DE19820168C2 - Verfahren zur kontinuierlichen mikrobiologischen Herstellung von Polyhydroxybuttersäure - Google Patents
Verfahren zur kontinuierlichen mikrobiologischen Herstellung von PolyhydroxybuttersäureInfo
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Description
Die Erfindung betrifft die mikrobielle Synthese von
Polyhydroxyalkansäuren [PHA(B)] aus Substraten, die
potentiell ökotoxisch sind, deshalb entgiftet werden
müssen, und die, wenn sie als Kohlenstoff- und
Energiequelle von Mikroorganismen für Wachstum und
Vermehrung genutzt werden können, das Phänomen der
Substratüberschußhemmung zeigen.
Über 150 Bakterienarten aus mehr als 50 Gattungen sind
als Polyhydroxybuttersäure-(PHB-)Bildner bekannt
[Steinbüchel, A. (1996) Biotechnology (ed. H.-J. Rehm
et al.) Vol. 6, Products of Primary Metabolism (ed. M.
Roehr), VCH Weinheim, 403-464]. Die Bildung von PHB ist
nicht an ein bestimmtes Substrat oder an einen
bestimmten Ernährungstyp gekoppelt [Babel, W. (1992)
FEMS Microbiology Rev. 103. 141-148]. Sie kann aus CO2
chemolithoautotroph ebenso erfolgen wie aus reduzierten
organischen Kohlenstoffverbindungen. Kohlenwasser
stoffe, darunter Methan, Alkohole, darunter Methanol,
und Säuren, darunter Essigsäure und Milchsäure kommen
ebenso in Frage wie Zucker. Über 50 verschiedene
Substanzen sind geprüft worden.
Verfahren zur bakteriellen Synthese von PHB sind
bekannt [Lee, S. Y. (1996) Biotechnol. Bioeng. 49, 1-
14]. Die am häufigsten eingesetzten Substrate sind
Kohlenhydrate als sog. nachwachsende Rohstoffe. Seit
geraumer Zeit wird auch versucht, Methanol und Methan,
da sie verfügbar und relativ kostengünstig sind, für
die Synthese von Polyhydroxyalkansäuren kommerzfähig
akzeptabel zu machen. Trotzdem ist der Preis des
Produktes noch immer hoch, so daß PHB in der Konkurrenz
mit den großtonnagig produzierten Kunststoffen
Polypropylen und Polyethylen, die ähnliche
Eigenschaften haben, jedoch nicht (mikro-)biologisch
abbaubar sind und deshalb als Müll ein
Entsorgungsproblem darstellen, nicht bestehen kann. Da
der Preis des Produktes maßgeblich vom Preis des
Rohstoffes bestimmt wird [Babel, W. (1997) BIOWORLD
4/97, 16-20], bleibt, kostengünstigere
Kohlenstoffquellen für die PHB-Synthese zu erschließen.
Bei den meisten der in der Literatur beschriebenen
Prozesse zur PHB-Produktion wird PHB(A) im Ergebnis von
Imbalanzen im Nährstoffangebot akkumuliert, bei batch-
Kultivierungen in der stationären Phase. Durch
entstehenden und fortschreitenden Mangel z. B. an
Stickstoff, Sauerstoff oder Phosphor (in Form von
Phosphat) wird die Vermehrungsgeschwindigkeit reduziert
und PHB-Bildung initiiert.
Für die PHB-Bildung typisch ist, daß sie
wachstumsentkoppelt stattfindet, so daß Prozesse zu
ihrer Synthese nicht so ohne weiteres kontinuierlich
gestaltet werden können. EP 0149 744 A1 beschreibt ein
kontinuierliches Verfahren. Es setzt eindeutig auf die
besondere Eigenschaft von Alcaligenes latus, das in der
Lage ist, bei vollständiger und für das Wachstum
optimaler Nährstoffversorgung unter unlimitierten
Wachstumsbedingungen aus Zuckern PHB zu synthetisieren.
Dieses Verfahren ermöglicht entweder durch ein
ständiges, periodisches Zufüttern von Substrat (fed-
batch-Regime) oder durch kontinuierliche Arbeitsweise,
bei der der Kultur im konstanten Strom frische
Nährlösung zugeführt wird, und andererseits dem
Fermentor eine dem Zufluß aliquote Menge an
biomassehaltigem Kulturmedium entnommen wird, sehr gute
PHB-Anreicherungen.
Auch Methylobacterium rhodesianum muß in besonderer
Weise metabolisch/regulatorisch disponiert sein, die
genutzt werden kann, um PHB kontinuierlich zu
produzieren [Ackermann, J.-U., Babel, W. (1997) Appl.
Microbiol. Biotechnol. 47, 144-149].
Wie im Falle von A. latus ist auch bei M. rhodesianum
Zucker (neben anderen Substraten) Rohstoff für die PHB-
Synthese.
Weiterhin ist in Canadian Journal of Microbiology (1995)
41: 267-273 die Testung zweier in ihren Eigenschaften gut
bekannter Stämme (den zur PHB-Bildung befähigten Wildtyp H16
und die Defektmutante PHB-4), mit einem neuen
Fermenterkalorimeter dargestellt, wobei die Wärmeproduktion
bei der Kultivierung vermessen wird. Das Ziel bestand darin,
physiologische Zustände zu erzeugen, die von einer minimalen
Wärmeproduktion begleitet sind. Es wurde festgestellt, daß
sich die Defektmutante PHB-4 vom Wildtyp in bezug auf die
Reaktionsenthalpie positiv unterscheidet.
In Microbiology (1998) 144: 241-248 ist die Synthese von PHB
mittels Alcaligenes eutrophus (ATCC 17697) über den meta-Weg
der Phenoldegradation beschrieben. Aus dieser Studie geht
hervor, daß Synthese und Akkumulation einsetzen, wenn bei
chemostatischem Wachstum eine bestimmte Verdünnungsrate
überschritten wird. Es wird eine metabolische Beeinflussung
von Alcaligenes eutrophus dargestellt, die eine biotechnische
Nutzung eher negativ beeinträchtigt.
Es wurde nun gefunden, daß PHB alternativ auch aus
potentiell ökotoxischen Substraten hergestellt werden
kann und ein Prozeßregime entwickelt, das die Synthese
von PHB aus Abprodukten der chemischen Industrie und
der Landwirtschaft ermöglicht. Das erfindungsgemäße
Verfahren nutzt damit kostengünstige Kohlenstoffquellen
wie z. B. Phenol oder Benzoate und ermöglicht eine
Problemstoffentsorgung bei gleichzeitiger Wertstoff
synthese.
Die Erfindung wird mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1
realisiert. Die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Erfindungsgemäß werden potentiell ökotoxische Substrate
eingesetzt, die das Phänomen der Substratüberschuß
hemmung zeigen und damit im herkömmlichen Sinne für die
Synthese von Produkten des overflow metabolism, also
auch von PHB, nicht geeignet sind. Sie sind weder im
batch-Betrieb, noch für das einstufige kohlenstoff
substratlimitierte chemostatische Verfahren geeignet,
da die eigentlich Wachstum und Vermehrung verhindernden
und PHB-Synthese favorisierenden Bedingungen nicht
realisiert sind.
Solche Substrate sind Aromaten, darunter Phenole,
Benzoesäure und Benzaldehyd. Letztere sind in bezug auf
ihre bakteriozide (bakteriostatische) Wirkung bekannt
und häufig nennenswerte Komponenten in
Industrieabwässern.
Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem
PHB aus Substraten hergestellt werden kann, die
Wachstumsinhibition bei Substratüberschuß zeigen, indem
entsprechende Mikroorganismen, die diese Substrate
verwerten, chemostatisch so vermehrt werden, daß die
Wärmeproduktion bezogen auf die Substratdurchsatz
geschwindigkeit ein Maximum ergibt. Es wird das
Wachstum der Zellen kalorimetrisch verfolgt und das
Maximum an Wärmeproduktion, das einem max. PHB-Gehalt
in der Biomasse entspricht, über die Substratdurchsatz
geschwindigkeit reguliert. Die PHB-Bildung wird
initiiert und gesteuert, indem die Substratdurchsatz
geschwindigkeit bei kleinem Volumenaustausch erhöht
wird.
Die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismenstämme
sind bekannte PHB-Bildner und gehören den Gattungen
Comamonas, vorzugsweise Comamonas acidovorans und
Comamonas testosteroni, Ralstonia, vorzugsweise
Ralstonia eutropha, oder Variovorax, vorzugsweise
Variovorax paradoxus, an. Als Substrate sind im
erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere wasserlösliche
Aromaten, vorzugsweise Phenole, Benzoesäure und
Benzaldehyd geeignet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung wird Variovorax paradoxus JMP 116 bei
Benzoatdurchsatzgeschwindigkeiten zwischen 0,3 bis 1,0 g/l.h
mit Geschwindigkeiten zwischen 0,07 bis 0,4 h-1
vermehrt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
wird Ralstonia eutropha JMP 134 bei
Phenoldurchsatzgeschwindigkeiten zwischen 0,3 bis 0,6 g/l.h
mit Geschwindigkeiten zwischen 0,05 bis 0,2 h-1
vermehrt. Es ist ebenfalls bevorzugt, Ralstonia
eutropha JMP 134 bei Benzoatdurchsatzgeschwindigkeiten
zwischen 0,25 bis 0,7 g/l.h mit Geschwindigkeiten
zwischen 0,04 bis 0,21 h-1 zu vermehren. Die
verwendeten Stämme sind in Kultursammlungen allgemein
zugänglich.
Zur kalorimetrischen Bestimmung der Wärmeproduktion
wird erfindungsgemäß dem Fermentor eine konstante
Wärmemenge über einen wendelförmigen Wärmeaustauscher
entzogen. Dazu wird der Massefluß an Kühlmittel durch
den Wärmeaustauscher und die Temperaturdifferenz
zwischen Ein- und Ausgang konstant gehalten. Ein
elektrischer Heizer wird dabei so gesteuert, daß die
Reaktortemperatur konstant bleibt. Die Differenz
zwischen der aktuellen elektrischen Heizleistung und
der vor dem Animpfen entspricht der Wärmeproduktion der
Mikroorganismen.
Nachfolgend wird die Erfindung an Ausführungsbeispielen
näher erläutert, ohne sie darauf einzuschränken.
Es wird der Stamm Ralstonia eutropha JMP 134 verwendet.
Die Kultivierung erfolgt in einem 2,2 l fassenden,
thermisch isolierten Fermentor bei pH 7,0 und 30°C.
Alle in diesem und den weiteren Beispielen verwendeten
Medien enthalten 1,14 g/l NH4Cl, 1,7 g/l KH2Po4,
2,18 g/l K2HPO4 und Spurensalze (in mg/l) MgSO4 . 7H2O
(712), CaCl2 . 2H2O (37), FeSO4 . 7H2O (50), CuSO4 . 5H2O
(7,8), MnSO4 . 1H2O (6,1), ZnSO4 . 7H2O (4,4), NaMoO4 . 2H2O
(2,5). Der Fermentor wird mit 1,7 l Nährmedium mit 100 mg/l
Phenol befüllt. Ein Kühlmedium entzieht ihm
kontinuierlich eine konstante Leistung und die
Reaktortemperatur wird mit Hilfe eines elektrischen
Heizers aufrecht erhalten. Seine Begasung erfolgt mit
100 Nl/h humider Luft und die Homogenisierung durch
Rühren mit 900 U/min. Zulaufendes Medium, 1 N NaOH zur
Erhaltung des pH-Wertes und die Luft werden mittels
eines Wärmeaustauschers auf die Reaktortemperatur
gebracht. 100 ml einer Vorkultur, deren Biomasse durch
fed-batch-Kultivierung auf ca. 500 mg/l gebracht wurde,
dienen zum Animpfen des Fermentors. Die Heizleistung,
die notwendig ist, um die Reaktortemperatur konstant zu
halten, verringert sich um die Wärmeproduktion der
Mikroorganismen, sobald diese anfangen, das Phenol zu
verwerten. Sobald die Wärmeproduktion wieder auf 0 W/l
abfällt und damit den Verbrauch des Phenols indiziert,
wird ein erneutes Wachstum durch eine 200 ml Portion
des Mediums mit 1 g/l Phenol initiiert. Durch
Wiederholungen des Vorganges wird die Biomasse auf ca.
0,7 g/l vermehrt, ein Reaktorfüllstand von 2 l
eingestellt, und anschließend kontinuierlich 200 ml/h
Medium mit 1 g/l Phenol zugegeben. Dabei fließt das
Kulturmedium im gleichen Maße ab und so wird eine
Substratverbrauchsgeschwindigkeit von 0,1 g/(l.h)
realisiert. Nach 30 Stunden zeigt die konstante
Wärmeproduktion das Erreichen eines stationären
Zustandes an. Das Kulturmedium weist dann eine
Restphenolkonzentration < 0,1 mg/l und eine
Biomassekonzentration von 0,7 g/l ohne nachweisbare
PHB-Anteil auf. Danach wird der Fermentor aus einem gut
gerührten Mischbehälter (200 Umin), der ein Medium mit
1 g/l Phenol enthält, mit 200 ml/h gespeist. Zu dem
Mischbehälter fließt mit 100 ml/h ein Medium mit 10 g/l
Phenol. Die Wärmeproduktion steigt linear an, bis ein
Knickpunkt den Beginn der PHB-Produktion anzeigt.
Danach wächst der PHB-Gehalt an, bis die
Wärmeproduktion ein Maximum von 2,7 W/l erreicht. Das
geschieht bei einem Substratdurchsatz von ca.
0,69 g/(l.h). Zur Stabilisierung wird der Zulauf zum
Fermentor gestoppt und anschließend der
Substratdurchsatz auf den Wert reduziert, bei dem 96%
der Wärmeproduktion erreicht wurden. Das Kulturmedium
enthält unter diesen Bedingungen Restphenol < 0,1 mg/l
und eine Biomassekonzentration von 2,9 g/l mit einem
PHB-Gehalt von 17% der Bakterientrockenmasse.
Der Stamm Ralstonia eutropha JMP 134 wird, analog zu
Beispiel 1 chemostatisch kultiviert. Die Medien
enthalten jedoch 0,88 g/l Natriumbenzoat im
Mischbehälter und 12 g/l Natriumbenzoat in der
Vorratsflasche und der Zufluß zum Fermentor beträgt
100 ml/h. Der pH-Wert wird durch Titration von 0,5 N
Salzsäure konstant gehalten. Die Messung der
Wärmeproduktion, die Vortemperierung der Medien, der
Säure und der humiden Luft erfolgt wie in Beispiel 1
beschrieben. Das Maximum der Wärmeproduktion von ca.
0,94 W/l wird bei einem Substratdurchsatz von ca. 0,353 g/(l.h)
erreicht. Das Kulturmedium enthält in diesem
Fall eine Restkonzentration an Natriumbenzoat von 25 mg/l
und 4,2 g/l Biomasse mit einem PHB-Gehalt von 25%.
Der Stamm Variovorax paradoxus DSM 4065 wird
kontinuierlich, wie in Beispiel 1 angegeben, vermehrt.
Die Medien enthalten jedoch 1,2 g/l Natriumbenzoat im
Mischbehälter und 9,5 g/l Natriumbenzoat in der
Vorratsflasche bei ansonsten gleicher Zusammensetzung
des Mediums wie in Beispiel 1. Auch die Bestimmung des
Wärmeflusses, die Temperierung der Medien, der humiden
Luft und des Titrationsmittels enspricht Beispiel 1.
Der Zufluß zum Fermentor beträgt 240 ml/h und der pH-
Wert wird durch Zugabe von 0,5 N HCl konstant gehalten.
Das Maximum der Wärmeproduktion von ca. 3,9 W/l wird
bei einem Substratdurchsatz von 1,14 g(l.h) erreicht.
Dabei enthält das Kulturmedium eine Restkonzentration
an Natriumbenzoat von 45 mg/l und 3,6 g/l Biomasse mit
einem PHB-Gehalt von 21%.
Claims (7)
1. Verfahren zur kontinuierlichen mikrobiologischen
Herstellung von Polyhydroxybuttersäure (PHB),
dadurch gekennzeichnet, daß
als PHB-Bildner bekannte Mikroorganismenstämme auf
Substraten, die Wachstumsinhibition bei
Substratüberschuß zeigen, chemostatisch bei
maximaler Wärmeproduktion vermehrt werden, wobei
das Maximum der Wärmeproduktion, das einem
maximalen PHB-Gehalt in der Biomasse entspricht,
mit Hilfe der Substratdurchsatzgeschwindigkeit
eingestellt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß
als Substrate Aromaten Verwendung finden,
vorzugsweise Phenole, Benzoesäure und Benzaldehyd.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, daß
Mikroorganismenstämme der Gattungen Comamonas,
Ralstonia oder Variovorax eingesetzt werden,
vorzugsweise die Spezies Comamonas acidovorans,
Comamonas testosteroni, Ralstonia eutropha oder
Variovorax paradoxus.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß
die kontinuierliche Herstellung im
Temperaturbereich zwischen 25 und 40°C und bei pH-
Werten zwischen 6 und 8 unter Belüftung und
Homogenisierung durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
Variovorax paradoxus JMP 116 bei Benzoatdurchsatz
geschwindigkeiten zwischen 0,3 bis 1,0 g/l.h mit
Geschwindigkeiten zwischen 0,07 bis 0,4 h-1
vermehrt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
Ralstonia eutropha JMP 134 bei Phenoldurchsatz
geschwindigkeiten zwischen 0,3 bis 0,6 g/l.h mit
Geschwindigkeiten zwischen 0,05 bis 0,2 h-1 vermehrt
wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß
Ralstonia eutropha JMP 134 bei Benzoatdurchsatz
geschwindigkeiten zwischen 0,25 bis 0,7 g/l.h mit
Geschwindigkeiten zwischen 0,04 bis 0,21 h-1
vermehrt wird.
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