DE19815812A1

DE19815812A1 - Modifizierte Cytostatika

Info

Publication number: DE19815812A1
Application number: DE1998115812
Authority: DE
Inventors: Hans-Georg Lerchen; Joerg Baumgarten; Michael Sperzel
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1998-04-08
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 1999-10-14

Abstract

Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I) DOLLAR F1 in welcher R und R·1· Seitenketten von Aminosäureresten, CPT einen Camptothecinrest oder dessen Derivat und A eine Gruppe, die den proteolytischen Abbau von Peptidkonjugaten hemmt, darstellt. Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen und deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate aus Cytostatika und Nα-modifizierten Aminosäuren bzw. Peptiden, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel, insbesondere im Zusammenhang mit Krebserkrankungen.

Die Chemotherapie bei Tumorerkrankungen ist begleitet von meist schwerwiegenden Nebenwirkungen, bedingt durch die Toxizität von Chemotherapeutika auf proliferie rende Zellen anderer Gewebe. Seit vielen Jahren beschäftigen sich Wissenschaftler mit dem Problem der Verbesserung der Selektivität von eingesetzten Wirkstoffen. Ein vielfach verfolgter Ansatz ist die Synthese von Prodrugs, die mehr oder weniger selektiv im Zielgewebe beispielsweise durch Veränderung des pH-Wertes (z. B. Tietze et al., DE 42 29 903) durch Enzyme (z. B. Glucuronidasen; Jacquesy et al., EP 511 917; Bosslet et al., EP 595 133) oder durch Antikörper-Enzym-Konjugate (Bagshaawe et al., WO 88/07378; Senter et al., US PS 4 975 278; Bosslet et al., EP 595 133) freigesetzt werden. Problematisch bei diesen Ansätzen ist u. a. die mangelnde Stabilität der Konjugate in anderen Geweben und Organen und insbesondere die ubiquitäre Wirkstoffverteilung, die sich an die extrazelluläre Wirkstofffreisetzung im Tumorgewebe anschließt.

20(S)-Camptothecin (3) ist ein pentacyclisches Alkaloid, das 1966 von Wall et al. isoliert wurde (J. Amer. Chem. Soc. 88 (1966) 3888). Es besitzt ein hohes Antitumor- Wirkpotential in zahlreichen In-vitro- und In-vivo-Tests. Die Realisierung des vielver sprechenden Potentials in der Klinik scheiterte jedoch an Toxizitäts- und Löslich keitsproblemen.

Durch Öffnung des E-Ring-Lactons und Bildung des Natriumsalzes wurde eine wasserlösliche Verbindung erhalten, die in einem pH-abhängigen Gleichgewicht mit der ringgeschlossenen Form steht. Klinische Studien führten auch hier bisher nicht zum Erfolg.

Etwa 20 Jahre später wurde gefunden, daß die biologische Aktivität auf eine Enzym inhibition der Topoisomerase I zurückzuführen ist. Seither wurden die Forschungs Aktivitäten wieder verstärkt, um verträglichere und in vivo wirksame Camptothecin- Derivate zu finden.

Zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit wurden z. B. Salze von A-Ring- und B-Ring- modifizierten Camptothecin-Derivaten sowie von 20-O-Acyl-Derivaten mit ionisier baren Gruppen beschrieben (Vishnuvajjala et al., US 4 943 579). Das letztere Prodrug-Konzept wurde später auch auf modifizierte Camptothecin-Derivate übertragen (Wani et al. WO 96/02546). Die beschriebenen 20-O-Acyl-Prodrugs haben allerdings in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit und werden sehr schnell zum Grundkörper gespalten.

Es wurde nun gefunden, daß die Modifizierung von Cytostatika wie z. B. Campto thecin bzw. Camptothecin-Derivaten mit N^α-modifizierten Aminosäuren und Peptiden zu neuen Verbindungen mit überraschenden, interessanten Eigenschaften führt:

- Die so erhaltenen Konjugate sind synthetisch gut zugänglich und zeigen in vitro eine hohe Aktivität gegenüber verschiedenen Tumorzellinien und Tumor xenografts.
- In Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Nα-modifizierten Amino säuren zeigen die erfindungsgemäßen Konjugate im Vergleich zu den zu grundeliegenden Cytostatika wesentlich verbesserte Löslichkeitseigenschaften.
- Bedingt durch die α-Modifizierung sind sie in extrazellulärem Medium und in Blut wesentlich stabiler als die zuvor beschriebenen reinen Aminosäure- Prodrugs von Camptothecin-Derivaten.
- Im Fall von 20-O-Acylierungen von Camptothecin-Derivaten wird durch die esterartige Verknüpfung der Carrier-Reste mit der 20-Hydroxygruppe der für die Wirkung wichtige Lactonring stabilisiert.

Die Erfindung betrifft Verbindungen der allgemeinen Formel (I)

mit R, R' Seitenketten von Aminosäureresten.

Bevorzugt sind R, R' Seitenketten von Aminosäureresten, wie z. B. Alanin, Aspara ginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Leucin, Histidin, Lysin, Arginin, Ornithin, Serin, Tyrosin, Valin, Diaminopropionsäure, α-, γ-Diaminobuttersäure oder Phenylalamin, wobei mehrere Aminosäurereste über die α-Aminogruppe peptidisch verknüpft sein können.

Falls R und R' weitere funktionelle Gruppen tragen, so sind diese bevorzugt deblockiert, wobei dann R und R' gleich oder unterschiedlich im Sinne der Definition sein kann.

In der allgemeinen Formel (I) nimmt n Werte von 0 bis 10, bevorzugt 0 bis 2, an.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin CPT für einen Campto thecin-Rest oder ein im A-Ring, B-Ring oder C-Ring modifiziertes Camptothecin- Derivat seht und CPT über eine Hydroxyfunktion esterartig verknüpft ist.

Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen der Formel (I), worin A eine Gruppe ist, die den proteolytischen Abbau von Peptidkonjugaten hemmen kann.

A kann beispielsweise ein verzweigter oder unverzweigter (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁- C₆)-Alkylcarbonylrest sein, der weiterhin durch Halogen, Hydroxy, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, Amino, Carbonyl, Carboxy oder einen (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylrest substituiert sein kann.

Weiterhin kann A ein (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylcarbonylrest sein, der durch Halogen, Hydroxy, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)- Alkoxy, Amino, Carabonyl, Carboxy oder einen verzweigten oder unverzweigten (C₁- C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkylrest substituiert sein kann.

Weiterhin kann A ein (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylaminocarbonylrest oder ein verzweigter oder unverzweigter (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkylaminocarabonyl rest sein, der durch Halogen, Hydroxy, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, Carbonyl, Carboxy oder einen verzweigten oder unver zweigten (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkyl- bzw. (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Aryl rest substituiert sein kann.

Weiterhin kann A ein (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Aryl- oder ein verzweigter oder unverzweigter (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkylsulfonylrest sein, der durch Halo gen, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, oder einen verzweigten oder unverzweigten (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkyl- bzw. (C₆- C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylrest substituiert sein kann.

Die Aminosäurereste können jeweils in der D-Form oder in der L-Form vorliegen.

Die Nomenklatur der Aminosäuren folgt den von der IUPAC aufgestellten Regeln. Bei fehlender Angabe der Stereochemie wurden Aminosäuren der L-Form eingesetzt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in stereoisomeren Formen, beispiels weise als Enantiomere oder Diastereomere, oder als deren Gemische, beispielsweise als Racemat, vorliegen. Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Stereoisomere als auch deren Gemische.

Diastereomerengemische können gegebenenfalls, falls erforderlich, mittels bekannter Methoden in die einheitlichen Bestandteile getrennt werden, beispielsweise durch Chromatographie (z. B. HPLC) oder durch Kristallisationsverfahren. Möglich ist dies nicht nur auf der Endstufe der Konjugate, sondern gegebenenfalls auch auf Zwischen stufen. Aus den diastereomerenreinen Zwischenstufen können gegebenenfalls durch geeignete Syntheseführung die diastereomerenreinen Endstufen hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in Form ihrer Salze vorliegen. Im allgemeinen seien hier Salze mit organischen oder anorganischen Basen oder Säuren sowie innere Salze genannt.

Zu den Säuren, die addiert werden können, gehören vorzugsweise Halogenwasser stoffsäuren, wie z. B. die Chlorwasserstoffsäure und die Bromwasserstoffsäure, insbesondere die Chlorwasserstoffsäure, ferner Phosphorsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, mono- und bifunktionelle Carbonsäuren und Hydroxycarbonsäuren, wie z. B. Essigsäure, Trifluoressigsäuree, Maleinsäure, Malonsäure, Oxalsäure, Gluconsäure, Bernsteinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Salizylsäure, Sorbinsäure und Milchsäure sowie Sulfonsäuren, wie z. B. p-Toluolsulfonsäure, 1,5- Naphthalindisulfonsäure oder Camphersulfonsäure.

Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze solcher erfindungsgemäßen Verbindungen sein, die eine freie Carboxylgruppe be sitzen. Besonders bevorzugt sind z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calcium salze, sowie Ammoniumsalze, die abgeleitet sind von Ammoniak oder organischen Aminen wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethylamin, Di- bzw. Triethanol amin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder Phenethylamin.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I), dadurch gekennzeichnet, daß man Peptidkonjugate; von Camptothecin oder von Camptothecin-Derivaten in bekannter Weise herstellt, selektiv an der α-Amingruppe der terminalen Aminosäure zu (II) deblockiert und anschließend mit Verbindungen der allgemeinen Formel (III)

in geeigneten Lösemitteln gegebenenfalls in Gegenwart einer Base umsetzt,
worin A die oben angegebene Bedeutung hat und X entweder eine Abgangsgruppe wie OH, Halogen, OB (inneres oder symmetrisches Anhydrid wie Bernsteinsäure anhydrid, Acetanhydrid, bzw. Ester) sein kann.

Weiterhin kann die Gruppe AX zusammen ein Elektrophil wie z. B. ein Isocyanat sein.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) sind zugänglich, indem man nach üblichen Methoden der Peptidchemie gegebenenfalls geschützte Aminosäurebausteine an die Hydroxyfunktionen von CPT anknüpft und gegebenenfalls durch schrittweise Einführung weiterer Aminosäurebausteine eine Peptidkette aufbaut. Alternativ können auch gegebenenfalls Schutzgruppen tragende Peptid-Bausteine nach üblichen Metho den mit CPT verknüpft werden.

Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck- und Temperaturverhältnissen, beispielsweise 0,5 bis 2 bar, bzw. -30 bis +100°C, in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloroform, niederen Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel durchgeführt werden. In der Regel sind Reaktionen in DMF oder THF/Dichlormethan bei Normaldruck und bei einer Temperatur von 0 bis 60°C, insbesondere bei etwa Raumtemperatur, bevorzugt.

Für die Aktivierung der Carboxylgruppen kommen die in der Peptidchemie bekannten Kupplungsreagenzien wie sie z. B. in Jakubke/Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine; Verlag Chemie 1982 oder Tetrahedr. Ltt. 34, 6705 (1993) beschrieben sind, in Frage. Bevorzugt sind beispielsweise Säurechloride, N-Carbonsäureanhydride oder gemischte Anhydride.

Weiterhin bevorzugt zur Aktivierung der Carboxylgruppen ist die Bildung von Addukten mit Carbodiimiden z. B. N,N'-Diethyl-, N,N'-Diisopropyl-, N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid, N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid-Hydro chlorid, N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat, oder Carbonylverbindungen wie Carbonyldiimidazol, oder 1,2-Oxazoliumverbin dungen wie 2-Ethyl-5-phenyl-1,2-oxazolium-3-sulfat oder 2-tert.-Butyl-5-methyl isoxazoliumperchlorat, oder Acylaminoverbindungen wie 2-Ethoxy-1-ethoxycarbonyl- 1,2-dihydrochinolin, oder Propanphosphonsäureanhydrid, oder Isobutylchloroform, oder Benzotriazolyloxy-tris(dimethylamino)phosphonium-hexafluorophosphat, 1- Hydroxybenzotriazol oder Hydroxysuccinimidester.

Als Basen können beispielsweise Triethylamin, Hünig-Base, Ethyldiisopropylamin, Pyridin, N,N-Dimethylaminopyridin oder andere eingesetzt werden.

Als Schutzgruppen für eventuelle weitere reaktive Funktionen im Camptothecin-Teil oder für Drittfunktionen der Aminosäuren können die in der Peptidchemie bekannten Schutzgruppen beispielsweise vom Urethan-, Alkyl-, Acyl-, Ester- oder Amid-Typ eingesetzt werden.

Aminoschutzgruppen im Rahmen der Erfindung sind die üblichen in der Peptid- Chemie verwendeten Aminoschutzgruppen.

Hierzu gehören bevorzugt: Benzyloxycarbonyl (Cbz), 3,4-Dimethoxybenzyloxy carbonyl, 3,5-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 2,4-Dimethoxybenzyloxycarbonyl, 4- Methoxybenzyloxycarbonyl, 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyloxycarbonyl, 2- Nitro-4,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, tert.- Butoxycarbonyl (Boc), Allyloxycarbonyl, Vinyloxycarbonyl, 3,4,5-Trimethoxy benzyloxycarbonyl, Phthaloyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2,2,2-Trichlor-tert.- butoxycarbonyl, Menthyloxycarbonyl, 4-Nitrophenoxycarbonyl, Fluorenyl-9-meth oxycarbonyl (Fmoc), Formyl, Acetyl, Propionyl, Pivaloyl, 2-Choracetyl, 2-Brom acetyl, 2,2,2-Trifluoracetyl, Benzoyl, Benzyl, 4-Chlorbenzoyl, 4-Brombenzoyl, 4- Nitrobenzoyl, Phthalimido, Isovaleroyl oder Benzyloxymethylen, 4-Nitrobenzyl, 2,4- Dinitrobenzyl, 4-Nitrophenyl oder 2-Nitrophenylsulfenyl. Besonders bevorzugte Schutzgruppen sind Fmoc, Boc und Cbz.

Die Abspaltung von Schutzgruppen in den entsprechenden Reaktionsschritten kann z. B. durch Säure- oder Baseneinwirkung, hydrogenolytisch oder auf andere Weise reduktiv erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Krebs erkrankungen.

Zur vorliegenden Erfindung gehören pharmazeutische Zubereitungen, die neben nicht toxischen, inerten pharmazeutisch geeigneten Trägerstoffen eine oder mehrere erfin dungsgemäße Verbindungen enthalten oder die aus einem oder mehreren erfindungs gemäßen Wirkstoffen bestehen, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zuberei tungen.

Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls in einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Die therapeutisch wirksamen Verbindungen sollen in den oben aufgeführten pharma zeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 99,5, vorzugsweise von etwa 0,5 bis 95 Gew.-%, der Gesamtmischung vorhanden sein.

Die oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer den erfin dungsgemäßen Verbindungen auch weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten.

Im allgemeinen hat es sich sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen, den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe in Gesamtmengen von etwa 0,5 bis etwa 500, vorzugsweise 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht je 24 Stun den, gegebenenfalls in Form mehrerer Einzelgaben, zur Erzielung der gewünschten Ergebnisse zu verabreichen. Eine Einzelgabe enthält den oder die erfindungsgemäßen Wirkstoffe, vorzugsweise in Mengen von etwa 1 bis etwa 80, insbesondere 3 bis 30 mg/kg Körpergewicht.

Biologische Testung 1. Wachstumsinhibitionstest zur Bestimmung der cytotoxischen Eigen schaften

Die humanen Dickdarmtumorzellinien SW 480 und HT 29 (ATCC-Nr. CCl 228 und HBT-38) sowie die Maus-Melanom-Zellinie B16F10 wurden in Rouxschalen in RPMI 1640 Medium unter Zusatz von 10% FCS gezogen. Anschließend wurde trypsiniert und in RPMI plus 10% FCS zu einer Zellzahl von 50 000 Zellen/ml aufgenommen. 100 µl Zellsuspension/Well wurden in eine 96 Mikrowellplatte gegeben und 1 Tag bei 37°C im CO₂-Brutschrank inkubiert. Anschließend wurden weitere 100 µl RPMI Medium und 1 µl DMSO mit den Prüfsubstanzen zugesetzt. Das Wachstum wurde nach Tag 3 und Tag 6 überprüft. Dazu wurde zu jedem Mikrowell 40 µl MTT-Lösung (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolinbromid) mit einer Ausgangs konzentration von 5 mg/ml H₂O zugesetzt. Es wurde 5 Stunden im CO₂- Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und 100 µl i-Propanol/Well zugesetzt. Nach 30 Minuten Schütteln mit 100 µl H₂O wurde die Extinktion bei 540 nm mit einem Titertek Multiskan MCC/340 (Flow) gemessen.

Die cytotoxische Wirkung ist in der Tabelle 1 als IC₅₀-Wert jeweils für die SW 480- und HT 29- und B16F10-Zellinie angegeben:

Tabelle 1

2. Hämatopoetische Aktivität von Konjugaten im Vergleich zum zugrunde liegenden Wirkstoff Material und Methoden

Knochenmarkzellen wurden aus dem Femur der Maus gespült. 10⁵-Zellen werden in McCoy 5A-Medium (0,3% Agar) zusammen mit rekombinaten murinen GM-CSF (Genzyme; Stammzellen-Kolonienbildung) und den Sub stanzen (10^-4 bis 100 µg/ml) bei 37°C und 7% CO₂ inkubiert. 7 Tage später wurden die Kolonien (< 50 Zellen) und Kluster (17-50 Zellen) ausgezählt.

Ergebnisse

Wie in Tabelle 2 dargestellt zeigen die untersuchten Konjugate eine gegenüber dem zugrundeliegenden Wirkstoffe drastisch verminderte Hemmung der Knochenmarkstammzellproliferation.

Tabelle 2 Hemmung der CSF-induzierten Proliferation von Knochenmarkstammzellen der Maus

Beispiel
IC₅₀ [ng/ml]
Camptothecin	2
2	100
5	90
6	60
10	200

Synthesebeispiele Synthesebeispiele Vorstufen Aminosäure bzw. Peptidkonjugate

Folgende Aminosäure-Konjugate von 20(S)-Camptothecin oder 20(S)-Camptothecin- Derivaten sind in WO 96/31532 beschrieben oder können in Analogie dazu hergestellt werden.

I. Peptidkonjugate von 20(S)-Camptothecin Beispiel E1 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-alanyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E2 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-phenylalanyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E3 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-leucyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E4 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E5 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-D-lysyl-leucyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E6 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E7 20-O-[N^ε-(Fluorenyl-9-methoxycarbonyl)-lysyl-D-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E8 20-O-[Histidyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E9 20-O-[Glutamyl-valyl]-camptothecin, Trifluoracetat II. Peptidkonjugate von Camptothecinderivaten Beispiel E10 10,11-Methylendioxy-20-O-{N^ε-[fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-lysyl-leucyl}- camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E11 7-Ethyl-20-O-{N^ε-[fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-lysyl-valyl}-camptothecin, Trifluoracetat Beispiel E12 7-Ethyl-20-O-{N^ε-[fluorenyl-9-methoxycarbonyl]-lysyl-valyl}-10-hydroxy camptothecin, Trifluoracetat Methoden zur Modifizierung der α-Aminofunktion Allgemeine Vorschriften A: Acylierung mit freien Carbonsäuren

0,5 mmol der α-aminodeblockierten Peptidkonjugate mit Camptothecin oder Campto thecin-Derivaten werden zusammen mit 0,5 mmol der Carboxylkomponenten in 50 ml Dimethylformamid gelöst und dann bei 5°C mit 1,5 Äq. Hydroxybenzotriazol, 1,2 Äq. N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl-carbodiimid Hydrochlorid sowie 2 Äq. Hünig- Base versetzt. Man läßt auf Raumtemperatur erwärmen und über Nacht rühren. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand mit Wasser verrührt. Man saugt ab, nimmt den Rückstand in Methanol/Dichlormethan 1 : 1 auf und fällt mit Diethyl ether. Gegebenenfalls wird diese Prozedur wiederholt. Man erhält die Zielverbin dungen in der Regel in Ausbeuten von über 70%.

B: Acylierung mit Carbonsäureanhydriden

0,5 mmol der α-aminodeblockierten Peptidkonjugate mit Camptothecin oder Campto thecin-Derivaten werden zusammen mit 2 mmol der Carbonsäureanhydrids in 50 ml Dimethylformamid gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungs mittel wird abgedampft und der Rückstand mit Wasser verrührt. Man saugt ab, nimmt den Rückstand in Methanol/Dichlormethan 1 : 1 auf und fällt mit Diethylether. Gegebe nenfalls wird diese Prozedur wiederholt. Man erhält die Zielverbindungen in der Regel in Ausbeuten von über 80%.

C: Acylierung mit Isocyanaten

0,5 mmol der α-aminodeblockierten Peptidkonjugate mit Camptothecin oder Campto thecin-Derivaten werden zusammen mit 0,5 mmol des Isocyanats (im Chemikalien handel erhältlich oder nach Standardmethoden herstellbar) und 2 Äq. Hünig-Base in 40 ml Dimethylformamid gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand mit Wasser verrührt. Man saugt ab, nimmt den Rückstand in Methanol/Dichlormethan 1 : 1 auf und fällt mit Diethyl ether. Gegebenenfalls wird diese Prozedur wiederholt. Man erhält die Zielverbin dungen in der Regel in Ausbeuten von über 80%.

D: Acylierung mit Carbonsäurechloriden und Sulfonsäurechloriden

Reaktionen erfolgen in Analogie zu Vorschrift B in Dichlormethan als Lösungsmittel und gegebenenfalls noch in Gegenwart von 2 Äq. Hünig-Base.

E: Allgemeine Vorschrift zur Ablösung der Fmoc-Schutzgruppe

0,25 mmol der modifizierten Peptidkonjugate, die in der Seitenkette die Fluorenyl-9- methoxycarbonyl-Schutzgruppe tragen, werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und nach Zugabe von 2 ml Piperidin 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird abgedampft und der Rückstand aus Methanol/Dichlormethan 1 : 1 mit Diethylether gefällt. Man erhält die Zielverbindungen in der Regel in Ausbeuten von über 80%.

F: Überführung in Hydrochloride

0,25 mmol der seitenketten-aminodeblockierten Peptidkonjugate mit Camptothecin oder Camptothecin-Derivaten werden in Wasser aufgenommen und mit 1 Äq. von 0,1 M wäßriger Salzsäure versetzt. Sollte keine Lösung entstanden sein wird mit wenig Dioxan versetzt. Die Mischung wird lyophilisiert und anschließend gegebe nenfalls noch mit Dichlormethan digriert oder aus Methanol/Dichlormethan 1 : 1 mit Diethylether gefällt.

Beispiel 1 20-O-[N^α-(Benzoyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E6, Benzoylchlorid
Methoden: D, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,4

Beispiel 2 20-O-[N^α-(Phenylacetyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E6, Phenylessigsäure
Methoden: A, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,4

Beispiel 3 20-O-[N^α-(Acetyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E6, Acetanhydrid
Methoden: B, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,35

Beispiel 4 20-O-[N^α-(Succinyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E6, Bernsteinsäureanhydrid
Methoden: B, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,28

Beispiel 5 20-O-[N^α-(Phenylamino-carbonyl)-lysyl-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E6, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,48

Beispiel 6 20-O-(N^α-(Phenylamino-carbonyl)-glutamyl-valyl]-camptothecin

Edukte: Beispiel E9, Fhenylisocyanat
Methoden: C
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 Rf = 0,76

Beispiel 7 20-O-[N^α-(Phenylamino-carbonyl)-histidyl-valyl]-camptothecin

Edukte: Beispiel E8, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,6

Beispiel 8 20-O-[N^α-(Acetyl)-histidyl-valyl]-camptothecin

Edukte: Beispiel E8, Acetanhydrid
Methoden: B, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,34

Beispiel 9 20-O-(N^α-(Acetyl)-lysyl-D-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E7, Acetanhydrid
Methoden: B, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,25

Beispiel 10 20-O-[N^α-(Phenylacetyl)-lysyl-D-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E7, Phenylessigsäure
Methoden: A, dann E, dann F
DC: AcetonitrillWasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,3

Beispiel 11 20-O-[N^α-(Phenylamino-carbonyl)-lysyl-D-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E7, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,4

Beispiel 12 20-O-[N^α-(Benzoyl)-lysyl-D-valyl]-camptothecin, Hydrochlorid

= 0,45

Beispiel 13 20-O-[N^α-(Acetyl)-lysyl-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E3, Acetanhydrid
Methoden: D, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,31

Beispiel 14 20-O-[N^α-(Phenylacetyl)-lysyl-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E3, Phenylessigsäure
Methoden: A, dann E, dann F
DC: AcetonitrillWasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,42

Beispiel 15 20-O-[N^α-(Succinyl)-lysyl-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E3, Bernsteinsäureanhydrid
Methoden: B, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,3

Beispiel 16 20-O-[N^α-(Phenylamino-carbonyl)-lysyl-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E3, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,45

Beispiel 17 20-O-[N^α-(Acetyl)-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E4, Acetanhydrid
Methoden: B, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,53

Beispiel 18 20-O-[N^α-(Phenylacetyl)-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E4, Phenylessigsäure
Methoden: A, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,44

Beispiel 19 20-O-[N^α-(Phenylamino-carbonyl)-lysyl-D-leucyl]-camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E4, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2 R_f

= 0,48

Konjugate des 10,11-(Methylendioxy)-camptothecins Beispiel 20 10,11-(Methylendioxy)20-O-[N^α-(Phenylaminocarbonyl)-lysyl-leucyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E10, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2

Konjugate des 20(S)-7-Ethyl-10-hydroxy-camptothecins; allgemeine Formel

Beispiel 21 7-Ethyl-10-hydroxy-20-O-[N^α-(Phenylamino-carbonyl)-lysyl-valyl]- camptothecin, Hydrochlorid

Edukte: Beispiel E12, Phenylisocyanat
Methoden: C, dann E, dann F
DC: Acetonitril/Wasser/Eisessig 5 : 1 : 0,2

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
oder deren Salze, in der
A ein verzweigter oder unverzweigter (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)- Alkylcarbonylrest, der weiterhin durch Halogen, Hydroxy, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, Amino, Carbonyl, Carboxy oder einen (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylrest substituiert sein kann, oder
ein (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylcarbonylrest, der durch Halogen, Hydroxy, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, Amino, Carbonyl, Carboxy oder einen verzweigten oder unverzweigten (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkylrest substituiert sein kann, oder
ein (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylaminocarbonylrest oder ein verzweigter oder unverzweigter (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)- Alkylaminocarbonylrest, der durch Halogen, Hydroxy, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, Carbonyl, Carboxy oder einen verzweigten oder unverzweigten (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkyl- bzw. (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylrest substituiert sein kann, oder
ein (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Aryl- oder ein verzweigter oder unver zweigter (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkylsulfonylrest ist, der durch Halogen, verzweigtes oder unverzweigtes (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkoxy, oder einen verzweigten oder unverzweigten (C₁-C₈)-, bevorzugt (C₁-C₆)-Alkyl- bzw. (C₆-C₁₂)-, bevorzugt (C₆)-Arylrest substituiert sein kann,
R und R' gleich oder verschieden sind und Seitenketten von Aminosäureresten sind
CPT einen Camptothecin-Rest oder ein im A-Ring, B-Ring oder C-Ring modifiziertes Camptothecin-Derivat bedeutet, die über eine esterartige Verkämpfung über eine Hydroxygruppe angebunden sind und
n 0 bis 10 ist.

2. Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R Seitenketten von Alanin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin. Leucin, histidin, Lysin, Arginin, Ornithin, Serin, Tyrosin, Valin, Diaminopropionsäure, α,γ-Diaminobuttersäue und/oder Phenylalanin sind, wobei mehrere Amino säurereste über die α-Aminogruppe peptidisch verknüpft sein können.

3. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im ersten Schritt (A) Camptothecin mit einer carboxyaktivierten Aminosäure verestert wird, worauf im zweiten Schritt (B) eine oder mehrere Aminosäuren über Peptidbindungen mit der im ersten Schritt erhaltenen Verbindung konjugiert werden, worauf im dritten Schritt (C) die gegebenenfalls blockierte α-Aminogruppe der terminalen Aminosäure deblockiert wird und im letzten Schritt (D) die freie terminale α-Aminogruppe mit einer Verbindung der allgemeinen Formel A-X in geeigneten Lösemitteln, gegebenenfalls in Gegenwart einer Base, umgesetzt wird und wobei A ein Rest gemäß Anspruch 1 ist und X für OH, Halogen oder OB steht, worin B = . . . oder wobei AX für eine Isocyanatgruppe steht.

4. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösemittel Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dichlormethan, Chloroform, gerad- oder verzweigtkettige Alkanole mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder Gemische dieser Lösemittel eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß Reaktionen in Dimethylformamid oder einem Tetrahydrofuran-Dichlormethan-Gemisch bei Normaldruck und einer Temperatur von 0 bis 50°C, bevorzugt Raumtemperatur, durchgeführt werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Base Triethylamin, Hünig-Base, Ethyldiisopropylamin, Pyridin oder N,N-Di methylaminopyridin eingesetzt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere der nicht in den Reaktionen umzusetzenden reaktiven Gruppen mit üblichen Schutzgruppen blockiert sind.

8. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Arzneimitteln, enthaltend neben nichttoxischen, inerten pharmazeutisch ge eigneten Trägerstoffen eine oder mehrere der Verbindungen gemäß Anspruch 1 oder 2, oder bestehend aus einer oder mehreren Verbindungen gemäß An spruch 1 oder 2.

9. Verwendung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Ver bindungen gemäß Anspruch 1 oder 2 in mikroverkapselter Form in einem oder mehreren Trägerstoffen vorliegen.

10. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 8 oder 9 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Krebserkrankungen.