazolone, Azalactone, Aminimide, Diketopiperazine, oder (ein) Monosaccharid(e), kovalent miteinander verknüpft. Die entsprechend durch zuführenden chemischen Reaktionen sind dem auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann bekannt (z. B. Hermannson, Bioconjugate Techniques (1996), Academic Press, San Diego; Peeters et al., J. Immunol. Meth. 120, (1989), 133-144; Inman et al., Bioconjugate Chem. 2 (1991), 458-463).

Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Homodimere oder Heterodimere, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Monomere gegenüber den entsprechenden Ausgangsmonomeren I bis VI Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) aufweisen. Dabei werden Homo- bzw. Heterodimere erhalten, die (a) im Vergleich zu den ursprünglichen Formen ähnlich oder besser an den IL12 Rezeptor binden und/oder ein zelluläres Signal auslösen können, oder (b) an den IL12 Rezeptor zwar noch binden können, jedoch eine antagonistische Wirkung aufweisen, d. h. nach Verabreichung wird die biologisch aktive Form durch diese Form, die nicht mehr zur Auslösung eines zellulären Signals nach Bindung an den Rezeptor führt, verdrängt. Inwieweit diese veränderten Homo- bzw. Heterodimere die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweisen, kann mittels der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren bzw. den vorstehend beschriebenen Verfahren untersucht werden. Vorzugsweise werden bei den Aminsosäuresubstitutionen bzw. Additionen natürliche Aminosäuren eingeführt, wobei modifizierte Aminosäuren nicht ausgeschlossen sind. Zu den bevorzugten Modifikationen zählen Glykosylierungen mit Mono- oder Disacchariden von Serin, Threonin und Asparagin, Farnesylierung und Palmitoylierung von Cystein, Phosphorylierung von Threonin, Serin und Tyrosin, wobei die Modifikationen, die die zentralen Aminosäuren betreffen, meist zu antagonistischen Formen führen. Bei den vorstehend beschriebenen veränderten erfindungsgemäßen Homodimeren bzw. Heterodimeren betreffen die Deletionen, Additionen, Substitutionen und/oder Modifikationen höchstens 10, vorzugsweise höchstens 7, stärker bevorzugt höchstens 3 und am meisten bevorzugt höchstens 1 Aminosäure(n) pro Monomer Die erfindungsgemäßen, aus veränderten Monomeren bestehenden Homo- bzw. Heterodimere enthalten neben der für die Rezeptorbindung verantwortlichen Domäne keine weiteren Domänen, wie sie für das natürliche Cytokin charakteristisch sind.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen bzw. aus veränderten Monomeren bestehenden Dimer um folgende Homodimere: [AALQNHNHQQIILDK]₂ oder [AALQNHNKQQIILDK]₂, welche gegenüber IL12 sogar eine deutlich höhere spezifische Aktivität aufweisen. Beide Monomeren sind sowohl C-C als auch C-N verknüpft.

Die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere können als solche vorliegen, aber auch mit anderen weiteren Verbindungen, beispielsweise (Poly)peptiden verknüpft sein. Zu diesen (Poly)peptiden zählen beispielsweise Trägerproteine, z. B. Transferrin oder Albumin, die vom Körper nicht als fremd erkannt werden. Die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere können auch noch mit anderen (Poly)peptiden fusioniert sein, beispielsweise einem Leaderpeptid, das das Eindringen des erfindungsgemäßen Peptids in die Zelle ermöglicht oder unterstützt. Ein Beispiel für ein solches Leaderpeptid ist Penetratin von Drosophila.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehenden Homodimere oder Heterodimere, die weiter dadurch gekennzeichnet sind, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Fettsäuren, Mono- und/oder Oligosaccharide kovalent modifiziert sind. Dies kann durch allgemein bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise während der Synthese der Monomere durch den Einsatz von Aminosäuren, die bereits die vorstehenden Modifikationen tragen. Die Modifizierungen können aber auch nachträglich erfolgen. Durch diese Modifizierungen kann beispielsweise eine höhere Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau und damit eine noch höhere biologische Halbwertszeit erreicht werden.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Dimere. Diese Antikörper können beispielsweise auch in diagnostischen Assays verwendet werden. Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei die erfindungsgemäßen Homodimere oder Heterodimere als Antigen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z. B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 10029, und Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor- Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht-menschlichen Immunglobulin (z. B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin). Die (der) konstante(n) Bereich(e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die mensch lichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper oder einen partiell fremden chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erniedrigten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, oder von infektiösen oder entzündlichen Prozessen (z. B. HIV, Leishmaniasis: Mountford et al., J. Immuol. 156 (996), S. 4739-4745). Bestimmte modifizierte Formen der erfindunggemäßen Dimere können auch eine antagonistische Wirkung aufweisen. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere enthaltenden Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, z. B. Tumore, arthritische Prozesse, allergische Reaktionen oder bestimmte Formen von Hauterkrankungen, wie Psoriasis (Wigginton et al., J. Natl. Cancer Inst. 88 (1996), 38-43; Brunda et al., J. Exp. Med. 178 (1993), 1223-1230). Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die erfindungsgemäßen Dimere enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Reduzierung der IL2- Nebenwirkungen bei einer Therapie mit IL2, beispielsweise einer Immuntherapie.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel liegt gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger vor. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in Form einer Injektionslösung, Tablette, Salbe, Suspension, Emulsion, eines Zäpfchens etc. vorliegen. Es kann auch in Form von Depots (Mikrokapseln, Zinksalze, Liposomen etc.) verabreicht werden. Die Art der Verabreichung des Arzneimittels hängt unter anderen davon ab, in welcher Form der Wirkstoff vorliegt, sie kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z. B. direkt zu einem Tumor), intramuskuläre, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, transdermale oder transmukosale (nasal, vaginal, rektal, sublingual) Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Homodimer oder Heterodimer enthält oder den erfindungsgemäßen Antikörper und zur Diagnose von Erkrankungen verwendet werden kann, die mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten IL12 Rezeptor in Zusammenhang stehen bzw. mit einer zu hohen oder geringen Konzentration von IL12. Dabei können die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere in allgemein üblichen Assayformaten zum diagnostischen Nachweis vorliegen.

Dieser Nachweis beinhaltet beispielsweise (a) die Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten, (b) das Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem erfindungsgemäßen Homo bz. Heterodimer oder Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die spezifische Bindung an das Ziel erlauben, und (c) den Nachweis der Bindung an das Ziel. Dieser Nachweis kann unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durch geführt werden. Dabei können die erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden und auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die es erlauben, daß IL12 bzw. der Rezeptor mit dem erfindungsgemäßen Antikörper oder Homo- bzw. Heterodimer in spezifischen Kontakt gebracht werden kann.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der ein erfindungsgemäßes Dimer oder den erfindungsgemäßen Antikörper oder das Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das Dimer bzw. der Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Festphasensynthese von KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMO (Monomer II), AALONHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) und RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI)

Die Monomere I-VI wurden nach einer Standard- Festphasensynthese hergestellt (Seitz et al., Angew. Chem. 107 (1995), 901). Die Synthese erfolgte an einem HYCHRON-Anker mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure mit Start über den C- Terminus. Die Carboxylgruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure wurden in Form von tert-butyl-Estern geschützt. Die Schutzgruppen der Seitenketten von Tyr beinhalteten tetrahydropyranyl-, tert-butyl(Boc)- und trityl-Gruppen. Die Seitenketten-Schutzgruppen von Serin und Threonin beinhalteten Acetyl-, Benzoyl- und Benzyloxycarbonyl-(=Cbz)-Gruppen. Die Schutzgruppen für die Seitenkette von Arginin beinhalteten Cbz, Mesitylen-2-sulfonyl (= Mts) oder tert-butyloxycarbonyl (= Boc). Die Seitenkette von Lysin wurde durch Tosyl-(= Tos) oder Boc geschützt. Nach Entfernen der α-Amino-Schutzgruppe und entsprechenden Waschschritten, gefolgt von Aktivierung der Carboxylgruppe der nächsten Aminosäure wurde diese an die vorhergehende Aminosäure gekoppelt. In dieser Reihenfolge wurden die kompletten Monomere synthetisiert. Die fertigen Monomere wurde durch einen Palladium(0)katalysierten Allyl- Transfer von der Säule gelöst, wobei die Schutzgruppen an den Seitenketten erhalten blieben. Anschließend wurde die Fmoc- Gruppe durch Morpholin abgelöst, die restlichen Schutzgruppen wurden durch Behandlung mit TFA abgespalten.

Beispiel 2 Polyäthylenglykol-Dimerisierung von Monomer I

Die Dimerisierung der Monomere I erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG- Succinimidylpropionat, MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 5).

Beispiel 3 Polyäthylenglykol-Dimerisierung von Monomer II

Die Dimerisierung der Monomere II erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG- Succinimidylpropionat, MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 5).

Beispiel 4 Polyäthylenglykol-Dimerisierung der Monomere I und II

Die Dimerisierung der Monomere erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG succinimidylpropionat, MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 5).

Die Monomeren wurden im Verhältnis 1 : 1 eingesetzt, die Abtrennung erfolgte über Umkehrphasen-HPLC, da sich die beiden Dimere in ihrem Elutionsverhalten deutlich (je nach Zusammensetzung zwischen 4 und 9 Minuten Unterschied im Elutionspeak) unterscheiden und dadurch voneinander abtrennbar sind.

Beispiel 5 Analytische und präparative HPLC

Die Bildung der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Dimere wurde durch analytische Umkehrphasen-HPLC überprüft. Die Analyse wurde mittels einer Vydac-C18 Protein-Peptid-Säule (0,46 × 25 cm) (The Separation Group, USA), einem BioRad HPLC- System und einem Zweiwellenlängen-Detektor von Perkin-Elmer durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,1% TFA in dest. Wasser äquilibriert, und 10 min. nach Injektion der Probe (in der Regel 6 ml) wurde ein 45-minütiger linearer Gradient (0-100) von Acetonitril mit 0,1% TFA gefahren. Die Flußrate wurde kontinuierlich bei 1 ml/min. gehalten. Unter diesen Bedingungen erschien der Quervernetzer im Durchfluß. Das Reaktionsprodukt eluierte nach 37 min., während das unkonjugierte Monomer bereits nach 32 min. eluiert wurde und damit klar vom Dimer abgetrennt werden konnte. Das Dimer wurde auf einer präparativen Umkehr-HPLC-Säule (2,2 × 25 cm) am gleichen HPLC-System weiter aufgereinigt. Die Säule wurde mit einer konstanten Flußrate von 8 ml/min. mit dest. Wasser: Acetonitril 80 : 20 (beide enthielten 0,1% TFA) äquilibriert. 20 min. nach Injektion der Probe (6 ml) wurde ein 60-minütiger linearer Gradient auf 100% Acetonitril/0,1% TFA gefahren. Der Hauptpeak wurde gesammelt und lyophilisiert. Für das Monomer II wurde ein flacherer Gradient (20-80% Acetonitril/0,1% TFA über 60%) gefahren, um so eine bessere Abtrennung zu erreichen. Die isolierten Dimere und die nativen Monomere wurden in Bindungsstudien (siehe Beispiel 7) und Proliferationstests (siehe Beispiel 8) eingesetzt.

Beispiel 6 Radioaktive Markierung der Dimere

Die Dimere wurden wie nachstehend beschrieben iodiert. 20 µl Chloramin T (0,5 mg/ml) wurden zu 20 µl Na¹²⁵I (2 mCi, Amersham Buchler, Braunschweig) gegeben, das Gemisch wurde 2 min. später zu 50 µl Dimer (5 µg in PBS) zugemischt und 15 sec. inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion wurden 30 µl Natrium metabisulfit (1 mg/ml in PBS) und nach 30 sec. 50 µl KI (10 mg/ml in PBS) zugegeben. Als Carrier wurde Gelatine (50 µl, 1 mg/ml. In dest. Wasser) zugegeben und die Lösung sofort auf eine Bio-Sil SEC 125-5 Säule (BioRad, 10 ml) aufgetragen, die mit 0,25% Gelatine/0,02% Natriumazid in PBS äquilibriert war. Die Fraktionen, die das radioaktive Produkt enthielten, wurden vereinigt und auf der Umkehrphasen-HPLC-Säule wie in Beispiel 5 beschrieben weiter aufgereinigt und isoliert. Die gereinigten Dimere wiesen eine spezifische Radioaktivität von 50-100 µCi/µg auf, ergaben in der Tricin-SDS-PAGE eine einzelne Bande und die Radioaktivität konnte zu 95-100% mit dem Chloroform/Methanol-Verfahren (Wessel et al., Anal. Biochem. 138 (1984), 141-143) gefällt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß das radioaktiv markierte Produkt aus einem reinen Dimer bestand und daß die Radioaktivität ausschließlich dem Dimer zuzuschreiben war.

Beispiel 7 Zellbindungsstudien

Diese Studien geben Aufschluß darüber, ob die erfindungsgemäßen Dimere spezifisch an Zellen binden, die den IL12-Rezeptor exprimieren. In diesem Beispiel wurde das aus den Monomeren III bestehende Homodimer verwendet. Das Experiment wurde an PHA-stimulierten humanen Lymphoblasten nach einem modifizierten Protokoll gemäß Chizzonite et al., J. Immunol. 148 (1992), 3117-3124, durchgeführt.

Die stimulierten Zellen (7,5 × 10⁵ Zellen/ml RPMI-Medium) wurden 90 Minuten mit radioaktiv markiertem Dimer in verschiedenen Konzentrationen (0,01 bis 1 ng) inkubiert und anschließend mittels 3 Zentrifugationsschritten in PBS gewaschen und die Zell-gebundene Radioaktivität im Flüssigszintillationszähler gemessen. Das Ausmaß der unspezifischen Bindung wurde in Gegenwart einer 100-fach höheren Konzentration von IL12 bestimmt, wobei markiertes Homodimer und IL12 gleichzeitig zu den Zellen gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.

Tabelle I

Testsubstanz
Bindung (% maximale Bindung)
Interleukin 12	100
AALQNHNHQQIILDK	9
[AALQNHNHQQIILDK]₂	66

Beispiel 8 Proliferationsstudien

Diese Studien sollten zeigen, ob die erfindungsgemäßen Dimere ähnlich wie natives IL12 proliferationsstimulierende Wirkung besitzen. Sie wurden wiederum an PHA-stimulierten humanen Lymphoblasten in einem 48 Stunden Assay gemäß Gately und Chizzonite, Curr. Protocols in Immunology Voll (1992), S. 6.16- 6.16.8, mit Monomer III durchgeführt. Dabei wurden die Zellen in 200 µl Kulturmedium in einer Zellzahl von 5 × 10⁴ ausgesät und in Gegenwart verschiedener Konzentrationen (0,01-1 ng) der Dimere 48 Stunden kultiviert. Nach Zugaben von tritiiertem Thymidin (0,25 µCi/ml) wurden die Zellen weitere 4 Stunden kultiviert und anschließend über ein Zellernte-Gerät isoliert. Die eingebaute Radioaktivität wurde im Flüssigszintillationszähler gemessen. Die Werte sind in Tabelle II als spezifische Aktivität in Einheiten × 10^-7/mg IL12 dargestellt.

Tabelle II

Testsubstanz
Spezifische Aktivität
Interleukin 12	53
AALQNHNHQQIILDK	0.03
[AALQNHNHQQIILDK]₂	10.5
[AALQNHNKQQIILDK]₂	10.5

Beispiel 9 Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Das in Beispiel 4 hergestellte Heterodimer wurde einer 18% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 6,5 kB Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Das Dimer wird mittels eines Elektroelutors (BioRad) aus dem Gel eluiert und nach einer kB- Dialyse über Nacht lyophilisiert. Das Peptid wird in einer Konzentration von 5 mg/ml PBS aufgenommen und mit dem Trägerprotein Albumin in einem Verhältnis 1 mol Peptid/p,02 mol Carrier in insgesamt 2 ml PBS gemischt. Zu dem Gemisch werden 2 ml Glutardialdehyd (0,2% in PBS) unter kontinuierlichem Rühren zugetropft und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend wird das Gemisch 48 Stunden mit 12-stündigem Pufferwechsel in einem 20 kB- Dialyseschlauch gegen PBS dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Die Tiere werden mit dem Gemisch bestehend aus Dimer-BSA-Komplexen, BSA-BSA-Komplexen sowie Dimer- Komplexen mit 100 µg (Kaninchen und Huhn) bzw. mit 30 µg (Maus) immunisiert:

- Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung wurden 100 µg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56: 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten

Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Heterodimer von Beispiel 4 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al., Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1 : 10000 in PBS). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikör per inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Dianova) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren.

Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

- Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung wurden 100 µg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)

Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.

- Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung wurden 30 µg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56: 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84: 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion

Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Synthetisches Homodimer oder Heterodimer aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenzen KHYSCTAEDID (Monomer I), PPVGEADPYRVKMQ (Monomer II), AALQNHNHQQIILDK (Monomer III), IRDIIKPDPPKN (Monomer IV), SLTFCVQVQGKSKR (Monomer V) oder RFTCWWLTTISTDLTF (Monomer VI) haben bzw. Varianten davon, wobei das Homodimer oder Heterodimer an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor bindet.

2. Homodimer oder Heterodimer nach Anspruch 1, wobei die Monomere über ihre C-Termini oder N-Termini verknüpft sind oder der N-Terminus eines Monomers mit dem C- Terminus des anderen Monomers verknüpft ist.

3. Heterodimer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der C-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II, oder der N-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II verknüpft ist.

4. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere über Polyäthylenglykol, Peptid(e), aktivierte Benzodiazepine, Oxazolone, Azalactone, Aminimide, Diketopiperazine, oder (ein) Monosaccharid(e) kovalent miteinander verknüpft sind.

5. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) aufweisen, wobei die Homodimere oder Heterodimere im Vergleich zu den ursprünglichen Formen ähnlich oder besser (a) an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden und/oder (b) ein zelluläres Signal auslösen können.

6. Homodimer nach Anspruch 5, das das Homodimer [AALQNHNKQQIILDK]₂ oder [AALQNHNKQQIILDK]₂ ist.

7. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) aufweisen, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interleukin 12 (IL12) Rezeptor binden können, jedoch eine antagonistische Wirkung aufweisen.

8. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Fettsäuren, Mono- und/oder Oligosaccharide kovalent modifiziert sind.

9. Antikörper oder Fragment davon, der (das) an das Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 8 spezifisch bindet.

10. Antikörper nach Anspruch 9, der ein monoclonaler Antikörper ist oder ein Fragment davon.

11. Verfahren zur Herstellung des in den Ansprüchen 1 bis 8 definierten Homodimers oder Heterodimers, umfassend eine Festphasensynthese der Monomere und anschließende Dimerisierung.

12. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8, oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellten Homodimers oder Heterodimers zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer ernied rigten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen oder zur Reduzierung der IL2-Nebenwirkungen bei einer Therapie mit IL2.

13. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 7 und 8, oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellten Homodimers oder Heterodimers zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems oder von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Zellproliferation in Zusammenhang stehen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei es sich bei der Erkrankung um eine Krebserkrankung handelt.

15. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellten Homodimers oder Heterodimers oder des Antikörpers nach Anspruch 9 oder 10 oder des Fragments davon zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten Interleukin 12 (IL12) Rezeptor bzw. einer zu hohen oder zu niedrigen Konzentration von Interleukin 12 in Zusammenhang stehen.

16. Kit zur Durchführung des in Anspruch 15 definierten Diagnoseverfahrens, das Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das nach dem Verfahren nach Anspruch 11 hergestellte Homodimer oder Heterodimer oder den Antikörper nach Anspruch 9 oder 10 oder das Fragment davon enthaltend.