DE19838011A1 - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Fettsäuremethylestern ("Biodiesel") auf Molkebasis - Google Patents

Description

Es wird ein biotechnologisches Verfahren zur Herstellung von in der Zusammensetzung mit Rapsölmethylester ("Biodiesel") vergleichbaren Fettsäuremethylestern auf Basis von zuvor auf verschiedenen Molkefraktionen hergestellten mikrobiellen Triglyceriden angegeben. Dieses Verfahren ermöglicht sowohl eine sinnvolle Verwertung des in großen Mengen und mit hoher organischer Belastung und hohen CSB- und BSB-Werten als landwirtschaftliches Abfallprodukt anfallenden Rohstoffes Molke aus der milchverarbeitenden Industrie - weltweit fallen jährlich ca. 115 Mio. Tonnen Molke pro Jahr an (Castillo, 1990, in "Yeast", Marcel Dekker, New York), einige Firmen in Deutschland verarbeiten bis zu 1 Mio. Liter Molke am Tag - als auch die einfache und wirtschaftliche Herstellung von Fettsäuremethylestern ("Biodiesel"), die zum Betreiben von Dieselmotoren eingesetzt werden können.

Mikrobielle Triglyceride werden von verschiedenen Mikroorganismen vor allem der Gattungen Cryptococcus, Lipomyces, Rhodotorula, Trichosporon - sogenannten "Fetthefen" - und Pilzen der Gattungen Cunninghamella, Rhizopus, Aspergillus und Penicillium bevorzugt unter Stickstofflimitierung in Konzentrationen von bis zu 70% der Zelltrockenmasse als Speicherstoffe gebildet (C. Ratledge (1993) TIBTECH 11: 278-284).

Die Hefe Cryptococcus curvatus hat sich in verschiedenen Screeningverfahren als besonders geeigneter Produzentenstamm für die "Single Cell Oil"-Bildung erwiesen (M. Hassan et al. (1994 a) J. Microbiol. Biotechnol. 10: 534-537; M. Hassan et al. (1994 b) Biotechnol. Lett. 16: 819-824; L. Heredia and C. Ratledge (1988) Biotechnol. Lett. 10: 25-30; N. J. Moon et al. (1978) J. Dairy Sci. 61: 1537-1547).

Die mikrobiell gewonnenen Triglyceride zeigen nach den oben genannten Arbeiten in etwa dieselbe Zusammensetzung wie Pflanzenöle und lassen sich ohne Schwierigkeiten z. B. auf Molkebasis ohne weitere Zusätze (N. J. Moon et al. (1978) J. Dairy Sci. 61: 1537-1547) oder auch auf Holzhydrolysaten (L. Heredia and C. Ratledge (1988) Biotechnol. Lett. 10: 25-30) herstellen. Das mikrobielle Triglycerid aus der genannten Hefe Cryptococcus curvatus ist mit ca. 50% der enthaltenen Fettsäuren sehr reich an ungesättigter Ölsäure, die eine Kettenlänge von 18 C-Atomen hat und auch Hauptbestandteil von Rapsöl ist.

In Neuseeland gab es bereits Ende der achtziger Jahre Bestrebungen, solche mikrobiellen Triglyceride großtechnisch auf Molkebasis herzustellen und als Lebensmittel zu nutzen, um so die enormen Abfälle der dortigen milchverarbeitenden Industrie sinnvoll zu verwerten (C. Ratledge (1993) TIBTECH 11: 278-284). Trotz ihrer mit hochwertigen Pflanzenölen vergleichbaren Zusammensetzung und Qualität, der Möglichkeit zur schnellen und preiswerten Herstellung (1 Liter entproteiniertes 20%iges Molkekonzentrat, das sich als Substrat für die o.g. Mikroorganismen gut eignet, kostet in Deutschland z. Zt. ca. 0,10 DM, daraus lassen sich innerhalb von 3-5 Tagen im Bioreaktor ca. 40 g/L Biotrockenmasse herstellen, die bis zu 50% entsprechend ca. 20 g/L Triglycerid enthält), die im Vergleich zu den pflanzlichen Produkten unter genau definierten Bedingungen witterungsunabhängig und ohne Zusatz von Herbiciden im Bioreaktor erfolgen kann, konnten sich diese Produkte jedoch bisher am Lebensmittelmarkt nicht gegen pflanzliche Öle, wie z. B. Sonnenblumenöl, Canolaöl oder Kokosfett und tierische Fette behaupten. Der Grund dafür besteht einerseits in der Kostenverzerrung durch die Subventionen für landwirtschaftliche Verfahren im Gegensatz zu biotechnologischen, andererseits aber auch darin, daß die mikrobiellen Produkte intrazellulär vorliegen und sich die für einen späteren Einsatz als Speiseöl oder Speisefett notwendige Freisetzung und Reindarstellung aus den Mikroorganismen aufwendiger gestalten als bei den vergleichbaren pflanzlichen und tierischen Produkten. Zur Zeit gehen neuere Forschungsarbeiten dahin, durch gezieltes Eingreifen in den Stoffwechsel der jeweiligen Mikroorganismen zu ungewöhnlichen Fettsäuren mit wesentlich höherer Wertschöpfung (Vitaminvorstufen) zu kommen (Kettenlängen von <18 C-Atomen mit bis zu 5 Doppelbindungen), die so nicht in tierischen und pflanzlichen Fetten zu finden sind.

Mikrobiell gewonnene Triglyceride sind jedoch aufgrund ihrer Zusammensetzung und einfachen und preiswerten Herstellung gut dazu geeignet, um daraus Fettsäuremethylester, vor allem Ölsäuremethylester herzustellen, die als Hauptkomponente bei der Verarbeitung des landwirtschaftlich hergestellten Rapsöles auftreten und als "Biodiesel" verwendet werden.

Ein entsprechendes Verfahren wurde in unserer Arbeitsgruppe etabliert: In einem 2-stufigem kombiniertem mikrobiellen/chemischen Prozeß wird dazu zunächst auf zuvor kalt-sterilfiltrierten Molkefraktionen, bevorzugt auf entproteiniertem Molkekonzentrat mit 20% Trockensubstanz, ohne weitere Zusätze die fettbildende Hefe Cryptococcus curvatus angezogen. Nach Eintreten der Stickstofflimitierung (nach ca. 24 h) bildet dieser Organismus intrazellulär ein Triglycerid, das sehr reich an Ölsäure ist. Schließt man nach Beendigung der Züchtung die Biomasse z. B. mechanisch mit einer Glasperlenmühle oder einem Hochdruckhomogenisator auf und trennt - evtl. nach vorheriger Pasteurisierung, die zu einer schnelleren Abtrennung des Öls von den Zelltrümmern führt - das gewonnene Öl durch Sedimentation oder Zentrifugation ab, kann dieses direkt nach dem bekannten chemischem Verfahren zur Herstellung von Fettsäuremethylestern verwendet werden, wobei als weiteres Produkt von Wertschöpfung Glycerin entsteht, das einfach abgetrennt werden kann.

Als weiteres wichtiges Ergebnis beobachtet man nach der Kultivierung der Hefe Cryptococcus curvatus auf dem Molkekonzentrat und der anschließenden Abtrennung der Biomasse bzw. der Zelltrümmer und des Öls eine starke Reduktion der CSB- und BSB-Werte in dem als Rest von der eingesetzten Molke verbleibendem Kulturüberstand. Da die deproteinisierte Molke bisher in das Abwasser gegeben wird und aufgrund der hohen organischen Belastung für die molkeverarbeitenden Betriebe hohe Abwassergebühren verursacht, könnten diese mit dem angegebenem Verfahren ebenfalls deutlich reduziert werden.

Die Wirtschaftlichkeit des oben beschriebenen Verfahrens kann deutlich gesteigert werden, wenn man zur Gewinnung der Biomasse und des Triglycerides einen sognannten "repeated-batch"-Prozeß einsetzt: Dabei trennt man nach erfolgter Kultivierung den größten Teil (90-95%) der Kulturbrühe ab und arbeitet diesen wie oben beschrieben auf. Die verbleibenden 5-10% beläßt man im Bioreaktor und benutzt diese als Startkultur, nachdem man diesen mit steriler Molke wieder aufgefüllt hat. Experimentell konnte in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden, daß sich dieses Verfahren beliebig oft wiederholen läßt.

Einige molkeverarbeitende Unternehmen in Deutschland setzen am Tag bis zu 1.000.000 Liter Molke um. Würde man nun eine Kaskade großer Bioreaktoren (Volumen 100-200 m³) zur biotechnologischen Herstellung der mikrobiellen Triglyceride einsetzen und dieses "repeated batch"-Verfahren zur ihrer Herstellung verwenden, wäre es möglich, parallel zu der täglich anfallenden großen Molkemenge kontinuierlich mikrobielles Triglycerid und daraus wiederum Fettsäuremethylester zu produzieren.

Der jährliche Bedarf an Dieselöl liegt in der Bundesrepublik Deutschland jährlich z. Zt. bei ca. 25 Mio. Tonnen. Davon sind bisher jedoch nur 80.000 Tonnen, entsprechend 0.32%, "Biodiesel" (aktuelle Auskunft des Bundesministeriums für Landwirtschaft). Aus 1.000.000 Liter Molke (dem durchschnittlichem täglichem Durchsatz eines mittelständischen milchverarbeitenden Unternehmens) könnte man auf diese Art täglich ca. 20.000 kg bzw. 20 Tonnen Triglycerid gewinnen, bzw. im Jahr 7.300.000 kg entsprechend 7300 Tonnen. Stöchiometrisch entspricht diese Menge nach Methylierung etwa derselben Menge an Fettsäuremethylester. Diese Menge würde damit rechnerisch schon 10% der jährlichen "Biodiesel"-Produktion der BRD auf Rapsölbasis entsprechen. Bei flächendeckender Einführung des Verfahrens könnte die biotechnologische "Biodiesel"-Herstellung auf Molkebasis einen entscheidenden Beitrag zur Deckung des "Biodiesel"-Bedarfes der BRD leisten und gleichzeitig die Abwasserbelastung durch die Molkeeinleitung deutlich reduzieren. Aus den nach Zellaufschluß verbleibenden Zelltrümmern könnte zusätzlich vitaminreicher und fettarmer Hefeextrakt für eine Verwendung im Lebensmittel- oder Tierfutterbereich hergestellt werden.

Kostenmäßig könnte ein entsprechendes biotechnologisches Verfahren - das im Gegensatz zur Rapsölherstellung unabhängig von Jahreszeit und Klimaeinflüssen durchführbar wäre - eine interessante Ergänzung zur bisherigen landwirtschaftlichen Herstellung von Rapsölmethylester ("Biodiesel") darstellen. Auch kostenmäßig sollte ein solches Verfahren durchaus konkurrenzfähig sein. Der Herstellungspreis für "Biodiesel" beträgt z. Zt. ca. 1.07 DM/Liter, die Rohstoffkosten für das verwendete 20% deptoteinisierte Molkekonzentrat sind äußerst niedrig, und Kosten wie für den Einsatz landwirtschaftlicher Maschinen, die Anwendung von Herbiciden und Düngemitteln und evtl. auch von Wasser zum Sprengen würden ebensowenig entstehen wie für Ernte und den Transport der Rapspflanzen zur Ölmühle und eine Entsorgung des Pflanzenmaterials. Die für das biotechnologische Verfahren notwendigen Investitionen für Bioreaktoren, Zellaufschlußgeräte und Separatoren für die Ölabtrennung und Methylierung wären überschaubar.

Das vorgestellte Verfahren könnte industriell für alle mittelständischen und großen molkeverarbeitenden Betriebe von großem Interesse sein, da sie so nicht nur ein wichtiges Massenprodukt aus den anfallenden Molkeabfallfraktionen herstellen könnten, sondern gleichzeitig auch die Umweltbelastung aufgrund der hohen BSB- und CSB-Werte der Molkeabfallfraktionen deutlich reduzieren und somit Abwassergebühren sparen bzw. auf z. Zt. durchgeführte aufwendige Verfahren zum Aufkonzentrieren der Molke z. B. für die Schweinemast - auch hier bereitet Molke aufgrund der hohen Lactosekonzentration und der damit verbundenen Unverträglichkeit Probleme - verzichten könnten.

Beispiel 1

Der Mikroorganismus Cryptococcus curvatus ATCC 20509 wird in einem 3-l-Bioreaktor auf zuvor steril filtrierten deproteinisierten Molkekonzentrat mit 20% Trockengewichtsanteil (Firma Milei GmbH Leutkirch-Adrazhofen, Allgäu; Zusammensetzung: 110 g/l Lactose, 2 g/l Galaktose, 1 g/l Glukose, 0.1 g/l Ammonium, Proteingehalt <1g/l) als einziger Kohlen- und Stickstoffquelle bei 30°C, 400 Upm und Sauerstoffsättigung gezüchtet. Der pH-Wert wird dabei mit steriler 10% NaOH-Lösung (w/w) bzw. 10% Phosphorsäure (v/v) auf pH 5.5 bis 5.8 konstant gehalten. Zum Beimpfen des Bioreaktors werden 200 ml einer 24 Stunden zuvor bei 30°C und 100 Upm im Schüttelkolben auf einer Schüttelmaschine kultivierten Vorkultur der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 auf Molkekonzentrat mit 20% Trockengewichtsanteil, pH 5.8, genommen. Diese Vorkultur ist zuvor beimpft worden mit einer Impföse von einem Schrägagarröhrchen von Cryptococcus curvatus ATCC 20509 auf ME-Agar (Zusammensetzung: 200 g/l Malzextrakt, 5 g/l Pepton, 15 g/l Agar in 1000 ml destilliertem Wasser).

Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 im Bioreaktor ist nach ca. 100-140 h beendet, sobald die Lactose vollständig verbraucht ist. Unter dem Mikroskop ist erkennbar, daß die Hefezellen sich nicht mehr teilen und intrazellulär Triglycerid in Form deutlich erkennbarer Fetttröpfchen gebildet haben. Pro Liter sind bei Abbruch der Kultur ungefähr 30-40 g/l Biotrockenmasse entsprechend 120-160 g/l Biofeuchtmasse mit ca. 15-20 g/l Triglycerid gebildet worden. Dessen Zusammensetzung ist so, daß je ein Molekül Glycerin mit ca. zwei Molekülen Ölsäure und einem Molekül Palmitin- oder Stearinsäure verestert ist.

Die so gewonnene Kulturbrühe wird direkt in bekannter Weise mit einer Glasperlenkugelmühle (Bedingungen: Dyno-Mill KDL, Firma Bachofen, ausgestattet mit einem 150 ml Mahlgefäß, das zu 80-85% mit 0.3 mm großen Glasperlen gefüllt ist und während des Aufschlusses auf 20°C gekühlt wird; 3200 Upm; Aufschlußzeit ca. 20 min) oder einem Hochdruckhomogenisator aufgeschlossen und in ein Sedimentationsgefäß überführt. Dort erfolgt eine Trennung in Zelltrümmer, wäßrige Phase und Fettphase.

Zur Herstellung der Fettsäuremethylester werden 155 g der Ölphase mit 1,5 g KOH, die zuvor in 45 ml Methanol gelöst wurden, versetzt und zwei Stunden lang durch Rühren vermischt. Danach ergeben sich zwei Phasen: Glycerin als schwerere Phase sammelt sich am Boden an, die Fettsäuremethylester als leichtere Phase darüber. Die obere Phase wird abgenommen, und vorsichtig mit Wasser gewaschen, um ein Emulgieren zu verhindern. Als Endausbeute werden 128 g Fettsäuremethylester gewonnen, die eine Zusammensetzung von ca. 50% Ölsäure- und je 25 Palmitinsäure- und Stearinsäuremethylester haben.

Beispiel 2

Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Direkt nach Verbrauch der Kohlenstoffquelle Lactose werden 90% der Kulturbrühe abgelassen und durch frisches, steriles Molkepermeat ersetzt. Die im Bioreaktor verbleibenden 10% Kulturbrühe dienen als Inokulum für eine erneute Kultivierung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509. Diese als "repeated batch-Prozeß" bezeichnete Verfahrensweise wird fünfmal wiederholt.

Die Aufarbeitung der Kulturbrühe und die Herstellung der Fettsäuremethylester erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3

Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben. Nach Abbruch der Kultivierung wird die Kulturbrühe bei 4-8°C bis zum Aufschluß und der anschließenden Herstellung der Fettsäuremethylester gelagert.

Beispiel 4

Die Züchtung der Hefe Cryptococcus curvatus ATCC 20509 erfolgt wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben. Nach Abbruch der Kultivierung wird die Kulturbrühe bei -20°C eingefroren und bis zum Aufschluß und der anschließenden Herstellung der Fettsäuremethylester gelagert.

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Fettsäuremethylestern ("Biodiesel") mit Mikroorganismen der Gattungen Cryptococcus, Lipomyces, Rhodotorula, Trichosporon, Cunninghamella, Rhizopus, Aspergillus oder Penicillium auf Basis von Molke als einziger assimilierbarer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle ohne weitere Zusätze gewonnene Triglyceride eingesetzt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus die Hefe Cryptococcus curvatus auf verschiedenen Molkefraktionen züchtet, die Zellen aufschließt, und das so gewonnene Triglycerid im Anschluß zur chemischen Herstellung von Fettsäuremethylestern einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzucht des und zur Triglyceridbildung durch den Mikroorganismus Cryptococcus curvatus Süßmolke, Sauermolke, Konzentrate davon oder in Wasser gelöstes Molkepulver verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen des Mikroorganismus Cryptococcus curvatus durch chemische, enzymatische oder physikalisch-mechanische Methoden, vorzugsweise mit Glasperlenmühlen oder Hochdruck­ homogenisatoren, aufschließt.