DE19903655A1

DE19903655A1 - Proteinhaltige Hydrogele

Info

Publication number: DE19903655A1
Application number: DE19903655A
Authority: DE
Inventors: Norbert Ettner; Michael Schink; Joerg Schreiber; Wolfgang Meier; Marc Sauer
Original assignee: Beiersdorf AG
Current assignee: Beiersdorf AG
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2000-08-10
Also published as: US6773703B1; AU6307799A; AU766593B2

Abstract

Hydrogel, bestehend aus zumindest einem Protein und/oder Enzym und/oder SOD/Katalase-Enzym-Mimic und PEGs sowie Teilen von Proteinen und Enzymen und/oder rekombinant hergestellten Proteinen und Enzymen, wobei die Verbindung zwischen den Proteinen und/oder Enzymen und den PEGs über Harnstoffgruppen erfolgt.

Description

Seit Menschengedenken ist die Heilung von therapieresistenten Wunden eine große Herausforderung für die Medizin und Naturwissenschaften. Die heutigen Anforderun gen an die Funktion von interaktiven Wundauflagen für chronische Wunden gehen zurück auf Winter (1962, Nature 193, 293) und sind jüngst von Turner neu formuliert (1994, Wound Rep. Reg. 2, 202). Im Vordergrund steht dabei die Schaffung eines feuchten Wundheilungsmilieus, das im Gegensatz zur traditionellen trockenen Wundbehandlung mit zum Beispiel Mullkompressen den natürlichen Abläufen der Wundheilung physiologische und damit bessere Konditionen bietet.

Das Prinzip der feuchten Wundheilung kann derzeit als der Stand der Technik in der Therapie schwer oder nicht heilender Wunden angesehen werden. Die Wundauflage muß die Hauptmenge des Exsudates aufnehmen und gleichzeitig aber auf der Wunde selbst einen Flüssigkeitsfilm belassen, in dem die eigentliche feuchte Wund heilung stattfindet. Bei trockenen und schwachexudierenden Wunden muß die Ver sorgung der Wunde mit ausreichend Feuchtigkeit erfolgen, um eine Rehydrierung des dehydratisierten Gewebes zu erreichen. In der auf diese Weise etablierten feuchten Wunde kommt es dann zur Proliferation von neuen Blutgefäßen und ver minderten Bakterienwachstum unter Einstellung eines geeigneten pH-Wertes.

Erfüllt werden diese Anforderungen von schwammartigen Strukturen, wie beispiels weise Hydrogele, die über einen Überschuß in Form von gebundenem Wasser ver fügen.

Hydrogele werden im allgemeinen dadurch hergestellt, daß hydrophile, kohärent vor liegende Monomere in einem Dispersionsmittel eine dreidimensionale Raumnetz struktur ausbilden, in dessen Zwischenräumen sich das Dispersionsmittel, üblicher weise Wasser, einlagern kann. Ein Hydrogel sollte über eine gewisse Sauerstoff durchlässigkeit verfügen und eine Barrierefunktion gegenüber möglicherweise aus der Umgebung eindringende Keime einnehmen. Eine grundlegende Anforderung an ein Hydrogel sind auch ein einfacher Herstellungsprozeß sowie eine gewisse Lager stabilität.

Der Gebrauch und die Vielfältigkeit der möglichen Anwendungen von Hydrogelen in der Wundbehandlung, sowie deren Zusammensetzung und Herstellung ist hinrei chend dokumentiert (Peppas in: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, 1986, CRC Press, Volume II, Chapter 4). Hydrogele werden bevorzugt für die Behandlung von trockenen nekrotischen Wunden wie zum Beispiel Brandwunden und chronisch venöse Ulcera eingesetzt (Thomas, in: Wound Management and Dressings, 1990, The Pharmaceutical Press, London, S. 50).

Sie bestehen aus unlöslichen polymeren Materialien, die in der Lage sind, in wäßri gen Medien aufzuquellen. Des weiteren sollten sie über einen hohen Wassergehalt verfügen, inert sein gegen biologische Prozesse, permeabel für zelluläre Metaboliten und vor allem im Kontakt mit lebenden Gewebe keine Reizungen auslösen.

Die Synthese eines biokünstlichen oder semi-synthetischen Hydrogels kann dadurch erzielt werden, daß das hydrophile synthetische Monomer kovalent an die Oberfläche eines Proteins verknüpft wird, wobei es dann innerhalb des Dispersionsmittels zur Ausbildung einer dreidimensionalen Polymer-Proteinmatrix kommt. Diese Klasse von Hydrogelen, bestehend aus synthetischen Polymeren und Biopolymeren, ist seit kur zer Zeit Gegenstand der Forschung. Diese neuartigen Biomaterialien werden als bio künstliche Hydrogele bezeichnet (Giusti et al., 1993, Trends in Polymeric Science, 9, 261).

In US 5,804,213 wird die Herstellung eines biologisch aktiven, wasserhaltigen Gels als Wundauflage berichtet. Dabei wird ein trockenes, hydrokolloidales Polymer mit Wasser und einer biologisch aktiven Substanz vermischt.

Die Verwendung von dehydratisierten, vernetzten Collagenmaterialien als Drug-Deli very-System wird in WO 98/22153 beschrieben. In WO 96/31551 werden im trocke nen Zustand Proteine oder Peptide als aktive Agentien zu Polyurethan-vernetzten Microgelen gemischt. Die Microgele quellen im wäßrigen Medium zu Hydrogelen auf und setzen aus der Hydrogelmatrix das Protein bzw. das Peptid wieder frei. Auch US 5,000,955 beschreibt Polyurethan-Hydrogele für kosmetische, biologische und medi zinische Anwendungen.

Kubische Phasen bestehend aus Glycerylmonooleat können Enzyme durch nicht kovalente Bindungen, wie in WO 96/39125 berichtet, immobilisieren. Dabei bleibt durch die Immobilisierung die enzymatische Aktivität erhalten und ist sogar, im Ver gleich zu gelöstem Enzym, über einen längeren Zeitraum erhöht. Hervorzuheben ist weiterhin die Barrierefunktion der Gelmatrix, die den proteolytischen Abbau der immobilisierten Enzyme, wie in der Wundflüssigkeit anzutreffen, unterbindet.

Von besonderem Interesse sind Hydrogele, in die ein Biomolekül kovalent eingebun den ist, wie in US 5,733,563 und 1994 von Fortier (1994, Biotechnol. Techn., 8, 71) beschrieben. Diese Hydrogele werden durch Copolymerisation von einem durch 4- Nitrophenylchloroformiat aktiviertem Polyethylenglykol und bovinem Serumalbumin in Boratpuffer gebildet. Dabei kann die aktivierte Gruppe mit einer Amino-, SH-, OH- oder COOH-Gruppe des Proteins reagieren.

Nachteile der im Stand der Technik bekannten biokünstlichen Hydrogele sind die hohe Gelbildungszeiten von 20 bis zu 270 Minuten, die Entstehung von Spaltpro dukten in Form von p-Nitrophenolen in der Hydrogelmatrix und die fehlende Möglich keit oligomere Proteine wie zum Beispiel dimere SOD oder tetramere Katalase stabil mit dem 4-Nitrophenylchloroformiat aktivierten Polyethylenglykol zu vernetzen.

Aufgabe der Erfindung ist es, wasserunlösliche, wasserquellbare Hydrogele mit kur zen Gelbildungszeiten zu fertigen, die für medizinische Zwecke einsetzbar sind und sich in besonderem Maße zur Förderung der Heilung von chronischen Wunden eig nen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Hydrogel, das aus zumindest einem Protein und/oder Enzym und PEGs besteht, wobei die Verbindung zwischen den Proteine und/oder Enzymen und den PEGs über Harnstoffgruppen erfolgt.

Bei der Herstellung des Hydrogels werden zusätzliche Substanzen verwendet, die mit den in Wundflüssigkeiten von chronischen Wunden vorhandenen Sauerstoffspezies (ROS) wechselwirken, d. h. mit Faktoren, die den Wundheilungsprozess behindern, wobei man diese zusätzlichen Substanzen kovalent in das Hydrogel einpolymerisiert. Die Erfindung beschreibt die neuartige Herstellung von proteinhaltigen Hydrogelen, mit denen es möglich ist, reaktive ROS in der Wundflüssigkeit von chronischen Wun den unschädlich zu machen. Sie beschreibt das Herstellen von collagenasehaltigen und trypsinhaltigen Hydrogelen zur Behandlung von nekrotischen Wundbeilägen, sowie das Herstellen von lysozymhaltigen Hydrogelen, die zur Bekämpfung von mit Bakterien infizierten Wunden eingesetzt werden können. Ferner wird die Machbarkeit beschrieben, in die Hydrogele biologisch aktive Substanzen wie zum Beispiel Anti biotika, Wachstumsfaktoren und andere Wirkstoffe einzuarbeiten.

Die vorliegende Erfindung bedient sich der Reaktion von insbesondere α,ω-Diisocya nato-Polyethylenglykolen mit Protein unter Bildung eines proteinhaltigen Hydrogels im wäßrigen Milieu. Dabei ist die Vernetzungsreaktion des Isocyanats mit den Amino gruppen des Proteins eine durch die höhere Nucleophilie bevorzugte Reaktion, im Vergleich zur Hydrolyse des Isocyanats zum Amin unter Bildung von Kohlendioxid. Die Reaktion stellt eine Möglichkeit zur dreidimensionalen Vernetzung von Polyethy lenglykol und Proteinen dar ohne das Auftreten von Spaltprodukten, die aus der akti vierten Gruppe entstehen. Ferner können stabile Hydrogele mit oligomeren Proteinen wie zum Beispiel SOD und Katalase gebildet werden.

Polyethylenglykole (PEGs) zählen zur Klasse der Polyether gehörenden Polyalkylengly kole der allgemeinen Formel (Römpp Lexikon Chemie - Version 1.3, Stuttgart/New York: Georg Thieme Verlag 1997):

H O-CH₂-CH₂ _nOH

Polyethylenglykole (PEGs) werden technisch hergestellt durch basisch katalysierte Polyaddition von Ethylenoxid (Oxiran) in meist geringe Mengen Wasser enthaltenden Systemen mit Ethylenglykol als Startmolekül. Sie haben Molmassen im Bereich von ca. 200-5.000.000 g/mol, entsprechend Polymerisationsgraden n von ca. 5 bis < 100.000. Im weiteren Sinne werden auch Produkte mit n = 2-4 (Di-, Tri- u. Tetramethylenglykol) zu den PEGs gerechnet; sie sind mol.-einheitlich herstellbar, während die PEGs mit höhe ren Molmassen polymol. sind, d. h. aus Kollektiven von Makromolekülen mit unter schiedlichen Molmassen bestehen.

Flüssige Produkte mit Molmassen < ca. 25.000 g/mol werden als eigentliche Polyethy lenglykole, die höhermolekularen festen (Schmelzpunkt ca. 65°C) als Polyethylenoxide bezeichnet. Polyethylenoxide besitzen eine äußerst niedrige Konzentrationen an reakti ven Hydroxy-Endgruppen und zeigen nur noch schwache Glykol-Eigenschaften.

Als PEG werden auch verzweigte Polyaddukte von Ethylenglykol an mehrwertige Alko hole bezeichnet.

PEG sind flüssige bzw. wachsartige bis feste Produkte, die sich in Wasser bis ca. 100°C und in vielen organischen Lösungsmitteln gut lösen. Wäßrige Lösungen haben auffallende rheologische Eigenschaften, so zeigen verschiedene Lösungen zum Teil starke Viskoelastizität. In fließendem Wasser bewirken schon minimale PEG-Mengen den sogenannten Toms-Effekt (Herabsetzung des Reibungswiderstands). PEG sind sehr hydrolysestabile, bei höheren Temperaturen aber oxididationsempfindliche Pro dukte. Ihre chemische Reaktivität wird durch die terminalen Hydroxy-Gruppen bestimmt, die leicht verestert (zu Polyethylenglykolester) oder verethert (zu Polyalkylenglykolether) oder mit Isocyanaten zu Urethanen umgesetzt werden können.

PEG werden als toxikologisch unbedenklich eingestuft. Ihre biologische Abbaubarkeit ist stark Molmassen-abhängig; Produkte mit niedrigen Molmassen, z. B. 4000 g/mol, wer den bis zu 80% abgebaut.

PEGs werden u. a. verwendet als Lösungsvermittler, Bindemittel, Konsistenzgeber, Emulgatoren, Dispergatoren, Schutzkolloide, Weichmacher oder Trennmittel für sehr unterschiedliche Einsatzgebiete; als Bindemittel für keramische Massen, Schlichtemittel, Flockungsmittel, Klebstoff-Komponenten, zur Verminderung des Fließwiderstands wäß riger Flüssigkeiten (drag-reduction), als Zwischenprodukte für Polymer-Synthesen, zum Beispiel im großen Umfang für die Herstellung von Polyurethanen; hochmolekulare PEGs als Stärkeersatz sowie zur Herstellung von Filmen und Folien.

Vorteilhafterweise hat das eingesetzte PEG ein Molgewicht von 8.000 bis 18.000 g/mol, insbesondere 10.000 bis 15.000 g/mol.

Erfindungsgemäß können auch modifizierte PEGs eingesetzt werden, die die fol gende Strukturschemata aufweisen können:

wobei B einen hydrophilen Bereich des jeweiligen Vernetzermoleküls symbolisiert und A eine Isocyanatgruppe darstellt, welche auch innerhalb eines Moleküls unter schiedlicher chemischer Natur sein mögen.

Ebenfalls in den Rahmen der hiermit vorgelegten Erfindung fallen Struktur schemata wie folgt:

wobei Z dabei eine Zentraleinheit darstellt, welche hydrophil oder hydrophob sein kann und in der Regel aus einem oligo- oder polyfunktionellen Molekülrest besteht.

Selbstverständlich fallen auch Verknüpfersubstanzen mit höherem Verzweigungs grad in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.

Beispielsweise kann Z in Schema (10) aus einem Glycerylrest bestehen, dessen drei OH-Funktionen in die Bereiche B übergehen, welche ihrerseits beispielsweise Polyoxyethylenketten gleicher oder ungleicher Länge darstellen können, und deren terminale OH-Gruppe mit einer längerkettigen Fettsäure verestert sind. Auch Teilsubstitution an Glycerin ist denkbar, wodurch Strukturen entstehen können, welche Schema (9) entsprechen.

Für das Strukturschema (1) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur schemata befolgt werden:

wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ket tenförmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen können, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alkanoylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 10⁷. a und b sind Zahlen, die in Abhängigkeit von x gewählt werden, dergestalt, daß die Verknüpfersubstanz eine wenigstens ausreichende Wasserlöslichkeit bzw. Was serdispergierbarkeit aufweist. Im Einzelfalle, beispielsweise wenn der Verdicker aus der Gruppe der derivatisierten Polysaccharide gewählt wird, kann x gegebe nenfalls wesentlich höhere Werte als z. B. 300, sogar mehrere Millionen, anneh men. Dies ist dem Fachmanne an sich bekannt und bedarf keiner weiteren Erläu terung.

Für das Strukturschema (2) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur schemata befolgt werden:

wobei R₁, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder kettenförmige ali phatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen können, bei spielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alkanoyl reste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 10⁷.

Auch Teilsubstitution ist dabei denkbar, wobei einer oder mehrere der Indices x, y, oder z den Wert Null annehmen können und einer oder mehrere der Reste R₁, R₂ oder R₃ Wasserstoffatome darstellen können.

Für das Strukturschema (3) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur schemata befolgt werden:

wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder ver zweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ketten förmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen kön nen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alka noylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 10⁷.

Auch hier gilt selbstverständlich, daß Teilsubstitution denkbar ist, wobei einer oder mehrere der Indices u, v, w, x den Wert Null annehmen können und einer oder mehrere der Reste R₁, R₂, R₃ oder R₄ Wasserstoffatome darstellen können. Dabei gehen die Substanzen natürlich in andere Strukturschemata über.

Für das Strukturschema (9) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur schemata befolgt werden:

Für das Strukturschema (10) können beispielsweise folgende spezielleren Struk turschemata befolgt werden:

wobei R₁, R₂, und R₃ unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder kettenförmige ali phatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen können, bei spielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alkanoyl reste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 10⁷.

Für das Strukturschema (11) kann beispielsweise folgendes speziellere Struktur schema befolgt werden:

Für das Strukturschema (12) kann beispielsweise folgendes speziellere Struktur schema befolgt werden:

wobei R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder ver zweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ketten förmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen kön nen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alka noylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 10⁷.

Für das Strukturschema (13) kann beispielsweise folgendes speziellere Struktur schema befolgt werden:

wobei R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ und R₆ unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ket tenförmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen können, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alkanoylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 10⁷.

Es ist auch gegebenenfalls von Vorteil, die vorab beschriebenen Strukturschemata so abzuwandeln, daß am Ende des Verdickermoleküls erneut Verzweigung auftritt, etwa dergestalt, wie es in der Gruppe der sogenannten Dendrimere verwirklicht wird.

Die Wahl des zur Herstellung des Hydrogels erforderlichen Proteins ist abhängig von den gewünschten Eigenschaften des Hydrogels. Prinzipiell eignen sich alle Proteine und Enzyme sowie Teile von Proteinen und Enzymen oder rekombinat hergestellte Proteine und Enzyme wie beispielsweise:

- Antikörper
- Radikale detoxifizierende Enzyme wie z. B. Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion-Peroxidase, Myeloperoxidase und/oder Kombinationen daraus sowie SOD/Katalase-Enzym-Mimics
- proteolytisch wirkende Enzyme wie Collagenase, Trypsin, Elastase und/oder Kombinationen daraus
- Proteaseinhibitoren aus der Klasse der Tissue Inhibitos of Matrixmetalloprotei nases (TIMPs) und/oder andere proteinogene Proteaseinhibitoren wie Aprotenin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-2-Makroglobulin
- antimikrobiell wirksame Enzyme wie zum Beispiel Lysozym und Hydrolase
- phosphorylierend wirksame Enzyme wie Phosphatasen und Kinasen
- Wachstumsfaktoren wie z. B. PDGF
- beliebige Mischungen der Proteine, wobei sich die Zusammensetzung der Mischung ebenfalls an den gewünschten funktionalen Eigenschaften des Hydro gels orientiert.

Als Enzyminhibitoren werden besonders natürliche proteinogene Protease-Inhibitoren aus der Klasse der TIMPs gewählt sowie Aprotinin, Alpha-2-Antiplasmin, Alpha-2- Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-1- Protease-Inhibitor.

Im Falle eines proteinhaltigen Hydrogels, das aus SOD, Katalase oder aus einer Mischung der beiden Enzyme besteht, ist ein selektives Entfernen von ROS aus der Wundflüssigkeit möglich. ROS werden in der entzündlichen Phase der Wundheilung durch Neutrophiele und Monozyten nach einem zellulären Reiz ausgeschüttet. Das Enzym SOD katalysiert die Dismutationsreaktion von reaktivem Superoxid in die weniger toxische Zwischenstufen Wasserstoffperoxid und Sauerstoff (Gleichung 1). Es spielt die Hauptrolle in der zellulären Verteidigung gegen die sauerstoffvermittelte Toxizität von ROS und bei der Regulierung der intrazellulären Sauerstoffkonzentra tion (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97). Das durch die Reaktion der SOD gebildete Wasserstoffperoxid wird anschließend durch das in aeroben Organismen ubiquitäre Redoxenzym Katalase in einem mehrstufigen katalytischen Zyklus in die nichttoxischen Moleküle Wasser und Sauerstoff (Gleichung 2) umgewandelt (Gouet et al, 1996, Nature Structural Biology, 3, 951). Außer Katalase sind auch die Enzyme Gluthathion-Peroxidase und Myeloperoxidase befähigt, Wasserstoffperoxid abzu bauen.

2 O₂ ^- + 2 H⁺ → H₂O₂ + O₂ (1)

H₂O₂ → H₂O + ½O₂ (2)

Collagenasehaltige Salben werden seit Jahren zur Entfernung von nekrotischen Wundbelägen eingesetzt (Nano et al., 1996, in: Proteolysis in Wound Repair, Abatangelo, Donati und Vanscheidt (Eds.), Springer Verlag, Berlin, Seite 61) und J. Hansbrough & W. Hansbrough 1996, in: Proteolysis in Wound Repair, Abatangelo, Donati und Vanscheidt (Eds.), Springer Verlag, Berlin, Seite 97. Das Enzym Collage nase und andere Proteasen spalten dabei Collagenmoleküle in abgestorbenem Gewebe und machen somit das Einwandern von Fibroblasten möglich und somit das Abheilen der Wunde (Glyantsev et al., 1997, J. Wound Care, 6, 13). Ein aus Colla genase bestehendes Hydrogel trägt in vergleichbarer Art und Weise zur Auflösung des nekrotischen Gewebes bei.

Die aktiven Enzyme werden beim Entfernen des Hydrogels ebenfalls mit entfernt, ohne daß sie in der Wunde bzw. in der Wundflüssigkeit verbleiben. Erfindungsgemäß schließt diese Wechselwirkung eine Umwandlung der ROS als Störfaktoren in die Wundheilung nicht mehr behindernde Substanzen ein. Die zur Wechselwirkung ver wendeten, kovalent in das Hydrogel eingebundenen Enzyme werden somit nur vor übergehend in die Wunde eingebracht und werden, nachdem sie ihre bestimmungs gemäße Aufgabe verrichtet haben (d. h., die oben genannten Wechselwirkungen eingegangen sind), wieder aus dem Wundbereich entfernt. Durch die selektive Beseitigung bzw. Eliminierung der toxischen ROS, das proteolytische Auflösen von totem Gewebe und das Abtöten von Mikroorganismen wird der Heilungsprozeß chro nischer, d. h. schwer oder nicht heilender, Wunden verbessert bzw. eingeleitet.

In der chronischen Wunde findet man eine deutlich erhöhte Proteaseaktivität (Weck roth et al., 1996, J. Invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Der matol. 106, 335) im Vergleich zur akuten Wunde. Dem steht eine deutlich verringerte Menge an Proteaseinhibitoren gegenüber (Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Dermatol. 106, 335). Durch dieses Ungleichgewicht kommt es zu einem proteolytischen Abbau von proliferationsfördernden Substanzen wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren (Wla schek et al., 1997, Brit. J. Dermatol., 137, 646). Enzyme wie zum Beispiel SOD und Katalase die durch ihre schützende Wirkung wundheilungsfördernd wirken, würden dadurch proteolytisch abgebaut und somit unwirksam. Ein proteinhaltiges Hydrogel in das solche Enzyme kovalent eingearbeitet sind, wirkt als Schutzschild und kann den Angriff von Proteasen verhindern, wie mit Polyethylenglykol modifizierten gelösten Enzymen gezeigt wurde (Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Inada et al., 1995, Tibtech, 13, 86).

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es somit nicht nur möglich, ein feuchtes Wundmilieu zu generieren, um den Heilungsprozeß chronischer Wunden zu verbes sern, sondern der Heilungsprozeß kann auch erfindungsgemäß dadurch weiter beschleunigt werden, zum Beispiel durch die oben genannten Umwandlungs prozesse.

Anschließend werden Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Hydrogeles näher erläutert.

In übersichtlicher Form stellt sich ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Hydrogele wie folgt dar:

a) Wasserfreie PEGs werden in Lösungsmittel mit Diisocyanat gegebenenfalls unter Zusatz eines Katalysators umgesetzt,
b) das resultierende Produkt aus aktiviertem PEGs wird vom Lösungsmittel durch Abfiltern, Waschen oder Trocknung befreit,
c) die aktivierten PEGs werden in wäßriger Lösung mit Proteinen umgesetzt, wobei sich die Proteine in einem Puffer befinden, der bevorzugt so gewählt ist, daß die Proteine ihre biologische Aktivität erhalten,
d) gegebenenfalls werden Reinigungsschritte und Waschungen vorgenommen.

Vorzugsweise wird das Hydrogel anschließend dehydratisiert.

Das erfindungsgemäße Hydrogel ist besonders vorteilhaft als Wundauflage insbe sondere für tiefe und flächige chronische Wunden sowie Brandwunden geeignet.

Des weiteren zeigt das Hydrogel vorteilhafte Eigenschaften als Auflage auf gegebe nenfalls luft- und wasserdampfdurchlässigen Trägermaterialien wie Binden, Kompres sen, Pflastern, Folien, Filmen und dergleichen.

Im folgenden werden die einzelnen Verfahrensschritte intensiver beschrieben.

Herstellung von aktivierten α,ω-Diisocyanato-Polyethylenglykolen

Die Experimente zur Herstellung eines aktivierten Polyethylenglykols werden wie folgt beschrieben durchgeführt.

Polyethylenglykol verschiedener Molmassen (6000-35.000 g/mol) werden durch kovalente Verknüpfung von aliphatischen Diisocyanaten, unter Ausbildung von Urethanbindungen in α,ω-Diisocyanato-Polyethylenglykolen überführt. Um eine Hydrolyse der eingesetzten Isocyanatgruppen zu vermeiden, wird das PEG vor der eigentlichen Verwendung dehydriert. Dazu werden 1.0 mmol PEG in 60 ml Benzol gelöst und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das dabei gebildete Benzol-Wasser Azeotrop wird für 7 h im Hochvakuum abgetrennt. 1.0 mmol des so dehydratisierten PEG werden unter Aufrechterhaltung einer Argonatmosphäre in 50 ml abs. Dichlor methan gelöst. Zu dieser Lösung werden beispielsweise 10 mmol Hexamethylendi isocyanat und 1 ml abs. Pyridin gegeben und für 12 h bei RT gerührt. Die Reaktions lösung wurde durch zweimaliges Umfällen in 800 ml abs. Petrolether 35/60 aufgear beitet. Das kristalline Produkt wurde über einen Büchnertrichter abgefiltert und mit abs. Petrolether 35/60 (2 × 100 ml) gewaschen. Nach 8 h Trocknung im Hochvakuum wird das aktivierte PEG in einer Argonatmosphäre bei -20°C gelagert.

Für die Aktivierung der PEG können erfindungsgemäß neben 1,6-Hexamethylendi isocyanat auch andere aliphatische oder aromatische Diisocyanate eingesetzt wer den, beispielsweise 1,12-Dodecandiisocynat, Isophorondiisocyanat, Methylcyclo hexan-2,4- und/oder -2,6-diisocyanat, Dicyclohexylmethan-2,4'- und/oder -4,4'-diiso cyanat ferner Cyclobutan-1,3-diisocyanat, Cyclohexan-1,3- und 1,4-diisocyanat, 2,4- und/oder 2,6-Hexahydrotoluylendiisocyanat, Hexahydro-1,3- und/oder -1,4-phenylen diisocyanat sowie 1,3- und 1,4-Phenylendiisocyanat, 2,4- und 2,6-Tolylendiisocyanat, Diphenylmethan-2,4'- und/oder -4,4'-diisocyanat und Naphthylen-1,5-diisocyanat.

Herstellung von proteinhaltigen Hydrogelen

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die neuheitliche Reaktion der α,ω-Diiso cyanato-Polyethylenglykole mit Proteinen unter Bildung proteinhaltiger Hydrogele im Vergleich zu der 4-Nitrophenylchloroformiat-Aktivierung mit erheblich kürzeren Gelbil dungszeiten verbunden ist.

Fig. 1 ist die graphische Darstellung der Abhängigkeit der Gelbildungszeit in Abhän gigkeit vom Molekulargewicht der eingesetzten α,ω-Diisocyanato-Polyethylenglykole und dem pH-Wert der Reaktionslösung. Dabei ist auf der x-Achse das Molekular gewicht der eingesetzten PEG in Gramm/Mol und auf der y-Achse die Gelbildungs zeit in Sekunden dargestellt. Desweiteren sind drei 0.1 M Boratpufferlösungen unter schiedlicher pH-Werte dargestellt (○ = pH 9.5, = pH 9.0, Δ = pH 8.5).

Fig. 2 ist die graphische Darstellung der Abhängigkeit der maximal aufnehmbaren Wassermenge von der Ionenstärke der Inkubationslösung. Der prozentuale Was seranteil am Gesamtgewicht der Hydrogele ist auf der x-Achse dargestellt, während auf der y-Achse die Ionenstärke der Inkubationslösung in Form der Boratkonzentra tion, aufsteigend von 0-0.2 Mol pro Liter, aufgeführt ist. Der dargestellte Versuch erfolgte mit Hydrogelen der Zusammensetzung 100 mg PEG₁₅₀₀₀ und 35 mg BSA.

Wie oben beschrieben, war es bisher nicht möglich, andere als albuminartige Pro teine isoliert, in dreidimensionaler Form, innerhalb einer Hydrogelmatrix zu immobili sieren. Erfolgte eine beobachtbare Gelbildung mit anderen Proteinen bzw. Enzymen, lösten sich diese innerhalb weniger Minuten wieder auf (siehe US 5,733,563) und lediglich eine Immobilisierung als ternäres System, bestehend aus PEG/BSA/Enzym, konnte erzielt werden (Fortier et al. 1996. Enz. Microbiol. Technol 18, 482).

Überraschenderweise stellte sich weiterhin heraus, daß die beschriebene Form der PEG-Aktivierung über Diisocyanate, eine Immobilisierung anderer Proteine und Enzyme, als albuminartige, zuläßt, so Superoxiddismutase (SOD) aus Rind und Hefe. Hierzu werden 44 mg Superoxiddismutase in 2 ml 0.1 m Boratpuffer gelöst und mit 150 mg PEG verschiedener Molekulargewichte versetzt. Nach erzielter Vernetzung werden die SOD-Hydrogele analog zu den BSA-Hydrogelen durch Inkubation in phy siologischem Boratpuffer gewaschen und die Waschlösung auf unvernetztes PEG und Enzym hin untersucht. Hierbei wird festgestellt, daß unter bestimmten Voraus setzungen eine Gelbildung erfolgt, so daß sich ein stabiles SOD-Hydrogel ergibt. Als ein wesentlicher Faktor erweist sich dabei das Molekulargewicht und damit die Ket tenlänge, der eingesetzten Polyethylenglykole. Oberhalb eines Molekulargewichtes von PEG₂₀₀₀₀ ist eine Gelbildung nur mehr schwerlich möglich.

Um eine Abschätzung über die Beibehaltung der Enzymaktivität zu erhalten, werden Proben der hergestellten SOD-Hydrogele mithilfe des NBT-Nachweises (Auclair and Voisin, 1985, in: CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC Press Inc., Boca Raton) hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht. Da sich dieser Test nur zur quantitativen Bestimmung gelöster SOD eignet, lassen sich damit nur qualitative Aussagen über das Vorhandensein von Aktivität immobilisierter SOD treffen. Die erzielten Ergebnisse lassen jedoch darauf schließen, daß die Immobilisierung inner halb der Gelmatrix keinen signifikanten Einfluß auf die Aktivität des Enzyms zu neh men scheint. Auch nach mehrwöchiger Lagerung bei unterschiedlichen Temperatu ren (4°C, 25°C, 37°C), anschließender Dehydratisierung im Hochvakuum und erneutem Quellen in Inkubationslösung, kann eine unverändert vorhandene Enzy maktivität beobachtet werden.

Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden die Versuche auf andere Enzyme aus geweitet. Dabei wurde die Vernetzungsmöglichkeit folgender Enzyme getestet:

- Katalase aus Rind
- Lysozym aus Hühnereiweiß und
- Collagenase aus achromobacter iophagus.

Mit allen genannten Enzymen kann ein stabiles Hydrogel erzielt werden, wobei der limitierende Faktor die Kettenlänge des eingesetzten PEG-Molekül ist.

Tabelle 1

Vernetzungsmöglichkeiten von verschiedenen Proteinen und Enzymen mit α,ω- Diisocyanato-PEG.

Alle Versuche erfolgten in 2 ml 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) mit 150 bis 300 mg PEG und 35 bis 100 mg Protein/Enzym.

Methode zur Waschung der proteinhaltigen Hydrogele

Nach vollendeter Vernetzung werden die Hydrogele bei RT in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 0.1 m MgCl₂, 0.1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) inkubiert. Nach jeweils 12 Stunden wird die Inkubationslösung gewechselt und der erhaltende Überstand auf ausgewaschenes Protein und PEG hin untersucht. Die Evaluation der resultierenden Mengen an Protein erfolgt mithilfe des BCA- und Micro BCA-Nachwei ses (Rhoderick, Jarvis and Hyland, 1989, Anal. Biochem., 180, 136) und die Bestim mung der eluierten Mengen an PEG mithilfe des Jod-Nachweises (Sims and Snape, 1980, Anal. Biochem., 107, 60).

Das Ende der Waschung ist dann erreicht, wenn weder Protein noch PEG in der Waschlösung detektierbar sind (zwischen 48-72 h Inkubation). Anschließend wer den die Hydrogele entweder in dehydratisierter (siehe Methode zur Dehydratisierung proteinhaltiger Hydrogele) oder in gequollener Form bei RT gelagert.

Methode zur Dehydratisierung der proteinhaltigen Hydrogele

Nach Abschluß des Waschvorganges werden die Gele im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz dehydratisiert und erneut in Pufferlösungen inkubiert, um so die Abhängigkeit der Wasseraufnahme von verschiedenen Faktoren wie pH-Wert und Ionenstärke der Hydrogele zu untersuchen. Das Quellen der Gele wird, bis zum Erreichen der maximalen Wasseraufnahmekapazität, durch regelmäßige Gewichts bestimmung verfolgt, wobei die Inkubationslösung alle 12 h gewechselt wird. Der Quellfaktor (SF) [Gleichung 3] und der maximale Wassergehalt (EWC) [Gleichung 4] werden durch zwei mathematische Beziehungen beschrieben, die zur Bestimmung des Quellverhaltens von Polyvinylalkohol-Hydrogelen benutzt werden (Urushisaki et al., 1990, Int. J. Pharm., 58, 135):

Quellfaktor (SF) = (W_s-W_d)/W_d (3)

Hierbei entspricht W_s dem maximal erreichbaren Quellgewicht und W_d dem Trocken gewicht der Hydrogele. Dieses Trockengewicht wird nach Abschluß der Unter suchungen durch Trocknung der Gele bei 70°C, über einen Zeitraum von 24 h bestimmt.

Aus diesen gewonnenen Daten läßt sich auch der prozentuale Anteil des Wassers am Gesamtgewicht der Hydrogele bestimmen:

EWC = (Gewicht Wasser/Gewicht gequollenes Hydrogel) × 100 (4)

Versuche hinsichtlich des Quellverhaltens bei unterschiedlichen pH-Werte und Ionenstärken der Inkubationslösungen haben gezeigt, daß ein direkter Zusammen hang zwischen diesen Parametern und dem Quellvermögen der Hydrogele besteht. Bewirkt zum Beispiel die Erhöhung der Ionenstärke der Inkubationslösung eine Abnahme der Wasseraufnahmekapazität, so läßt sich bei der Variation des pH-Wer tes der Inkubationslösung der gegenläufige Effekt beobachten. Hier führt die Erhö hung des pH-Wertes zu einer Zunahme der Wasseraufnahmekapazität.

Der Einfluß des Molekulargewichtes der eingesetzten Polyethylenglykole auf das Quellverhalten der resultierenden Hydrogele ist in Tabelle 1 detailliert aufgeführt.

Tabelle 2

Evaluierung der Quellparameter (Quellfaktor SF und Wassergehalt EWC) verschie dener Hydrogele folgender Zusammensetzung: 100 mg α,ω-Diisocyanato-PEG_x und 35 mg BSA in 2 ml 0.1 m Boratpufferlösung (pH 9.0).

Die Bestimmung der Quellparameter erfolgte nach 72 h Inkubation in physiologi schem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 1 m MgCl₂, 1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) bei RT und 24 h Trocknung bei 70°C.

Hierbei ist zu beobachten, daß eine stetige Zunahme der Wasseraufnahmekapazität in Richtung höherer eingesetzter Molekulargewichte von PEG vorliegt. Eine Wieder holung des Versuches nach durchgeführter Trocknung der Hydrogele (Dehydratisie rung im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz) zeigt eine Irreversibilität hinsichtlich der maximalen Wasseraufnahmekapazität auf. Tatsächlich liegen die Wassergehalte nach erneutem Quellen, in Anschluß an einen Trocknungsschritt, bei 60-70% der vor dem Trocknen erreichbaren Wassergehalte.

Hinsichtlich der Sauerstoffdurchlässigkeit der vorliegenden Hydrogele kann ange nommen werden, daß ab einem Wassergehalt < 94% die Sauerstoffdiffusion inner halb der Hydrogele der einer wäßrigen Lösung entspricht (Corkhill et al. 1990, Crit. Rev. Biocompatibility., 5, 363).

Methode zur Aktivitätsbestimmung von SOD

Für die Messung der Aktivität der verschiedenen SOD-Enzyme wurde der Biotech SOD-525-Assay (OXIS International S. A., Frankreich) eingesetzt. Dieser Assay basiert auf dem durch SOD verursachten Anstieg der Geschwindigkeitskonstante der Autooxidationsreaktion des Catechols 5,6,6a,11b-Tetrahydro-3,9,10-Trihydroxy benzo[c]fluoren (BXT-01050) in wäßriger alkalischer Lösung (Nebot et al., 1993, Analytical Biochemistry, 214, 442). Diese Autooxidationsreaktion erzeugt ein Chromophor mit einer maximalen Absorption bei 525 nm. Der Assay wird in einem luftgesättigten Puffer mit 50 mM 2-Amino-2-Methyl-1,3-Propandiol, 0.1 mM Diethy lentriaminpentaessigsäure und 3 mM Borsäure, pH 8.8, bei 37°C durchgeführt. Kine tiken werden bei 525 nm innerhalb einer Minute nach Zugabe von BXT-01050 gemessen. Die SOD-Aktivität wird bestimmt durch das Verhältnis der Geschwindig keitskonstante der Autooxidationsreaktion V_s/V_c, die in Gegenwart (V_s) und in Abwe senheit (V_c) der Probe gemessen wird. Eine SOD-Einheit (U-525) wird definiert als die Aktivität, die den Hintergrund der Autooxidationsreaktion verdoppelt, das heißt V_s/V_c = 2.

Methode zur Aktivitätsbestimmung von Katalase

Katalase (EC 1.11.1.6, Boehringer Mannheim) katalysiert die Spaltung von Wasser stoffperoxid (H₂O₂) in Sauerstoff und Wasser. Die Aktivitätsbestimmung des gelösten Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischen Assay modifiziert nach R.F. Beers und I.W. Sizers (J. Biol. Chem. 195, 133 (1952)). Die Extinktionsabnahme bei 240 nm korreliert hierbei mit der Abnahme von Wasserstoffperoxid durch Katalase-Akti vität im Reaktionsgemisch.

In einer Quarzküvette (Hellma, Jena) werden 3 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7.0) (Referenzposition) bzw. 3 ml eines mit H₂O₂ versetzten Phosphatpuffers (0,05 mM, pH 7) (Probe) mit je 0,05 ml der Katalase-haltigen Probe gegeben. Dabei wird die Wasserstoffperoxidkonzentration in dem H₂O₂-haltigen Puffer durch Extinktionsmes sung bei 240 nm kontrolliert, deren Absorption bei 0,500 ± 0,01 liegt. Nach Mischen der Komponenten in den Quarzküvetten (Schichtdicke 10 mm) wird die Reaktion solange beobachtet, bis die Extinktion einen Wert von 0,450 erreicht. Ab dann wird mit einer Stoppuhr diejenige Zeitspanne erfaßt, die benötigt wird, die Extinktion auf 0,400 zu vermindern. Die Enzymkonzentration in der Küvette wird dahingehend angepaßt, daß die hierfür benötigte Zeit 20 s ± 2 s beträgt. Die Errechnung der Volumenaktivität erfolgt nach folgender Formel:

Volumenaktivität [U/ml] = (17 × 13)/gestoppte Zeit [s] × 0,05
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]

Ein Unit ist dabei definiert als diejenige Enzymaktivität, die 1 µmol Wasserstoffper oxid unter den gewählten Assaybedingungen (25°C, pH 7.0) pro Minute dispropor tioniert.

Methode zur Aktivitätsbestimmung von Collagenase

Collagenase (EC 3.4.24.3, Boehringer Mannheim) katalysiert die hydrolytische Spaltung von N-(3[2-Furyl]Acryolyl)-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) (Sigma Chemical Steinheim) an der Peptidbindung des Substrates zwischen den Aminosäuren Leucin und Glycin. Die Aktivitätsbestimmung des gelösten Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischen Assay modifiziert nach H.E. von Wart und D.R. Steinbrink (Anal. Biochem. 113, 356 (1981)). Die Extinktionszunahme bei 345 nm korreliert hierbei mit der Freisetzung von gefärbtem N-(3-[2-Furyl]Acryloyl)-Leu aus dem Substrat durch Collagenase-Aktivität im Reaktionsgemisch.

In einer Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm, Hellma Jena) werden 2.9 ml Pufferlösung (50 mM Tricin, 10 mM Calciumchlorid, 400 mM Natriumchlorid, pH 7.5) mit 0.1 ml der collagenasehaltigen (2 units/ml) Probe (Probenposition) bzw. mit 0.1 ml destilliertem Wasser (Referenzposition) versetzt. Nach Mischen der Komponenten in den Quarz küvetten und Temperatureinstellung auf 25°C wird die resultierende Extinktionsdifferenz über einen Zeitraum von fünf Minuten bei 345 nm kontrolliert. Die Berechnung der Volumenaktivität der Probe erfolgt nach folgender Formel:

Volumenaktivität der Probe [U/ml] = DE nm/min Probe - DE nm/min Referenzposition/(0.53) × (mg Enzym/ml Reaktions mix) DE = Extinktionsdifferenzdifferenz
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]

Eine Unit ist definiert als diejenige Enzymaktivität, die 1.0 mmol FALGPA unter den gewählten Assyaybedingungen (25°C, pH 7.5) pro Minute hydrolisiert.

Methode zur Aktivitätsbestimmung von Trypsin

Trypsin (EC 3.4.21.4, Sigma Chemical Steinheim) katalysiert die Spaltung von Peptid bindungen am C-terminalen Ende der Aminosäuren Arginin und Lysin. Die Aktivitäts bestimmung des gelösten Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischem Assay modifiziert nach Hummel (Can. J. Biochem. Physiol. 37, 1393 (1959)). Die Extinktions zunahme bei 257 nm korreliert mit der Freisetzung von p-Toluolsulfonyl-I-arginin aus p- Toluolsulfonyl-I-arginin-methylester (Sigma Chemical Steinheim).

In einer Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm, Hellma Jena) werden 2.6 ml Pufferlösung (0.65 m Tris(hydroxymethyl)-amminomethan, 11 mM Calciumchlorid-Dihadrat, pH 8.1) und 0.3 ml Substratlösung (10 mM p-Toluolsulfonyl-I-arginin-methylester) gegeben und mit 0.1 ml Enzymlösung (0.5 U/in 1 ml 0.001 n Salzsäure) versetzt. Nach Mischen in der Quarzküvette und Temperatureinstellung auf 25°C wird die Extinktionszunahme über einen Zeitraum von fünf Minuten gegen destilliertes Wasser bestimmt, wobei ein kon stanter Wert pro Minute ermittelt wird. Die Berechnung der Volumenaktivität der Probe erfolgt nach folgender Formel:

Volumenaktivität der Probe [U/ml] = DE nm/min Probe × Probevolumen ×/(0.54) × (mg Enzym/ml Reaktionsmix) DE = Extinktionsdifferenzdifferenz
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]

Eine Unit ist definiert als diejenige Enzymaktivität, die die Bildung von 1 mmol p-Toluol sulfonyl-I-arginin unter den gewählten Assyaybedingungen (25°C, pH 7.5) pro Minute bewirkt.

Methode zur Aktivitätsbestimmung von Elastase

Elastase (EC 3.4.21.36, Sigma Chemical Steinheim) katalysiert die Spaltung von zum Beispiel Elastin in Aminosäuren und Peptide. Die Aktivitätsbestimmung des gelösten Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischem Assay modifiziert nach Sacher et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90, 1955 (1955)). Die Extinktionszunahme bei 590 nm korre liert mit der hydrolytischen Freisetzung von Orcein aus Elastin-orcein (Sigma Chemical Steinheim).

In einem Erlenmeyerkolben werden 20 mg Elastin-orcein eingewogen und mit 1.5 ml Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid (197 mM, pH 8.8) versetzt und auf 37°C temperiert. Nach Zugabe von 0.5 ml Enzymlösung wird der Kolben verschlossen und bei 37°C gelagert. Durch Zugabe von 2 ml Phosphatpufferlösung (500 mM, pH 6.0) wird die Reaktion nach 20 Minuten unterbrochen. Der Ansatz wird filtriert und der Kolben mit 1 ml destilliertem Wasser gespült. In einer Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm, Hellma Jena) wird die Extinktion von 3 ml Probenlösung gegen 3 ml einer Referenzposition (2.0 ml Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid (197 mM, pH 8.8), 2.0 ml Phosphat pufferlösung (500 mM, pH 6.0) und 1.0 ml destilliertes Wasser) bei 590 nm bestimmt. Die Berechnung der Volumenaktivität der Probe erfolgt nach folgender Formel:

Volumenaktivität der Probe [U/ml] = E₅₉₀ × 19.45-0.1185 = mg gespaltenes Elastin-orcein mg gespaltenes Elastin-orcein/(mg Enzym/0.5 ml Reaktionsmix)
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]

Eine Unit ist definiert als diejenige Enzymaktivität, die innerhalb von 20 min 1 mg Elastin unter den gewählten Assyaybedingungen (37°C, pH 8.8) spaltet.

Im folgenden sollen anhand mehrerer Beispiele besonders vorteilhafte Ausführungsfor men der Erfindung dargestellt werden, ohne damit die Erfindung unnötig einschränken zu wollen.

Beispiel 1 Herstellung von Hydrogelen mit Serumalbumin

Die Synthese der Hydrogels erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Albumin aus Rinderserum. Zu einer 2%igen (m/V) Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 6.5-9.0) werden verschiedene Mengen (1-20% m/V) akti viertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Anschlie ßend wird das gebildete Hydrogel 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Vernet zung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wird das Hydro gel in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 1 m MgCl₂, 1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt werden. Die dabei eluierten Mengen an Protein werden mithilfe des BCA- und Micro BCA-Nachweises (Rhoderick, Jarvis and Hyland, 1989, Anal. Biochem., 180, 136) und die eluierten Mengen an PEG mithilfe des Jod-Nachweises (Sims and Snape, 1980, Anal. Biochem., 107, 60) evaluiert.

Analog findet die Vernetzungsreaktion in 0.05 M Natriumbicarbonatpuffer mit den pH- Werten 8.5, 9.0 und 9.3 statt sowie in einem 0.1 M Natriumveronalpuffer bei pH 9.0. Die in Natriumphosphatpuffer hergestellten Hydrogele können durch Austausch in physiologischen Boratpuffer stabil gehalten werden.

Die folgende Darstellung zeigt schematisch die Vernetzung von PEG₃₅₀₀₀ mit Rinder serumalbumin (BSA).

Beispiel 2 Herstellung von Hydrogelen mit Superoxiddismutase

Das ubiquitäre Enzym SOD tritt als dimere oder tetramere Form auf. Die verschiede nen Enzyme mit Molekulargewichten von 32.000 bis 56.000 Da haben Metall-Ionen wie Kupfer und Zink (Cu-Zn-SOD), Mangan (Mn-SOD) oder Eisen (Fe-SOD) als Co- Faktoren im katalytischen Zentrum.

Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Superoxiddismutase aus Rind und Hefe. Zu einer 2%igen (m/V) Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden verschieden Mengen (6-25% m/V) aktiviertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden grünlich transparente Gele erhalten.

Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, werden die Hydrogele in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 0.1 m MgCl₂, 0.1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt werden.

Eine Gelbildung wurde für die PEG PEG₂₀₀₀₀, PEG₁₅₀₀₀, PEG₁₀₀₀₀ und PEG₆₀₀₀ beob achtet.

Beispiel 3 Herstellung von Hydrogelen mit Katalase

Die weitverbreitetste Form der Katalase ist ein Homotetramer (235.000 Da, Rinder leber) mit einer porphyrinischen Gruppe mit einem Eisenatom je Untereinheit.

Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Katalase aus Rinderleber. Zu einer 2.5%igen (m/V) Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 7.5% (m/V) aktiviertes PEG₁₀₀₀₀ bzw. 15% (m/V) aktiviertes PEG₆₀₀₀ zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden bräunlich transparente Gele erhalten.

Beispiel 4 Herstellung von Hydrogelen mit Superoxiddismutase und Katalase

Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Superoxiddismutase aus Hefe und Katalase aus Rinderleber. Zu einer 2.4%igen (m/V) Superoxiddismutase-Lösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 0.8-0.15% (m/V) Katalyse und 5% (m/V) aktiviertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden grün-bräunlich transparente Gele erhalten.

Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, werden die Hydrogele in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 0.1 m MgCl₂, 0.1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt werden. Eine Gelbildung wurde für PEG₁₀₀₀₀ und PEG₆₀₀₀ beobachtet.

Beispiel 5 Herstellung von Hydrogelen mit Collagenase

Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Collagenase aus Achromobacter iophagus. Zu einer 5%igen (m/V) Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 7.5-15% (m/V) aktiviertes PEG₁₅₀₀₀ bzw. aktiviertes PEG₁₀₀₀₀ zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden rot-bräunlich transparente Gele erhalten.

Beispiel 6 Herstellung von Hydrogelen mit Lysozym

Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ai-akti viertem PEG mit Lysozym aus Hühnereiweiß. Zu einer 2.5-0%igen (m/V) Protein lösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 7.5-15% (m/V) aktiviertes zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden milchig-trübe Gele erhal ten.

Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wird das Hydrogel in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 0.1 m MgCl₂, 0.1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt werden.

Eine Gelbildung konnte für folgende PEG beobachtet werden: PEG₃₅₀₀₀, PEG₂₀₀₀₀, PEG₁₅₀₀₀, PEG₁₀₀₀₀ und PEG₆₀₀₀.

Beispiel 7 Herstellung von Hydrogelen mit Trypsin

Die Synthese der Hydrogele erfolgte durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Trypsin aus Rind. Zu einer 2.5-5%igen (m/V) Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) wurden 7.5-15% (m/V) aktiviertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzte. Es wurden milchig-trübe Gele erhalten. Anschlie ßend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Vernetzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wurde das Hydrogel in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 0.1 m MgCl₂, 0.1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt wurden. Eine Gelbildung konnte für folgende PEG beobachtet werden: PEG₁₀₀₀₀ und PEG₆₀₀₀.

Beispiel 8 Herstellung von Hydrogelen mit Phosphatase

Die Synthese der Hydrogele erfolgte durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti viertem PEG mit Phosphatase aus Weizenkeimen. Zu einer 2.5%igen (m/V) Protein lösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) wurden 10-15% (m/V) aktiviertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzte. Es wurden bräunliche Gele erhalten. Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Vernet zung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wurde das Hydrogel in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H₃BO₃, 0.1 m MgCl₂, 0.1 m CaCl₂, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt wur den. Eine Gelbildung konnte für folgende PEG beobachtet werden: PEG₁₀₀₀₀ und PEG₆₀₀₀.

Claims

1. Hydrogel, bestehend aus zumindest einem Protein und/oder Enzym und/oder SOD/Katalase-Enzym-Mimic und PEGs sowie Teilen von Proteinen und Enzymen und/oder rekombinant hergestellten Proteinen und Enzymen, wobei die Verbin dung zwischen den Proteinen und/oder Enzymen und den PEGs über Harnstoff gruppen erfolgt.

2. Hydrogel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das PEG ein Mol gewicht von 8.000 bis 18.000 g/mol, insbesondere 10.000 bis 15.000 g/mol auf weist.

3. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aktivie rung des PEGs aliphatische oder aromatische oder araliphatische Diisocyanate, insbesondere 1,6-Hexamethylen-diisocyanat, eingesetzt werden.

4. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Antikörper, Matrix-Metallo-Proteasen, Enzyminhibitoren, Peptide verwendet wer den.

5. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Radikalfänger wie Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion-Peroxidase, Myelo peroxidase und SOD/Katalase-Enzym-Mimics und/oder Kombinationen daraus verwendet werden.

6. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine antimikrobiell wirksame Enzyme wie Lysozym und Hydrolasen eingesetzt werden.

7. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine phosphorylierend wirksame Enzyme wie Phosphatasen und Kinasen eingesetzt werden.

8. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine Wachstumsfaktoren wie PDGF eingesetzt werden.

9. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine proteolytisch wirkende Enzyme wie Collagenase, Trypsin, Elastase und/oder Kombinationen daraus eingesetzt werden.

10. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Pro teine proteinogene Protease-Inhibitoren wie Aprotenin, Sojabohnen-Trypsininhibi tor und Alpha-2-Makroglobulin und/oder Kombinationen daraus eingesetzt werden.

11. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Proteine in Mischungen eingesetzt werden.

12. Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels nach zumindest einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

a) wasserfreie PEGs in Lösungsmittel mit Diisocyanat gegebenenfalls unter Zusatz eines Katalysators umgesetzt werden,
b) das resultierende Produkt aus aktiviertem PEGs vom Lösungsmittel durch Abfiltern, Waschen oder Trocknung befreit wird,
c) die aktivierten PEGs in wäßriger Lösung mit Proteinen umgesetzt werden, wobei sich die Proteine in einem Puffer befinden, der bevorzugt so gewählt ist, daß die Proteine ihre biologische Aktivität erhalten,
d) gegebenenfalls Reinigungsschritte und Waschungen vorgenommen werden.

13. Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels nach Anspruch 12, dadurch gekenn zeichnet, daß das Hydrogel dehydratisiert ist.

14. Verwendung des Hydrogels gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche als Wundauflage insbesondere für tiefe und flächige chronische Wunden sowie Brandwunden.

15. Verwendung des Hydrogels gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche als Auflage auf gegebenenfalls luft- und wasserdampfdurchlässigen Trägermaterialien wie Binden, Kompressen, Pflastern, Folien, Filmen und dergleichen.