DE19860542A1 - An enzyme fragment with hyaluronate lyase activity is derived from streptococci and used for medical applications - Google Patents
An enzyme fragment with hyaluronate lyase activity is derived from streptococci and used for medical applicationsInfo
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Abstract
Es wird ein neues, enzymatisch aktives Enzymfragment beschrieben, welches eine höhere Stabilität und ein besseres Penetrationsvermögen in feste oder gelförmige Substrate als das Holoenzym, eine Hyaluronatlyase, besitzt. Das Holoenzym kann aus einem Streptococcus der serologischen Gruppe B gewonnen werden. Das Fragment entsteht beispielsweise bei der Behandlung des Holoenzyms mit einer spezifisch spaltenden Protease. Für das Fragment werden Anwendungen im medizinischen Bereich an Stelle des Holoenzyms vorgeschlagen.A new, enzymatically active enzyme fragment is described which has a higher stability and a better penetration capacity in solid or gel-like substrates than the holoenzyme, a hyaluronate lyase. The holoenzyme can be obtained from a Streptococcus of serological group B. The fragment arises, for example, when treating the holoenzyme with a specifically cleaving protease. Applications for the fragment are proposed in the medical field instead of the holoenzyme.
Description
Hyaluronatlyasen spalten Glycosaminoglycane nach einem Eliminierungsmechanismus unter Bildung einer Doppelbindung, während die bekannteren Hyaluronidasen nach einem hydrolytischen Mechanismus spalten. Beide Enzymarten bauen die hochmolekularen Glycosaminoglycane, bevorzugt das Hyaluronat, zu kleineren Bruchstücken ab.Hyaluronate lyases cleave glycosaminoglycans using an elimination mechanism to form a double bond, while the better known hyaluronidases after one cleave hydrolytic mechanism. Both types of enzyme build the high molecular ones Glycosaminoglycane, prefers hyaluronate, to smaller fragments.
Unterschiede zwischen den beiden Enzymtypen können im Verhalten gegenüber unterschiedlichen Glycosaminoglycanen, in der Stabilität, in der Penetrationsgeschwindigkeit sowie gegenüber Inhibitoren auftreten. Hyaluronat kommt beispielsweise im menschlichen bzw. tierischen Körper in der extrazellulären Matrix, in der Gelenkflüssigkeit und im Kammerwasser der Augen vor. In der Medizin wird Hyaluronidase tierischer Herkunft beispielsweise zur Behandlung von atheromatösen Plaques, zur Penetrationsverbesserung bei der intramuskulären Wirkstoffapplikation, in der transdermalen Therapie als Penetrationsstimulator und in der Tumortherapie eingesetzt bzw. sie wird für diese Anwendungen vorgeschlagen. Vorteilhaft bei medizinischem Einsatz von glycosaminoglycanspaltenden Enzymen aus Mikroorganismen ist, daß das Enzym oder Enzymfragment keine Viren oder immunogenes bzw. infektiöses Fremdeiweiß aus dem tierischen Organismus übertragen kann. Technische Anwendungen liegen weiterhin in der Leder- und in der fleischverarbeitenden Industrie.Differences between the two types of enzyme may differ in behavior different glycosaminoglycans, in stability, in which Penetration rate and inhibitors occur. Hyaluronate is coming for example in the human or animal body in the extracellular matrix in which Synovial fluid and in the aqueous humor of the eyes. In medicine Hyaluronidase of animal origin, for example for the treatment of atheromatous Plaques, to improve penetration during intramuscular drug application, in the transdermal therapy used as a penetration stimulator and in tumor therapy or it is suggested for these applications. Advantageous for medical Use of glycosaminoglycan-cleaving enzymes from microorganisms is that Enzyme or enzyme fragment no viruses or immunogenic or infectious foreign protein can be transferred from the animal organism. Technical applications lie still in the leather and meat processing industries.
Für die erfindungsgemäßen Fragmente werden die gleichen Anwendungsgebiete vorgeschlagen wie sie für Hyaluronatlyasen und Hyaluronidasen beschrieben werden.The same fields of application are used for the fragments according to the invention proposed as described for hyaluronate lyases and hyaluronidases.
Bisher sind keine Enzymfragmente bekannt, bei denen eine Herkunft zu einer mikrobiellen Hyaluronatlyase an Hand identischer Abschnitte in der Aminosäuresequenz erkennbar ist oder die aus ihr hergestellt werden. Es sind demnach auch keine Verfahren bekannt, mit denen aus Hyaluronatlyasen enzymatisch aktive Fragmente hergestellt werden.So far, no enzyme fragments are known in which an origin to a microbial Hyaluronate lyase is recognizable on the basis of identical sections in the amino acid sequence or that are made from it. Accordingly, no methods are known with which are made from hyaluronate lyases enzymatically active fragments.
Dagegen ist es Stand der Technik, Proteine mit Hilfe von Proteasen zu spalten, um für die Sequenzierungen - in der Regel nicht enzymatisch aktive - Proteinbruchstücke zu erhalten.In contrast, it is state of the art to cleave proteins with the help of proteases in order for Sequencing - usually not enzymatically active - to obtain protein fragments.
Es ist das Ziel der Erfindung, ein enzymatisch aktives Enzymfragment mit einer glycosaminoglycanspaltenden Aktivität, insbesondere mit einer Hyaluronatlyase-Aktivität auf einfachem Weg aus einer Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft als Holoenzym zu erhalten.It is the aim of the invention to provide an enzymatically active enzyme fragment with a glycosaminoglycan-cleaving activity, in particular with a hyaluronate lyase activity in a simple way from a hyaluronate lyase of microbial origin as a holoenzyme receive.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein glycosaminoglycanspaltendes Enzymfragment. Glycosaminoglycanspaltende Enzyme sind Enzyme, die im Fall der Hyaluronatlyasen hochmolekulare Hyaluronsäure nach einem Eliminierungsmechanismus in ungesättigte Oligo- und/oder Tetrasaccharide spalten.The present invention relates to a glycosaminoglycan-cleaving enzyme fragment. Glycosaminoglycan-cleaving enzymes are enzymes that are used in the case of hyaluronate lyases high molecular hyaluronic acid by an elimination mechanism in unsaturated Split oligosaccharides and / or tetrasaccharides.
Die meisten mikrobiellen Hyaluronatlyasen sind hochmolekulare Proteine mit Molmassen zwischen 116.000 bis 120.000 Dalton. Diese hochmolekularen Hyaluronatlyasen sind zumeist relativ empfindlich gegenüber denaturierenden Agentien und extremen physiologischen Bedingungen. Insbesondere bei der Zubereitung von pharmazeutischen und veterinärmedizinischen Formulierungen kann es zu beträchtlichen Aktivitätsverlusten durch Denaturierungsvorgänge kommen. Darüber hinaus ist die Diffusionsfähigkeit des relativ großen Holoenzyms wesentlich geringer als die Diffusionsfähigkeit kleiner Moleküle. Hierdurch wird die Diffusion und damit die Penetrationsförderung der hochmolekulare Hyaluronatlyasen in Geweben eingeschränkt.Most microbial hyaluronate lyases are high molecular weight proteins with molecular weights between 116,000 to 120,000 daltons. These are high molecular weight hyaluronate lyases mostly relatively sensitive to denaturing agents and extreme physiological conditions. Especially when preparing pharmaceuticals and veterinary formulations can cause significant loss of activity come through denaturing processes. In addition, the diffusibility of the relatively large holoenzyme much less than the diffusivity smaller Molecules. As a result, the diffusion and thus the penetration promotion high molecular hyaluronate lyases in tissues restricted.
Es ist Teil der Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kleineres Protein bzw. Fragment mit Hyaluronatlyaseaktivität zu beschreiben und ein Verfahren zu seiner Herstellung anzugeben. Das Fragment soll ähnliche oder gleiche enzymatischen Aktivitätseigenschaften wie die hochmolekulare Hyaluronatlyasen aufweisen.It is part of the object of the present invention to create a smaller protein or fragment describe with hyaluronate lyase activity and a process for its preparation specify. The fragment is said to have similar or identical enzymatic activity properties as the high molecular hyaluronate lyases have.
Überraschend wurde gefunden, daß durch proteolytische Verdauung mit einer Protease, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spaltet, Hyaluronatlyase mikrobieller Herkunft in ein Fragmente gespalten wird, welches enzymatisch aktiv ist und Hyaluronatlyaseaktivität aufweist. In einem Beispiel wird die Hyaluronatlyase aus einem allgemein verfügbaren Mikroorganismus, einem Streptococcus der Art Streptococcus agalactiae, mit einem Molekulargewicht von 116.000 Dalton in ein enzymatisch aktives Hyaluronatlyase-Fragment gespalten. Das Fragment besitzt eine Molmasse von 84.000-86.000 Dalton. In seiner Spaltspezifität besteht keine Unterschiede zu der unverdauten Hyaluronatlyase (Holoenzym). Gegenüber dem Holoenzym zeichnet es sich das Fragment jedoch durch eine deutlich höhere Stabilität in wäßrigen Lösungen und gegenüber denaturierenden Agentien aus. Das Fragment besitzt eine spezifische Aktivität zwischen 400.000 IU/mg bis 800.000 IU/mg und weist damit gegenüber dem Holoenzym mit einer spezifischen Aktivität von 400.000 IU/mg die gleiche beziehungsweise sogar eine höhere spezifische Aktivität auf.Surprisingly, it was found that by proteolytic digestion with a protease, which cleaves the C-terminal peptide bond of aromatic amino acids, Hyaluronate lyase of microbial origin is split into fragments which is enzymatically active and has hyaluronate lyase activity. In one example, the Hyaluronate lyase from a commonly available microorganism, a Streptococcus of the species Streptococcus agalactiae, with a molecular weight of 116,000 daltons in one enzymatically active hyaluronate lyase fragment cleaved. The fragment has one Molar mass of 84,000-86,000 daltons. There is no difference in its column specificity to the undigested hyaluronate lyase (holoenzyme). Draws opposite the holoenzyme However, the fragment is characterized by a significantly higher stability in aqueous solutions and towards denaturing agents. The fragment has a specific one Activity between 400,000 IU / mg to 800,000 IU / mg and thus points to that Holoenzyme with a specific activity of 400,000 IU / mg the same or even a higher specific activity.
Ohne die Erfindung dadurch einzuschränken, soll beispielhaft ein Weg zur Gewinnung des Fragmentes beschrieben werden. Erfindungsgemäß werden Proteasen zur Verdauung eingesetzt, welche die C-terminale Peptidbindung von aromatischen Aminosäuren spalten. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Metalloprotease MO/2 eingesetzt, die aus dem Kulturfiltrat von Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40) hergestellt wird. MO/2 ist ein Metalloenzym mit Co++ im aktiven Zentrum (Müller et al. DD 270 924). Die Proteasen erden bevorzugt in gereinigter Form eingesetzt. Die Reinigung der Protease MO/2 erfolgt beispielsweise durch Chromatografie an Phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S 100 mit einem Anreicherungsfaktor von 20. Die spezifische Aktivität liegt bei 0,25 Kunitz Units/mg (U/mg), das Reaktionsmaximum bei einer Azidität von pH = 4,2 und das Reaktionstemperaturmaximum bei 65°C. Das Molekulargewicht (Mm.) des Enzyms, bestimmt durch SDS Gelelektrophorese und Molekulargewichtschromatografie an Sephadex G50 superfine beträgt Mr = 14.000 bis 15.000 D. Die Protease MO/2 ist eine Endopeptidase mit einem Isoelektrischen Punkt bei IP = 3,85 und einem bei I = 3,92. Das Enzym hydrolysiert natürliche Polypeptide wie Kasein, Hämoglobin, Bovineserum, Albumin und Ovalbumin.Without restricting the invention thereby, a way to obtain the example Be described fragment. According to the invention, proteases are used for digestion used which cleave the C-terminal peptide bond of aromatic amino acids. In a preferred embodiment, the metalloprotease MO / 2 is used, which is prepared from the culture filtrate from Streptomyces hygroscopicus (strain AP 40). MO / 2 is a metalloenzyme with Co ++ in the active center (Müller et al. DD 270 924). The Proteases are preferably used in a purified form. The cleaning of the protease MO / 2 is carried out, for example, by chromatography on phenylsepharose, DEAE-Sepharose, Q-Sepharose and Sephacryl S 100 with an enrichment factor of 20. The specific Activity is 0.25 Kunitz Units / mg (U / mg), the maximum reaction is acidity of pH = 4.2 and the reaction temperature maximum at 65 ° C. The molecular weight (Mm) of the enzyme determined by SDS gel electrophoresis and Molecular weight chromatography on Sephadex G50 superfine is Mr = 14,000 to 15,000 D. The protease MO / 2 is an endopeptidase with an isoelectric point at IP = 3.85 and one at I = 3.92. The enzyme hydrolyzes natural polypeptides such as Casein, hemoglobin, bovine serum, albumin and ovalbumin.
Vorteilhaft an der Anwendung von MO/2 ist, daß das Enzym Proteine sehr spezifisch spaltet bzw. eine sehr geringe allgemeine Verdauungsaktivität gegenüber Proteinen besitzt. Das Enzym spaltet fast ausschließlich nur die Peptidbindungen des C-terminalen Restes von den aromatischen Aminosäuren. Es besitzt eine esterolytische Aktivität gegenüber N-benzoyl-L-proline nitroanilid und ausgeprägte milchfällende Eigenschaften. Die Eigenschaften der Milchfällung, die an der Bildung eines langzeitstabilen Kaseingels nachweisbar ist, vergleichbar mit dem Gel, welches bei der Milchfällung mit dem sehr spezifisch wirkenden Labenzym auftritt, sind als weiterer Hinweis auf die begrenzte, für die Erfindung sehr vorteilhafte Aktivität der Protease MO/2 zu werten, die Bindungen des Holoenzyms spezifisch zu spalten, ohne zu einem Abbau der Fragmente zu führen.An advantage of using MO / 2 is that the enzyme proteins are very specific cleaves or has a very low general digestive activity towards proteins. The enzyme almost exclusively cleaves only the peptide bonds of the C-terminal residue of aromatic amino acids. It has an esterolytic activity towards N-benzoyl-L-proline nitroanilide and pronounced milk-removing properties. The Properties of milk precipitation, which contribute to the formation of a long-term stable cheese gel is detectable, comparable to the gel, which with the milk precipitation with the very specific acting labenzyme occurs are a further indication of the limited, for the invention very advantageous activity of the protease MO / 2 to evaluate the bonds of the Specifically cleave holoenzyme without breaking down the fragments.
In einer weiteren Ausführung der Erfindung wird die Protease MO/2 an geeignete unlösliche Immobilisierungssupporte gebunden und in dieser Form zur Spaltung des Holoenzyms eingesetzt. Vorteilhaft an dieser Vorgehensweise ist, das auf diese Weise der Übergang gelöster Protease in die Lösungen der Fragmente verhindert wird.In a further embodiment of the invention, the protease MO / 2 is suitable insoluble immobilization supports bound and in this form to cleave the Holoenzyme used. The advantage of this approach is that it is the Transition of dissolved protease into the solutions of the fragments is prevented.
10 mg Hyaluronatlyase aus Streptoococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 0,25 g fixierter MO/2- Proteasesepharose zugesetzt, an die eine proteolytische Aktivität von 0,1 Kunitz-Einheiten/g gebunden wurden. Nach 15 Minuten wird die Proteasesepharose abgetrennt und das entstandene Fragment aus der Lösung durch Sättigung mit Ammoniumsulfat auf 80% ausgefällt. Nach 18 Stunden wird das Sediment gesammelt und in 0,05 M Tris-Puffer pH 7,5 gelöst. Das Fragment wird durch Molgewichtschromatografie an Superdex 200 gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hatte eine spezifische Aktivität von 600 000 IU/mg.10 mg hyaluronate lyase from Streptoococcus agalactiae are mixed in 1 ml 0.05 M Phosphate buffer pH 7.0 dissolved and in the thermostat to a temperature of 37 ° C tempered. 0.25 g of fixed MO / 2 protease sepharose are added to this solution which bound a proteolytic activity of 0.1 Kunitz units / g. After 15 Minutes, the protease sepharose is separated and the resulting fragment from the Solution precipitated to 80% by saturation with ammonium sulfate. After 18 hours the sediment was collected and dissolved in 0.05 M Tris buffer pH 7.5. The fragment will purified by molecular weight chromatography on Superdex 200. The active ones Fragment fractions are pooled, dialyzed against 0.05 M Tris buffer and with the addition lyophilized from albumin. The fragment had a specific activity of 600,000 IU / mg.
4 mg Hyaluronatlyase aus Streptococcus agalactiae werden in 1 ml 0,05 M Tris-HCl-Puffer pH 7,8 gelöst und im Thermostaten auf eine Temperatur von 37°C temperiert. Dieser Lösung werden 80 µg der Protease MO/2 mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Kunitz- Einheiten/mg zugefügt und das Gemisch für 30 Minuten bei 37°C verdaut. Zum Stoppen der Reaktion werden dem Gemisch 10 µl 0,1 M EDTA pH 7,0 zugesetzt. Danach wird das das Gemisch auf eine 3 ml Affinitätssäule von N-(p-Aminophenyl)oxaminsäure-Agarose aufgetragen und mit 0,05 M Na2 CO3 pH 9,7 eluiert. Das Fragment wurde durch Sättigung auf 80% Ammoniumsulfat gefällt, gesammelt und durch Molekulargewichtschromatografie gereinigt. Die aktiven Fragmentfraktionen werden vereinigt, gegen 0,05 M Trispuffer dialysiert und unter Zusatz von Albumin lyophilisiert. Das Fragment hat eine spezifische Aktivität von 460 000 IU/mg.4 mg hyaluronate lyase from Streptococcus agalactiae are dissolved in 1 ml 0.05 M Tris-HCl buffer pH 7.8 and the temperature in the thermostat is 37 ° C. 80 μg of protease MO / 2 with a specific activity of 0.1 Kunitz units / mg are added to this solution and the mixture is digested at 37 ° C. for 30 minutes. To stop the reaction, 10 μl of 0.1 M EDTA pH 7.0 are added to the mixture. The mixture is then applied to a 3 ml affinity column of N- (p-aminophenyl) oxamic acid agarose and eluted with 0.05 M Na 2 CO 3 pH 9.7. The fragment was precipitated by saturation on 80% ammonium sulfate, collected and purified by molecular weight chromatography. The active fragment fractions are pooled, dialyzed against 0.05 M Tris buffer and lyophilized with the addition of albumin. The fragment has a specific activity of 460,000 IU / mg.
0,5 ml Lösung des Hyaluronatlyasefragmentes (Beispiel 2) werden zu 0,5 ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 gegeben und in Form einer geometrischen Reihe verdünnt. Danach werden zu jeder Verdünnung 0,5 ml einer Hyaluronsäurelösung hinzugefügt, die 0,2 mg Hyaluronsäure/ml 0,1 M Acetatpuffer pH 6,0 enthält. Dieses Gemisch wird anschließend bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Die Enzymreaktion wird gestoppt, indem jede Verdünnung mit 2 ml einer 2,5%igen Cetyltrimethylammoniumbromidlösung in 2%iger Natronlauge versetzt wird. Nach 20 Minuten Stehen bei Raumtemperatur wird die Trübung in jeder Verdünnung bei 600 nm in 1 cm Küvetten vermessen und über eine Eichkurve die Menge an gespaltener Hyaluronsäure bestimmt. Fünf internationale Einheiten (IU) Hyaluronatlyasefragment spalten 16 µg Hyaluronsäure/min.0.5 ml solution of the hyaluronate lyase fragment (Example 2) becomes 0.5 ml 0.1 M Acetate buffer pH 6.0 and diluted in the form of a geometric series. After that 0.5 ml of a hyaluronic acid solution containing 0.2 mg Contains hyaluronic acid / ml 0.1 M acetate buffer pH 6.0. This mixture is then incubated at 37 ° C for 30 minutes. The enzyme reaction is stopped by each Dilution with 2 ml of a 2.5% cetyltrimethylammonium bromide solution in 2% Sodium hydroxide solution is added. After standing for 20 minutes at room temperature, the Measure turbidity in every dilution at 600 nm in 1 cm cuvettes and over a Calibration curve determines the amount of split hyaluronic acid. Five international Units (IU) hyaluronate lyase fragment cleave 16 µg hyaluronic acid / min.
Je 20.000 IU des Holoenzyms und des Fragments werden in 3 ml destilliertem Wasser gelöst. Beide Lösungen wurden bei Raumtemperatur 24 h aufbewahrt und anschließend die Enzymaktivität gemessen. Die Aktivität der Holoenzymlösung sinkt in diesem Zeitraum auf 60% ab, während die Aktivität der Fragmentlösung 95% der Aktivität der Ausgangslösungen beträgt.Each 20,000 IU of the holoenzyme and the fragment are in 3 ml of distilled water solved. Both solutions were kept at room temperature for 24 hours and then the Enzyme activity measured. The activity of the holoenzyme solution drops during this period 60% decrease, while the activity of the fragment solution 95% of the activity of the Starting solutions is.
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