DE19909503A1 - Tumorassoziiertes Antigen - Google Patents

Abstract

Tumorassoziiertes Antigen, davon abgeleitete immunogene Peptide und dafür kodierende DNA-Moleküle sowie deren Verwendung in der Immuntherapie von Krebserkrankungen.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Immuntherapie von Tumorerkrankungen.

Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Organismus vor einer Vielzahl verschiedener Mikroorganismen zu schützen bzw. diese aktiv zu bekämpfen. Die Bedeutung eines intakten Immunsystems zeigt sich vor allem bei vererbten oder erworbenen Immundefizienzen. Der Einsatz von prophylaktischen Vakzinprogrammen erwies sich in vielen Fällen als äußerst zielführende und erfolgreiche immunologische Intervention im Kampf gegen virale oder bakterielle Infektionserkrankungen. Weiters hat sich gezeigt, daß das Immunsystem auch an der Eliminierung von Tumorzellen maßgeblich beteiligt ist. Dabei spielt die Erkennung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) durch Komponenten des Immunsystems eine wesentliche Rolle. Im weitesten Sinn kann jede (peptidische oder nicht peptidische) Komponente einer Tumorzelle, die von einem Element des Immunsystems erkannt und zur Stimulation einer immunologischen Antwort führt, als immunogenes Tumorantigen fungieren. Besondere Bedeutung kommt dabei jenen Tumorantigenen zu, die nicht nur eine immunologische Reaktion hervorrufen, sondern auch eine Abstoßung des Tumors bewirken. Die Identifizierung definierter Antigene, die solch eine immunologische Reaktion bewirken können, stellt einen wichtigen Schritt für die Entwicklung einer molekular definierten Tumorvakzine dar. Obwohl noch nicht ganz geklärt ist, welche Elemente des Immunsystems für eine Abstoßung des Tumors verantwortlich sind, besteht doch ein Konsens darüber, daß dabei CD8-exprimierende zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs) eine Hauptrolle spielen (Coulie, 1997). Besonders bei jenen Tumorarten (z. B. Melanom und Nierenkarzinom), die eine relativ hohe Spontanremissionsrate aufweisen, konnte eine Korrelation zwischen klinischem Verlauf und dem vermehrten Auftreten von CD8⁺- und CD4⁺-T-Zellen festgestellt werden (Schendel et al., 1993; Mackensen et al., 1993; Halliday et al., 1995; Kawakami et al., 1995; Kawakami et al., 1996; Wang, 1997; Celluzzi und Falo, 1998). Dabei wurden spezifische CTL-Klone entweder aus tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TIL) oder peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) nach Kokultivierung mit meist autologen Tumorzellen und Zytokinstimulierung in vitro erhalten. Sowohl in Tiermodellen als auch in in vitro kultivierten humanen Zellkultursystemen konnte die T-Zell-Antwort gegen Tumorzellen durch Transfektion der Tumorzellen mit Zytokinen verstärkt werden (von Elsas et al., 1997; Gansbacher et al., 1990; Tepper et al., 1989; Fearon et al., 1990; Dranoff et al., 1993).

Aufgrund der Korrelation zwischen Remission und Beteiligung von CD8⁺-T-Zellen ist die Identifizierung tumorassoziierter Antigene (TAA), die durch CD8-positive CTLs erkannt werden, ein erklärtes Hauptziel auf dem Weg zur Entwicklung einer Tumorvakzine (Pardoll, 1998; Robbins und Kawakami, 1996). Ob auch andere Zelltypen des Immunsystems wie z. B. CD4⁺-T-Helferzellen eine wesentliche Rolle spielen ist noch unklar; einige Studien mit MAGE-3/HLA-A1- Peptiden in Melanompatienten deuten darauf hin (Marchand et al., 1995; Boon et al., 1998). In den vergangenen Jahren ist eine Reihe von TAAs, die durch CTLs erkannt werden, identifiziert worden (Boon et al., 1994; von den Eynde und von der Bruggen, 1997).

T-Zellen erkennen Antigene als Peptidfragmente, die an Zelloberflächen von MHC-Molekülen ("major histocompatibility complex", im Menschen "HLA" = "human leukocyte antigen") präsentiert werden. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-I Moleküle kommen auf den meisten Zellen mit Kern vor und präsentieren Peptide (üblicherweise 8-10-mere), die durch proteolytischen Abbau endogener Proteine entstehen (sog. Antigen-Verarbeitung, "antigen processing"). Peptid:MHC-I Komplexe werden von CD8-positiven CTLs erkannt. MHC-II Moleküle kommen nur auf sog. "professionellen antigen-präsentierenden Zellen"(APC) vor, und präsentieren Peptide exogener Proteine, die im Zuge der Endocytose von APC aufgenommen und verarbeitet werden. Peptid:MHC-II Komplexe werden von CD4-Helfer-T- Zellen erkannt. Durch eine Interaktion zwischen T-Zellrezeptor und Peptid:MHC Komplex können verschiedene Effektormechanismen ausgelöst werden, die im Fall von CTLs zur Apoptose der Zielzelle führen. Das geschieht, wenn entweder der MHC (z. B. % im Fall der Transplantatabstoßung), oder das Peptid (z. B. im Fall intrazellulärer Pathogene) als fremd erkannt wird. Allerdings erfüllen nicht alle präsentierten Peptide die strukturellen und funktionellen Anforderungen für eine effektive Interaktion mit T-Zellen (wie von Rammensee et al., 1995 und weiter unten beschrieben).

Für den Einsatz von TAAs in einer Tumorvakzine sind grundsätzlich mehrere Applikationsformen möglich: Das Antigen kann entweder als rekombinantes Protein mit geeigneten Adjuvantien bzw. Trägersystemen, oder als für das Antigen kodierende cDNA in Plasmid- (DNA- Vakzine; Tighe et al., 1998), bzw. viralen Vektoren (Restifo, 1997) appliziert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz von rekombinanten Bakterien (z. B. Listeria, Salmonella), die das humane Antigen rekombinant exprimieren und durch ihre zusätzlichen Komponenten eine adjuvative Wirkung haben (Paterson, 1996; Pardoll, 1998). In allen diesen Fällen ist eine Verarbeitung und Präsentation des Antigens durch sog. "professionelle antigen- präsentierende Zellen" (APC) notwendig. Eine weitere Möglichkeit ist der Einsatz synthetischer Peptide (Melief et al., 1996), die den korrespondierenden T-Zell-Epitopen des Antigens entsprechen und die entweder von außen auf die APC geladen (Buschle et al., 1997; Schmidt et al., 1997) oder von den APC aufgenommen und intrazellulär auf die MHC-I-Moleküle transferiert werden. Die therapeutisch effizienteste Applikationsform für ein definiertes Antigen wird im allgemeinen in klinischen Studien bestimmt.

Zu den von den tumorspezifischen CTLs erkannten Antigenen bzw. deren Epitopen zählen Moleküle, die aus sämtlichen Proteinklassen stammen können (z. B. Transkriptionsfaktoren, Rezeptoren, Enzyme; zur Übersicht siehe Rammensee et al., 1995; Robbins und Kawakami, 1996). Diese Proteine müssen nicht notwendigerweise an der Zelloberfläche lokalisiert sein, wie dies bei der Erkennung durch Antikörper erforderlich ist. Um für die Erkennung durch CTLs als tumorspezifisches Antigen zu fungieren bzw. um für die Therapie eingesetzt zu werden, müssen die Proteine bestimmte Bedingungen erfüllen: erstens soll das Antigen ausschließlich von Tumorzellen exprimiert werden oder in sog. "kritischen" Normalgeweben nur in geringerer Konzentration als in Tumoren vorkommen. Kritische Normalgewebe sind essentielle Gewebe; eine gegen sie gerichtete Immunreaktion hätte schwerwiegende, zum Teil letale Folgen. Zweitens soll das Antigen nicht nur im Primärtumor, sondern auch in den Metastasen vorhanden sein. Des weiteren ist es im Hinblick auf eine breite klinische Anwendung des Antigens erstrebenswert, wenn es in mehreren Tumorarten in hoher Konzentration vorhanden ist. Eine weitere Vorbedingung für die Eignung eines TAA als wirksamer Bestandteil einer Vakzine ist das Vorhandensein von T-Zell-Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens; vom TAA abgeleitete Peptide sollen zu einer in-vitro/in vivo-T-Zell-Antwort führen ("immunogenes" Peptid). Ein weiteres Selektionskriterium für ein klinisch breit anwendbares immunogenes Peptid ist die Häufigkeit, mit der das Antigen in einer gegebenen Patientenpopulation anzutreffen ist.

Die immunogenen tumorassoziierten Antigene (TAAs), von denen größtenteils bereits gezeigt wurde, daß sie T-Zell Epitope besitzen, lassen sich in mehrere Kategorien einteilen, u. a. virale Proteine, mutierte Proteine, überexprimierte Proteine, durch chromosomale Translokation gebildete Fusionsproteine, Differenzierungsantigene, onkofötale Antigene (Van den Eynde und Brichard, 1995; von den Eynde und von der Bruggen, 1997).

Die Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von TAAs, die den Ausgangspunkt für die Entwicklung einer Tumorvakzine darstellen, beruhen einerseits auf dem Einsatz von in Patienten bereits induzierten CTLs (zelluläre Immunantwort) oder Antikörpern (humorale Immunantwort), oder basieren auf der Erstellung differenzieller Transkriptionsprofile zwischen Tumoren und Normalgeweben. Im ersten Fall, dem immunologischen Ansatz, werden Patienten-CTLs für ein Screening eukaryotischer Tumor-cDNA-Expressionsbibliotheken, die über MHC-I-Moleküle die CTL-Epitope präsentieren, eingesetzt (Boon et al., 1994), während mittels hochaffiner Patienten-Antiseren prokaryotische-cDNA- Expressionsbibliotheken, direkt über eine Immunoblot- Analyse der einzelnen Plaques auf das Vorhandensein von TAAs untersucht werden (Sahin et al., 1995). Eine Kombination von CTL-Reaktivität und proteinchemischen Verfahren stellt die Isolierung von aus MHC-I- isolierten Peptiden von Tumorzellen dar, die über Reaktivität mit Patienten-CTLs vorselektioniert wurden. Die Peptide werden aus dem MHC-I- Komplex ausgewaschen und mit Hilfe der Massenspektrometrie identifiziert (Falk et al., 1991; Woelfel et al., 1994; Cox et al., 1994). Die Ansätze, welche CTLs zum Charakterisieren von Antigenen verwenden, sind aufgrund der erforderlichen Kultivierung und Aktivierung von CTLs mit einem erheblichen Aufwand verbunden bzw. nicht immer erfolgreich.

Methoden zur Identifizierung von TAAs, welche auf dem Vergleich des Transkriptionsprofils von Normal- mit Tumorgewebe beruhen, sind vielfältig; dazu zählen die differenziellen Hybridisierung, die Erstellung von Subtraktions-cDNA-Banken ("representational difference analysis"; Hubank und Schatz, 1994; Diatchenko et al., 1996) und der Einsatz der DNA-Chip- Technologie oder der SAGE-Methode (Velculescu et al., 1995). Im Gegensatz zur oben erwähnten immunologischen Methode mit Hilfe von Patienten-CTLs muß beim Einsatz von molekularbiologischen Methoden gezeigt werden, daß die damit gefundenen potentiellen Antigenkandidaten tumorspezifisch (tumorassoziiert) sind und tatsächlich T-Zell Epitope besitzen, die eine zytotoxische T-Zell Antwort auslösen können. In zumindest einem Fall (NY-ESO/LAGE-1) wurde ein Antigen sowohl durch die Verwendung von Patientenseren als auch durch RDA identifiziert (Chen et al., 1997; Lethe et al. 1998), außerdem wurden CTL-Epitope dieses Antigens und eine gleichzeitige spontane humorale und T-Zell-Antwort in einem Patienten beschrieben (Jager et al., 1998).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein neues tumorassoziiertes Antigen (TAA) bereitzustellen.

Diese Aufgabe wurde gelöst, indem zunächst mittels RDA ("representational difference analysis") zwischen Nierenzellkarzinom- und Normalnierengewebe eine cDNA- Substraktionsbibliothek hergestellt und diese mit einer testis-spezifischen cDNA-Bibliothek hybridisiert wurde, um Antigene vom Tumor/Testis-Typ zu selektionieren.

Die erhaltenen cDNA-Klone wurden sequenziert und mit in Datenbanken verfügbaren Sequenzen verglichen. Unter den dabei identifizierten Genen befanden sich 29 unbekannte, zu denen ESTs ("expressed sequence tags")- Einträge in der Datenbank existierten. Von diesen Genen wurden jene 16 näher untersucht, deren ESTs nicht aus kritischem Normalgewebe stammen. Mittels RT-PCR wurde festgestellt, daß fünf der sechzehn untersuchten Klone eine deutliche Überexpression in einem Nierenzellkarzinom gegenüber Normalnierengewebe aufweisen. Der quantitative Vergleich (mittels PCR) der Expression eines der Klone (9D7) zwischen Tumor- und Normalgewebe zeigte eine deutliche Überexpression der 9D7-cDNA im Tumor. Das mittels Northern Blot analysierte Expressionsprofil zeigte ergänzend, daß 9D7 in den untersuchten Normalgeweben keine oder nur eine schwache Transkription aufwies. Die in situ Hybridisierung von Nierenzellkarzinom und Normalnierengewebe mit einer 9D7-spezifischen markierten RNA-Sonde bestätigte die mittels RT-PCR, quantitativer PCR und Northern Blot erhaltenen Ergebnisse.

Die humane 9D7-cDNA wurde vollständig kloniert, die erhaltene Sequenz ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt. Die Sequenz von 9D7 zeigt, auf Nukleotid- und Proteinebene, eine hohe Homologie zu SM20, einem durch Wachstumsfaktoren in Zellen der glatten Muskulatur der Ratte induzierten "immediate early gene", das als spezifischer Marker für Zellen der glatten Aorta- Muskulatur beschrieben wurde (Wax et al. 1994, 1996). Die Sequenzanalyse der humanen 9D7-cDNA im Vergleich mit SM20 ergab, daß die ersten 323 bp eine deutlich geringere Identität als der Rest der cDNA aufweisen (40% im Vergleich zu 96% auf Ebene der abgeleiteten Aminosäuresequenz). Da die humane cDNA an dem Übergang zwischen hoher und geringerer Identität mit SM20 an Position 324 das erste ATG aufweist, ist anzunehmen, daß es sich dabei um das Startcodon des humanen 9D7-Gens handelt. Da die von Position 324 stromaufwärts liegende Sequenz ebenfalls einen durchgängigen Leserahmen aufweist, der, wenn auch geringere, so doch signifikante Identität mit SM20 zeigt (40% auf der Ebene der abgeleiteten Aminosäuresequenz), ist nicht auszuschließen, daß ein Startcodon weiter stromaufwärts vorhanden ist.

Die Information über die weiter stromaufwärts liegende Sequenz kann durch molekularbiologische Standardmethoden gewonnen werden, z. B. mittels 5'-RACE ("rapid amplification of cDNA ends"). Bei dieser Methode wird RNA, vorzugsweise mRNA, aus Zellen oder Geweben, in denen 9D7 transkribiert wird (z. B. RCC Gewebe oder von RCC abgeleitete Zellinien wie 786-0, siehe Beispiel 8) revers transkribiert und anschließend mit einem Adaptor bekannter Sequenz ligiert. Eine PCR mit einem Adaptorprimer (bindet spezifisch an den Adaptor am 5'-Ende der cDNA) und einem 9D7-spezifischen Primer (z. B. SEQ ID NO: 21, 19, 17, 16, 14, 12, 11, 4) erlaubt die Amplifikation entsprechender 9D7-Fragmente. Diese PCR-Produkte können, wie in Beispiel 1 beschrieben, nach Standardmethoden kloniert und, insbesondere durch DNA Sequenzierung, charakterisiert werden.

Eine alternative Methode zur Charakterisierung des 5'-Endes ist das Screenen von cDNA-Bibliotheken durch Hybridisierung mit für 9D7 spezifischen DNA-Sonden oder Antiseren.

Führt das Screenen von cDNA-Bibliotheken aufgrund methodisch bedingter Beschränkungen, z. B. ineffiziente reverse Transkription bedingt durch ausgeprägte Sekundärstrukturen der RNA, nicht zum gewünschten Ziel, können genomische Bibliotheken untersucht werden, indem z. B., wie beim Screenen von cDNA-Bibliotheken, durch Hybridisierung mit für 9D7 spezifischen DNA-Sonden Klone isoliert werden können, die die stromaufwärts vom erhaltenen 5'-Ende der cDNA liegende Sequenzinformation z. B. die Promotorregion von 9D7 enthalten.

Die isolierte cDNA kodiert für das tumorassoziierte Antigen (TAA) der Bezeichnung 9D7 mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz. Diese Sequenz wird definiert durch das Startcodon an Position 324 der isolierten 9D7-cDNA.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt das tumorassoziierte Antigen der Bezeichnung 9D7 mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz.

Die in SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz kann Abweichungen aufweisen, z. B. solche, die durch konservativen Austausch von Aminosäuren bedingt sind, sofern das 9D7-Derivat die für die Anwendung in einer Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften aufweist.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Polypeptid, das die 9D7-Sequenz als Teilsequenz enthält. Dieses Polypeptid weist gegenüber der in SEQ ID NO: 2 angegebenen 9D7-Sequenz eine Verlängerung am N-terminalen Ende auf, seine Sequenz wird definiert durch ein gegebenenfalls in V-Richtung stromaufwärts von Position 324 gelegenes Startcodon der 9D7-cDNA.

Die Aminosäuresequenz (bzw. entsprechend die Sequenz der 9D7-cDNA) kann gegebenenfalls modifiziert sein, indem einzelne Aminosäuren in einem 9D7 CTL-Epitop ausgetauscht werden, um, im Vergleich zum natürlichen 9D7 CTL-Epitop, eine Steigerung der Affinität von 9D7-Peptiden zu MHC-I-Molekülen und damit eine erhöhte Immunogenität und letztlich eine verstärkte Reaktivität gegenüber Tumoren zu bewirken. Modifikationen im Bereich der 9D7-Epitope können am 9D7-Gesamtprotein (dieses wird von den APCs zu den entsprechenden Peptiden prozessiert) bzw. an größeren 9D7-Proteinfragmenten oder an 9D7-Peptiden (vgl. unten) vorgenommen werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung immunogene Fragmente und Peptide, die von 9D7 abgeleitet sind. Letztere werden im folgenden als "9D7-Peptide" bezeichnet. Eine erste Gruppe sind 9D7-Peptide, die eine humorale Immunantwort (Induktion von Antikörpern) auslösen. Derartige Peptide sind ausgewählte Abschnitte von 9D7 (mindestens 12 bis 15 Aminosäuren), die mittels sogenannter Vorhersage- Algorithmen ("prediction algorithms") wie z. B. dem "surface probability blot" (Emini et al., 1985), dem "hydrophobicity blot" (Kyte and Doolittle, 1982) und dem "antigenic index" (Jameson and Wolf, 1988) ermittelt werden können.

9D7-Peptide werden direkt oder in modifizierter Form (z. B. an KLH = "keyhole limpet hemocyanine" gekoppelt) verabreicht und die Bildung von Antikörpern mittels gängiger immunologischer Assays, z. B. mittels ELISA, bestimmt.

Weitere, im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte, 9D7-Peptide sind diejenigen, die durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort bewirken. Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, nämlich MHC-I-Moleküle, die von CD8-positiven CTLs und MHC-II-Moleküle, die von CD4-positiven T-Helferzellen erkannt werden.

Damit ein Peptid eine zelluläre Immunantwort auslöst, muß es an ein MHC-Molekül binden; wobei der zu -Molekül in seinem Repertoire aufweisen muß. Die Bestimmung des MHC-Subtyps des Patienten stellt somit, im Hinblick auf die Auslösung einer zellulären Immunantwort, eine der wesentlichen Voraussetzungen für die wirksame Anwendung eines Peptids an diesem Patienten dar.

Die Sequenz eines therapeutisch einzusetzenden Peptids wird durch das jeweilige MHC-Molekül hinsichtlich Ankeraminosäuren und Länge vorgegeben. Definierte Ankerpositionen und Länge gewährleisten, daß ein Peptid in die Peptid-Bindungsfurche des jeweiligen MHC-Moleküls des Patienten paßt. Dies hat zur Folge, daß das Immunsystem stimuliert wird und eine zelluläre Immunreaktion erzeugt wird, die sich, im Falle der Verwendung eines von einem Tumorantigen abgeleiteten Peptids, gegen die Tumorzellen des Patienten richtet.

Immunogene 9D7-Peptide können nach bekannten Methoden identifiziert werden, eine der Grundlagen dafür ist die Beziehung zwischen MHC-Bindung und CTL-Induktion.

Da also die Sequenz immunogener Peptide aufgrund ihres Peptidbindungsmotivs vorherbestimmbar ist, können 9D7-Peptide, die CTL-Epitope darstellen, aufgrund der 9D7-Proteinsequenz identifiziert und synthetisiert werden. Dazu sind verschiedene Methoden geeignet, die zur Identifizierung von CTL-Epitopen von bekannten Protein-Antigenen verwendet wurden; z. B. die von Stauss et al., 1992, für die Identifizierung von T-Zell- Epitopen in humanem Papillomavirus beschriebene Methode.

Die allelspezifischen Anforderungen jedes MHC-I-Allel- Produkts an ein Peptid, das an das MHC-Molekül bindet und von diesem präsentiert wird, wurden als Motiv zusammengefaßt (z. B. Falk et al., 1991). Bisher ist eine große Anzahl sowohl von MHC-Peptid-Motiven als auch von MHC-Liganden bekannt. Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Suche nach Epitopen eines bekannten Proteins, das in ein bestimmtes MHC-I-Molekül paßt, wurde in einem Übersichtsartikel von Rammensee et al., 1995, beschrieben. Sie umfaßt die folgenden Schritte:
zunächst wird die Protein-Sequenz auf Abschnitte untersucht, die dem Anker-Motiv entsprechen, wobei gewisse Variationen hinsichtlich Peptidlänge und Ankerbesetzung möglich sind. Wenn z. B. ein Motiv ein 9-mer mit Ile oder Leu am Ende vorschreibt, können auch 10-mere mit einem entsprechenden C-Terminus in Betracht gezogen werden, ebenso Peptide mit anderen aliphatischen Resten, wie Val oder Met am C-Terminus. Auf diese Weise wird eine Reihe von Peptid-Kandidaten erhalten. Diese werden auf das Vorhandensein möglichst vieler Ankerreste, die sie gemeinsam mit bereits bekannten Liganden haben, untersucht und/oder daraufhin, ob sie für verschiedene MHC-Moleküle "bevorzugte" Reste haben (entsprechend der Tabelle von Rammensee et al., 1995). Um schwach bindende Peptide auszuschließen, werden zweckmäßig Bindungs-Assays durchgeführt. Wenn die Anforderungen an die Peptid- Bindung für bestimmte MHC-Moleküle bekannt sind, können die Peptid-Kandidaten auch auf Nicht-Ankerreste untersucht werden, die sich negativ oder positiv auf die Bindung auswirken, oder die diese erst ermöglichen (Ruppert et al., 1993). Bei dieser Vorgangsweise ist jedoch in Betracht zu ziehen, daß das Peptid-Bindungs- Motiv für die Suche nach natürlichen Liganden nicht allein ausschlaggebend ist; auch andere Aspekte, z. B. die Enzymspezifität während der Antigenprozessierung, tragen - zusätzlich zur Spezifität der MHC-Bindung - zur Identität des Liganden bei. Eine Methode, die diese Aspekte berücksichtigt, und die im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von immunogenen 9D7-Peptiden geeignet ist, wurde u. a. von Kawakami et al., 1995, angewendet, um auf der Grundlage bekannter HLA-A*0201 Motive gp100 Epitope zu identifizieren.

Die Peptide können auch im Hinblick auf ihre Bindungsfähigkeit an MHC-II-Moleküle ausgewählt werden.

Das MHC-II-Bindungsmotiv, das sich über neun Aminosäuren erstreckt, weist einen höheren Grad an Degeneration in den Ankerpositionen auf als das MHC-I- Bindungsmotiv. Es wurden kürzlich, ausgehend von der Röntgenstrukturanalyse von MHC-II-Molekülen, Methoden entwickelt, die die genaue Analyse der MHC-II- Bindungsmotive, und ausgehend davon, Variationen der Peptidsequenz erlauben (Rammensee et al., 1995, und die dort zitierte Originalliteratur). Peptide, die an MHC-II-Moleküle binden, werden den CD4-T-Zellen typischerweise von dendritischen Zellen, Makrophagen oder B-Zellen präsentiert. Die CD4-T-Zellen wiederum aktivieren dann in der Folge direkt CTLs durch z. B. Cytokin-Ausschüttung und Verstärken die Effizienz der Antigen-Präsentation durch APC (dendritische Zellen, Makrophagen und B-Zellen).

Seit kurzem sind Datenbanken und Vorhersage-Algorithmen verfügbar, die mit großer Verläßlichkeit die Vorhersage von Peptid-Epitopen erlauben, die an ein bestimmtes MHC-Molekül binden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden, unter Verwendung des von Parker et al., 1994, beschriebenen Algorithmus, für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, daß sie an die entsprechenden HLA- Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstellen; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 3 aufgelistet. Auf ähnliche Weise können, gegebenenfalls unter Verwendung weiterer Algorithmen, die den unterschiedlichen Charakteristika der Peptide (Hydrophobizität, Ladung, Größe) bzw. Anforderungen an die Peptide, z. B. die 3D-Struktur des HLA-Moleküls, Rechnung tragen, weitere potentielle Peptid-Epitope für andere HLA-Typen ermittelt werden.

Nach Auswahl von 9D7-Peptid-Kandidaten mit Hilfe der angeführten Methoden wird deren MHC-Bindung mittels Peptidbindungs-Assays getestet. Als nächstes wird die Immunogenität der Peptide mit guten Bindungseigenschaften bestimmt (Stabilität der Peptid- MHC-Wechselwirkung korreliert in den meisten Fällen mit Immunogenität; von der Burg et al., 1996). Um die Immunogenität des ausgewählten Peptids oder Peptid- Äquivalents zu bestimmen, können Methoden, wie z. B. von Sette et al., 1994, beschrieben, in Kombination mit quantitativen MHC-Bindungs-Assays verwendet werden. Alternativ kann die Immunogenität des ausgewählten Peptids über in vitro-CTL-Induktion mittels bekannter Methoden (wie weiter unten für ex-vivo-CTL-Induktion beschrieben) getestet werden. Das Prinzip der in mehreren Schritten durchgeführten Methode für die Auswahl von Peptiden, die zur Auslösung einer zellulären Immunantwort fähig sind, ist in der WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird, beschrieben. Eine allgemeine Strategie zum Erhalt effizienter immunogener Peptide, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wurde außerdem von Schweighoffer, 1997, beschrieben.

Statt die Originalpeptide zu verwenden, die in die Bindungsfurche von MHC-I -oder MHC-II-Molekülen passen, also Peptide, die unverändert von 9D7 abgeleitet sind, können anhand der auf der Grundlage der Originalpeptidsequenz angegebenen Minimalanforderungen bezüglich Ankerpositionen und Länge Variationen vorgenommen werden, sofern durch diese Variationen die effektive Immunogenität des Peptids, die sich zusammensetzt aus seiner Bindungsaffinität an das MHC-Molekül und seiner Fähigkeit, T-Zell-Rezeptoren zu stimulieren, nicht nur nicht beeinträchtigt ist, sondern vorzugsweise verstärkt wird. In diesem Fall werden also künstliche Peptide oder Peptid-Äquivalente verwendet, die entsprechend den Anforderungen der Bindungsfähigkeit an ein MHC-Molekül entworfen sind.

Solchermaßen veränderte Peptide werden als "heteroclitische Peptide" bezeichnet. Sie können nach folgenden Methoden erhalten werden:
Zunächst werden die Epitope von MHC-I- bzw. MHC-II- Liganden bzw. deren Variation z. B. nach dem von Rammensee et al., 1995, beschriebenen Prinzip vorgenommen. Die Länge des Peptids entspricht im Falle seiner Abstimmung auf MHC-I-Moleküle vorzugsweise einer Minimalsequenz von 8 bis 10 Aminosäuren mit den erforderlichen Ankeraminosäuren.

Gegebenenfalls kann das Peptid auch am C- und/oder am N-Terminus verlängert sein, sofern diese Verlängerung die Bindungsfähigkeit an das MHC-Molekül nicht beeinträchtigt bzw. das verlängerte Peptid auf die Minimalsequenz zellulär prozessiert werden kann.

Die modifizierten Peptide werden daraufhin auf ihre Erkennung durch TILs (tumor-infiltrating lymphocytes, auf CTL-Induktion sowie auf verstärkte MHC-Bindung und Immunogenität geprüft, wie von Parkhurst et al., 1996, und Becker et al., 1997, beschrieben.

Eine weitere im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignete Methode zur Auffindung von Peptiden mit stärkerer Immunogenität als die der natürlichen 9D7-Peptide besteht im Screenen von Peptid-Bibliotheken mit CTLs, die die natürlich auf Tumoren vorkommenden 9D7-Peptide erkennen, wie von Blake et al., 1996, beschrieben; in diesem Zusammenhang wird die Verwendung kombinatorischer Peptid-Bibliotheken vorgeschlagen, um Moleküle zu entwerfen, welche von MHC-I-restringierten CTLs erkannte Tumorepitope nachahmen.

Die 9D7-Polypeptide der vorliegenden Erfindung oder davon abgeleitete immunogene Fragmente oder Peptide können rekombinant oder mittels Peptid-Synthese hergestellt werden, wie in der WO 96/10413 beschrieben, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird. Für die rekombinante Herstellung wird das entsprechende DNA-Molekül nach Standardmethoden in einen Expressionsvektor eingefügt, in eine geeignete Wirtszelle transfiziert, der Wirt unter geeigneten Expressionsbedingungen kultiviert und das Protein gereinigt. Für die chemische Synthese von 9D7-Peptiden können herkömmliche Methoden verwendet werden, z. B. im Handel erhältliche automatische Peptid-Synthesizer.

Alternativ zu natürlichen 9D7-Peptiden oder heteroclitischen Peptiden können Substanzen, die solche Peptide vortäuschen, z. B. "Peptidomimetica" oder "retro­ inverse-Peptide", verwendet werden. Zur Testung dieser Moleküle im Hinblick auf die therapeutische Verwendbarkeit in einer Tumorvakzine werden dieselben Methoden angewendet wie oben für die natürlichen 9D7-Peptide oder 9D7-Peptidäquivalente.

Das TAA der Bezeichnung 9D7 gemäß der vorliegenden Erfindung und die davon abgeleiteten Proteinfragmente, Peptide bzw. Peptid-Äquivalente oder Peptidomimetika können in der Krebstherapie eingesetzt werden, z. B. um eine Immunantwort gegen Tumorzellen zu induzieren, die die entsprechenden Antigen-Determinanten exprimieren. Vorzugsweise werden sie für die Therapie von Tumoren mit starker 9D7-Expression verwendet, insbesondere beim Nierenzell-, Lungen-, Kolon- und Mammakarzinom sowie beim Hodgkin-Lymphom.

Die Immunantwort in Form einer Induktion von CTLs kann in vivo oder ex vivo bewirkt werden.

Für die in-vivo-Induktion von CTLs wird eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend als wirksame Komponente das TAA 9D7 bzw. bzw. davon abgeleitete Fragmente oder Peptid(e), einem Patienten verabreicht, der an einer mit dem TAA assoziierten Tumorerkrankung leidet, wobei die Menge an TAA(Peptid) ausreichen muß, um eine wirksame CTL-Antwort auf den Antigen-tragenden Tumor zu erzielen.

Die Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung. Vorzugsweise dient die Zusammensetzung der parenteralen Verabreichung, z. B. für die subkutane, intradermale oder intramuskuläre Anwendung. Die 9D7-TAAs/Peptide sind in einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise wässerigen, Träger gelöst oder suspendiert. Die Zusammensetzung kann außerdem übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, etc. enthalten. Die TAAs/Peptide können allein oder in Kombination mit Adjuvantien, z. B. inkomplettem Freunds Adjuvans, Saponinen, Aluminiumsalzen oder, in einer bevorzugten Ausführungsform, Polykationen wie Polyarginin oder Polylysin, verwendet werden. Die Peptide können auch an Komponenten, die die CTL-Induktion oder CTL-Aktivierung unterstützen, gebunden werden, z. B. an T-Helferpeptide, Lipide oder Liposomen, oder sie werden gemeinsam mit diesen Substanzen und/oder gemeinsam mit immunstimulierenden Substanzen, z. B. Zytokinen (IL-2, IFN-γ) verabreicht. Methoden und Formulierungen, die zur Herstellung und Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung geeignet sind, sind in der WO 95/04542 und WO 97/30721, auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird, beschrieben.

9D7(Fragmente) bzw. 9D7-Peptide können auch verwendet werden, um eine CTL-Antwort ex vivo auszulösen. Eine ex- vivo-CTL-Antwort auf einen Tumor, der 9D7 exprimiert, wird induziert, indem man die CTL-Vorläuferzellen zusammen mit APCs und 9D7-Peptiden bzw 9D7-Protein inkubiert. Dann läßt man die aktivierten CTLs expandieren, worauf sie dem Patienten wieder verabreicht werden. Alternativ können APCs mit 9D7-Peptiden beladen werden, was zu einer effizienten Aktivierung zellulärer Immunreaktionen gegen 9D7 positive Tumoren führen kann (Mayordomo et al., 1995; Zitvogel et al., 1996). Eine geeignete Methode um Peptide auf Zellen, z. B. dendritische Zellen, zu laden, wird in der WO 97/19169 geoffenbart.

In einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Kombination mehrerer verschiedener 9D7-Peptide oder 9D7-Peptidäquivalente angewendet. In einer weiteren Ausführungsform werden 9D7-Peptide mit von anderen TAAs abgeleiteten Peptiden kombiniert. Die Auswahl von Peptiden für derartige Kombinationen wird im Hinblick auf die Erfassung unterschiedlicher MHC-Typen getroffen, um eine möglichst breite Patientenpopulation abzudecken, und/oder sie wird auf ein möglichst breites Indikationsspektrum abgestellt, indem Peptide mehrerer unterschiedlicher Tumorantigene kombiniert werden. Die Anzahl der Peptide in einer pharmazeutischen Zusammensetzung kann über einen weiten Bereich schwanken, typischerweise enthält eine klinisch anwendbare Vakzine 1 bis 15, vorzugsweise 3 bis 10 verschiedene Peptide.

Die erfindungsgemäßen Peptide können auch als diagnostische Reagentien eingesetzt werden.

Beispielsweise können die Peptide dazu benutzt werden, um das Ansprechen eines Patienten auf die durch das immunogene Peptid hervorgerufene humorale oder zelluläre Immunantwort zu testen. Dadurch besteht die Möglichkeit, ein Behandlungsprotokoll zu verbessern. Beispielsweise kann in Abhängigkeit der Darreichungsform (Peptid, Gesamtprotein oder DNA-Vakzine) des TAA die Zunahme von Vorläufer T-Zellen in den PBLs, die eine Reaktivität gegen das definierte Peptidepitop aufweisen, untersucht werden (Robbins und Kawakami, 1996 sowie darin zitierte Referenzen). Außerdem können die Peptide oder das Gesamtprotein bzw. gegen das TAA gerichtete Antikörper dazu verwendet werden, um das Risiko eines Patienten an einem 9D7-assoziierten Tumor zu erkranken, vorherzusagen bzw. den Krankheitsverlauf eines 9D7-positiven Tumors zu charakterisieren (z. B. durch immunhistochemische Analysen von Primärtumor und Metastasen). Eine derartige Strategie hat sich schon mehrfach als erfolgreich erwiesen, z. B. der Nachweis des Östrogenrezeptors als Entscheidungsgrundlage zur Endokrintherapie bei Brustkrebs; c-erbB-2 als relevanter Marker bei Prognostik und Therapieverlauf bei Brustkrebs (Raviaioli et al., 1998; Revillion et al., 1998); PSMA ("prostate specific membrane antigen") als Marker für Epithelialzellen des Prostatakarzinoms im Serum bzw. durch Einsatz eines ¹¹¹In-markierten monoklonalen Antikörpers gegen PSMA bei der Immunoscintigraphie auf Prostatakarzinom (Murphy et al., 1998 und inkludierte Referenzen); CEA ("carcinoembryonic antigen") als serologischer Marker für die Prognose und Verlauf bei Patienten des kolorektalen Karzinoms (Jessup und Loda, 1998).

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt isolierte DNA-Moleküle, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften von 9D7 oder für Fragmente davon.

Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes DNA-Molekül, das ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz enthält oder das ein Polynukleotid enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

Das erfindungsgemäße DNA-Molekül bzw. Fragmente davon kodieren für ein immunogenes (Poly)peptid der Bezeichung 9D7 mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide; damit sind DNA Moleküle mitumfaßt, die durch die Degeneration des genetischen Codes Abweichungen von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch DNA-Moleküle, die durch konservativen Austausch von Aminosäuren bedingte Abweichungen von der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz aufweisen, sofern sie für ein 9D7-Derivat bzw. Fragmente oder Peptide mit den für die Anwendung als Tumorvakzine erwünschten immunogenen Eigenschaften kodieren.

Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können, im Vergleich zu dem in SEQ ID NO: 1 dargestellten Molekül, am 5'-Ende bis zu einem gegebenenfalls stromaufwärts von Position 324 gelegenen Startcodon verlängert sein.

Die 9D7-DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung oder die entsprechenden RNAs, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, werden, wie die davon kodierten (Poly)Peptide, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen eingesetzt.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden DNA-Moleküle, kodierend für das natürliche 9D7 verwendet. Alternativ zur natürlichen 9D7-cDNA bzw. Fragmenten davon können modifizierte Derivate verwendet werden. Diese umfassen Sequenzen mit Modifikationen, die für ein Protein(fragment) bzw. Peptide mit stärkerer Immunogenität kodieren, wobei für die Modifikationen auf DNA-Ebene dieselben Überlegungen gelten wie für die oben beschriebenen Peptide. Eine weitere Art der Modifikation ist die Aneinanderreihung zahlreicher Sequenzen, kodierend für immunologisch relevante Peptide, nach Art einer Perlenschnur ("string-of-beads"; Toes et al., 1997). Die Sequenzen können auch durch Anfügung von Hilfselementen modifiziert werden, z. B. Funktionen, die eine effizientere Abgabe und Prozessierung des Immunogens gewährleisten (Wu et al., 1995). Beispielsweise kann durch Anfügen einer Lokalisierungssequenz in das endoplasmatische Retikulum ("ER targetting sequence") die Prozessierung und damit die Präsentation und letztlich die Immunogenität des Antigens erhöht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt ein rekombinantes DNA-Molekül, das 9D7-DNA enthält.

Die DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können, vorzugsweise in rekombinanter Form als Plasmide, direkt oder als Bestandteil eines rekombinanten Virus, oder Bakteriums verabreicht werden. Prinzipiell kann jede gentherapeutische Methode für die Immuntherapie von Krebs auf Basis von DNA ("DNA-Vakzine") auf 9D7-DNA angewendet werden, und zwar sowohl in vivo als auch ex vivo.

Beispiele für die in-vivo-Verabreichung sind die direkte Injektion von "nackter" DNA, entweder intramuskulär oder mittels Gen-Pistole ("gene gun") von der sich gezeigt hat, daß sie zur Bildung von CTLs gegen Tumorantigene führt. Beispiele für rekombinante Organismen sind Vaccinia Virus, Adenovirus oder Listeria monocytogenes (eine Übersicht wurde von Coulie, 1997, gegeben). Desweiteren können synthetische Träger für Nukleinsäuren, wie kationische Lipide, Mikrosphären, Mikrokügelchen oder Liposomen für die in vivo Verabreichung von Nukleinsäure-Molekülen, kodierend für 9D7-Peptid verwendet werden. Ähnlich wie für Peptide können verschiedene Hilfsstoffe, die die Immunantwort verstärken, mitverabreicht werden, z. B. Zytokine, entweder in Form von Proteinen oder dafür kodierenden Plasmiden. Die Applikation kann gegebenenfalls mit physikalischen Methoden, z. B. Elektroporation, kombiniert werden.

Ein Beispiel für die ex-vivo-Verabreichung ist die Transfektion dendritischer Zellen, wie von Tuting, 1997, beschrieben, oder anderer APCs, die als zelluläre Krebsvakzine zur Anwendung kommen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit in einem weiteren Aspekt die Verwendung von Zellen, die 9D7 exprimieren, entweder von sich aus oder, in gegebenenfalls modifizierter Form, nach Transfektion mit der entsprechend kodierenden Sequenz, für die Herstellung einer Krebsvakzine.

Die Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt Antikörper gegen 9D7 bzw. Fragmente davon. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, mittels Injektion des Antigens bzw. Fragmenten davon, und anschließender Reinigung des Immunglobulins erhalten werden.

Monoklonale anti-9D7-Antikörper können nach Standardprotokollen gemäß dem von Köhler und Milstein, 1975, beschriebenen Prinzip gewonnen werden, indem Tiere, insbesondere Mäuse, immunisiert, anschließend antikörperproduzierende Zellen der immunisierten Tiere immortalisiert werden, z. B. durch Fusion mit Myelomzellen, und der Überstand der erhaltenen Hybridome mittels immunologischer Standard-Assays auf monoklonale anti-9D7-Antikörper gescreent wird. Für den therapeutischen oder diagnostischen Einsatz im Menschen können diese tierischen Antikörper gegebenenfalls auf herkömmliche Weise chimerisiert (Neuberger et al., 1984, Boulianne et al., 1984) oder humanisiert (Riechmann et al., 1988, Graziano et al., 1995) werden.

Humane monoklonale anti-9D7-Antikörper(fragmente) können auch von sog. "Phage Display Libraries" (Winter et al., 1994, Griffiths et al., 1994, Kruifet al., 1995, Mc Guiness et al., 1996) und mittels transgener Tiere (Brüggemann et al., 1996, Jakobovits et al., 1995) gewonnen werden.

Die erfindungsgemäßen anti-9D7-Antikörper können in immunhistochemischen Analysen für diagnostische Zwecke eingesetzt werden.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von 9D7-spezifischen Antikörpern, um beliebige Substanzen selektiv zu bzw. in einen Tumor zu bringen, der 9D7 exprimiert. Beispiele für solche Substanzen sind zytotoxische Agentien oder radioaktive Nuklide, deren Wirkung darin besteht, den Tumor vorort zu schädigen. Aufgrund der tumorspezifischen Expression von 9D7 sind dabei keine oder nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten. In einem weiteren Aspekt können mit Hilfe von 9D7-Antikörpern Substanzen zur Sichtbarmachung von Tumoren, die 9D7 exprimieren, herangezogen werden. Dies ist für die Diagnose und die Bewertung des Therapieverlaufs von Nutzen.

Therapeutische und diagnostische Anwendungen von Antikörpern, die für anti-9D7-Antikörper in Frage kommen, sind in der WO 95/33771 für beschrieben.

Figurenübersicht

Fig. 1 Transkription von 9D7 in Normalgeweben und RCC:
Semiquantitative RT-PCR von RNA aus Nieren, Herz, Leukozyten, Leber, Lunge, Testis und vier Nierenzellkarzinomen,

Fig. 2 Transkription von 9D7 in Normalgeweben:
Northern Blot Analyse von mRNA aus 16 Normalgeweben,

Fig. 3 in-situ-Hybridisierung von 9D7-RNA mit Nierenzellkarzinom- und Normalnierengewebeschnitten.

Beispiel 1 RDA (Representational Difference Analysis) von Nierenzellkarzinom und Normalnierengewebe

Biopsien von humanen Nierenzellkarzinomen vom klarzelligen Typ (RCC, renal cell carcinoma) sowie normales Nierengewebe vom selben Patient wurden sofort nach der chirurgischen Entfernung in flüssigem N₂ schockgefroren und bei -80° gelagert. Für die Isolierung von RNA wurden serielle 20-µm- Schnitte bei -20° in einem Kryomikrotom (Jung CM1800, Leica) angefertigt und direkt in 4 M Guanidiniumthiocyanat/­ 1% β-mercaptoethanol aufgelöst. Diese Probe wurde einer Ultrazentrifugation über einen CsCl-Gradienten unterworfen (Sambrook, 1989). Ausgehend von 60 µg total-RNA aus dem Nierenzellkarzinom RCC6 und 350 µg total-RNA aus der autologen Normalniere N6 sowie eines weiteren Normalnierengewebes (N3) wurde RDA (Diatchenko et al.,; Hubank and Schatz,) unter Verwendung des PCR-select^TM kit (Clontech, Palo Alto) entsprechend dem Hersteller-Protokoll durchgeführt: dabei wurde RNA von RCC ("tester") und normalem Nierengewebe ("driver") für die Isolierung von poly-A(+)RNA mittels des PolyATtract Kit (Promega) entsprechend dem Hersteller-Protokoll verwendet. Nach der Synthese von doppelsträngiger cDNA mittels oligo-dT wurde diese mit RsaI verdaut. Gleiche Teile von "tester-cDNA" wurden entweder mit den Adaptoren A oder B ligiert und anschließend getrennt mit einem Überschuß an "driver-cDNA" bei 65°C hybridisiert. Danach wurden die beiden Ansätze vereinigt und einer zweiten Hybridisierung mit frischer denaturierter "driver-cDNA" unterworfen. Die angereicherten "tester"-spezifischen cDNAs wurden anschließend durch PCR mit für die Adaptoren A bzw. B spezifischen Primern exponentiell amplifiziert. Für eine weitere Anreicherung wurde ein Aliquot dieser Reaktion einer zweiten PCR mit spezifischen nach innen versetzten ("nested") Primern unterworfen. Das aus dieser Reaktion resultierende Produkt wurde in den pCRII-Vektor (Invitrogen) ligiert und anschließend in kompetente E. coli (OneShot™, Invitrogen) transfiziert. 1920 positive Transformanten (Blau-Weiß-Selektion) wurden in 96-Napf-Blöcken in LB-Anip-Medium für 24-48 h bei 37C kultiviert. 200 µl Aliquots der E. coli- Suspensionen wurden für 10 Minuten auf 100°C erhitzt. Nach kurzem Abzentrifugieren der Bakterienreste wurden 140 µl klarer Überstand (~ 1 µg Plasmid-DNA) in 60 µl 20 × SSC aufgenommen und auf äquilibrierten Nylonmembranen (Hybond-N, Amersham) entsprechend den Standardmethoden zur Herstellung von DNA-Dot-Blots immobilisiert (Sambrook, 1989). Die verbleibenden Bakterienkulturen wurden als Gycerinstammkulturen bei -80°C gelagert.

Es wurde eine cDNA-Subtraktionsbibliothek aus 1920 Einzelklonen erhalten, die sowohl als E.-coli-Glycerin- Stammkulturen als auch als immobilisierte Plasmide auf DNA-Dot-Blots vorlagen.

Beispiel 2 Selektion von "Tumor-Testis"-Antigenen durch Hybridisierung der cDNA-Subtraktionsbibliothek mit einer Testis-spezifischen cDNA-Bibliothek

"Human Testis-Specific PCR-Select™ cDNA" (Clontech, Palo Alto) wurde entsprechend den Herstellerangaben mittels 11 Zyklen PCR amplifiziert. Aliquots wurden nach der "random priming"-Methode (HiPrime Kit, Boehringer Mannheim) mit [α-³²P]dCTP (NEN, Boston) markiert und nach Standardvorschriften (Sambrook, 1989) unter stringenten Bedingungen (65°C) mit den unter Beispiel 1 beschrieben DNA-Dot-Blots hybridisiert. Klone, die mit der "Human Testis-Specific PCR-Select™ cDNA" hybridisieren, wurden mittels Standard- Autoradiografie (Xomat DR film, Kodak) visualisiert. Das Ergebnis von Beispiel 2 erlaubte die Auswahl von 150 Klonen, die vorwiegend im Nierenzellkarzinom RCC6 und in Testis transkribiert werden. Diese Klone sind Kandidaten für die Klasse der "Tumor-Testis"-Antigene.

Beispiel 3 DNA-Sequenzierung und Annotation von "Tumor-Testis" Antigen-Kandidaten

Plasmid-DNA von 62 Klonen, die aufgrund der Beispiel 2 erhaltenen Ergebnisse ausgewählt worden waren, wurde entsprechend den Herstellerangaben (QIAgen) isoliert und nach der Sanger-Methode auf einem ABI-Prism Gerät sequenziert. Die so ermittelten Sequenzen wurden mittels der BioWorkBench-Software (GeneData, Basel) annotiert und Datenbankvergleichen (Genbank) unterzogen. Das erlaubte die Identifizierung von 33 bekannten und 29 unbekannten Genen. Für letztere existierten lediglich EST-Einträge. Bekannte Gene wurden nicht weiter behandelt. Für die 29 unbekannten Gene wurde eine Abschätzung des Expressionsprofils vorgenommen: dabei wurde für alle in Datenbanken ESTs mit < 95% Identität (BLAST) zur experimentell ermittelten Sequenz das Ausgangsgewebe für die entsprechende cDNA-Bibliothek überprüft. Es wurde eine Unterteilung in i) kritische Normalgewebe, ii) foetale, "verzichtbare" und immunprivilegierte Gewebe und iii) Tumore und Zellinien vorgenommen. Auf der Basis dieses "virtuellen mRNA-Profils" wurden 16 Klone, für die keine ESTs in der Gruppe i) gefunden wurden, für eine weitere experimentelle Analyse ausgewählt.

Beispiel 4 Transkriptionelle Analyse der Kandidaten-Klone in Nierenzellkarzinom und Normalniere

Zwischen 2 und 5 µg total-RNA aus Tumor- oder Normalgeweben wurden mittels SuperscriptII (Gibco) oder AMV-RT (Promega) entsprechend den Hersteller­ empfehlungen revers transkribiert. Für jede individuelle RNA-Probe wurde ein zweiter Ansatz ohne reverse Transkriptase als Kontrolle für Kontamination durch chromosomale DNA durchgeführt. Alternativ wurden Plasmid-cDNA-Bibliotheken aus humanem Herz, Leukozyten, Niere, Leber, Lunge und Testis (Gibco) verwendet.

Qualität und Menge der cDNAs wurde durch PCR mit β-Actin spezifischen Primern (SEQ ID NO: 29 und 30) nach 20, 25 und 30 Zyklen (40" 94°C, 45" 55°C, 1'30" 72°C, ab Zyklus 11 mit 30" 55° und einer Verlängerung um 3" 55° bei jedem weiteren Zyklus) überprüft.

9D7-cDNA wurde durch 30 Zyklen des selben Programms mit den 9D7-spezifischen Primern gemäß SEQ ID NO: 3 und 4 amplifiziert. Analog wurden die anderen 15 Kandidaten- Klone mit jeweils spezifischen Primern untersucht. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarose-Gel-Elektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung nachgewiesen. Für 5 der 16 untersuchten Klone konnte mittels RT-PCR eine deutliche Überexpression im Nierenzellkarzinom RCC6 im Vergleich zum autologen Normalnierengewebe N6 gezeigt werden. Als zusätzliche Positivkontrolle wurde für alle Klone das Vorkommen in Testis-cDNA untersucht.

Beispiel 5 Quantitativer Vergleich der 9D7 mRNA- Expression zwischen Tumoren und Normalgeweben

Pools von 9 µg total-RNA aus je 3 Tumor- bzw. Normalgeweben wurden nach einer Vorbehandlung mit DNase I (Boehringer Mannheim) und anschließender Phenolextraktion mittels oligo-dT und AMV-RT (Promega) revers transkribiert. Die Kopienzahl der 9D7-cDNA bzw. Glycerinaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase-cDNA (GAPDH) als Referenz für Menge und Qualität der gesamt cDNA wurde mittels 5'-Nuclease-PCR-Assay (TaqMan®PCR, PE Applied Biosystems) quantifiziert. Als Primer bzw. markierte TaqMan-Sonden für die cDNA-Quantifizierung dienten die Primer gemäß SEQ ID NO: 3 und 4 sowie SEQ ID NO: 31 (am 5'-Ende mit 6-Carboxy-fluorescein und am 3'-Ende mit 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine markiert) bzw. für GAPDH die Primer gemäß SEQ ID NO: 25 und 26 und die Sonde gemäß SEQ ID NO: 32 (am 5'-Ende mit Tetrachloro-6-carboxy-fluorescein und am 3'-Ende mit 6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin markiert). Die PCR (40 Zyklen {15" 95°C, 1' 60°C} für 9D7 bzw. 40 Zyklen {15" 95°C, 1' 66°C} für GAPDH) und die online- Fluoreszenzmessung erfolgten mit einem ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems).

Beispiel 5 zeigt, daß 9D7 in Pools von Nierenzellkarzinomen und Lungenkarzinomen (SCC) rund 1,5 bis 6,5 mal stärker als GAPDH transkribiert wird. In anderen Tumortypen schwankt die Transkriptionsrate zwischen dem 0,25-0,6-fachen Wert von GAPDH.

Normalleber und Testis zeigt einen Wert von etwa 10% der GAPDH-Transkription, während die anderen untersuchten Normalgewebe praktisch keine Transkription von 9D7 zeigen (Tab. 1).

Beispiel 6 Expressionsprofil von 9D7 in Tumor- und Normalgeweben

Einer der 15 Kandidaten (Bezeichnung: 9D7) zeigte mittels RT-PCR starke Transkription in allen getesteten Nierenzellkarzinomen und mehreren anderen Tumortypen. In den meisten Normalgeweben konnte hingegen keine Transkription festgestellt werden.

Fig. 1 zeigt einen Vergleich zwischen vier Normalnieren (N1, 2, 4, 5) und vier Nierenzellkarzinomen (RCC1, 2, 3, 6); außerdem wurden in diesem Versuch cDNA aus Herzmuskel (he), Leukozyten (leu), Niere (ki), Leber (li), Lunge (lu) und Testis (tes) getestet sowie eine Kontrolle mit β-Actin Primern durchgeführt. Diese Ergebnisse wurden in unabhängigen Experimenten mit drei verschiedenen Primerpaaren bestätigt (SEQ ID NO: 3 und 4, SEQ ID NO: 5 und 10 sowie SEQ ID NO: 11 und 15). Für die Northern Blot Analyse wurden Human Multiple Tissue Northern blots (Clontech, Palo Alto) mit dem [α-³²P]dCTP (NEN, Boston) markierten 170 bp 9D7 PCR Produkt bei 65° für 16 h hybridisiert. Die Visualisierung erfolgte durch Standard-Autoradiografie (Xomat AR film, Kodak).

Fig. 2 zeigt das Ergebnis dieser Analyse: von 16 Normalgeweben (1: Leukozyten, 2: Kolon, 3: Dünndarm, 4: Ovarien, 5: Testes, 6: Prostata, 7: Thymus, 8: Milz, 9: Pankreas, 10: Niere, 11: Skelettmuskel, 12: Leber, 13: Lunge, 14: Plazenta, 15: Gehirn, 16: Herzmuskel) zeigte sich lediglich in Herzmuskel ein Transkript von ~ 2,2 kb Größe. Die geringe Intensität des Signals läßt jedoch eine immunologisch relevante Expression als unwahrscheinlich erscheinen.

Das Ergebnis aller Versuche bezüglich des mRNA-Profils von 9D7 (kompiliert aus RT-PCR, quantitative RT-PCR und Northern Blot Analyse) ist in Tab. 2 zusammengefaßt. Beispiel 6 zeigt, daß 9D7 in einem hohen Prozentsatz von Tumoren verschiedener Indikationen stark transkribiert wird, während in allen untersuchten Normalgeweben keine oder nur schwache Transkription gefunden wurde.

Beispiel 7 in-situ-Hybridisierung einer 9D7-spezifischen RNA-Sonde mit Nierenzellkarzinom- und Normalnierengewebe

Ein 280-bp-NotI-Fragment mit 220-bp-Sequenzinformation von 9D7 wurde in pBluescript subkloniert und anschließend für die Transformation kompetenter E.coli DH5-α verwendet. Die Synthese der RNA-Sonden erfolgte durch in-vitro-Transkription mit T3- bzw. T7-RNA- Polymerase (sense: Sac I, T3; antisense: BamH I, T7) unter Zusatz von Digoxigenin-UTP entsprechend den Herstellerempfehlungen (DIG RNA Labeling kit, Boehringer Mannheim). Nach Reinigung der Transkripte (Sephadex G50 quick spin columns, Boehringer Mannheim) wurde die Markierungseffizienz mittels Dot-Blot bestimmt. Die in-situ-Hybridisierung wurde nach Standardverfahren durchgeführt (Boehringer Mannheim, Nonradioactive In Situ Hybridzation Application Manual, 1996): dabei wurden 5 µm Gefrierschnitte nach Paraformaldehydfixierung, Acetylierung und De- bzw. Re-hydratisierung denaturiert und über Nacht bei 52°C in einer feuchten Kammer hybridisiert. Nach den üblichen Waschschritten wurden unspezifische Proteinbindungsstellen 15 Min. mit 10% FCS und 3% Ziegenserum (DAKO) abgesättigt. Die Visualisierung der an 9D7-mRNA hybridisierten Sonde erfolgte durch Inkubation mit einem α-DIG-AP-Konjugat nebst NBT/BCIP (Boehringer Mannheim) Entwicklung bei 4°C im Dunkeln.

Fig. 3 zeigt das Ergebnis einer in-situ-Hybridisierung von Nierenzellkarzinom- bzw. Normalnierengewebe mit einer 9D7-spezifischen Digoxigenin-UTP markierten RNA-Sonde ("antisense"): das Tumorgewebe zeigt starke und homogene Färbung, während das Normalgewebe nicht reagiert; die Spezifität der Färbung ist durch die Negativkontrolle ("sense") gezeigt.

Beispiel 7 zeigt, daß 9D7 in Tumorzellen von Nierenzellkarzinomgeweben, nicht aber in irgendeinem Zelltyp aus Normalnierengewebe transkribiert wird und bestätigt damit die in den Beispielen 4-6 beschriebenen Ergebnisse.

Beispiel 8 Klonierung von 9D7

Klon 9D7 besitzt zwischen den durch die RDA eingeführten Adaptoren ein 221 bp langes Insert eines unbekannten humanen Gens. Datenbankvergleiche zeigten eine Homologie von 9D7 zu Ratten-SM20, wobei 69 bp der C-terminalen kodierenden Region (entsprechend 23 Aminosäuren), das Stopcodon und 149 bp der 3'-untranslatierten Region von SM20 den 221 bp von 9D7 in "antisense"-Orientierung entsprechen. Die 23 Aminosäuren zeigen lediglich 2 Austäusche zwischen Ratten- und Humansequenz. SM20 wurde als ein durch Wachstumsfaktoren induziertes "immediate early gene" und spezifischer Marker für Zellen der glatten Aorta- Muskulatur beschrieben (Wax et al.,; Wax et al.,). Zur vollständigen Klonierung der humanen Sequenz wurde wie folgt vorgegangen: eine UniGene Analyse (National Center for Biotechnology Information) ergab folgende zu 9D7 homologe ESTs: AA234127, AA233899, AA917421, AA878927. Total-RNA aus den Tumorzellinien 786-0 (ATCC# CRL-1932) oder A549 (ATCC# CCL 185) wurde mittels TRIzol (Gibco) isoliert und mit Superscript II MMLV-RT (Gibco) und einem Adaptor-oligo-dT-Primer (SEQ ID NO: 27) entsprechend den Herstellerangaben revers transkribiert. PCR-Amplifikation dieser cDNA mit den Primern gemäß SEQ ID NO: 5, 6, 7 und 10 ergaben mit den ursprünglichen Primern (SEQ ID NO: 3 und 4) sowie untereinander die nach den homologen Sequenzen erwarteten Fragmente. Das längstes Fragment von 804 bp wurde durch Kombination der Primer gemäß SEQ ID NO: 10 und 5 gewonnen. Die Primer der Sequenz SEQ ID NO: 8 und 9 liegen in einem Sequenzbereich der EST-AA234127, die keine Homologie zu SM-20 aufweisen und ergaben folgerichtig mit keinem der anderen Primer ein Amplifikationsprodukt.

Klonierung des 3'-Endes: 10 µg total-RNA aus der Nierenzellkarzinom-Zelllinie 786-0 wurden revers transkribiert, und ein Aliquot dieser cDNA wurde einer PCR unterzogen, deren Programm mit hohen Annealingtemperaturen beginnt, sodaß nur der genspezifische Primer an die cDNA bindet (T_m ~ 93°C, SEQ ID NO: 22), während der zweite Primer (T_m ~ 53°C, SEQ ID NO: 28) erst bei niedrigerer Temperatur an die neu synthetisierte DNA-Vorlage bindet. Diese sog. "touch-down PCR" (Mastercycler Gradient, Eppendorf) wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt:
20 Zyklen {15" 95°C, 30" 80°C (reduziert um 1°C je Zyklus), 2' 72°C} sowie 20 Zyklen {15" 95°C, 30" 50°C, 2' 72°C}.

Klonierung des 5'-Endes: 1 µg total-RNA aus der Nierenzellkarzinom-Zelllinie 786-0 wurde nach einem modifizierten SMART™ Protokoll (SMART™ PCR cDNA Synt.hesis Kit, Clontech) unter Verwendung der Primer SEQ ID NO: 4 und Smart-II (SEQ ID NO: 23) revers transkribiert: dabei wurde die cDNA mit dem 9d7-spezifischen Primer gemäß SEQ ID NO: 4 und unter Zusatz von RNasin (Promega) synthetisiert. Der 9D7-spezifische Primer gemäß SEQ ID NO: 11 wurde in einer Endkonzentration von 0,4 pN eingesetzt, der SMART-PCR Primer (SEQ ID NO: 24) mit 0,1 µM. Die PCR-Amplifikation erfolgte mit 40 Zyklen zu je (15" 95°C, 30" 65°C, 2' 72°C).

Aliquots der PCR-Ansätze wurden direkt in den pCR2.1-Vektor (Invitrogen) ligiert und anschließend in kompetente E. coli (OneShot™, Invitrogen) transformiert. Positive Klone wurden nach Blau-Weiß- Selektion sequenziert. Die Sequenzierung ergab 50 zusätzliche Nukleotide, die mit EST-AA878927 übereinstimmten, zum bis dahin bestätigten 3'-Ende und 870 zusätzliche Nukleotide zum bis dahin bestätigten 5'-Ende. PCR Amplifikation von cDNA aus Tumorzellinien (786-0, A549) sowie Gewebsbiopsien von Nierenzellkarzinomen mit den Primern gemäß SEQ ID NO: 14 bis 21 ergaben mit den ursprünglichen Primern sowie untereinander die nach der Klonierung erwarteten Fragmente. Die Identität aller PCR-Produkte wurde durch Sequenzierung verifiziert. Bei der Sequenzierung wurden mehrere Klone mit bzw. ohne ein Exon von 282 bp (Pos. 399-680) identifiziert. Das Vorhandensein beider Spleißvarianten wurde mittels RT-PCR mit den Primern gemäß SEQ ID NO: 11 und 15 bzw. 13 in mehreren Tumorproben (Nierenzellkarzinom, Lungenkarzinom/SCC, Kolonkarzinom/AC) nachgewiesen.

Beispiel 9 Potentielle MHC-Bindungspeptide in der kodierenden Region von 9D7

Potentielle Peptid-Epitope innerhalb der kodierenden Region von 9D7 gemäß SEQ ID NO: 2 wurden mittels den von Parker et. al., 1994 beschriebenen Algorithmen unter Zugrundelegung bekannter Motive (Rammensee et al. 1995) durchgeführt. Für die wichtigsten HLA-Typen, insbesondere für HLA-A1, -A*0201, -A3, -B7, -B14 und -B*4403, wurden Kandidaten-Peptide identifiziert, von denen zu erwarten ist, daß sie an die entsprechenden HLA-Moleküle binden und daher immunogene CTL-Epitope darstelle; die ermittelten Peptide sind in Tabelle 3 aufgelistet. Durch analoges Vorgehen können weitere potentielle Peptid-Epitope für andere HLA-Typen ermittelt werden.

Tabelle 1

Transkription von 9D7 in Tumor- und Normalgeweben relativ zu GAPDH

Tabelle 2

mRNA-Expressionsprofil von 9D7

Tabelle 3

Immunogene 9D7-Peptid-Kandidaten

Literatur

Becker, D., Kuhn, U., Lempertz, U., Enk, A., Saloga, J., and Knop, J. (1997), J. Immunol. Methods 203, 171-180.
Blake, J., Johnston, J. V., Hellström, K. E., Marquardt, H., and, Chen, L. (1996), J. Exp. Med. 184, 121-130.
Boon, T, J. C. Cerottini, B. Van den Eynde, P. von der Bruggen, and A. Van Pel (1994), Annu.Rev.Immunol. 12: 337-365
Boon T, (1998). Tumor antigens recognized by cytolytic T cells. Cancer Vaccine Week - International Symposium, New York, Oct 1998; abstract S01
Boulianne, G. L., et al., (1984), Nature 312: 643-646
Brüggemann, M. und Neuberger, M. S., (1996), Immunol. Today 17: 391-397
Buschle M, Schmidt W, Zauner W, Mechtler K, Trska B, Kirlappos H, Birnstiel M (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 3256-3261
Celluzzi, cm and Falo, LD, Jr. (1998), J. Immunol. 160: 3081-3085
Chen, Y. T., Scanlan, M. J., Sahin, U., Tureci, O., Gure, A. O., Tsang, S., Williamson, B., Stockert, E., Pfreundschuh, M., and. Old, L. J. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1914-1918.
Coulie, P. G. (1997), Mol. Med. Today 3: 261-268
Cox, AL, Skipper, J, Chen, Y, Henderson, RA, Darrow, TL, Shabanowitz, J, Engelhard, VH, Hunt, DF, and Slingluff, CL, Jr. (1994), Science 264: 716-719
Diatchenko, L., Lau, Y. F., Campbell, A. P., Chenchik, A., Moqadam, F., Huang, B., Lukyanov, S., Lukyanov, K., Gurskaya, N., Sverdlov, E. D., and Siebert, P. D. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 6025-6030.
Dranoff, G., Jaffee, E., Lazenby, A., Golumbek, P., Levitsky, H., Brose, K., Jackson, V., Hamada, H., Pardoll, D., and Mulligan, R. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 90: 3539-3543.
Emini, EA, Hughes, J, Perlow, D, and Boger, J (1985), J. Virol. 55: 836-839
Falk, K., Rötzschke, O., Stevanovic, S., Jung, G., and Rammensee, H-G (1991), Nature 351: 290-296.
Fearon, E. R., Pardoll, D. M., Itaya, T., Golumbek, P., Levitsky, H. I., Simons, J. W., Karasuyama, H., Vogelstein, B., and Frost, P. (1990), Cell 60: 397-403.
Gansbacher, B., Zier, K., Daniels, B., Cronin, K., Bannerji, R., and Gilboa, E. (1990), J. Exp. Med. 172:
1217-1224.
Graziano, R. F., et al., (1995), J. Immunol. 155:
4996-5002
Griffiths, A. D., et al., (1994), EMBO J. 13: 3245-3260
Halliday, GM, Patel, A, Hunt, MJ, Tefany, FJ, and Barnetson RS (19ß5), World J. Surg. 19: 352-358
Hubank, M. and Schatz, D. G., (1994), Nucleic. Acids. Res. 22, 5640-5648.
Jager, E., Chen, Y. T., Drijfhout, J. W., Karbach, J., Ringhoffer, M., Jager, D., Arand, M., Wada, H., Noguchi, Y., Stockert, E., Old, L. J., and Knuth, A. (1998), J. Exp. Med. 187, 265-270.
Jakobovits, A., (1995), Curr. Opin. Biotechnol. 6: 561-566
Jameson, BA and Wolf, H (1988) The antigenic Index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput. Appl. Biosci. 4: 181-186
Jessup, JM and Loda, M (1998) Prognostic markers in rectal carcinoma. Semin. Surg. Oncol. 15: 131-140.
Kawakami, Y., Eliyahu, S., Jennings, C., Sakaguchi, K., King, X., Southwood, S., Robbins, P. F., Sette, A., Appella, E., and Rosenberg, S. A. (1995), J. Immunol. 154: 3961-3968.
Kawakami, Y, Robbins, PF, and Rosenberg, SA (1996), Keio J. Med. 45: 100-108
Köhler, G. und Milstein, C. (1975), Nature 265, 495-497
Kruif, J., et al., (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 3938-3942
Kyte, J and Doolittle, RF (1982), J. Mol. Biol. 157: 105-132
Lethe, B, Lucas, S. Michaux, L, De Smet, C, Godelaine, D, Serrano, A, De Plaen, E, and Boon, T (1998), Int. J. Cancer 76: 903-908
Mackensen A, Ferradini L, Carcelain G, Triebel F, Faure F, Viel S. and Hercend T (1993), Cancer Res. 53: 3569-3573
Marchand M, Weynants P, Rankin E et al (1995), Int. J. Cancer 63: 883-885
Mayordomo, J. I., Zorina, T., Storkus, W. J., Zitvogel, L., Celluzzi, C., Falo, L. D., Melief, C. J., Ildstad, S. T., Kast, W. M., DeLeo, A. B., and Lotze, M. T. (1995), Nature Medicine 1, 1297-1302.
McGuinnes, B. T., et al., (1996), Nature Biotechnol. 14, 1149
Melief CJ, Offringa R, Toes RE, Kast WM (1996), Curr. Opin. Immunol. 8: 651-657
Murphy, G. P., Elgamal, A. A., Su, S. L., Bostwick, D. G., and Holmes, E. H. (1998), Cancer 83, 2259-2269
Neuberger, M. S., et al., (1984), Nature 312: 604-608
Pardoll, D. M. (1998) Nature Medcine 4: 525-531
Parker, K. C., M. A. Bednarek, and J. E. Coligan. (1994), J. Immunol. 152: 163.
Parkhurst, M. R., Salgaller, M. L., Southwood, S., Robbins, P. F., Sette, A., Rosenberg, S. A., and Kawakami, Y. (1996), J. Immunol. 157, 2539-2548.
Paterson Y, Ikonomidis G (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 664-9
Rammensee HG, Friede T, Stevanovic S (1995), Immunogenetics 41: 178-228
Rapellino, M, Pecchio, F, Baldi, S. Scappaticci, E, and Cavallo, A (1995), Anticancer Res. 15: 1065-1070
Ravaioli, A., Bagli, L., Zucchini, A., and Monti, F. (1998), Cell. Prolif. 31, 113-126
Revillion, F, Bonneterre, J, and Peyrat, JP (1998), Eur. J. Cancer 34: 791-808
Restifo NP (1996), Curr. Opin. Immunol. 5: 658-63
Riechmann, L., et al., (1988), Nature 332: 323-327
Robbins, PF and Kawakami, Y (1996), Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636
Ruppert, J., Sidney, J., Celis, E., Kubo, R. T., Grey, H. M., and Sette, A. (1993), Cell 74, 929-937.
Sahin, U., Türeci, Ö., Schmitt, H., Cochlovius, B., Johannes, T., Schmits, R., Stenner, F., Luo, G., Schobert, I., and Pfreundschuh, M. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 11 810-11 813
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989
Schendel DJ, Gansbacher B, Oberneder R, Kriegmair M, Hofstetter A, Riethmuller G, and Segurado OG (1993), J. Immunol. 151: 4209-4220
Schmidt W, Buschle M, Zauner W, Kirlappos H, Mechtler K, Trska B, Birnstiel M (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 94: 3262-3267
Schweighoffer, T. (1997), Onc. Res. 3, 164-176
Sette, A., Vitiello, A., Reherman, B., Fowler, P., Nayersina, R., Kast, W. M., Melief, C. J. M., Oseroff, C., Yuan, L., Ruppert, J., Sidney, J., del Guercio, M.-F., Southwood, 5., Kubo, R. T., Chesmut, R. W., Grey, H. M., and Chisari, F. V. (1994), J. Immunol. 153, 5586-5592.
Stauss, H. J., Davies, H., Sadovnikova, E., Chain, B., Horowitz, N., and Sinclair, C. (1992), Proc. Natl. Acacl. Sci. U.S.A 89, 7871-7875.
Tepper, R. I., Pattengale, P. K., and Leder, P. (1989), Cell 57: 503-512.
Tighe H, Corr, M, Roman M, and Raz E (1998), Immunol. Today 19: 89-97
Toes, R. E., Hoeben, R. C., Van der Voort, E., Ressing, M. E., Van der-Eb, A. J. Melief, C. J. M., and Offringa, R. (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (26):
14 660-14 665
Tuting, T., DeLeo, A. B., Lotze, M. T., and Storkus, W. J., (1997), Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707.
Van den Eynde, B, and Brichard, V. G. (1995), Curr. Opin. Immunol. 7, 674-681.
Van den Eynde, BJ, and van der Bruggen, P (1997), Curr. Opin. Immunol. 9: 684-693
van der Bruggen, P., C. Traversari, P. Chomez, C. Lurquin, E. De Plaen, B. Van den Eynde, A. Knuth, and T. Boon. (1991, Science 254: 1643-1647
van der Burg, S. H., et al., (1996), J. Immunol. 156, 3308-3314
van Elsas, A., von der Minne, C. E., Borghi, M., van der Spek, C. W., Braakman, E., Osanto, S., and Schrier, P. I. (1996), CTL Recognition of an IL-2 Producing Melanoma Vaccine. In: Immunology of human melanoma. Tumor-host interaction and immunotherapy, edited by M. Maio, Amsterdam: IOS, 1996, p. 165-173
van Elsas, A., Aarnoudse, C., van der Minne, C. E., van der Spek, C. W., Brouwenstijn, N., Osanto, S., and Schrier, P. I. (1997), J. Immunother. 20: 343-353.
Vaughan, T. J., et al., (1998), Nature Biotechnol. 16, 535-539
Velculescu, VE, Zhang, L, Vogelstein, B, and Kinzler, KW (1995), Science 270: 484-487
Wang, L., et al., (1997), Mol. Immunol. 34: 609-618
Wang, RF (1997), Mol. Med. 3: 716-731
Wax, S. D., Rosenfield, C. L., and Taubman, M. B., (1994), J. Biol. Chem. 269, 13 041-13 047.
Wax, S. D., Tsao, L., Lieb, M. E., Fallon, J. T., and Taubman, M. B. (1996), Lab. Invest. 74, 797-808.
Winter, G., et al., (1994), Annu. Rev. Immunol. 12, 433-455
Woelfel, T, Schneider; J, Zum Buschenfelde, Meyer, KH, Rammensee, HG, Rotzschke, O, and Falk, K (1994), Int. J. Cancer 57: 413-418
Wu, T. C., Guarnieri, F. G., Staveley-O'Carroll, K. F., Viscidi, R. P., Levitsky, H. I., Hedrick, L., Cho, K. R., August, J. T., and Pardoll, D. M. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (25): 11 671-11 675.
Zitvogel, L., Mayordomo, J. I., Tjandrawan, T., DeLeo, A. B., Clarke, M. R., Lotze, M. T., and Storkus, W. J. (1996), J. Exp. Med. 183, 87-97.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (20)

1. Tumorassoziiertes Antigen der Bezeichnung 9D7, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO: 2 definierte Aminosäuresequenz aufweist.

2. Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß es die in SEQ ID NO: 2 definierte Sequenz als Teilsequenz enthält.

3. Immunogenes Proteinfragment oder Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es von dem in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigen abgeleitet ist.

4. Immunogenes (Poly)peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das eine humorale Immunantwort auslöst.

5. Immunogenes (Poly)peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das bzw. dessen Abbauprodukte durch MHC-Moleküle präsentiert werden und eine zelluläre Immunantwort auslösen.

6. Immunogenes Peptid nach Anspruch 5, ausgewählt aus der Gruppe von Peptiden gemäß SEQ ID NO: 34 bis 58.

7. Immunogenes (Poly)peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für die Immuntherapie von Krebserkrankungen in vivo oder ex vivo, wobei das (Poly)peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die 9D7 exprimieren.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung für die parenterale, topische, orale oder lokale Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als wirksame Komponente ein oder mehrere immunogene (Poly)peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie verschiedene, von 9D7 abgeleitete immunogene Peptide enthält.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein oder mehrere von 9D7 abgeleitete Peptide in Mischung mit von anderen tumorassoziierten Antigenen abgeleiteten Peptiden enthält.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, daß die Peptide an mindestens zwei verschiedene HLA-Typen binden.

12. Isoliertes DNA-Molekül, kodierend für ein Protein mit den immunogenen Eigenschaften des in Anspruch 1 definierten tumorassoziierten Antigens oder für Fragmente davon.

13. DNA-Molekül nach Anspruch 12, kodierend für ein immunogenes Polypeptid der Bezeichung 9D7 mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz bzw. für davon abgeleitete Proteinfragmente oder Peptide.

14. DNA-Molekül nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Polynukleotid mit der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz ist oder dieses enthält oder daß es ein Polynukleotid ist oder dieses enthält, das mit einem Polynukleotid der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Sequenz unter stringenten Bedingungen hybridisiert.

15. Rekombinantes DNA-Molekül, enthaltend ein DNA- Molekül gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14.

16. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 12 bis 15, für die Immuntherapie von Krebserkrankungen, wobei das von dem DNA-Molekül exprimierte 9D7- (Poly)peptid eine Immunantwort gegen Tumorzellen des Patienten induziert, die 9D7 exprimieren.

17. Verwendung von Zellen, die das in Anspruch 1 oder 2 definierte tumorassoziierte Antigen exprimieren, für die Herstellung einer Krebsvakzine.

18. Antikörper gegen ein in einem der Anspüche 1 bis 6 definiertes (Poly)peptid.

19. Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

20. Antikörper nach Anspruch 18 oder 19 für die Therapie und Diagnose von Krebserkrankungen, die mit der Expression von 9D7 assoziiert sind.