DE19840435A1

DE19840435A1 - New vitamin D derivatives useful as competitive binding reagents in specific binding assays for vitamin D metabolites

Info

Publication number: DE19840435A1
Application number: DE19840435A
Authority: DE
Inventors: Franz Paul Armbruster; Jens Schwing; Wolfgang Voelter; Christian Birkmayer
Original assignee: Biomedica Wien GmbH; IMMUNDIAGNOSTIK GmbH
Current assignee: Immundiagnostik AG
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1998-09-04
Publication date: 1999-12-30
Also published as: DE59908120D1

Abstract

Vitamin D derivatives (I) with a label attached to a spacer group in the 3 position are new. Vitamin D derivatives of formula (I) are new: X = an optionally substituted hydrocarbon group with a length of 0.8-4.2 nm, optionally containing heteroatoms, e.g. S, O, N or P; Y = H or OH; A = a label capable of binding with high affinity to a protein; R = an optionally substituted hydrocarbon side chain of a D vitamin or a D vitamin metabolite. AN Independent claim is also included for the preparation of (I).

Description

Die Erfindung betrifft Derivate von 25-Hydroxyvitamin-D, deren Herstellung sowie Verfahren zur Bestimmung von 25-Hydroxy- und 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D in Proben.The invention relates to derivatives of 25-hydroxyvitamin-D, their manufacture and method for determining 25-hydroxy and 1,25-dihydroxy vitamin D in samples.

Die D-Vitamine oder Calciferole entstehen aus ihren Provitaminen durch eine Sonnenlicht-katalysierte Spaltung des B-Rings im Sterangerüst. Ihre wichtigsten Vertreter sind Vitamin-D₃ (Cholecalciferol) und Vitamin-D₂ (Ergo calciferol), welche sich nur in den Seitenketten gering fügig unterscheiden, die aber - soweit bekannt - gleich metabolisiert werden und identische biologische Wirkungen besitzen. Während Provitamin-D₂ mit der Nahrung aufgenommen werden muss, kann das Provitamin-D₃ im menschlichen Organismus gebildet werden. Soweit durch Indizes nicht näher bezeichnet, umfasst die Bezeichnung Vitamin-D nachstehend allgemein alle Vitamin-D-Formen. In der Haut, gebildetes oder mit der Nahrung aufgenommenes Vitamin-D wird im Plasma vom Vitamin-D-Bindungs- oder -Transportprotein (DBP) gebunden, zur Leber transportiert und dort zu 25-Hydroxyvitamin-D (25-OH-D) metabolisiert. Das Vitamin-D-bindende Protein DBP ist auch als Gc- Globulin oder group specific component bekannt (John G. Haddad in J. Steroid Biochem. Molec. Biol. (1995) 53, pp 579-582). Über 95% des im Serum messbaren 25-Hydroxy vitamin-D ist in der Regel 25-Hydroxyvitamin-D₃. 25-Hydroxyvitamin-D₂ wird nur in höheren Anteilen gefun den, wenn die Person unter einer Medikation mit Vitamin-D₂ steht oder, wie in den Vereinigten Staaten häufig praktiziert, die Nahrung mit Vitamin-D₂ angereichert wird.The D vitamins or calciferols arise from their provitamins through a sunlight-catalyzed cleavage of the B ring in the sterane structure. Its most important representatives are vitamin D ₃ (cholecalciferol) and vitamin D ₂ (ergo calciferol), which differ only slightly in the side chains, but which - as far as is known - are metabolized immediately and have identical biological effects. While provitamin-D _{2 has to be taken up} with food, provitamin-D ₃ can be formed in the human organism. Unless otherwise specified by indices, the term vitamin D generally includes all forms of vitamin D below. Vitamin D in the skin, formed or ingested with food, is bound in plasma by the vitamin D binding or transport protein (DBP), transported to the liver and metabolized there to 25-hydroxyvitamin-D (25-OH-D) . The vitamin D-binding protein DBP is also known as Gc-globulin or group specific component (John G. Haddad in J. Steroid Biochem. Molec. Biol. (1995) 53, pp 579-582). More than 95% of the 25-hydroxyvitamin-D that can be measured in serum is usually 25-hydroxyvitamin-D ₃ . 25-Hydroxyvitamin-D ₂ is only found in higher proportions if the person is on medication with vitamin D ₂ or, as is often practiced in the United States, the diet is enriched with vitamin D ₂ .

25-Hydroxyvitamin-D ist der vorherrschende Vitamin-D- Metabolit im Blutkreislauf und seine Konzentration im Serum beschreibt allgemein den Vitamin-D-Status, d. h., inwieweit dem Organismus Vitamin-D zur Verfügung steht. 25-Hydroxyvitamin-D wird bei Bedarf in der Niere zu 1α,25-Dihydroxyvitamin-D metabolisiert, einer hormon artigen Substanz mit hoher biologischer Wirkung. Die Bestimmung von 1α,25-Dihydroxyvitamin-D gibt an, wieviel Vitamin-D sich in der aktivierten Form befinden.25-hydroxyvitamin-D is the predominant vitamin D- Metabolite in the bloodstream and its concentration in Serum generally describes the vitamin D status, i.e. H., to what extent vitamin D is available to the organism. 25-Hydroxyvitamin-D is added to the kidney if necessary 1α, 25-Dihydroxyvitamin-D metabolized, a hormone like substance with high biological effect. The Determination of 1α, 25-dihydroxyvitamin-D indicates how much Vitamin D is in the activated form.

Die Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin-D in einer Probe er folgt bevorzugt nach dem Prinzip der kompetitive Protein bindungsanalyse, wobei anhand der Verdrängung von radio aktivem 25-Hydroxyvitamin-D von den Bindungsstellen eines Vitamin-D-bindenden Proteins das in der Probe vorhandene 25-Hydroxyvitamin-D quantifiziert wird. Daneben haben sich seit einigen Jahren Radioimmunoassays mit ¹²⁵I- markierten Vitamin-D-Derivaten und Antikörpern gegen Vitamin-D-Derivate in der Diagnostik etabliert. Die Anga ben zum üblichen 25-Hydroxyvitamin-D-Spiegel im Serum schwanken je nach Labor. Es besteht aber Einigkeit dahin, dass die Konzentration von 25-Hydroxyvitamin-D im Serum in der Regel größer als 5 ng/ml und kleiner als 80 ng/ml ist. Die kompetitive Proteinbindungsanalyse verlangt den Einsatz eines radioaktiven Vitamin-D-Derivats, welches das gleiche Proteinbindungsverhalten besitzen muss wie 25-Hydroxyvitamin-D. Ähnliches gilt auch für die kompeti tive Bindungsanalyse für das biologisch aktive 1α,25- Dihydroxyvitamin-D oder andere Vitamin-D-Metaboliten.The determination of 25-hydroxyvitamin-D in a sample is preferably carried out according to the principle of competitive protein binding analysis, with the 25 present in the sample being displaced from the binding sites of a vitamin D-binding protein by the displacement of radioactive 25-hydroxyvitamin-D -Hydroxyvitamin-D is quantified. In addition, radioimmunoassays with ¹²⁵ I-labeled vitamin D derivatives and antibodies against vitamin D derivatives have been established in diagnostics for several years. The information on the usual 25-hydroxyvitamin D level in the serum varies depending on the laboratory. However, there is agreement that the concentration of 25-hydroxyvitamin-D in the serum is generally greater than 5 ng / ml and less than 80 ng / ml. Competitive protein binding analysis requires the use of a radioactive vitamin D derivative, which must have the same protein binding behavior as 25-hydroxyvitamin D. The same applies to competitive binding analysis for the biologically active 1α, 25-dihydroxyvitamin-D or other vitamin D metabolites.

Die europäischen Patentschriften 0 312 360 und 0 363 211 sowie Tanabe et al. (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989, pp. 1220-1221 und J. Nutri. Sci. Vitaminol. (1991) 37, pp. 139-147) offenbaren verschiedene ¹²⁵Iod-markierte Hydroxy- und Dihydroxyvitamin-D-Derivate und deren Ver wendung in Bindungsanalysen. Nachteilig an diesen Derivaten ist, dass sie problematisch herzustellen und extrem labil sind. Licht, radioaktive Strahlung, Protonen, Wasserstoff, Enzyme, freie Radikale oder die Gegenwart von Iod in freier oder gebundener Form haben großen Einfluss auf die Raumstruktur und die Bindeeigen schaften der Vitamin-D-Derivate an Vitamin-D-bindendes Protein DBP oder spezifischen Antikörpern. Sie können vor allem eine Drehung, des A-Rings im Sterangerüst verur sachen oder katalysieren. Die 3β-Hydroxygruppe des Vitamin-D-Moleküls wird dabei in die Pseudo-1α-Position gedreht, so dass dann das 5,6-trans-Vitamin-D vorliegt. Die sogenannten Pseudo-1α-Hydroxy-Analogen des Vitamin-D werden zwar ähnlich wie Vitamin-D metabolisiert, sie haben aber eine in wesentlichen Punkten andere Struktur und werden von Vitamin-D-bindenden Proteinen wie bspw. DBP/Gc-Globulin oder Anti-Vitamin-D-Antikörper nicht oder deutlich schlechter gebunden.
European patents 0 312 360 and 0 363 211 and Tanabe et al. (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1989, pp. 1220-1221 and J. Nutri. Sci. Vitaminol. (1991) 37, pp. 139-147) disclose various ¹²⁵ iodine-labeled hydroxy and dihydroxyvitamin D-derivatives and their use in binding analyzes. A disadvantage of these derivatives is that they are difficult to manufacture and extremely unstable. Light, radioactive radiation, protons, hydrogen, enzymes, free radicals or the presence of iodine in free or bound form have a great influence on the spatial structure and the binding properties of the vitamin D derivatives to vitamin D-binding protein DBP or specific antibodies . Above all, they can cause or catalyze a rotation of the A-ring in the sterling structure. The 3β-hydroxy group of the vitamin D molecule is rotated into the pseudo-1α position so that the 5,6-trans-vitamin D is then present. The so-called pseudo-1α-hydroxy analogues of vitamin D are metabolized similarly to vitamin D, but they have a different structure in essential points and are derived from vitamin D-binding proteins such as DBP / Gc-globulin or anti -Vitamin-D antibodies not bound or significantly less bound.

Die vorstehend beschriebene Umlagerung ist als Beispiel zu verstehen. Es treten auch andere chemische Reaktionen und Umlagerungen auf. Gleiches gilt für ³H- oder ¹⁴C- markierte Vitamin-D-Derivate. Auch diese Vitamin-D-Deri vate sind nicht so stabil, dass sie eine zuverlässige Bindungsanalyse erlauben. Die radioaktive Markierung steigert zudem die Kosten für Lagerung, Transport und Entsorgung und ist allgemein nachteilig für Gesundheit und Umwelt. Ferner ist die Halbwertszeit von ¹²⁵Iod vergleichsweise kurz. Eine kompetitive Bindungsanalyse mit ³H- und ¹⁴C-markierten Vitamin-D-Derivaten hingegen verlangt besondere Szintillationszähler und ist apparativ anspruchsvoller, bei weitgehend gleichen Problemen.The rearrangement described above is to be understood as an example. Other chemical reactions and rearrangements also occur. The same applies to ³ H- or ¹⁴ C-labeled vitamin D derivatives. These vitamin D derivatives are also not so stable that they allow reliable binding analysis. Radioactive labeling also increases storage, transportation and disposal costs and is generally detrimental to health and the environment. Furthermore, the half-life of ¹²⁵ iodine is comparatively short. A competitive binding analysis with ³ H- and ¹⁴ C-labeled vitamin D derivatives, on the other hand, requires special scintillation counters and is more demanding in terms of equipment, with largely the same problems.

Ray et al. (Biochemistry, 1991, 30, 4809-4813) offenbaren die Kopplung von Vitamin-D₃ mit verschiedenen farbgeben den Gruppen. Die Nachweisempfindlichkeit für die farb stoffmarkierten Vitamin-D₃-Derivate ist aber zu gering, als dass man sie in einer kompetitiven Bindungsanalyse für natürliche Vitamin-D-Metabolite einsetzen könnte, abgesehen davon, dass die farbstoffmarkierten Derivate in Serum nicht stabil und zudem besonders lichtempfindlich sind.Ray et al. (Biochemistry, 1991, 30, 4809-4813) disclose the coupling of vitamin D ₃ with different coloring groups. However, the sensitivity to detection of the dye-labeled vitamin D ₃ derivatives is too low to be used in a competitive binding analysis for natural vitamin D metabolites, apart from the fact that the dye-labeled derivatives are not stable in serum and also particularly sensitive to light are.

Es ist Aufgabe der Erfindung, Vitamin-D-Derivate zur Ver fügung zu stellen, die in einer kompetitiven Bindungs analyse oder ganz generell in Immunoassays von Vitamin-D- Metaboliten wie 25-Hydroxy- und 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D eingesetzt werden können. Dies setzt folgende Eigen schaften voraus, erstens, dass für die Vitamin-D-Derivate eine Nachweisempfindlichkeit besteht, welche höher ist, beziehungsweise in einem niedrigeren Konzentrations bereich liegt, als die Konzentration der gesuchten Vitamin-D-Metabolite in den Proben; zweitens, dass die Derivate in Serum, Plasma oder Urin unter üblichen protischen Bedingungen und gegenüber Serumenzymen stabil sind; und schließlich drittens, dass die Derivate über Wochen und Monate hinreichend licht- und lagerstabil sind.It is an object of the invention to use vitamin D derivatives for ver to put oneself in a competitive bond analysis or in general in immunoassays of vitamin D Metabolites such as 25-hydroxy and 1,25-dihydroxy vitamin D can be used. This implies the following first, that for the vitamin D derivatives there is a detection sensitivity which is higher, or in a lower concentration range lies as the concentration of the searched Vitamin D metabolites in the samples; second, that the Derivatives in serum, plasma or urine under usual protic conditions and stable to serum enzymes are; and finally, third, that the derivatives are about Sufficient light and storage stability for weeks and months are.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Vitamin-D-Derivate der Formel
This task is solved by vitamin D derivatives of the formula

worin ist:
O das Sauerstoffatom einer Ethergruppe;
X eine substituierte oder unsubstituierte Kohlen wasserstoffstoffgruppe von 0,8 bis 4,2 nm Länge, bevorzugt ein C₈- bis C₁₂-gruppe, die übliche Heteroatome wie S, O, N oder P aufweisen kann;
Y Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe;
A eine funktionelle Gruppe, die von einem bindenden Protein wie einem Antikörper oder Vitamin-D- bindendes Protein DBP mit hoher Affinität gebunden wird;
R die Seitengruppe eines Vitamin-D-Metabolits, bevor zugt die Seitengruppe von Vitamin-D₂ oder D₃, besonders bevorzugt die 25-hydroxylierte Seiten gruppe von Vitamin-D₂ oder D₃.where is:
O is the oxygen atom of an ether group;
X is a substituted or unsubstituted hydrocarbon group of 0.8 to 4.2 nm in length, preferably a C ₈ to C ₁₂ group, which may have conventional heteroatoms such as S, O, N or P;
Y is hydrogen or a hydroxy group;
A is a functional group bound by a binding protein such as an antibody or vitamin D binding protein DBP with high affinity;
R the side group of a vitamin D metabolite, before the side group of vitamin D ₂ or D ₃ , particularly preferably the 25-hydroxylated side group of vitamin D ₂ or D ₃ .

Eine hohe Affinität liegt vor, wenn die Disso ziationskonstante (K) zwischen dem bindenden Protein, z. B. dem Antikörper oder DBP, und dem Antigen bzw. der funktionelle Gruppe A größer 10⁸ ist. Eine Dissoziationskonstante größer 10¹⁶ ist für viele Anwendungen vorteilhaft. In einer bevorzugten Ausführungsform ist A ausgewählt aus Biotin, Digoxigenin, Tyrosin, substituiertem Tyrosin, substituierten Amino säuren, charakteristischen Aminosäure- und Peptid sequenzen, FITC, Proteinen und Proteingruppen wie Protein A und Protein G oder einem weiteren Vitamin-D-Derivat, ganz besonders bevorzugt 25-Hydroxyvitamin-D.A high affinity exists if the dissociation constant (K) between the binding protein, e.g. B. the antibody or DBP, and the antigen or the functional group A is greater than 10 ⁸ . A dissociation constant greater than 10 ¹⁶ is advantageous for many applications. In a preferred embodiment, A is selected from biotin, digoxigenin, tyrosine, substituted tyrosine, substituted amino acids, characteristic amino acid and peptide sequences, FITC, proteins and protein groups such as protein A and protein G or another vitamin D derivative, very particularly preferably 25-hydroxyvitamin-D.

Die Abstandsgruppe X ist bevorzugt ausgewählt aus substituierten und unsubstituierten C-Körpern mit 0,8 bis 4,2 nm, bevorzugt etwa 0,12 nm Länge. Besonders bevorzugt ist eine Aminocarbonsäure, insbesondere eine Amino- undecansäure, peptidische und Ketogruppe oder ein substituierter oder unsubstituierter Aminopolyetherrest mit einer Länge von 0,8 bis 4,2 nm, bevorzugt etwa 0,9 bis 1,5 nm. Dieser Abstand zwischen der Gruppe A und der Bindungs- bzw. Erkennungsstelle für den Vitamin-D-Rest ist erforderlich, dass die bindenden Proteine an die jeweiligen Bindungsstellen binden können und dabei sich nicht gegenseitig stören. Zu beachten ist, dass beispielsweise für das Vitamin-D-bindende Protein DBP (Gc-Globlin) die 19-Methylengruppe, gegebenenfalls die 1- Hydroxygruppe des A-Rings und die Vitamin-D-Seitenkette zur Erkennungsstelle gehören und in einer Bindungstasche aufgenommen werden. Ähnliches gilt auch für spezifische Antikörper gegen die verschiedenen Vitamin-D-Derivate. Ist die Abstandsgruppe X zu kurz, kann neben dem Vitamin- D-bindenden Protein kein weiteres Bindungsprotein an der gewählten funktionellen Gruppe A binden. Für das bevor zugte Beispiel heißt das, wenn sich die funktionelle Biotin-Gruppe innerhalb der Bindungstasche des Vitamin-D bindenden Proteins befindet, ist sie für das zweite Bindungsprotein, zum Beispiel das Streptavidin, nicht mehr zugänglich. Ist die Abstandsgruppe X hingegen zu lang, können Molekülfaltungen auftreten, welche gleichfalls die gleichzeitig Bindung zweier Bindungs partner behindern.The spacing group X is preferably selected from substituted and unsubstituted carbon bodies with 0.8 to 4.2 nm, preferably about 0.12 nm in length. Particularly preferred is an aminocarboxylic acid, especially an amino undecanoic acid, peptide and keto group or a substituted or unsubstituted aminopolyether residue with a length of 0.8 to 4.2 nm, preferably about 0.9 to 1.5 nm. This distance between group A and the Binding or recognition site for the vitamin D residue it is necessary that the binding proteins to the can bind respective binding sites and thereby do not interfere with each other. It should be noted that for example for the vitamin D-binding protein DBP (Gc-Globlin) the 19-methylene group, optionally the 1- Hydroxy group of the A ring and the vitamin D side chain belong to the recognition site and in a binding pocket be included. The same applies to specific ones Antibodies against the various vitamin D derivatives. If the distance group X is too short, in addition to the vitamin D-binding protein no further binding protein on the bind selected functional group A. For that before pulled example, that means if the functional Biotin group inside the vitamin D binding pocket binding protein, it is for the second Binding protein, for example streptavidin, is not more accessible. However, the distance group X is too long, molecular folds can occur which likewise the simultaneous binding of two bonds hinder partner.

Daneben besitzt die erfindungsgemäße Abstandsgruppe über raschenderweise einen sterischen Effekt, als sie offenbar eine 180°-Drehung des A-Rings aktiv verhindern hilft. Es wird vermutet, ohne an diese Theorie gebunden zu sein, dass das 3β-Sauerstoffatom der Ethergruppe am A-Ring entsprechend einer natürlichen Hydroxygruppe hydratisiert ist und so einen Angriff auf die 5,6-Doppelbindung ver hindert, abgesehen von anderen elektronischen und sterischen Effekten. Ein anderer wichtiger Aspekt ist, dass die erfindungsgemäße Ethergruppe von den im Serum oder Plasma stets vorhandenen Esterasen nicht gespalten werden kann.In addition, the spacer group according to the invention has over surprisingly a steric effect than it appears actively preventing a 180 ° rotation of the A-ring. It is suspected without being bound by this theory, that the 3β oxygen atom of the ether group on the A ring hydrated according to a natural hydroxy group is an attack on the 5,6 double bond prevents, apart from other electronic and steric effects. Another important aspect is that the ether group according to the invention from those in the serum or plasma does not cleave esterases that are always present can be.

Ganz besonders bevorzugt ist 25-Hydroxy-Vitamin-D₃-3β- 3'[6-N-(biotinyl)hexamido]amidopropylether der Formel
25-Hydroxy-Vitamin-D ₃ -3β- 3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether of the formula is very particularly preferred

und die 1α-Hydroxy- und Vitamin-D₂-Analogen.and the 1α-hydroxy and vitamin D ₂ analogs.

Weiterhin bevorzugt sind Derivate, die als zweite funktionelle Gruppe einen Vitamin-D-Rest enthalten. Der Vorteil dieser Derivate ist, dass sie keine systemfremden Gruppen und Verbindungen enthalten und so eine erhöhte Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit der kompetitiven Bindungsanalyse erlauben, auch weil sich eventuelle Bindungsbesonderheiten aus erster und zweiter Bindung des Vitamin-D-bindenden Proteins bei einer quantitativen Bestimmung kompensieren. Besonders bevorzugt sind Verbindungen der nachstehenden Formel III:
Derivatives which contain a vitamin D residue as the second functional group are also preferred. The advantage of these derivatives is that they do not contain non-systemic groups and compounds and thus allow increased sensitivity and reliability of the competitive binding analysis, also because any binding peculiarities from the first and second binding of the vitamin D-binding protein are compensated for in a quantitative determination. Compounds of formula III below are particularly preferred:

worin R, Y und X wie in oben in Formel I definiert sind. Besonders günstig sind dabei symmetrische Vitamin-D- Derivate.wherein R, Y and X are as defined in Formula I above. Symmetrical vitamin D Derivatives.

Die erfindungsgemäßen 25-Hydroxy- und 1α,25-Hydroxy- Vitamin-D-Derivate sind überraschend licht-, lager- und serumstabil und erlauben in allen kompetitiven immun diagnostischen Verfahren eine empfindliche, zuverlässige quantitative Bestimmung von Vitamin-D-Metaboliten wie 25- Hydroxy- und 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D, beispielsweise für die Routinediagnostik im Human- und Veterinärmedizin bereich sowie in der Forschung.The 25-hydroxy and 1α, 25-hydroxy Vitamin D derivatives are surprisingly light, storage and serum stable and allow in all competitive immune diagnostic procedures a sensitive, reliable quantitative determination of vitamin D metabolites such as 25- Hydroxy and 1α, 25-dihydroxy vitamin D, for example for routine diagnostics in human and veterinary medicine area as well as in research.

Erfindungsgemäß wird die Verbindung der Formel I erhalten durch ein Verfahren, umfassend die Schritte:
According to the invention, the compound of formula I is obtained by a process comprising the steps:

a) Cyanoethylation of the 3-hydroxy group of Vitamin D or 25-hydroxyvitamin D with acrylonitrile in a suitable solvent such as acetonitrile in Presence of potassium hydride and tert-butanol;
b) reduction of the resulting nitrile group with a mixture of lithium hydride and lithium aluminum hydride to an amine; and
c) adding a distance group, if necessary together with a functional group A to the amine, For example, biotinylating the compound with an activated one Biotinylation reagent such as LC-BHNS or, to obtain a Vitamin D derivative according to formula III, coupling of two Amino vitamin D groups by condensation with a Dicarboxylic acid such as sebacic acid using carbodiimide.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung funktio neller Vitamin-D-Derivate ergibt höhere Ausbeuten bei kürzeren Reaktionszeiten. Anders als in herkömmlichen Verfahren erfolgt nämlich in Schritt a) die Cyano ethylierung der 3-Hydroxygruppe in Gegenwart von Kaliumhydrid und tert.-Butanol. Dadurch wird erreicht, dass nur an der 3-Hydroxy-Gruppe von Vitamin-D eine Cyanoethylierung erfolgt und die andere Hydroxygruppen des Vitamin-D vor einer Umsetzung geschützt sind. Die Umsetzung erfolgt bei 0 bis 20°C, bevorzugt bei 5 bis 8°C in einem neutralen Lösungsmittel wie Acetonitril.The inventive method for producing functio neller vitamin D derivatives results in higher yields shorter response times. Different from conventional ones The process takes place in step a) the cyano ethylation of the 3-hydroxy group in the presence of Potassium hydride and tert-butanol. This ensures that only on the 3-hydroxy group of vitamin D one Cyanoethylation takes place and the other hydroxy groups of vitamin D are protected from implementation. The Reaction takes place at 0 to 20 ° C, preferably at 5 to 8 ° C in a neutral solvent such as acetonitrile.

Bei der nachfolgenden Reduktion wird die Nitrilgruppe des Cyanoethylethers quantitativ in das Amin überführt, welches dann vergleichsweise einfach mit einer anderen funktionellen Gruppe verknüpft werden kann, zum Beispiel durch Umsetzung mit einem handelsüblichen Biotinylie rungsreagenz.In the subsequent reduction, the nitrile group of the Quantitatively converted cyanoethyl ether into the amine, which is then comparatively easy with another functional group can be linked, for example by implementation with a commercially available biotinyly reagent.

Die Erfindung umfasst zudem die Verwendung der erfin dungsgemäßen funktionellen Vitamin-D-Derivate in Ver fahren zur Bestimmung von 25-Hydroxy- und 1α,25-Hydroxy- Vitamin-D in Serum, Plasma, Urin oder einer anderen Probe. Hierbei wird das erfindungsgemäße funktionelle Vitamin-D-Konjugat entweder als Zwischenglied eingesetzt, wobei das Vitamin-D-bindende Protein und nativer Vitamin- D-Metabolit um die Bindestelle kompetitieren, oder selbst als kompetitive Bindungskomponente zu nativem Vitamin-D. Das quantitative Bestimmungsverfahren ist vorzugsweise ein EIA, ELISA, RIA, IRMA, LiA oder ILMA, FIA oder IFMA in manuell abzuarbeitenden Testsystemen oder auf Automaten angepasste Versionen in Flüssigphasen- wie Festphasentechnik.The invention also includes the use of the inventions functional vitamin D derivatives according to the invention in ver drive to the determination of 25-hydroxy and 1α, 25-hydroxy Vitamin D in serum, plasma, urine or another Sample. Here, the functional according to the invention Vitamin D conjugate either used as an intermediate link, the vitamin D binding protein and native vitamin D-metabolite compete for the binding site, or yourself as a competitive binding component to native vitamin D. The quantitative determination method is preferred an EIA, ELISA, RIA, IRMA, LiA or ILMA, FIA or IFMA in test systems to be processed manually or on Automatically adapted versions in liquid phase like Solid phase technology.

Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von 25-Hydroxy-und 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D-Derivaten um fasst die Schritte: a) Beschichten eines Trägers mit Streptavidin, b) Zugabe ein oder mehrerer multi funktioneller Biotin-Vitamin-D-Derivate, c) Zugabe der Probe und einer definierten Menge Vitamin-D-bindendes Protein, d) Bestimmung des gebundenen Bindungsproteins mit markierten anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikör pern. Die Markierung der anti-Vitamin-D-Bindungsprotein- Antikörper kann direkt sein, bspw. eine radioaktive Markierung, oder auch indirekt, bspw. ein Enzym oder ein aktives Enzymfragment wie Peroxidase, das eine Farbreak tion zu katalysieren vermag.A particularly preferred method for determining 25-hydroxy and 1α, 25-dihydroxy vitamin D derivatives summarizes the steps: a) coating a carrier with Streptavidin, b) adding one or more multi functional biotin vitamin D derivatives, c) addition of Sample and a defined amount of vitamin D binding Protein, d) determination of the bound binding protein with labeled anti-vitamin D binding protein antibody pern. The labeling of anti-vitamin D binding protein Antibody can be direct, for example a radioactive one Labeling, or also indirectly, for example an enzyme or a active enzyme fragment such as peroxidase, which is a color freak is able to catalyze ion.

Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung von 25- Hydroxy- und 1α,25-Dihydroxy-Vitamin-D-Derivaten umfasst die Schritte: a) Beschichten eines Trägers mit anti- Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörpern, b) Zugabe des Vitamin-D-Bindungsproteins, c) Zugabe der Probe sowie eine definierte Menge Biotin-Vitamin-D-Derivat, d) Bestimmung der Menge gebundenes Derivat mit markiertem Streptavidin. Das Streptavidin ist bevorzugt indirekt mit Peroxidase markiert; der Träger ist vorzugsweise eine Reaktionsgefäßwand, beispielsweise von einer Mikrotiter platte, oder Teilchen aus polymerem oder magnetischem Material oder beidem, beispielsweise Kunststoff- oder Cellulose-Mikropartikel.Another preferred method for determining 25- Hydroxy and 1α, 25-dihydroxy vitamin D derivatives the steps: a) coating a support with anti- Vitamin D binding protein antibodies, b) adding the Vitamin D binding protein, c) addition of the sample and a defined amount of biotin vitamin D derivative, d) Determination of the amount of bound derivative with labeled Streptavidin. The streptavidin is preferably indirect with Labeled peroxidase; the carrier is preferably one Reaction vessel wall, for example from a microtiter plate, or particles of polymeric or magnetic Material or both, for example plastic or Cellulose microparticles.

Diese Verfahren ermöglichen eine nicht-radioaktive quantitative Bestimmungen von 25-Hydroxy- und 1,25- Dihydroxy-Vitamin-D, ohne dass aufwendige Sicherheits vorkehrungen erforderlich sind. Die hier vorgeschlagenen kompetitiven Verfahren sind somit für Routineuntersuchun gen im Rahmen einer Osteoporose-Prophylaxe, bei einer vermuteten D-Hypovitaminose oder D-Hypervitaminose, zur Diagnostik allgemeiner Art und in der Forschung.These methods enable a non-radioactive one quantitative determinations of 25-hydroxy- and 1,25- Dihydroxy-Vitamin-D without the need for complex security precautions are required. The ones suggested here competitive procedures are therefore for routine examinations conditions within the framework of an osteoporosis prophylaxis, at a suspected D-hypovitaminosis or D-hypervitaminosis, for Diagnostics of a general nature and in research.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Kit zur Bestimmung von Vitamin-D-Metaboliten wie 25-Hydroxy- und 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D, der unter anderem das erfindungsgemäße funktionelle Vitamin-D-Derivat enthält. Der Kit umfasst wahlfrei Vitamin-D-Bindungsprotein (Gc- Globulin), anti-Vitamin-D-Bindungsprotein-Antikörper, Streptavidin und vorbehandelte oder unvorbehandelte Mikrotiterplatten und/oder magnetische oder andere Mikropartikel und andere Reagenzien.Another aspect of the invention is a kit for Determination of vitamin D metabolites such as 25-hydroxy and 1,25-Dihydroxy-Vitamin-D, which among other things contains functional vitamin D derivative according to the invention. The kit optionally includes vitamin D binding protein (Gc- Globulin), anti-vitamin D binding protein antibody, Streptavidin and pretreated or untreated Microtiter plates and / or magnetic or others Microparticles and other reagents.

Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den nachstehenden Beispielen und den beiliegenden Zeichnungen. Es zeigt:Further advantages, features and embodiments of the Invention emerge from the examples below and the accompanying drawings. It shows:

Fig. 1 den schematischen Syntheseweg für das bifunk tionelle Vitamin-D-Derivat 25-Hydroxy-Vitamin- D₃-3β-3'[6-N-(biotinyl)hexamido]amidopropyl ether) gemäß der Erfindung; Figure 1 shows the schematic synthetic route for the bifunk tional vitamin D derivative 25-hydroxy-vitamin D ₃ -3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether) according to the invention.

Fig. 2, 3 und 4 Schemadarstellungen verschiedener ELISAs zur Bestimmung von 25-Hydroxy-Vitamin-D mit Hilfe des erfindungsgemäßen 25-Hydroxy- Vitamin-D-Konjugat; Fig. 2, 3 and 4 are schematic representations of various ELISAs for the determination of 25-hydroxy vitamin D with the aid of the 25-hydroxy vitamin D conjugate according to the invention;

Fig. 5 die Eichkurve eines kompetitiven ELISAs für 25-Hydroxy-Vitamin-D nach Fig. 2; FIG. 5 shows the calibration curve of a competitive ELISA for 25-hydroxy-vitamin D according to FIG. 2;

Fig. 6 und 7 Schemadarstellungen kompetitiver RIA für 25-Hydroxy-Vitamin-D mit Hilfe des erfindungs gemäßen 25-Hydroxy-Vitamin-D-Konjugats; Figures 6 and 7 are schematic representations of competitive RIA for 25-hydroxy-vitamin D using the 25-hydroxy-vitamin D conjugate according to the invention;

Fig. 8, 9 und 10 Schemadarstellungen kompetitiver, radioaktiver IRMAs für 25-Hydroxy-Vitamin-D mit Hilfe des erfindungsgemäßen 25-Hydroxy-Vitamin- D-Konjugats; Fig. 8, 9 and 10, schematic representations of competitive, radioactive IRMAs for 25-hydroxy vitamin D with the aid of the 25-hydroxy vitamin D conjugate according to the invention;

Fig. 11 und 12 Schemadarstellungen kompetitiver ELISAs unter Verwendung von Mikropartikeln; Figs. 11 and 12 schematic representations of competitive ELISAs using microparticles;

Fig. 13 Schemadarstellung eines kompetitiven Bindungs assays für 25-Hydroxyvitamin-D mit Hilfe eines 25-Hydroxyvitamin-D-Konjugats gemäß der Erfindung und einem direktmarkierten Vitamin- D-bindenden Protein. Fig. 13 Schematic representation of a competitive binding assay for 25-hydroxyvitamin-D using a 25-hydroxyvitamin-D conjugate according to the invention and a directly labeled vitamin D-binding protein.

Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Syntheseweg zur Herstellung des bifunktionellen 25-Hydroxy-Vitamin-D- Konjugats. Zunächst wird 25-Hydroxy-Vitamin-D in einem Gemisch aus Acetonitril, Kaliumhydrid und tert.-Butanol mit Acrylnitril cyanoethyliert. Durch die Gegenwart des als Base fungierenden Kaliumhydrids und durch die Anwesenheit von tert.-Butanol zur Abwendung unspezi fischer Reaktionen an der 25-Hydroxygruppe wird erreicht, dass selektiv die 3-Hydroxy-Gruppe des Vitamin-D cyano ethyliert wird. Die Ausbeute an 25-Hydroxy-Vitamin-D-3β- cyanoethylether beträgt in der Regel etwa 74% bei einer Reaktionsdauer von 40 Minuten. Fig. 1 shows the synthetic route of the invention for preparing the bifunctional 25-hydroxy vitamin D conjugate. 25-Hydroxy-Vitamin-D is first cyanoethylated in a mixture of acetonitrile, potassium hydride and tert-butanol with acrylonitrile. The presence of the potassium hydride acting as the base and the presence of tert-butanol to prevent unspecific reactions on the 25-hydroxy group means that the 3-hydroxy group of vitamin D is cyanoethylated selectively. The yield of 25-hydroxy-vitamin D-3β-cyanoethyl ether is usually about 74% with a reaction time of 40 minutes.

Nach üblicher Aufarbeitung wird der 25-Hydroxy-Vitamin-D- 3β-cyanoethylether mit Lithiumhydrid versetzt und die 25- Hydroxygruppe in das Lithiumalkoholat überführt. Es folgt eine Reduktion des Nitrils mit LiAlH₄ zu 25-Hydroxy- Vitamin-D-3β-3'-aminopropylether. Dieser Schritt ist quantitativ, ohne dass Nebenprodukte auftreten. Zuletzt erfolgt gegebenenfalls eine Biotinylierung mit einem aktivierten Biotinylierungsreagenz wie LC-BHNS (Biotinyl- N-ε-aminocaproyl-hydroxysuccinimidester). Die resultie rende Abstandsgruppe X hat entsprechend der Aminocaproyl kette eine Länge von etwa 0.8 bis 0.9 nm.After the usual work-up, the 25-hydroxy-vitamin D-3β-cyanoethyl ether is mixed with lithium hydride and the 25-hydroxy group is converted into the lithium alcoholate. The nitrile is then reduced with LiAlH ₄ to 25-hydroxy-vitamin-D-3β-3'-aminopropyl ether. This step is quantitative, with no by-products occurring. Finally, biotinylation is optionally carried out using an activated biotinylation reagent such as LC-BHNS (biotinyl-N-ε-aminocaproyl-hydroxysuccinimide ester). The resulting spacer group X has a length of about 0.8 to 0.9 nm, corresponding to the aminocaproyl chain.

25-Hydroxy-Vitamin-D-3β-3'[6-N-(biotinyl)hexamido]amido propylether ist temperaturstabil und kann in einer wässrigen, leicht sauren Matrix über mehrere Monate gelagert werden. Da die Verbindung von Serumenzymen nicht gespalten wird, eignet sie sich bestens für diagnostische Routmetests in Serum, Plasma und Urin.25-hydroxy-vitamin-D-3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amido propyl ether is temperature stable and can be used in one aqueous, slightly acidic matrix over several months be stored. Because the connection of serum enzymes is not is split, it is ideal for diagnostic Routine tests in serum, plasma and urine.

Fig. 2 zeigt eine Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA für 25-Hydroxy-Vitamin-D. Hierbei wird das 25- Hydroxy-Vitamin-D-Konjugat (25-Hydroxy-Vitamin-D-3β-3'[6- N-(biotinyl)hexamido] amidopropylether) über Streptavidin an eine feste Phase gebunden. Dann erfolgt in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von Vitamin-D-bindenden Protein und 25-Hydroxy-Vitamin-D aus Standard oder Probe an das 25-Hydroxy-Vitamin-D-Konjugat. Der Nachweis erfolgt durch Peroxidase-markierte Antikörper gegen das Vitamin-D-bindende Protein. Der Fachmann weiß, dass auch andere Markerenzyme verwendet werden können, zum Beispiel alkalische Phosphatase oder Galaktosidase, etc. Figure 2 shows a schematic of a competitive ELISA for 25-hydroxy-vitamin-D. The 25-hydroxy-vitamin-D conjugate (25-hydroxy-vitamin-D-3β-3 '[6- N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether) is bound to a solid phase via streptavidin. The competitive binding of vitamin D-binding protein and 25-hydroxy-vitamin D from the standard or sample to the 25-hydroxy-vitamin D conjugate then takes place in the liquid phase. Detection is carried out using peroxidase-labeled antibodies against the vitamin D-binding protein. The person skilled in the art knows that other marker enzymes can also be used, for example alkaline phosphatase or galactosidase, etc.

Fig. 3 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven, nicht-radioaktiven ELISA, wobei das Vitamin-D-bindende Protein zunächst über anti-Vitamin-D-Bindungsprotein- Antikörper an die feste Phase gebunden wird. Danach erfolgt in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von 25-Hydroxy-Vitamin-D-Biotin und 25-Hydroxy-Vitamin-D aus Standard bzw. Probe. Zur Bestimmung wird dann Peroxidase markiertes Streptavidin eingesetzt. Das gezeigte Prinzip lässt sich selbstverständlich auf andere Tracer-Gruppen statt Biotin und auf andere Markerenzyme, wie oben angegeben, übertragen. FIG. 3 shows the schematic representation of a competitive, non-radioactive ELISA, the vitamin D-binding protein first being bound to the solid phase via anti-vitamin D binding protein antibodies. This is followed by the competitive binding of 25-hydroxy-vitamin D-biotin and 25-hydroxy-vitamin D from the standard or sample in the liquid phase. Peroxidase-labeled streptavidin is then used for the determination. The principle shown can of course be applied to other tracer groups instead of biotin and to other marker enzymes, as stated above.

Fig. 4 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA, wobei das Vitamin-D-bindende Protein direkt an die feste Phase gebunden ist. Die kompetitive Bindung von 25- Hydroxy-Vitamin-D₃-Biotin und 25-Hydroxy-Vitamin-D₃ aus Standard bzw. Probe erfolgt in flüssiger Phase und Peroxidase-markiertes Streptavidin wird zur quantitativen Bestimmung eingesetzt. FIG. 4 shows the schematic representation of a competitive ELISA, the vitamin D-binding protein being bound directly to the solid phase. The competitive binding of 25-hydroxy-vitamin D ₃ biotin and 25-hydroxy vitamin D ₃ from standard or sample takes place in the liquid phase and peroxidase-labeled streptavidin is used for the quantitative determination.

Fig. 5 zeigt die typische Eichkurve eines kompetitiven ELISA mit 25-Hydroxy-Vitamin-D₃-Biotin gemäß dem in Fig. 2 gezeigten Prinzip. Die Menge an gebundenem Vitamin-D- Bindungsprotein wurde bestimmt durch eine standardisierte Farbreaktion mit Peroxidase-gekoppelten anti-Vitamin-D- Bindungsprotein-Antikörpern und Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat. Alternative Substrate wären beispielsweise OPD (1,2-Phenyldiamin × 2 HCl), ABTS und andere. Für die Eichkurve wurden Vitamin-D-Proben mit Konzentrationen von 0, 8, 20, 50, 125 und 312 nmol/l eingesetzt. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert von zwei Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration an kompetitierenden 25-Hydroxy-Vitamin- D in nMol/l. FIG. 5 shows the typical calibration curve of a competitive ELISA with 25-hydroxy-vitamin D ₃ biotin according to the principle shown in FIG. 2. The amount of bound vitamin D binding protein was determined by a standardized color reaction with peroxidase-coupled anti-vitamin D binding protein antibodies and tetramethylbenzidine (TMB) as substrate. Alternative substrates would be, for example, OPD (1,2-phenyldiamine × 2 HCl), ABTS and others. Vitamin D samples with concentrations of 0, 8, 20, 50, 125 and 312 nmol / l were used for the calibration curve. The ordinate shows the optical density as the average of two measurements at 450 nm; the abscissa the concentration of competitive 25-hydroxy-vitamin D in nmol / l.

Fig. 6 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven Protein-Bindungsversuch (CPBA), wobei 25-Hydroxy-Vitamin- D₃-Biotin und 25-Hydroxy-Vitamin-D aus Standard bzw. Probe in flüssiger Phase um die Bindungsstelle des Vitamin-D- Bindungsproteins kompetitieren. Es wird ¹²⁵I-markiertes Streptavidin für die quantitative Bestimmung verwendet. Fig. 6 shows the schematic representation of a competitive protein binding assay (CPBA), wherein 25-hydroxy vitamin D ₃ -biotin and 25-hydroxy vitamin D from a standard or sample in the liquid phase to the binding site of vitamin D Compete binding protein. ¹²⁵ I-labeled streptavidin is used for the quantitative determination.

Fig. 7 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven Radioimmunoassays (RIA), wobei 25-Hydroxy-Vitamin-D- Biotin und 25-Hydroxy-Vitamin-D aus Standard bzw. Probe in flüssiger Phase um die Bindungsstelle eines anti- Vitamin-D-Antikörpers kompetitieren. Für die quantitative Bestimmung wird ¹²⁵I-markiertes Streptavidin eingesetzt. FIG. 7 shows the schematic representation of a competitive radioimmunoassay (RIA), with 25-hydroxy-vitamin-D-biotin and 25-hydroxy-vitamin-D from the standard or sample in the liquid phase around the binding site of an anti-vitamin-D antibody compete. ¹²⁵ I-labeled streptavidin is used for the quantitative determination.

Erfolgt die Bestimmung durch ein Streptavidin, das nicht radioaktiv, sondern mit einem Fluorophor oder Luminophor markiert ist, liegen sogenannte LIA- oder FIA-Assays vor.Is determined by a streptavidin that is not radioactive, but with a fluorophore or luminophore so-called LIA or FIA assays are available.

Fig. 8 zeigt die Schemadarstellung eines 25-Hydroxy- Vitamin-D-IRMA. Es wird zunächst 25-Hydroxy-Vitamin-D- Biotin über Streptavidin an die feste Phase gebunden. Die kompetitive Bindung von Vitamin-D-Bindungsprotein an das Konjugat und 25-Hydroxy-Vitamin-D₃ aus Standard oder Probe erfolgt dann in flüssiger Phase. Die Menge des Konjugat gebundenen Bindungsproteins wird mit ¹²⁵I-markierten Antikörpern bestimmt. Figure 8 shows the schematic of a 25-hydroxy vitamin D IRMA. First 25-hydroxy-vitamin-D-biotin is bound to the solid phase via streptavidin. The competitive binding of vitamin D binding protein to the conjugate and 25-hydroxy-vitamin D ₃ from the standard or sample then takes place in the liquid phase. The amount of binding protein bound to the conjugate is determined using ¹²⁵ I-labeled antibodies.

Fig. 9 ist die Schemadarstellung einer IRMA-Sandwich- Technik (Immunoradiometrischer Assay). Hierzu werden anti-Vitamin-D₃-Antikörper an die feste Phase gekoppelt. An diese binden dann Vitamin-D-Bindungsproteine. Die Kompetition erfolgt im nächsten Schritt zwischen dem 25- Hydroxy-Vitamin-D-Konjugat und 25-Hydroxy-Vitamin-D aus Standard oder Probe. Die Bestimmung der Menge gebundenes Konjugat erfolgt durch ¹²⁵I-markiertes Streptavidin. Figure 9 is a schematic of an IRMA sandwich technique (Immunoradiometric Assay). For this, anti-vitamin D ₃ antibodies are coupled to the solid phase. Vitamin D binding proteins then bind to these. The competition takes place in the next step between the 25-hydroxy-vitamin D conjugate and 25-hydroxy-vitamin D from standard or sample. The amount of conjugate bound is determined ^{using 125} I-labeled streptavidin.

Fig. 10 zeigt die Schemadarstellung eines weiteren IRMA- Sandwich-Technik. Es wird zunächst Vitamin-D₃- Bindungsprotein an die feste Phase gekoppelt. Dann erfolgt daran die kompetitive Bindung zwischen dem 25- Hydroxy-Vitamin-D₃-Konjugat und 25-Hydroxy-Vitamin-D₃ aus Standard oder Probe. Die Menge gebundenes Konjugat wird durch ¹²⁵I-markiertes Streptavidin bestimmt. Fig. 10 shows the schematic representation of a further sandwich IRMA technique. Vitamin D ₃ binding protein is first coupled to the solid phase. Then the competitive binding between the 25-hydroxy-vitamin D ₃ conjugate and 25-hydroxy-vitamin D ₃ from the standard or sample takes place. The amount of conjugate bound is determined by ¹²⁵ I-labeled streptavidin.

Fig. 11 zeigt die Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA unter Verwendung von Mikropartikeln. Hierbei wird 25-Hydroxy-Vitamin-D-Biotin über Streptavidin an Mikropartikel gebunden. Dann wird 25-Hydroxy-Vitamin-D- Derivat daran gebunden. In flüssiger Phase wird Vitamin- D-Bindungsprotein und die jeweilige Probe zugegeben. Figure 11 shows the schematic of a competitive ELISA using microparticles. 25-Hydroxy-Vitamin-D-Biotin is bound to microparticles via streptavidin. Then 25-hydroxy vitamin D derivative is bound to it. Vitamin D binding protein and the respective sample are added in the liquid phase.

Bindungsproteine und 25-Hydroxy-Vitamin-D₃ aus Standard oder Probe kompetitieren um die Bindungsstelle des Konjugats. Die gebundenen Bestandteile werden dadurch abgetrennt, dass sie über die Mikropartikel von einem Magneten zurückgehalten werden, während der Überstand mit den ungebundenen Substanzen entfernt wird. Die Menge gekoppeltes Bindungsprotein wird bestimmt in einem zweistufigen Verfahren mit einem primären Antikörper gegen Vitamin-D-Bindungsprotein und einem sekundären Peroxidase-markierten Antikörper.Binding proteins and 25-hydroxy-vitamin D ₃ from standard or sample compete for the binding site of the conjugate. The bound components are separated in that they are held back by a magnet via the microparticles, while the supernatant with the unbound substances is removed. The amount of coupled binding protein is determined in a two-step procedure with a primary antibody against vitamin D binding protein and a secondary peroxidase-labeled antibody.

Fig. 12 zeigt eine Schemadarstellung eines kompetitiven ELISA unter Verwendung von Mikropartikeln. Es wird 25- Hydroxy-Vitamin-D-Biotin über Streptavidin an Mikropartikel gebunden. Dann wird die flüssige Probe mit 25-Hydroxy-Vitamin-D₃ (aus Standard oder Probe) dazugegeben sowie eine nicht-sättigende Menge Antikörper. Das Konjugat und das native Vitamin-D₃ kompetitieren um die Bindung des Antikörpers. Die Menge gebundener Antikörper erfolgt durch Agglutination der Mikropartikel. Diese kann beispielsweise direkt durch Nephelometrie bzw. Turbimetrie bestimmt werden. Figure 12 shows a schematic of a competitive ELISA using microparticles. 25-Hydroxy-vitamin-D-biotin is bound to microparticles via streptavidin. Then the liquid sample with 25-hydroxy-vitamin D ₃ (from standard or sample) is added, as well as a non-saturating amount of antibody. The conjugate and the native vitamin D ₃ compete for the binding of the antibody. The amount of bound antibodies occurs through agglutination of the microparticles. For example, this can be determined directly by nephelometry or turbimetry.

Fig. 13 zeigt das Schema eines kompetitiven Bindungs assays, wobei das Vitamin-D-bindende Protein direkt markiert ist, beispielsweise radioaktiv mit ¹²⁵Iod, oder für eine Elektrochemolumineszenz mit Ruthenium(II)tris- (bipyridin)-NHS-ester. Die Markierung können auch Enzyme sein wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, β-Galacto sidase u. a., oder auch FITC. Fig. 13 shows the scheme of a competitive binding assay, wherein the vitamin D-binding protein is directly labeled, for example radioactive with ¹²⁵ iodine, or for an electrochemiluminescence with ruthenium (II) tris (bipyridine) -NHS-ester. The label can also be enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, β-galactosidase and others, or also FITC.

Die bekannten Bestimmungsverfahren für Proteine wie der kompetitive ELISA beruhen auf dem Prinzip, dass die nachzuweisende Verbindung mit einem Bindungsprotein oder Konjugat um eine Bindungsstelle kompetitiert. Es wird dann die Menge gebundenes Bindungsprotein oder Konjugat bestimmt und anhand einer Eichkurve die Konzentration der nachzuweisenden Verbindung ermittelt.The known methods of determination for proteins such as competitive ELISA are based on the principle that the Compound to be detected with a binding protein or Conjugate competes for a binding site. It will then the amount of bound binding protein or conjugate determined and using a calibration curve the concentration of connection to be detected.

Die in den Figuren gezeigten Testprinzipien lassen sich einfach auf andere Vitamin-D-Derivate übertragen. Beson ders erwähnt sei 1α,25-Hydroxyvitamin-D₂/D₃. In diesem Fall muss ein Bindungsprotein bzw. ein Rezeptor oder Antikörper gewählt werden, der das 1α,25-Hydroxy-Vitamin- D-Analoge spezifisch erkennt. Das zugehörige bifunktionelle 1α,25-Hydroxyderivat kann gewonnen werden enzymatisch durch Umsetzung von 25-Hydroxy-Vitamin-D-3β- cyanoethylether mit 25-Hydroxy-Vitamin-D-1α-Hydroxylase, Reduktion zum Amin und schließlich Addition der zweiten funktionellen Gruppe. Ferner werden hier Derivate von Vitamin-D₂ und Vitamin-D₃ vorgeschlagen. Deren Synthese kann auf dem in Beispiel 1 vorgestellten Weg erfolgenThe test principles shown in the figures can easily be transferred to other vitamin D derivatives. Special mention should be made of 1α, 25-hydroxyvitamin D ₂ / D ₃ . In this case, a binding protein or a receptor or antibody must be selected that specifically recognizes the 1α, 25-hydroxy-vitamin D analog. The associated bifunctional 1α, 25-hydroxy derivative can be obtained enzymatically by reacting 25-hydroxy-vitamin D-3β-cyanoethyl ether with 25-hydroxy-vitamin D-1α-hydroxylase, reduction to the amine and finally addition of the second functional group. Derivatives of vitamin D ₂ and vitamin D _{3 are also} proposed here. Their synthesis can be carried out in the way presented in Example 1

EXAMPLES example 1 Synthesis of 25-hydroxy-vitamin-D ₃ -3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether (4)

Alle Umsetzungen erfolgten im Dunkeln unter trockener Stickstoffatmosphäre. Zwischenprodukte wurden bei -20°C gelagert. Es wurden HPLC-reine Lösungsmittel eingesetzt. Das 25-Hydroxy-Vitamin-D₃ war von BIOMOL Feinchemikalien GmbH, Hamburg, der LC-BHNS (Long-Chain-Biotinyl-N-ε- aminocaproyl-hydroxysuccinimidester) von Sigma Chemie, alle weiteren Chemikalien von Fluka, Darmstadt. Die Massenspektroskopie(FAB) erfolgte mit einem Finigan-MAT- 90, die NMR-Messungen mit einem Bruker-ARX-400 (400 MHz) oder einem Bruker-ARC-250F (250 MHz). All reactions were carried out in the dark under a dry nitrogen atmosphere. Intermediates were stored at -20 ° C. HPLC-pure solvents were used. The 25-hydroxy-vitamin D ₃ was from BIOMOL Feinchemischen GmbH, Hamburg, the LC-BHNS (Long-Chain-Biotinyl-N-ε-aminocaproyl-hydroxysuccinimide ester) from Sigma Chemie, all other chemicals from Fluka, Darmstadt. Mass spectroscopy (FAB) was carried out with a Finigan-MAT-90, the NMR measurements with a Bruker-ARX-400 (400 MHz) or a Bruker-ARC-250F (250 MHz).

(i) 25-hydroxyvitamin D ₃ -3β-cyanoethyl ether (2)

5 mg 25-Hydroxyvitamin-D₃ (12,5 µMol), gelöst in Methylenchlorid (CH₂Cl₂), wurde in einen mit Stickstoff gefüllten Kolben überführt und das Lösungsmittel abge zogen. Der feste Rückstand wurde in 1 ml Acetonitril aufgenommen und versetzt mit 10 Tropfen einer Mischung von tert.-Butanol und Acetonitril (9 : 1 v/v) sowie 130 µMol Acrylnitril (10 eq.) in 100 µl Acetonitril [Stammlösung: 86 µl Acrylnitril (1.3 m/Mol) verdünnt mit Acetonitril auf 1 ml]. Die klare Lösung wurde 15 Minuten bei 6°C gerührt. Es wurde 6.25 µMol Kaliumhydrid (0,5 eq.) in 25 µl tert.-Butanol/Acetonitril (9 : 1 v/v) [Stammlösung: 10 mg KH (250 µMol) in 1 ml tert.- Butanol/Acetonitril (9 : 1 v/v)] zugegeben. Die dabei entstehende Ausflockung löste sich sofort wieder. Die Mischung wurde bei 6°C gerührt. Die wiederholte Dünnschichtchromatographie (DC) einzelner Proben mit 20% Petrolether in Methyl-tert.-butylether (MTBE) auf Kieselgel zeigte, dass nach 10 Minuten bereits 90% der Ausgangsverbindung umgesetzt waren. Nach 15 Minuten wurden wenige Tropfen Reaktionsgemisch mit etwa 5 Tropfen Wasser und 0,5 ml MTBE aufgearbeitet. Die DC der organischen Phase zeigte kein Edukt mehr. Nach 40 Minuten wurde das gesamte Reaktionsgemisch mit Wasser/MTBE aufgearbeitet. Es wurde 4 mg öliges Produkt erhalten.
IR (NaCl/CH₂Cl₂):
3422, OH
2941, 2872 CH
2252 Nitril
1105 Ether5 mg of 25-hydroxyvitamin-D ₃ (12.5 μmol), dissolved in methylene chloride (CH ₂ Cl ₂ ), was transferred into a flask filled with nitrogen and the solvent was drawn off. The solid residue was taken up in 1 ml of acetonitrile and mixed with 10 drops of a mixture of tert-butanol and acetonitrile (9: 1 v / v) and 130 μmol acrylonitrile (10 eq.) In 100 μl acetonitrile [stock solution: 86 μl acrylonitrile (1.3 m / mol) diluted to 1 ml with acetonitrile]. The clear solution was stirred at 6 ° C for 15 minutes. 6.25 μmol of potassium hydride (0.5 eq.) In 25 μl of tert-butanol / acetonitrile (9: 1 v / v) [stock solution: 10 mg KH (250 μmol) in 1 ml of tert-butanol / acetonitrile (9 : 1 v / v)] added. The resulting flocculation was released immediately. The mixture was stirred at 6 ° C. The repeated thin layer chromatography (TLC) of individual samples with 20% petroleum ether in methyl tert-butyl ether (MTBE) on silica gel showed that after 10 minutes 90% of the starting compound had already been converted. After 15 minutes, a few drops of the reaction mixture were worked up with about 5 drops of water and 0.5 ml of MTBE. The TLC of the organic phase showed no more educt. After 40 minutes, the entire reaction mixture was worked up with water / MTBE. 4 mg of oily product were obtained.
IR (NaCl / CH ₂ Cl ₂ ):
3422, OH
2941, 2872 CH
2252 nitrile
1105 ether

Die HPLC-Analyse (3% MeOH/CH₂Cl₂) ergab 93% Produkt und 7% Edukt. 4 mg Produkt enthielten somit 3.7 mg (8,2 µMol) Zielverbindung, was einer Ausbeute von 74% entspricht. HPLC analysis (3% MeOH / CH ₂ Cl ₂ ) showed 93% product and 7% educt. 4 mg of product thus contained 3.7 mg (8.2 μmol) of the target compound, which corresponds to a yield of 74%.

(ii) 25-Hydroxyvitamin-D ₃ -3β-3'aminopropylether (3)

3.75 mg (8.3 µMol) Nitril aus (i) wurde in 2 ml Ether gelöst, mit 125 µMol Lithiumhydrid gelöst in 1 ml Ether (Stammlösung: 7 mg frisches feinpulvriges LiH in 7 ml Ether) versetzt und eine Stunde bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Es wurde 169 µMol LiAlH₄ als Auf schlämmung in 1 ml Ether (Stamm: 18 mg frisches feinpulvriges LiAlH₄ in 3 ml Ether) zugegeben. Nach einer weiteren Stunde wurde das Gemisch mit 1 ml konzentriertem KOH, 5 ml H₂O und 4 × 20 ml MTBE aufgearbeitet. Die Dünn schichtchromatographie einer Probe mit 1 : 1 MTBE/Petrol ether auf Kieselgel zeigte nur noch den Ausgangspunkt. Das Diol lag bei R_i 0.27; das Nitril bei R_i 0.4. Die gewonnene Substanz wurde ohne weitere Analyse und Auf reinigung weiterverarbeitet.3.75 mg (8.3 μmol) of nitrile from (i) was dissolved in 2 ml of ether, 125 μmol of lithium hydride dissolved in 1 ml of ether (stock solution: 7 mg of fresh, finely powdered LiH in 7 ml of ether) was added and the mixture was stirred for one hour at room temperature under nitrogen. 169 µmol of LiAlH _{4 was added} as a slurry in 1 ml of ether (stock: 18 mg of fresh, finely powdered LiAlH ₄ in 3 ml of ether). After a further hour the mixture was worked up with 1 ml of concentrated KOH, 5 ml of H ₂ O and 4 × 20 ml of MTBE. The thin layer chromatography of a sample with 1: 1 MTBE / petroleum ether on silica gel only showed the starting point. The diol was R _i 0.27; the nitrile at R _i 0.4. The substance obtained was processed without further analysis and purification.

(iii) 25-Hydroxy-Vitamin-D ₃ -3β-3 '(6-N- (biotinyl) hex amido] amidopropyl ether (4)

Es wurde 3 mg (6.6 µMol) 25-Hydroxy-Vitamin-D₃-3β- aminopropylether (3) aus (ii) in 1 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst. Dann wurde unter Stickstoff 3 mg (6.6 µMol) LC-BNHS und 1 µl (17.5 µMol) Triethylamin zugegeben. Es wurde 18 h bei Raumtemperatur gerührt, das DMF abgezogen und der Rückstand mit 20% Methanol (MeOH) in CH₂Cl₂ vorgereinigt. 12 mg (< 100%) der so gewonnenen Substanz wurden mittels HPLC gereinigt (Bedingungen: Knauer Kromasil-100, 5 µM, 250 × 4 mm, 10% MeOH in CH₂Cl₂, 1,5 ml/min. OD 265 nm, 7 Minuten). Die Ausbeute betrug 1,2 mg (1,5 µMol). Dies entspricht 12%, bezogen auf das 25-OH- Vitamin-D₃ und 18% bezogen auf die Nitrilverbindung.
MS (Finigan MAT 90)
(FAB): 797 (MH⁺) vom 5.9.97 und 28.11.97
¹H-NMR (Bruker ARX 400) in CDCl₃/TMS bei 400 MHz.3 mg (6.6 μmol) of 25-hydroxy-vitamin-D ₃ -3β-aminopropyl ether (3) from (ii) were dissolved in 1 ml of dimethylformamide (DMF). Then 3 mg (6.6 μmol) LC-BNHS and 1 μl (17.5 μmol) triethylamine were added under nitrogen. The mixture was stirred at room temperature for 18 h, the DMF was stripped off and the residue was prepurified with 20% methanol (MeOH) in CH ₂ Cl ₂ . 12 mg (<100%) of the substance obtained in this way were purified by HPLC (conditions: Knauer Kromasil-100, 5 μM, 250 × 4 mm, 10% MeOH in CH ₂ Cl ₂ , 1.5 ml / min. OD 265 nm , 7 minutes). The yield was 1.2 mg (1.5 µmol). This corresponds to 12% based on the 25-OH vitamin D ₃ and 18% based on the nitrile compound.
MS (Finigan MAT 90)
(FAB): 797 (MH ⁺ ) from 5.9.97 and 28.11.97
¹ H-NMR (Bruker ARX 400) in CDCl ₃ / TMS at 400 MHz.

Die Analysedaten sind in Tabelle I gezeigt. The analysis data are shown in Table I.

Table I

Example 2 Stability of 25-hydroxy-vitamin-D ₃ -3β-3 '[6- N- (biotinyl) hexamido) amidopropyl ether

Es wurde jeweils 20 mg gereinigte 25-OH-D₃-Biotin-Verbin dung (25-Hydroxy-Vitamin-D₃-3β-3'[6-N-(biotinyl)-hexami do]amidopropylether) aus Beispiel 1 in ein NMR-Röhrchen gegeben und mit 1 ml Lösungsmittel versetzt. Das Lösungs mittel war eine Mischung aus Deuteriochloroform : Deutero acetonitril : D₂O im Verhältnis 3 : 2 : 1 mit einem pH-Wert zwischen 4 und 5. Die Proben wurden 200 Tage unter nach stehenden Bedingungen gelagert und in regelmäßigen Abständen die NMR-Spektren untersucht.
Probe 1: unter Lichtausschluss bei -20°C;
Probe 2: unter Lichtausschluss bei +4-6°C;
Probe 3: unter Lichtausschluss bei Umgebungstemperatur;
Probe 4: unter starker Lichteinwirkung (auf der Fenster bank) bei Umgebungstemperatur.In each case, 20 mg of purified 25-OH-D ₃ biotin compound (25-hydroxy-vitamin D ₃ -3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether) from Example 1 were incorporated into one Given NMR tubes and mixed with 1 ml of solvent. The solvent was a mixture of deuteriochloroform: deutero acetonitrile: D ₂ O in a ratio of 3: 2: 1 with a pH between 4 and 5. The samples were stored for 200 days under the following conditions and the NMR spectra at regular intervals examined.
Sample 1: with exclusion of light at -20 ° C;
Sample 2: with exclusion of light at + 4-6 ° C;
Sample 3: with exclusion of light at ambient temperature;
Sample 4: under strong light (on the windowsill) at ambient temperature.

Die Proben 1 und 2 zeigten über die ganzen Zeit keine wesentlichen Veränderungen im NMR-Spektrum. Eine HPLC- Analyse bestätigte, dass die Proben 1 und 2 auch nach 200 Tagen protisches Lösungsmittel intakt waren. Probe 3 zeigte eine minimale Veränderung im NMR-Spektrum nach 100 Tagen. Die HPLC-Analyse ergab, dass mehr als 78% der Verbindung noch intakt war. Probe 4 war nach 2 Monaten abgebaut.Samples 1 and 2 showed none at all times significant changes in the NMR spectrum. An HPLC Analysis confirmed that Samples 1 and 2 continued after 200 Days of protic solvent were intact. Sample 3 showed a minimal change in the NMR spectrum after 100 Days. HPLC analysis showed that more than 78% of the Connection was still intact. Sample 4 was after 2 months reduced.

Die Stabilitätsuntersuchung zeigt, dass die Verbindung unter Ausschluss von Licht sehr beständig ist, selbst in protischen Lösungsmitteln und ohne Kühlung.The stability study shows that the connection is very stable in the absence of light, even in protic solvents and without cooling.

Example 3 25-OH Vit.D ELISA with 25-hydroxy-vitamin D ₃ - 3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether

Die Bestimmung erfolgte nach dem in Fig. 2 gezeigten Prinzip. Hierzu musste zunächst 25-Hydroxy-Vitamin-D-3β- 3'[6-N-(biotinyl)hexamido]amidopropylether über Strepta vidin an eine feste Phase gebunden werden.The determination was made according to the principle shown in FIG. 2. For this purpose, 25-hydroxy-vitamin-D-3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether had to be bound to a solid phase via strepta vidin.

(i) Coating a microtiter plate with streptavidin

In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurde jeweils 100 ng Streptavidin gegeben, gelöst in 200 µl 60 mM NaHCO₃, pH 9,6, und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Streptavidin-Lösung in den Vertiefungen wurde entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit 200 µl Waschpuffer (PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20) gewaschen. Dann wurde in jede Vertiefung 250 µl Assaypuffer gegeben. Für den Assaypuffer wurde 5 g Casein in 100 ml 0,1 N NaOH gelöst und mit PBS, pH 7,4 auf 1 L Volumen aufgefüllt. Die Lösung wurde eine Stunde gekocht, das Volumen mit destilliertem Wasser auf einen Liter ergänzt, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und 0,1 g Thimerosal zur Vermeidung von Mikrobenwachstum zugefügt. Die Vertiefungen in der Mikrotiterplatte wurden eine Stunde bei Raumtemperatur mit Assaypuffer inkubiert, dann der Assaypuffer entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.In each case 100 ng streptavidin was added to the wells of a microtiter plate, dissolved in 200 μl 60 mM NaHCO ₃ , pH 9.6, and the plate was incubated at 4 ° C. overnight. The streptavidin solution in the wells was removed and each well was washed five times with 200 ul washing buffer (PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween-20). Then 250 µl assay buffer was added to each well. For the assay buffer, 5 g casein was dissolved in 100 ml 0.1 N NaOH and made up to 1 L volume with PBS, pH 7.4. The solution was boiled for one hour, the volume was made up to one liter with distilled water, the pH was adjusted to 7.4 and 0.1 g of thimerosal was added to avoid microbial growth. The wells in the microtiter plate were incubated for one hour at room temperature with assay buffer, then the assay buffer was removed and each well was washed five times with 200 μl wash buffer.

(ii) Binding of 25-hydroxy-vitamin-D ₃ -3β-3 '[6-N- (bio tinyl) hexamido] amidopropyl ether

Es wurde in eine jede Vertiefung 100 µl Biotin-Vitamin-D- Lösung gegeben (10 ng 25-Hydroxy-Vitamin-D-3β-3'[6-N- (biotinyl)hexamido]amidopropylether in 100 µl Waschpuf fer) und eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln und unter Schütteln inkubiert. Dann wurde die Biotin-Vitamin- D-Lösung aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertie fung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.100 µl of biotin vitamin D Solution (10 ng 25-hydroxy-vitamin-D-3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether in 100 µl washing pouf fer) and one hour at room temperature in the dark and incubated with shaking. Then the biotin vitamin D solution removed from the wells and each well fung washed five times with 200 µl wash buffer.

Es folgte in flüssiger Phase die kompetitive Bindung von Vitamin-D-bindenden Protein in Gegenwart von 25-Hydroxy- Vitamin-D aus Standard oder Probe. The competitive binding of followed in the liquid phase Vitamin D binding protein in the presence of 25-hydroxy Vitamin D from standard or sample.

(iii) Sample preparation

Es wurde 50 µl Serum in einem 1,5 ml Eppendorf-Reak tionsgefäß mit 200 µl Ethanol_abs (vorgekühlt auf -20°C) durch Vortexen gemischt und 20 Minuten bei -20°C aus gefällt. Die Proben wurden in einer Eppendorf-Tisch zentrifuge bei maximaler Umdrehung zentrifugiert und die Überstände abgenommen und im ELISA eingesetzt.50 .mu.l serum in a 1.5 ml Eppendorf reaction vessel with 200 .mu.l ethanol _abs (pre-cooled to -20 ° C) was mixed by vortexing and precipitated at -20 ° C for 20 minutes. The samples were centrifuged in an Eppendorf table centrifuge at maximum rotation and the supernatants were removed and used in the ELISA.

Man kann in der Regel davon ausgehen, dass Plasma oder Serumproben bei 4°C etwa 2 Wochen stabil sind. Bei längerer Lagerung müssen sie bis zur Bestimmung tiefgefroren werden. Urinproben müssen vor einer Lagerung mit 1 N NaOH auf einen pH-Wert zwischen 6 und 8 einge stellt werden. Sie können dann bei 4°C etwa 14 Tage auf bewahrt werden; bei längerer Lagerung müssen auch sie bis zur Bestimmung tiefgefroren werden.One can usually assume that plasma or Serum samples are stable at 4 ° C for about 2 weeks. At they must be stored for a longer period until they are determined be frozen. Urine samples must be taken before storage with 1 N NaOH to a pH between 6 and 8 be put. You can then stay at 4 ° C for about 14 days be preserved; in the case of long storage, they too must be be frozen for determination.

(iv) Competitive binding

Es wurde jeweils 100 µl Vitamin-D-bindendes Protein, isoliert aus Ziegenserum (1 : 15000 in Assaypuffer mit 3% (w/v) PEG 6000), zusammen mit 10 µl Standard, Kontrolle oder Probe (10 µl Überstand aus der Probenvorbereitung) in die Vertiefungen gegeben. Die Mikrotiterplatte wurde 24 Stunden bei 4°C im Dunkeln und unter Rütteln inkubiert. Dann wurden die Lösungen aus den Vertiefungen entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.100 µl of vitamin D-binding protein, isolated from goat serum (1: 15000 in assay buffer with 3% (w / v) PEG 6000), together with 10 µl standard, control or sample (10 µl supernatant from sample preparation) given in the wells. The microtiter plate was 24 hours at 4 ° C in the dark and with shaking incubated. Then the solutions from the wells removed and the wells five times with 200 µl each Wash buffer washed.

(v) Determine competitive binding

Es wurde jeweils 100 µl Kaninchen-anti-Vitamin-D-Bin dungsprotein (1 : 10000 verdünnt in Assaypuffer mit 3% (w/v) PEG 6000) in die Vertiefungen gegeben und eine Stunde im Dunkeln und unter Rütteln bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösungen wurden aus den Vertiefungen entfernt und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen. Die quantitative Bestimmung erfolgte mit 100 µl anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase (1 : 20 000 verdünnt in Waschpuffer). Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden Antikörper- Lösungen abgenommen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen. Für die Farbreaktion wurden 100 µl Tetramethylbenzidin(TMB)-Substrat-Lösung (gebrauchsfertig von NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) in die Vertiefungen gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Farbentwicklung gestoppt durch Zugabe von 50 µl 2 M H₂SO₄ pro Vertiefung. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 450 nm. Die nachstehenden Tabellen II und III zeigen das Pipettierschema für die Mikrotiterplatte sowie die Werte für die optische Dichten.In each case 100 μl of rabbit anti-vitamin D binding protein (diluted 1: 10,000 in assay buffer with 3% (w / v) PEG 6000) were added to the wells and incubated for one hour in the dark and with shaking at room temperature. The solutions were removed from the wells and each well was washed five times with 200 ul wash buffer. The quantitative determination was carried out with 100 μl anti-rabbit IgG peroxidase (diluted 1: 20,000 in washing buffer). It was incubated for one hour at room temperature. Antibody solutions were then removed and each well was washed five times with 200 μl wash buffer. For the color reaction, 100 μl of tetramethylbenzidine (TMB) substrate solution (ready for use by NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, DE) were added to the wells. After 30 minutes, the color development was stopped by adding 50 μl 2 MH ₂ SO ₄ per well. The optical density was measured at 450 nm. Tables II and III below show the pipetting scheme for the microtiter plate and the values for the optical densities.

Als Standard wurden Lösungen von 25-Hydroxyvitamin-D₃ in Assaypuffer mit folgenden Konzentrationen eingesetzt: 0, 8, 20, 50, 125 und 312 nMol/L (siehe Eichkurve in Fig. 5). Als Kontrolle bzw. Proben dienten vier Seren von Patienten mit einer D-Hypovitaminose (Proben-Nrn. 24, 203, 963, 965) und sowie vier willkürlich ausgewählte Normalseren (Proben-Nrn. NP 18, NP 25, NP 34, NP 37 - Testreihen 3 und 4). Von den Vitamin-D-Mangelseren wurde zudem die 25-Hydroxyvitamin-D-Konzentration durch kompe titiven Bindungsassay mit Hilfe von ³H-25-Hydroxy-Vitamin- D bestimmt. Als weitere "Kontrolle" dienten vier Lösungen, bei denen die jeweilige Konzentration an 25- Hydroxyvitamin-D aus anderweitigen Bestimmungen bekannt war, entweder aus den Herstellerangaben oder durch einen kompetitiven Bindungsassay (CBPA) mit ³H-25-Hydroxy- Vitamin-D. Solutions of 25-hydroxyvitamin D ₃ in assay buffer with the following concentrations were used as standard: 0, 8, 20, 50, 125 and 312 nmol / L (see calibration curve in FIG. 5). Four sera from patients with D-hypovitaminosis (sample numbers 24, 203, 963, 965) and four randomly selected normal sera (sample numbers NP 18, NP 25, NP 34, NP 37) served as controls and samples - Test series 3 and 4). The 25-hydroxyvitamin D concentration of the vitamin D deficiency sera was also determined by competitive binding assay with the aid of ³ H-25-hydroxy vitamin D. As a further "control" four solutions were used, in which the respective concentration of 25-hydroxyvitamin-D was known from other determinations, either from the manufacturer's instructions or by means of a competitive binding assay (CBPA) with ³ H-25-hydroxy-vitamin-D.

Tabelle II Table II

Probenanordnung Sample arrangement

Tabelle III Table III

Messwerte nach 30 Minuten Farbentwicklung Measured values after 30 minutes of color development

Aus den Mittelwerten der Spalten 1 und 2 und den bekannten Konzentration an 25-Hydroxyvitamin-D wurde die in Fig. 5 gezeigt Eichkurve erstellt. Die Ordinate zeigt die optische Dichte als Mittelwert der beiden Messungen bei 450 nm; die Abszisse die Konzentration an 25-Hydroxy- Vitamin-D in nMol/l. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 zusammengefasst.The calibration curve shown in FIG. 5 was created from the mean values of columns 1 and 2 and the known concentration of 25-hydroxyvitamin-D. The ordinate shows the optical density as the mean of the two measurements at 450 nm; the abscissa shows the concentration of 25-hydroxy-vitamin-D in nmol / l. The results are summarized in Table 5.

Example 4 Comparative binding analysis with ³ H-25-OH-Vitamin-D as a competitive partner

Soweit nicht anders angegeben ist, waren alle Reagenzien Puffer und Materialien gleich wie im vorgenannten Beispiel 3. Als kompetitiver Bindungspartner (Tracer) diente Tritium-markiertes 25-Hydroxyvitamin-D₃.Unless otherwise stated, all reagents, buffers and materials were the same as in Example 3 above. Tritium-labeled 25-hydroxyvitamin-D ₃ served as the competitive binding partner (tracer).

Abweichend zu Beispiel 3 wurden die Messproben durch Extraktion (in Einzelwerten) aufgereinigt. Hierzu wurde jeweils 50 µl Probe [nicht-spezifischer Assaypuffer NSB, Standard, Kontrolle, Patientenprobe (Plasma, Serum oder Urin)] in ein 1.5 ml Einmalreaktionsgefäß gegeben, 200 µl Acetonitril hinzugefügt, gemischt, die Gefäßwände frei zentrifugiert, und die Mischung 20 bis 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 1700 × g zentrifugiert. Die Bestimmungen erfolgten in Doppelwerten mit den Überständen.Deviating from example 3, the measurement samples were carried out Extraction (in individual values) cleaned up. This was done 50 µl sample each [non-specific assay buffer NSB, Standard, control, patient sample (plasma, serum or Urine)] into a 1.5 ml single-use reaction vessel, 200 µl Acetonitrile added, mixed, the vessel walls free centrifuged, and the mixture at 4 ° C for 20 to 30 minutes incubated. The mixture was at 1700 x g for 10 minutes centrifuged. The determinations were made in duplicate with the supernatants.

Hierzu wurde 25 µl klarer Überstand in ein Glasröhrchen (oder in ein Spezial-RIA-Gefäß von Sarstedt, Darmstadt) überführt, und 10 µl Tracer (³H-25-OH-D), 300 µl Assay puffer und 100 µl Vitamin-D-bindendes Protein (nicht in NSB) hinzugeben. Der Röhrcheninhalt wurde gemischt, eine Stunde bei 4°C inkubiert, und zum Entfernen von nicht gebundenem radioaktiven Tracer 100 µl Aktivkohlesuspension (aktivkohlehaltiger Phosphatpuffer mit 0,1% NaN₃) zugegeben. Der Röhrcheninhalt wurde gemischt, 3 bis 5 Minuten bei 4°C inkubiert, und die Aktivkohle durch 10 Minuten Zentrifugieren bei 1700 × g pellettiert. Es wurde dann jeweils 400 µl Überstand in ein Zählgefäß (7 ml) überführt und nach Zugabe von 2 ml Szintillatorflüssigkeit wie Aquasafe© 300 oder HiSafe© III die im Überstand befindliche Radioaktivität gezählt (2 Minuten in einem Beta-Counter). Die Messwerte für die Kontrollen nach Erstellung der Eichkurve sind in Tabelle 5 gezeigt.For this purpose, 25 ul clear supernatant was transferred into a glass tube (or in a special RIA tube from Sarstedt, Darmstadt), and 10 ul tracer ( ³ H-25-OH-D), 300 ul assay buffer and 100 ul vitamin D - add binding protein (not in NSB). The tube contents were mixed, incubated at 4 ° C. for one hour, and 100 μl of activated carbon suspension (activated carbon-containing phosphate buffer with 0.1% NaN ₃ ) were added to remove unbound radioactive tracer. The tube contents were mixed, incubated for 3 to 5 minutes at 4 ° C, and the activated carbon was pelleted by centrifugation at 1700 x g for 10 minutes. Then 400 µl of supernatant was transferred to a counting vessel (7 ml) and after adding 2 ml of scintillator liquid such as Aquasafe © 300 or HiSafe © III the radioactivity in the supernatant was counted (2 minutes in a beta counter). The measured values for the controls after the calibration curve has been drawn up are shown in Table 5.

Der Vergleich mit dem ELISA nach Beispiel 3 zeigt, dass für beide Assayverfahren (ELISA und CBPA) in gilt, dass der Normbereich für 25-Hydroxyvitamin-D im Plasma oder Serum etwa 25-125 nmol/l ist.The comparison with the ELISA according to Example 3 shows that for both assay methods (ELISA and CBPA) in that the normal range for 25-hydroxyvitamin-D in plasma or Serum is about 25-125 nmol / l.

Die Nachweisegrenze dieser Testsysteme wurde festgesetzt als B₀ + 2SD. Sie beträgt etwa 2,5 nmol/l.The detection limit of these test systems was set as B ₀ + 2SD. It is approximately 2.5 nmol / l.

Kreuzreaktionen: Zu Aktivkohle behandeltem Serum wurde 25- OH-Vitamin-D₂ (125 nmol/l), 24,25-(OH)₂-Vitamin-D₃ (250 nmol/l) und 1,25-(OH)₂-Vitamin-D₃ (250 nmol/l) zugesetzt. Das 25-OH-Vitamin-D₂ reagierte zu 60%, das 24,25-(OH)₂- Vitamin-D₃ zu 100% kreuz, während das 1,25-(OH)₂-Vitamin-D₃ keine Kreuzreaktivität zeigte. Ähnliche Ergebnisse werden auch für erfindungsgemäße multifunktionelle 25-Hydroxy vitamin-D-Konjugate gefunden bzw. erwartet.Cross-reactions: 25-OH-vitamin D ₂ (125 nmol / l), 24.25- (OH) ₂ -vitamin-D ₃ (250 nmol / l) and 1.25- (OH) _{2 were added} to activated carbon-treated serum -Vitamin-D ₃ (250 nmol / l) added. The 25-OH-vitamin D ₂ reacted to 60%, the 24,25- (OH) ₂ - vitamin-D ₃ to 100% cross, while the 1,25- (OH) ₂ -vitamin-D _{3 had} no cross-reactivity showed. Similar results are also found or expected for multifunctional 25-hydroxy vitamin D conjugates according to the invention.

Reproduzierbarkeit: In Wiederholungsmessungen (n = 11) einer 25-Dihydroxy-Vitamin-D₃-haltigen Probe wurden nachstehende Resultate erzielt. Ähnliches gilt auch für Messungen mit Hilfe der multifunktionellen 25-Hydroxyvitamin-D-Konjugate gemäß der Erfindung: Reproducibility: The following results were obtained in repeated measurements (n = 11) of a sample containing 25-dihydroxyvitamin D ₃ . The same applies to measurements using the multifunctional 25-hydroxyvitamin-D conjugates according to the invention:

Tabellen IV Tables IV

Intraassayvarianz Intra-assay variance

Interassayvarianz Interassay variance

Klinik clinic

Für die in Beispiel 3 genannten Proben wurden mit den Verfahren nach Beispiel 3 und 4 folgende 25-Hydroxy vitamin-D-Konzentrationen ermittelt. For the samples mentioned in Example 3, the Process according to Examples 3 and 4 following 25-hydroxy vitamin D concentrations determined.

Tabelle V Table V

Die von den Herstellern angegeben Werte waren generell höher als die im kompetitiven Bindungsassay ermittelten Konzentrationen. Dies lässt vermuten, dass sich in den überlassenen Proben bereits ein erheblicher Teile des 25- Hydroxyvitamin-D zersetzt bzw. durch Lichteinwirkung umgelagert hat.The values given by the manufacturers were general higher than that determined in the competitive binding assay Concentrations. This suggests that the a large part of the 25- Hydroxyvitamin-D decomposes or by exposure to light has relocated.

Example 5 Control of the ELISA determination by HLPC

Es wurden daher in verschiedenen Proben die 25-Hydroxy vitamin-D-Konzentration durch ELISA gemäß Beispiel 3 und zur Kontrolle durch HPLC nachbestimmt. Für die Eichkurve wurden Standards verwendet mit Vitamin-D₃-Konzentrationen von 0, 8, 20, 50, 125 und 312 nMol/l. Alle Proben und Standards wurden in Doppelwerten bestimmt. Die 25- Hydroxyvitamin-D₃-Konzentration der Proben wurde dann anhand der Eichkurve aus den Mittel der Doppelwerte berechnet.The 25-hydroxy vitamin D concentration was therefore determined in various samples by ELISA according to Example 3 and for control by HPLC. Standards were used for the calibration curve with vitamin D ₃ concentrations of 0, 8, 20, 50, 125 and 312 nmol / l. All samples and standards were determined in duplicate. The 25-hydroxyvitamin D ₃ concentration of the samples was then calculated using the calibration curve from the mean of the double values.

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle VI gezeigt. The results are shown in Table VI below.

Tabelle VI Table VI

Example 6 Long-term stability of 25-hydroxyvitamin-D- Conjugate in the ELISA determination.

Es wurden Eichkurven mit gleichen Standardlösungen und Reagenzien gemäß dem Beispiel 3 nach 60 und 100 Tagen wiederholt, um zu ermitteln, inwieweit sich eine ELISA- Bestimmung mit erfindungsgemäßen Biotin-25-Hydroxy vitamin-D-Konjugat im Laufe der Zeit verändert, wenn die Reagenzien zwischenzeitlich bei 4 bis 5°C im Dunkeln gelagert werden. Die nachstehende Tabelle zeigt die jeweiligen optischen Dichten nach 30 Minuten Entwicklung (siehe Beispiel 3). There were calibration curves with the same standard solutions and Reagents according to Example 3 after 60 and 100 days repeated to determine the extent to which an ELISA Determination with biotin-25-hydroxy according to the invention vitamin D conjugate changes over time if that Reagents in the meantime at 4 to 5 ° C in the dark be stored. The table below shows that respective optical densities after 30 minutes of development (see example 3).

Tabelle VII Table VII

Werden die Werte der verschiedenen Eichkurven, abzüglich der jeweiligen nichtspezifischen Bindung, in ein Diagramm nach Fig. 3 aufgetragen, so ist leicht ersichtlich, dass die Eichkurven abgesehen einer relativen vertikalen Verschiebung die gleiche Form besitzen. Dies zeigt, dass sich die Empfindlichkeit und Spezifität der ELISA- Bestimmungen über den genannten Zeitraum nicht verändert hat.If the values of the different calibration curves, minus the respective non-specific binding, are plotted in a diagram according to FIG. 3, it can easily be seen that the calibration curves have the same shape apart from a relative vertical shift. This shows that the sensitivity and specificity of the ELISA determinations did not change over the period mentioned.

Example 7 25 (OH) -Vitamin-D ₃ -ELISA-MTP with anti-vitamin-D binding protein

Der Versuch erfolgte im Wesentlichen nach dem Protokoll von Beispiel 3 und dem in Fig. 4 gezeigten Prinzip. Es wurden folgende Puffer verwendet: a) Waschpuffer: PBS, pH 7.4 mit 0.05% Tween-20; b) Assaypuffer: 5 g Casein wurden in 100 ml 0.1 N NaOH gelöst und mit PBS, pH 7,4 auf 1 l aufgefüllt. Dann wurden 3% (w/v) PEG-6000 sowie 0.1 g Thimerosal hinzugefügt. Alle Inkubationen erfolgten im Dunkeln und unter Schütteln. The experiment was carried out essentially according to the protocol of Example 3 and the principle shown in FIG. 4. The following buffers were used: a) Wash buffer: PBS, pH 7.4 with 0.05% Tween-20; b) Assay buffer: 5 g casein were dissolved in 100 ml 0.1 N NaOH and made up to 1 l with PBS, pH 7.4. Then 3% (w / v) PEG-6000 and 0.1 g thimerosal were added. All incubations were in the dark and with shaking.

(i) Coating the microtiter plate

In die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wurden jeweils 100 µl Kaninchen-anti-Vitamin-D-Bindungsprotein in 60 mM NaHCO₃, pH 9,6 gegeben und die Platte über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Lösungen wurden entfernt und jede Ver tiefung fünfmal mit 200 µl Waschpuffer gewaschen. Dann wurde 250 µl Assaypuffer in jede Vertiefung gegeben und die Platte eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Der Assaypuffer wurde entfernt und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.In each case 100 μl of rabbit anti-vitamin D binding protein in 60 mM NaHCO ₃ , pH 9.6 were added to the wells of a microtiter plate and the plate was incubated at 4 ° C. overnight. The solutions were removed and each well was washed five times with 200 ul wash buffer. Then 250 µl assay buffer was added to each well and the plate was incubated for one hour at room temperature. The assay buffer was removed and each well was washed five times with 200 ul wash buffer.

(ii) Sample preparation

Es wurde 50 µl Serum, Plasma oder Standard in einem 1.5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 200 µl Ethanol_abs (vor gekühlt auf -20°C) gemischt, gevortext und dann 20 Minuten bei -20°C ausgefällt. Die Proben wurden in einer Eppendorf-Tischzentrifuge bei maximaler Umdrehung zentri fugiert. Der Überstand wurde abgenommen und im ELISA eingesetzt.50 μl serum, plasma or standard were mixed in a 1.5 ml Eppendorf reaction vessel with 200 μl ethanol _abs (pre-cooled to -20 ° C.), vortexed and then precipitated at -20 ° C. for 20 minutes. The samples were centrifuged in an Eppendorf benchtop centrifuge at maximum rotation. The supernatant was removed and used in the ELISA.

(iii) ELISA

Als Erstes wurde in eine jede Vertiefung 100 µl Vitamin- D-Bindungsprotein, verdünnt in Assaypuffer, gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde die Platte ausgeschlagen und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.First, 100 µl of vitamin D-binding protein, diluted in assay buffer, and incubated for one hour at room temperature. Then the Knock out the plate and use each well five times Washed 200 ul wash buffer.

Danach wurden je 100 µl Biotin-Vitamin-D, verdünnt in Assaypuffer, zusammen mit 10µl Standard, Probe oder Kontrolle in die Vertiefungen gegeben. Die Platte wurde 24 Stunden bei 4°C inkubiert. Die Lösungen wurden wiederum entfernt und eine jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.Then 100 µl of biotin vitamin D, diluted in Assay buffer, together with 10µl standard, sample or Control given in the wells. The plate was Incubated for 24 hours at 4 ° C. The solutions were again removed and each well five times with each Washed 200 ul wash buffer.

Als Drittes wurde jeweils 100 µl Peroxidase-gekopppeltes Streptavidin einer 1 : 10000-Verdünnung in Waschpuffer in die Vertiefungen gegeben und 45 Minuten bei Raum temperatur inkubiert. Die Platte wurde ausgeschlagen und jede Vertiefung fünfmal mit je 200 µl Waschpuffer gewaschen.The third was 100 µl peroxidase-coupled Streptavidin a 1: 10,000 dilution in wash buffer in given the wells and 45 minutes at room temperature incubated. The plate was knocked out and each well five times with 200 µl wash buffer washed.

Für die Farbreaktion wurden 100 µl TMB-Substrat-Lösung in jede Vertiefung gegeben. Nach ausreichender Farbent wicklung (30 Minuten) wurde die Reaktion mit 50 µl 2M H₂SO₄ pro Vertiefung beendet. Die Messungen der optischen Dichte erfolgte bei 450 nm. Es wurden ähnliche bis gleiche Ergebnisse erhalten, wie in Beispiel 3 bzw. Tabelle V.For the color reaction, 100 ul TMB substrate solution was added to each well. After sufficient color development (30 minutes), the reaction was terminated with 50 μl 2M H ₂ SO ₄ per well. The optical density was measured at 450 nm. Similar to the same results were obtained as in Example 3 or Table V.

Example 8 Contents of a test pack or one Reagent set for the determination of 25- Hydroxyvitamin-D and 1α, 25-hydroxyvitamin-D

Inhalt der Testpackung bzw. Testreagenzien und deren Vorbereitung:
Contents of the test pack or test reagents and their preparation:

Standards, bspw. 6 Fläschchen 25-Hydroxyvitamin-D- Standards mit den Konzentrationen 0, 8, 20, 50, 125 und 312 nmol/l; gebrauchsfertig in Waschpuffer.
Mikrotiterplatten, bspw. mit Streptavidin beschichtet, steril verpackt und vorgewaschen.
Pufferlösungen, bspw. Waschpuffer, NSB-Puffer und Assaypuffer, Stopplösung.
Kontrollen, bspw. zwei Fläschchen 25-Hydroxyvitamin-D- Kontrollen in Humanserum. Kontrolle 1 (30 nMol 25-OH-D/L), Kontrolle 2 (80 nMol 25-OH-D/L).
Tracer, bspw. ein Fläschchen mit Biotin-Vitamin-D (25- Hydroxy-Vitamin-D₃-3β-3'[6-N-(biotinyl)hexamido]amidopro pylether) in Waschpuffer (100 ng/ml)
Vitamin-D-Bindungsprotein, bspw. ein Fläschchen mit Bindungsprotein aus Ziegenserum in Phosphatpuffer mit 0,1% NaN₃ als Stabilisator.
Marker, bspw. ein Fläschchen anti-Kaninchen-IgG- Peroxidase in Waschpuffer.
TMB-Entwicklerlösung, bspw. ein Fläschchen stabilisierte Tetramethylbenzidin-Entwicklerlösung in Waschpuffer.Standards, for example 6 vials of 25-hydroxyvitamin D standards with the concentrations 0, 8, 20, 50, 125 and 312 nmol / l; ready to use in washing buffer.
Microtiter plates, e.g. coated with streptavidin, sterile packed and pre-washed.
Buffer solutions, e.g. washing buffer, NSB buffer and assay buffer, stop solution.
Controls, for example two vials of 25-hydroxyvitamin D controls in human serum. Control 1 (30 nmol 25-OH-D / L), Control 2 (80 nmol 25-OH-D / L).
Tracer, e.g. a vial with biotin-vitamin-D (25-hydroxy-vitamin-D ₃ -3β-3 '[6-N- (biotinyl) hexamido] amidopropyl ether) in washing buffer (100 ng / ml)
Vitamin D binding protein, for example a vial with binding protein from goat serum in phosphate buffer with 0.1% NaN ₃ as a stabilizer.
Marker, for example a vial of anti-rabbit IgG peroxidase in washing buffer.
TMB developer solution, for example a vial of stabilized tetramethylbenzidine developer solution in washing buffer.

Claims

1. Vitamin D derivative of the formula:
where is:
O is the oxygen atom of an ether group;
X is a substituted or unsubstituted hydrocarbon group of 0.8 to 4.2 nm in length, which may have conventional heteroatoms such as S, O, N or P;
Y is hydrogen or hydroxy;
A is a tracer group that can be bound by a binding protein with high affinity;
R is a substituted or unsubstituted hydrocarbon side group of vitamin D or a vitamin D metabolite, a side group of vitamin D ₂ or D ₃ , the 25-hydroxy side group of vitamin D ₂ or -D ₃ .

2. Vitamin D derivative according to claim 1, wherein A out choose from biotin, digoxigenin, tyrosine, FITC substituted tyrosine, substituted amino acids, characteristic amino acid and peptide sequences, FITC, proteins and peptide groups, protein A, Protein G, vitamin D derivatives; 25-hydroxyvitamin-D.

3. Vitamin D derivative according to claim 1, wherein A is a Compound is of formula (I) which in the 3β- Position over an ether bridge with the Distance group X is connected.

4. Vitamin D derivative according to any one of claims 1 to 3, the spacing group being 0.8 to 2 in length nm, particularly preferably 0.9 to 1.5 nm.

5. Vitamin D derivative according to any one of claims 1 to 4, wherein the spacer group is an aminocarboxylic acid Aminoundecanoic acid or an amino polyether residue.

A method of making a vitamin D derivative according to any of claims 1 to 5, comprising the steps of:

a) Cyanoethylation of 25-hydroxy-vitamin D with acrylonitrile in a mixture with acetonitrile, potassium hydride and tert-butanol and
b) Reduction of the nitrile group with LiH / LiAlH ₄ .

7. Procedure for the quantitative determination of 25- Hydroxy and 1α, 25-dihydroxy vitamin D metabolite in a sample, characterized in that a Vitamin D derivative according to any one of claims 1 to 5 is used as a binding partner.

8. The method of claim 7, wherein the method is a Protein binding analysis includes.

9. The method of claim 8, wherein the method the Includes binding to a receptor.

10. The method of claim 8, wherein the method is a Binding to an antibody includes.

11. The method of claim 10, wherein the method is a competitive immunoassay, selected from RIA, EIA / ELISA, LiA and FiA.

12. The method of claim 10, wherein the method Sandwich immunoassay is selected from IRMA, IEMA / EUA, ILMA (Immunoluminescence Assay) and IFMA (Immunofluorescence assay).

13. The method according to any one of claims 7 to 12, comprising a solid phase selected from Microtiter plate and other solid supports, Microparticles, preferably from agarose, polymer Material, cellulose, magnetic microparticles.

14. The method according to claim 7 to 13, wherein the Process can be automated in liquid or solid phase he follows.

15. A method for the determination of 25-hydroxy and 1α, 25-dihydroxy-vitamin D metabolites according to any one of claims 7 to 14, comprising the steps:

a) coating a solid support with streptavidin;
b) adding biotin vitamin D derivative according to any one of claims 1 to 5;
c) adding the sample and a defined amount of vitamin D-binding protein;
d) Determination of the bound binding protein with labeled antibodies against vitamin D-binding protein.

16. A method for the determination of 25-hydroxy and 1α, 25-dihydroxy-vitamin D metabolites according to any of claims 7 to 14, comprising the steps of:

a) coating a support with antibodies against vitamin D-binding protein;
b) addition of vitamin D binding protein;
c) adding the sample and a defined amount of biotin-coupled vitamin D derivative according to claim 1;
d) Determination of the amount of bound derivative with labeled streptavidin.

17. The method of any of claims 7 to 16, wherein the determination is made by marking with a Enzyme that catalyzes a detection reaction.

18. Reagent set for the determination of 25-hydroxy and 1α, 25-dihydroxy vitamin D metabolites after one A method according to any of claims 7 to 17 characterized in that he is a standardized Amount of solid or solution of a vitamin D derivative according to one of claims 1 to 5.