DE19836183A1 - Verfahren und Vorrichtung zur räumlich (nm) und zeitlich (ms) aufgelösten Verfolgung der Bewegung mikroskopischer und submikroskopischer Objekte in mikroskopischen Volumina - Google Patents

Description

Stand der Technik mit Fundstellen

In der Kolloidchemie, Partikeltechnologie und Biologie besitzen Lichtstreutechniken eine weite Verbreitung und werden routinemäßig zur Charakterisierung von Größe, Größenverteilung und Oberflächenladung an Suspensionen oder Emulsionen von Pulvern, Pigmenten, Kolloiden, Polymeren, Vesikeln, Mizellen und Molekülen eingesetzt (Berne, B.J., R. Pecora. 1976. Dynamic Light Scattering. Wiley, New York; Ostrowsky, N. 1993. Liposome size measurements by photon correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lipids. 64: 45-56). Neben diesen Anwendungen werden Lichtstreumethoden in der Biologie ebenfalls angewandt, um aktive Bewegungen von Bakterien (Holz, M., S.-H. Chen. 1978. Tracking Bacterial Movements Using a One-Dimensional Fringe System. Optics Letters. 2: 109-111), Spermien (Gottlieb, C., M. Bygdeman, P. Thyberg, B. Hellman, R. Rigler. 1991. Dynamic laser light scattering compared with video micrography for analysis of sperm velocity and sperm head rotation. Andrologia. 23: 1-5) Epithelien, einzelnen Flagellen, Proteinbewegungen oder die Dynamik von Membransystemen (Tishler; R.B., F.D. Carlson. 1993. A study of the dynamic properties of the human red blood cell membrane using Quasi-elastic light-scattering spectroscopy Biophys. J. 65: 2586-2600) zu charakterisieren. Zur Messung inherenter elektrischer Eigenschaften kolloider und biologischer Partikeln und Zellen wurden spezielle Lichtstreumethoden entwickelt, die wechselfeldinduzierte Bewegungen auswerten (Prüger, B., P. Eppmann, E. Donath, J. Gimsa. 1997. Measurement of inherent particle properties by dynamic light scattering - introducing electrorotational light scattering. Biophys. J. 72: 1414-1424; Prüger, B., P. Eppmann, J. Gimsa. 1998. Particle charactehzation by AC-electrokinetic phenomena: 3. New developments in electrorotational light scattering (ERLS). Colloids and Surfaces A. 136: 199-207, Gimsa, F. Eppmann, B. Prüger. 1997. Introducing phase analysis light scattering for dielectric charactenzation. Measurement of traveling wave pumping. Biophys. 73: 3309-3316).

Die herkömmliche Dynamische Lichtstreuung (DLS), oder auch "Quasielastische Lichtstreuung" ist eine Einstrahlmethode mit homodyner oder heterodyner Detektion. Sie erlaubt die Erfassung der Dynamik in Partikelensembles über viele Zeitdekaden bis in den ns-Bereich. Bei dieser Technik wird das Streulicht der makroskopischen Probe, die aus einer großen Anzahl einzelner Streuer besteht, in einer größerer Entfernung zum Probenvolumen und unter einem definierten Winkel zum einfallenden Strahl detektiert. Das Detektorsignal wird durch die Interferenz der Streulichtsignale aller Streuer gebildet, deren thermisch oder aktiv induzierte Bewegungen zur Überlagerung der relativen Phasen des Streufeldes am Detektionsort führt. Dadurch entstehen zeitliche Intensitätsfluktuationen, die i.a. über die Autokorrelationsfunktion der Intensität ausgewertet werden. So lassen sich z. B. über die Stokes-Einstein-Beziehung Partikelradien bestimmen. Für die DLS sind auch Aufbauten mit optischen Lichtleitfasern bekannt (Dhadiwal, H. S. 1993. Integrated Fiber Optic Probe for Dynamic Light Scattenng. Applied Optics. 32: 3901-3904).

Die Laser-Doppler-Anemometrie ist eine heterodyne Zweistrahlmethode, bei der zwei kohärente Laserstrahlen in ihrem Kreuzungsgebiet ein Interferenzmuster bilden, das aus elliptischen, ebenen Flachen hoher bzw. niedrig er Lichtintensität besteht (Berne, B.J., R. Pecora. 1976. Dynamic Light Scattering. Wiley, New York). Partikeln, die sich durch das Interferenzgebiet bewegen, erzeugen ein sinusförmiges Streulichtsignal mit Gauß-förmiger Hüllkurve (Dopplerburst). Da der Abstand der Interferenzebenen bekannt ist, läßt sich die Partikelgeschwindigkeit aus der Frequenz des Sinussignals berechnen. Physikalisch gleichwertig ist die Beschreibung über den Dopplereffekt: Partikeln, die das Kreuzungsgebiet durchqueren, kreuzen beide Strahlen in verschiedenen Winkeln. Deshalb erzeugen sie mit jedem Strahl ein Streulichtsignal gering unterschiedlicher Frequenz. Die Mischung der gleichzeitig erzeugten Dopplerstreulichtsignale erfolgt durch die Partikeln nach dem Heterodynprinzip direkt im Überkreuzungsgebiet. Dadurch ergibt sich die weit geringere Differenzfrequenz, die mit der Frequenz des Dopplerbursts identisch ist. Im Gegensatz zur DLS-Ein­ strahlmethode, bei der die Fluktuationsfrequenz des Streulichtes am Detektorort vom Detektionswinkel abhängt, ist die Zweistrahlmethode im Prinzip unabhängig vom Detektionswinkel. Mit der Zweistrahlmethode sind mehrere Raumrichtungs­ komponenten der Bewegung im Meßvolumen gleichzeitig erfaßbar; zwei Komponenten, wenn die Detektoren hinter Polarisationsfiltern angeordnet sind und jeweils ein horizontal und ein vertikal polarisiertes Strahlenpaar verwendet wird; drei Komponenten, wenn die Detektion hinter Farbfiltern erfolgt und drei farbige Strahlenpaare verwendet werden. Die Bewegungsrichtung der Partikeln im Interferenzgebiet wird bestimmt, indem ein wanderndes Interferenzmuster dadurch erzeugt wird, daß ein Strahl in seiner Frequenz verändert wird. Bewegt sich das Interferenzmuster in oder entgegen der Richtung der Partikelbewegung, so verringert oder erhöht sich die Dopplerfrequenz entsprechend. Diese Methode wird in der Technik z. B. für Strömungsmessungen eingesetzt.

Zweistrahlmethoden sind auch zur Erfassung linearer Bewegungen in mikroskopischen Volumina geeignet. Allerdings müßte für ein ortsfestes Interferenzmuster die Partikelbewegung sehr schnell sein, damit die Partikeln bei der Wanderung durch das gesamte Interferenzgebiet sicher detektierbare Dopplerbursts erzeugen. Im wandernden Interferenzmuster wiederum wäre bei einer hohen Frequenzdifferenz des Strahlenpaares (in technischen Anwendungen im Bereich 40-120 MHz) und sehr langsamer Partikelbewegung, z. B. Brown'scher Bewegung, keine detektierbare Frequenzverschiebung zu erwarten. Deshalb werden in der Technik Wanderungsgeschwindigkeiten des Interferenzmusters im Bereich der Partikelgeschwindigkeiten eingesetzt, die z. B. durch Schwingspiegel erzeugt werden können.

Zur Erfassung kleinster Partikelgeschwindigkeiten wurde, ursprünglich für Elektrophoresemessungen in apolaren Medien, eine wesentlich elegantere Methode, die phasenanalytische Lichtstreuung (Phase Analysis Light Scattering; PALS) entwickelt (Schatzei, K., J. Merz. 1984. Measurement of small electrophoretic mobilities by light scattering and analysis of the amplitude weighted phase structure function. J. Chem. Phys. 81: 2482-2488, Schätzel, K. 1987. Correlation Techniques in Dynamic Light Scattering. Appl. Phys. B. 42: 193-213, Miller, J.F., K. Schätzel, B. Vincent. 1991. The Determination of Very Small Electrophoretic Mobilities in Polar and Nonpolar Colloidal Dispersions Using Phase Analysis Light Scattering. J. Colloid Interface Sci. 143: 532-554). Herzstuck der Methode sind optoakustische Modulatoren, die zwei Laserstrahlen mit einer sehr kleinen im Rahmen der Meßzeit phasenstarren Frequenzdifferenz erzeugen (vgl. auch Fig. 1). Für optoakustische Modulatoren läßt sich z. B. der Debye-Sears-Effekt nutzen, um eine Frequenzverschiebung des Strahls 1. Ordnung, die der elektronischen Ansteuerfrequenz entspricht, zu erzeugen. Da optoakustische Modulatoren üblicherweise mit Frequenzen um 30 bis 150 MHz betrieben werden, müssen zur Erzeugung einer kleineren Differenzfrequenz beide Strahlen durch optoakustische Modulatoren frequenzverschoben werden. Die Frequenzdifferenz der Ansteuersignale entspricht dann der Frequenzdifferenz der austretenden Strahlen 1. Ordnung. Im Meßvolumen werden diese Strahlen gekreuzt und es entsteht ein wanderndes Interferenzmuster. Die Streulichtintensität eines Partikels, das sich ortsfest im Meßvolumen befindet, würde exakt mit der optischen Frequenzdifferenz moduliert werden. Jede Translation entlang einer Achse senkrecht zu den Ebenen des Interferenzmusters führt zu einer Änderung der Phasenbeziehung zwischen dem detektierten Licht und dem elektronischen Referenzsignal Δf, die mit einem Lock-In-Voltmeter äußerst empfindlich ausgewertet werden kann (vgl. auch Fig. 1).

Bei der existierenden PALS-Methode wird das Streulicht durch das Ensemble der Partikeln im makroskopischen Meßvolumen erzeugt und die Lichtintensitäten an den Orten, an denen sich die einzelnen Partikeln befinden, besitzen ein unterschiedliches Phasenverhalten. Deshalb spiegelt das detektierte Streulicht synchrone Translationsbewegung des Ensembles nicht direkt wider. Zur Auswertung des Streulichtsignals wurde die amplitudengewichtete Phasendifferenz eingeführt, die eine statistisch sichere Messung der induzierten Partikelbewegungen erlaubt (Miller, J.F., K. Schätzel, B. Vincent. 1991. The Determination of Very Small Electrophoretic Mobilities in Polar and Nonpolar Colloidal Dispersions Using Phase Analysis Light Scattering. J Colloid Interface Sci. 143: 532-554). Da das wandernde Interferenzmuster auch bei Stillstand (bzw. reiner Diffusion) der Partikeln ein auswertbares Streulichtsignal erzeugt können mit PALS ungleich langsamere Bewegungen als mit den herkömmlichen Zweistrahlmethoden gemessen werden. Gegenüber diesen sinkt die untere Grenze der detektierbaren Partikelgeschwindigkeit um etwa zwei Größenordnungen, so daß z. B. elektrophoretisch Partikelladungen in der Größenordnung einer Elementarladung nachweisbar wurden.

Geräte mit mikroskopischen Meßvolumina wurden sowohl für die DLS (Blank, P.S., R.B. Tishler, F.D. Carlson. 1987. Quasielastic light scattering microscope spectrometer. Appl. Optics. 26: 351-356; Herbert, T.J., J.D. Acton. 1979. Photon correlation spectroscopy of light scattered from microscopic regions. Appl. Optics. 18: 588-590) als auch für die Laser-Doppler-Methode (Holz, Chen. 1978. Tracking Bacterial Movements Using a One-Dimensional Fringe System. Optics Letters. 2: 109-111. Cochrane, T., J. C. Earnshaw. 1978. Practical Laser Doppler microscopes. J. Phys. E; 11: 196) beschrieben. Die Verringerung des Meßvolumens wurde durch den Einbau der Lichtstreumethoden in modifizierte kommerzielle Mikroskope erreicht. Blank et al. beschreiben für ein mikroskopisches DLS-Spektrometer, je nach verwendetem Objektiv, Durchmesser des Meßvolumens zwischen 2,5 und 50 µm. In ihrem Aufbau wurde der einfallende Strahl von oben in das beobachtete Meßvolumen unter einem bestimmten Winkel eingespiegelt und das Streulicht durch das Objektiv detektiert, wobei ein Detektionswinkelfehler von 5,5° oder mehr entstand.

Kudo et al. (Kudo, S., Y. Mgariyama, S.-I. Aizawa. 1990. Abrupt changes in flagellar rotation observed by laser dark-field microscopy. Nature. 346: 677-680) haben eine spezielle Laser-Dunkelfeldmikroskopietechnik entwickelt. Diese ermöglicht die Beobachtung der Rotation eines einzelnen Bakterienflagellums über eine Schlitzblende mit einer zeitlichen Auflösung von weniger als einer ms. Mit Hilfe dieser Schlitzblende, die parallel zum Flagellum orientiert war, konnte die gewundene Form des Flagellums zur Signalerzeugung verwendet werden. Somit besitzt dieser Aufbau trotz seiner guten zeitlichen, letztendlich nur eine eindimensionale räumliche Auflösung.

Eine solch drastische Einschränkung besitzt die "Lokalisierte DLS" im Prinzip nicht, die zur Charakterisierung von Einzelpartikeln unterhalb von 1 µm Größe mit einer zeitlichen Auflösung bis in den ps-Bereich und einer prinzipiellen Ortsauflösung im nm-Bereich entwickelt wurde (Bar-Iv, R., A. Meller, T. Tlusty, E. Moses, J. Stavans, S.A. Safran. 1997. Localized dynamic light scattering: Probing single particle dynamics at the nanoscale. Phys. Rev. Letters. 78: 154-157; Meller, A., R. Bar-Ziv, T. Tlusty, E. Moses, J. Stavans, S.A. Safran. 1998. Localized dynamic light scattering: A new approach to dynamic measurements in optical microscopy Biophys. J. 74: 1541-1548). Nachteilig für allgemeinere Anwendungen ist jedoch der bisherige Aufbau: Das Partikel wird mit einer Laserpinzette lokalisiert. Ein zweiter, andersfarbiger Meßlaserstrahl wird ebenfalls durch das Mikroskopobjektiv eingekoppelt und in das Zentrum der Laserpinzette fokussiert. Der Fokusdurchmesser kann dabei unterhalb der Lichtwellenlänge liegen (Berns, M. W 1998. Mit Laserwerkzeugen ins Zellinnere. Spektrum d. Wissenschaft (6) 56-61). Die Partikelbewegung in der Nähe des Fokus erzeugt eine Intensitätsfluktuation des gestreuten Meßlaserlichtes, die über die Autokorrelationsanalyse ausgewertet werden kann. Auch diese Methode besitzt also keine 3-dimensionale Auflösung.

Für mikroskopische Zweistrahl-Laser-Doppler-Methoden ist die in der Technik übliche Frequenzverschiebung der Strahlen größer als 30 MHz für die Erfassung mikroskopischer Partikelbewegungen ebenso wie Geräte mit einem festen Interferenzmuster unsinnig. Für die Detektion von z. B. der Brown'schen Bewegung von Proteinen würde im ersten Fall keine ausreichende Frequenzdifferenz entstehen. Im zweiten Fall wären sehr lange Detektionszeiten erforderlich. Besser könnten eine Reihe von gerichteten Bewegungen biologischer Objekte, wie z. B. der lichtinduzierten Chloroplastenbewegungen, oder von Proteinbewegungen bei der Zellmigration, detektiert werden. Die Kräfte für diese gerichteten Bewegungen werden über spezielle Motorproteine, wie Kinesin oder Dynein erzeugt und bereits mit Laser-Pinzetten untersucht (Ashkin, A., K. Schütze, J. M. Dziedzic, U. Euteneuer, M. Schliwa. 1990. Force generation of organelle transport measured in vivo by an infrared laser trap. Nature. 348: 346-348; Svoboda, K., C.F. Schmidt, D. Branton, B.J. Schnapp, S.M. Block. 1993. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365: 721-727). Die Atomic Force Microscopy und Scanning-Optical-Near-Field- Microscopy erreichen potentiell molekulare Auflosungen, rufen jedoch eine mechanische Belastung des Meßobjektes hervor oder besitzen eine geringe Zeitauflösung. Die Verwendung von Schwingspiegeln im Strahlengang zur Erzeugung sehr geringer Frequenzunterschiede ist für genaue Messungen der Ortsveränderung unpraktikabel.

Ergänzung zu Fundstellen (Relevante US-Patentanmeldungen) 4,986,659; 5,013,928; 5,404,218; 5,627,642 und 5,751,422.

Problem

Der im Patentanspruch 1 angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, daß bisher kein Verfahren existiert, das die kontinuierliche, dreidimensionale Verfolgung individueller, mikroskopischer oder submikroskopischer Objekte in mikroskopischen Volumina mit einer zeitlichen Auflösung im ms-Bereich und einer räumlichen Auflösung im nm-Bereich ermöglicht. Schnelle bildgebende Verfahren erlauben i. allg. nur eine 2-dimensionale Auflösung und erfordern die mikroskopische Sichtbarkeit der Objekte. Scannende Laser-Verfahren besitzen zwar eine hohe Raum-, jedoch nur eine geringe zeitliche Auflösung. Für die Messung molekularer Bewegungen läßt sich zwar z. B. mit der Atomic-Force-Microscopy eine sehr hohe Auflösung erreichen, die Messung erfordert jedoch einen mechanischen Kontakt zum Objekt. Dies stellt in derartigen Mikrosystemen eine unvertretbar große Belastung des Systems dar und führt zu einer Verfälschung der Meßergebnisse.

Lösung

Das Problem wird durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale mit einer lokalisierten phasenanalytischen Lichtstreumethode gelöst. Die Erfindung erlaubt, mikroskopische oder submikroskopische Objekte in mikroskopischen Volumina kontinuierlich zu verfolgen.

Erreichte Vorteile

Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, daß eine kontinuierliche Verfolgung mikroskopischer oder submikroskopischer Objekte in mikroskopischen Volumina ohne mechanische Belastung mit einer zeitlichen Auflösung mindestens im ms-Bereich und parallel zu einer räumlichen Auflösung bis unterhalb des nm-Bereichs ermöglicht wird. Parallel kann das Meßvolumen mikroskopisch, spektroskopisch oder anderweitig beobachtet werden. Das Verfahren läßt sich zur Untersuchung sehr unterschiedlicher physikalischer, chemischer oder biologischer Phänomene einsetzen und gleichzeitig mit einer großen Anzahl physikalischer, chemischer oder biologischer Methoden kombinieren.

Weitere Ausgestaltung der Erfindung

Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 2 angegeben. Die Verwendung von 3 verschiedenfarbigen Strahlpaaren, die im Meßvolumen so gekreuzt werden, daß die Zentralachsen der Interferenzmuster zueinander orthogonale Komponenten besitzen, ermöglicht die Detektion der Bewegungskomponenten in allen 3 Raumrichtungen. Obwohl keine Absolutmessung des Ortes möglich ist, erlaubt das Verfahren jedoch die Verfolgung des Objektes relativ zum Startort. Dadurch läßt sich z. B. die dreidimensionale Trajektorie eines Objektes berechnen.

Die Einkopplung der Strahlen in das Meßvolumen und die Auskopplung des Streu- oder Fluoreszenzlichts kann auf verschiedene Art und Weise, z. B. über ein Mikroskopobjektiv, über Lichtleitfasern oder einer Kombination aus beidem erfolgen. Das ermöglicht eine genaue Lokalisation des Meßvolumens und einen hohen Signal- Rauschabstand. Gleichzeitig wird durch die Eingrenzung des Meßvolumens die eindeutige Zuordnung des detektierten Signals zu einem bestimmten Objekt möglich.

Ausführungsbeispiele

Ein Ausführungsbeispiel ist in Fig. 1 (- Hauptzeichnung -) dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben. Zur Verbesserung der Übersichtlichkeit der Darstellung ist im Ausführungsbeispiel zunächst nur die Verwendung eines einfarbigen Strahls gezeigt so daß die Objektbewegung nur in einer Dimension verfolgt werden kann. Das Ausführungsbeispiel ist jedoch sehr leicht für die Erfassung der mehrdimensionalen Bewegung erweiterbar.

Alle Lichtwege in Fig. 1 sind gestrichelt dargestellt. Das kohärente Licht eines Lasers (1) wird über den Strahlteiler (2) in zwei Strahlen gleicher Intensität geteilt, die durch optoakustische Wandler (3a, 3b) in ihrer Frequenz um die Frequenz f₁ bzw. f₂ verschoben werden. Als optoakustische Wandler (3a, 3b) können z. B. Bragg-Zellen eingesetzt werden. Die elektrischen Ansteuersignale der optoakustische Wandler (3a, 3b) werden durch die elektronischen Treiber (16a, 16b) erzeugt. Im Mischer (17) wird die Differenzfrequenz Δf gebildet und als Referenzsignal des Lock-In-Verstärkers (15) verwendet. Die aus den optoakustischen Wandlern (3a, 3b) austretenden frequenzverschobenen Strahlen erster Ordnung, die zueinander die Frequenzdifferenz Δf besitzen, werden durch Einkoppeloptiken (4a, 4b) in Lichtleitfasern (5a, 5b) eingekoppelt und zum mikroskopischen Objektträger (8) geleitet. Dort werden die Strahlen durch Auskoppeloptiken (6a, 6b), die z. B. als Gradientenindexstäbe ausgeführt sein können, in das Zentrum des Meßvolumens (7) fokussiert, in dem ein wanderndes Interferenzmuster entsteht. Die Intensität des Streulichts eines ortsfesten mikroskopischen oder submikroskopischen Objekts im wandernden Interferenzmuster des mikroskopischen Meßvolumens (7) schwankt mit der Frequenz Δf und besitzt eine starre Phasenbeziehung zum Referenzsignal des Lock-In-Verstärkers (15). Jede Ortsveränderung senkrecht zum Interferenzmuster führt zu einer Änderung dieser Phasenbeziehung und kann direkt und kontinuierlich in eine Geschwindigkeitskomponente oder eine Ortsänderung relativ zum Startort umgerechnet werden. Die Umwandlung der Streulichtintensität in ein elektronisches Signal mit der Frequenz f_Meß erfolgt durch den Photodetektor (14), der z. B. als Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) oder Lawinenphotodiode, ausgeführt sein kann. Zur Detektion wird das Streulicht über das Mikroskopobjektiv (9) gesammelt und über einen Spiegel (10), die Lochblende (12) zur Eingrenzung des Meßvolumens und den Farb- oder Polarisationsfilter (13) geführt. Der Spiegel (10) kann halbdurchlässig oder als Klappspiegel ausgeführt sein, so daß parallel zur Messung eine direkte visuelle Beobachtung des Meßvolumens oder eine Beobachtung über die Kamera (11) erfolgen kann.

Fig. 2 zeigt zwei verschiedene Ausführungsarten für Lichtleitfaser-Optiken zur Erzeugung des Meßvolumens (1) mit einem wandernden Interferenzmuster. Zur Detektion der Bewegungskomponente in x-Richtung wird das Interferenzmuster durch die beiden Strahlkomponenten x₁ und x₂ gebildet. Im Meßvolumen (1) ist schematisch eine Momentaufnahme des Interferenzmusters dargestellt, das sich in x-Richtung, entlang der Zentralachse (4), bewegt. Fig. 2A stellt 2 Lichtleitfasern oder Gradientenindexstäbe (2, 3) dar, aus denen unfokussierte Strahlen (gestrichelte Begrenzung) austreten. Trotzdem ist das Meßvolumen (1) auf ihr Überschneidungsgebiet begrenzt. Fig. 2B stellt 2 Lichtleitfasern (2a, 3a) mit einer speziellen Optik dar, die z. B. aus speziellen Kollimations- (2b, 3b) und Fokussierlinsen (2c, 3c) besteht. Diese Optik fokussiert die Strahlen in das Meßvolumen (1) und grenzt es dadurch sehr stark ein.

Fig. 3 zeigt zwei verschiedene Ausführungsarten für Mikroskop-Optiken zur Erzeugung des Meßvolumens (1) mit einem ändernden Interferenzmuster (siehe schematische Momentaufnahme des Interferenzmusters im Ausschnittsbild in Fig. 3B). In beiden Ausführungsbeispielen befindet sich das Meßvolumen (1) oberhalb des mikroskopischen Objektträgers (2) und ist von unten durch das Objektiv (3) beobachtbar. Das wandernde Interferenzmuster wird durch die beiden Strahlkomponenten mit den Frequenzen f₁ und f₂ durch Frequenzverschiebung in den optoakustischen Modulatoren (4a, 4b) gebildet. Das Objektiv (3) fokussiert die Strahlen in das Meßvolumen (1) und grenzt es dadurch sehr stark ein. In Fig. 2A erfolgt die Detektion mit dem Photodetektor (5), der z. B. ein Sekundärelektronenvervielfacher (SEV) sein kann, durch eine Lichtleitfaser (7), die mit oder ohne spezielle Optik (6), ausgeführt sein kann. In Fig. 2B erfolgt die Detektion durch das Mikroskopobjektiv (3) mit dem Photodetektor (5).

Fig. 4 zeigt zwei verschiedene Ausführungsarten mit Lichtleitfaser-Optiken (2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b) zur Erzeugung eines Meßvolumens (1) mit mehreren wandernden Interferenzmustern, zur Detektion der mehrdimensionalen Bewegungskomponenten des Objektes. Bei den gezeichneten Lichtleitfaser-Optiken (2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b) kann es sich z. B. um Lichtleitfasern mit oder ohne spezielle Auskoppeloptik oder Gradientenindexstäbe handeln, aus denen unfokussierte oder fokussierte Strahlen austreten. Der Strahlverlauf ist gestrichelt dargestellt. Fig. 4A zeigt 3 Paare von Lichtleitfaser-Optiken (2a-2b, 3a-3b, 4a-4b) zur Erzeugung des Meßvolumens (1) mit drei verschiedenfarbigen, wandernden Interferenzmustern. Die zugehörigen Strahlen x₁-x₂, y₁-y₂ und z₁-z₂ besitzen jeweils paarweise die gleiche Farbe und sind dadurch voneinander unterscheidbar. Jedes Paar erzeugt zur Detektion einer bestimmten Raumrichtung ein wanderndes Interferenzmuster mit Zentralachsen in x-, y- bzw. z-Richtung. Um die Detektion der Objektbewegung in 3 Raumrichtungen zu ermöglichen, müssen die Zentralachsen nicht notwendig ideal orthogonal zueinander sein, sondern es reicht im Prinzip aus, wenn sie orthogonale Komponenten aufweisen. Abweichungen von einer orthogonalen Anordnung lassen sich bei der Auswertung der Trajektorie der Objektbewegung verrechnen. Im orthogonalen Aufbau sind die Lichtleitfaser-Optiken 2a, 2b, 3a, 3b in einer Ebene, die Lichtleitfaser-Optiken 4a und 4b senkrecht dazu angeordnet. Zur Detektion der Bewegungskomponente in x-Richtung wird das Interferenzmuster durch die beiden Strahlkomponenten x₁ und x₂ (Fasern 2a und 2b) für die y-Richtung durch die beiden Strahlkomponenten y₁ und y₂ (Fasern 3a und 3b) und für die z-Richtung durch die beiden Strahlkomponenten z₁ und z₂ (Fasern 4a und 4b), gebildet. Die Detektion des Streulichtes aus dem Meßvolumen kann sowohl über eine Mikroskopoptik (nicht gezeichnet), eine zusätzliche Faseroptik (nicht gezeichnet) oder auch durch eine der gezeichneten optischen Fasern erfolgen. Fig. 4B zeigt einen Aufbau mit einer auf 4 reduzierten Anzahl von Lichtleitfaser-Optiken (2a, 2b, 2c, 2d), die in zwei verschiedenen, zueinander senkrechten Ebenen angeordnet sind (parallel zur Papierebene: 2b und 2c; senkrecht dazu: 2a und 2d). Die Anzahl von 4 Fasern reicht aus, um 3 wandernde Interferenzmuster im Meßvolumen (1) zu erzeugen, wobei deren Zentralachsen zueinander orthogonale Komponenten aufweisen. Auch in dieser Ausführung besitzen die Strahlen x₁-x₂, y₁-y₂ und z₁-z₂ jeweils paarweise die gleiche Farbe und sind dadurch voneinander unterscheidbar. Jedes Paar erzeugt zur Detektion der Objektbewegung in einer bestimmten Raumrichtung ein wanderndes Interferenzmuster. Zur Detektion der Bewegungskomponente in x-Richtung wird das Interferenzmuster durch die beiden Strahlkomponenten x₁ und x₂ (Fasern 2a und 2b) für die y-Richtung durch die beiden Strahlkomponenten y₁ und y₂ (Fasern 2b und 2c) und für die z-Richtung durch die beiden Strahlkomponenten z₁ und z₂ (Fasern 2a und 2d) gebildet. Die Detektion des Streulichtes aus dem Meßvolumen kann sowohl über eine Mikroskopoptik (nicht gezeichnet), eine zusätzliche Faseroptik (nicht gezeichnet) oder auch durch eine der gezeichneten optischen Fasern erfolgen.

Fig. 5 zeigt eine integrierte Lichtleitfaser-Optik zur Erzeugung von zwei zueinander orthogonalen, wandernden Interferenzmustern im Meßvolumens (1). Vorteilhaft an dieser Ausführungsform ist die Kompaktheit, die durch die Verwendung eines gemeinsamen Objektivs (2) für 4 Lichtleitfasern (3a, 3b, 4a, 4b) erreicht wird. Der gezeigte Aufbau ist zur Detektion der zweidimensionalen Bewegungskomponenten des Objektes geeignet, wenn 2 verschiedenfarbige oder verschieden polarisierte Strahlpaare, wobei die Strahlen eines Paares zur Erzeugung eines wandernden Interferenzmusters eine geringe Frequenzdifferenz aufweisen sollen, durch die zugehörigen Faserpaare 3a, 3b und 4a, 4b über das gemeinsame Objektiv (2) in das Meßvolumen (1) fokussiert werden. Für die Detektion einer dritten Raumkomponente ist eine zusätzliche Faser- oder Mikroskop-Optik erforderlich. Wie in den anderen Ausführungsbeispielen kann die Detektion des Streulichtes aus dem Meßvolumen sowohl über eine Mikroskopoptik (nicht gezeichnet), eine zusätzliche Faseroptik (nicht gezeichnet) oder auch durch eine der gezeichneten optischen Fasern erfolgen.

Claims (10)

1. Verfahren und Vorrichtung zur räumlich und zeitlich aufgelösten Verfolgung der Bewegung mikroskopischer und submikroskopischer Objekte in mikroskopischen Volumina, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden kohärenten Strahlen eines oder mehrerer Strahlpaare so gekreuzt werden, daß in einem mikroskopischen Meßvolumen ein oder mehrere wandernde Interferenzmuster dadurch gebildet werden, daß sich die beiden Strahlen jedes Paares in ihrer Frequenz so unterscheiden, daß die Streulichtintensität eines ortsfesten Objektes mit der Differenzfrequenz der Strahlen jedes Paares schwankt und jede Ortsveränderung des Objektes senkrecht zum jeweiligen Interferenzmuster als Phasenänderung des Streulichts relativ zu einer unabhängigen Referenz detektiert werden kann.

2. Verfahren und Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erfassung jeder Bewegungsrichtung des Objektes jeweils ein Strahlpaar benutzt wird, das von anderen Strahlpaaren durch seine Farbe oder Polarisation unterscheidbar ist.

3. Verfahren und Vorrichtung gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Verfolgung der Objektbewegung das Streulicht und/oder Fluoreszenzlicht des Objektes detektiert wird.

4. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Differenzfrequenz der kohärenten Strahlen eines Paars konstant oder veränderlich ist, jedoch um viele Größenordnungen geringer ist als die Lichtfrequenz und der Vergleich der vom Objekt detektierten Schwankung der Streulichtintensität mit einer unabhängig erzeugten Differenzfrequenz-Referenz zur Messung der Ortsveränderung und/oder Geschwindigkeit benutzt wird.

5. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem Phasenverhalten der Streulichtintensität, die durch jeweils ein Strahlpaar, das von den anderen Strahlpaaren durch sein Polarisation oder Farbe unterscheidbar ist, die ein-, oder mehrdimensionale Trajektorie der Bewegung des oder der Objekte errechnet wird.

6. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die räumliche und zeitliche Auflösung der Bewegung des oder der Objekte im mikroskopischen Meßvolumen im nm- bzw. im ms-Bereich oder besser ist.

7. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Einkopplung der Strahlen in das mikroskopische Meßvolumen, das im Überkreuzungsgebiet der Strahlen gebildet wird, durch Lichtleitfasern mit speziellen Auskoppeloptiken und/oder durch Lichtleitfasern ohne solche Optiken und/oder durch die Mikroskopoptik z. B. über Kollimatoren, Spiegel, Blenden und das Objektiv, erfolgt.

8. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion des Streulichtsignals des oder der Objekte, die sich im mikroskopischen Meßvolumen befinden, mit einem oder mehreren Photodetektoren über die Mikroskopoptik z. B. über ein Objektiv, Spiegel, Blenden und Farb- und/oder Polarisationsfilter, erfolgt und/oder über Lichtleitfasern mit speziellen Einkoppeloptiken oder durch Lichtleitfasern ohne solche Einkoppeloptiken, wobei das Licht über Farb- und/oder Polarisationsfilter geleitet wird.

9. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mehrfachnutzung von Lichtleitfasern und/oder Objektiven dadurch erfolgt daß Strahlen unterschiedlicher Farbe, Frequenz und/oder Polarisation gleichzeitig durch dieselbe Faser oder dasselbe Objektiv in das Meßvolumen eingekoppelt werden oder Streulicht aus dem Meßvolumen zum Photodetektor geleitet wird.

10. Verfahren und Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren mit der mikroskopischen Beobachtung des Meßvolumens kombiniert wird, die visuell oder durch ein Kamerasystem erfolgen kann.