DE19813692A1 - Cyanophycinsynthetasegene zur Erzeugung von Cyanophycin oder Cyanophycinderivaten, und ihre Verwendung - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Cyanophycinsynthetasegen mit mehr als 60% vorzugsweise mehr als 70 oder mehr als 80% und insbesondere mehr als 90% identischen Basen in der DNA-Sequenz zu der in Tabelle 1 dargestellten Sequenz und seine Verwendung.

Description

Die ernährungsphysiologische Wirkung der Futtermittel wird im wesentlichen durch deren Nährstoffzusammensetzung bestimmt, wobei der Aminosäurengehalt des Eiweißes von herausragender Bedeutung ist. Die im Organismus nicht oder nicht ausreichend schnell synthetisierbaren essentiellen Aminosäuren wie beispielsweise Lysin, Methionin, oder Thryptophan stellen dabei oft die begrenzenden Faktoren dar, daher werden Futtermitteln häufig freie Aminosäuren zugesetzt, die aus bakteriellen Kulturen oder aus Tiermehlen gewonnen werden.

Aber auch andere Aminosäuren können eine Verbesserung der Nahrungsmittelqualität bewirken. Arginin zählt bei wachsenden Schweinen schon seit langem zu den essentiellen Aminosäuren. Versuche an wachsenden Schweinen haben gezeigt, daß steigende Argininzulagen einen höheren Proteinansatz bewirken. Auch ist aus der Literatur bekannt, daß Arginin in der Bullenmast - insbesondere bei hohen Wachstumsraten - zum begrenzenden Faktor werden kann, obwohl diese Aminosäure laut Lehrbuchmeinung bei Wiederkäuern nicht als essentielle Aminosäure angesehen wird. Ergebnisse aus Untersuchungen zur Wirkung von Arginingaben an hochtragenden Milchkühen unterstreichen, daß die bisherige Lehrbuchmeinung nicht zu stimmen scheint. Arginingaben führten bei dieser Tierart zu einer drastischen Veränderung im Hormonstatus und während der ersten 22 Laktationswochen zu einer 10% höheren Milchproduktion.

Aus Untersuchungen der Sportmedizin ist bekannt, daß kombinierte Gaben von Asparaginsäure und Arginin stark leistungsfördernd wirken. In diesem Zusammenhang wird sogar von einer anabolischen Wirkung dieser Aminosäurenkombination gesprochen. Als eine der Ursache sieht man die Wirkung des Arginin im Ornithinzyklus bei der Entgiftung des Ammoniaks an, die besonders bei proteinreicher Ernährung von Leistungssportlern von Bedeutung ist. Auch wird die direkte Wirkung auf den Hormonstatus der Leistungssportler mit als Ursache angesehen.

Neben der beobachteten leistungsfördernden Wirkung scheint die basische Aminosäure Arginin auch einen Einfluß auf den Immunstatus der Tiere und Menschen zu nehmen. In einer Reihe von Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß erhöhte Arginingaben an Versuchstiere eine positive Beeinflussung des Gesundheitszustandes durch eine Stimulierung des Immunstatus - gemessen auf dem Niveau der Lymphocyten und Makrophagen - bewirkten. Diese immun-stimulatorische Wirkung des Arginins wird von Humanmedizinern auch als eine der Ursachen dafür angesehen, daß erhöhte Arginingaben zu einer Hemmung des Wachstums von Tumorzellen führen. Arginin erscheint unter dem Blickwinkel der aufgeführten Ergebnisse als eine Aminosäure, deren Wichtigkeit bisher nicht ausreichend genug Beachtung geschenkt worden ist.

Entscheidend für den Nährwert ist häufig auch das Verhältnis essentieller Aminosäuren zu nicht essentiellen Aminosäuren. Zu hohe Gaben von Lysin führten bei Versuchen an Hühnern zu Wachstumshemmungen; erst mit der gleichzeitigen Zugabe von Arginin konnte ein positiver Effekt auf das Wachstum erzielt werden. Eine Möglichkeit zur Verbesserung der Qualität von Nahrungs- bzw. Futtermitteln ist durch die Züchtung von Pflanzen gegeben, die einen erhöhten Protein- und/oder Aminosäurengehalt aufweisen. Im Gegensatz zu tierischem Eiweiß ist in der Pflanze der Gehalt sowie das Verhältnis der AS nicht optimal auf die Bedürfnisse des Menschen abgestimmt.

Die Steigerung des Anteils essentieller oder gesundheitsfördernder Aminosäuren in der Pflanze erfolgte bisher über die Expression von Genen, deren Produkte in die Aminosäuresynthese eingreifen und die nicht über einen Überschuß an der jeweiligen Aminosäure in ihrer Aktivität gehemmt werden können. Das Resultat ist eine Steigerung der Anteils der spezifischen Aminosäure im freien Aminosäurepool der Pflanze. Freie Aminosäuren werden aber, sofern sie nicht in Proteine eingebaut werden, wieder abgebaut, die Anreicherung ist also begrenzt, wenn nicht gleichzeitig die Proteinsynthese gesteigert wird.

Die Erfindung hat es sich zur Aufgabe gemacht Cyanophycin bzw. Derivate hiervon in Nutzpflanzen direkt herzustellen und speichern zu lassen. Ziel ist also insbesondere ein gentechnisch verändertes, gesundheitförderndes Lebensmittel, aber auch Pflanzen mit erhöhtem Anteil an einem biologisch abbaubaren Polymeren.

Die Aufgabe wird gelöst durch Anspruch 1 und die weiteren Ansprüche.

Die Erfindung betrifft somit natürliche, synthetische und modifizierte Cyanophycinsynthetasegene mit mehr als 60%, bzw. 70%, vorzugsweise mit mehr als 80% und insbesondere mit mehr als 90% identischen Basen in der DNA-Sequenz zu der in Tab. 1 dargestellten Sequenz, Verfahren zu ihrer Modifikation und Verwendung, insbesondere zur Erzeugung transgener Pflanzen, insbesondere in Nahrungs und Futtermittelpflanzen, unter Einsatz pflanzlicher Promotoren und Signalsequenzen zum Transport des Proteins in Organellen. In diesen Pflanzen führt die Expression der Gene zur

• a) Erhöhung des Proteingehalts
• b) spezifischen Anreicherung von gesundheitsfördernden Aminosäuren (wie Arginin, Aspartat und Lysin)
• c) Produktion von biologisch abbaubaren Polymeren (Poly Aspartat Kette).

Durch Modifikation der Cyanophycinsynthetase kann die Aminosäurezusammensetzung des Speicherproteins verändert werden.

Die Fixierung N-reicher Aminosäuren kann zu einer Glutaminlimitierung in der Pflanze führen, was eine Wachstumsreduktion bedeuten kann. Der Glutaminmangel soll durch die Expression einer Glutaminsynthetase aus Streptomyces viridochromogenes in der transgenen Pflanze aufgehoben werden. Die Neuheit des Ansatzes besteht in der Kombination von der Fixierung spezifischer Aminosäuren in der Pflanze durch die Expression eines Transgens und der gleichzeitigen Unterstützung der Amnisäuresynthese durch ein weiteres Transgen.

Cyanobakterien, aus deren Gruppe die Vorläufer der pflanzlichen Chloroplasten stammen, bilden über nicht ribosomale Proteinsynthese ein einfach strukturiertes Speicherpeptid, das Cyanophycin. Das nicht wasserlösliche Cyanophycin, das bis zu 16% der bakteriellen Trockenmasse ausmachen kann, wird ausschließlich von Cyanobakterien gebildet und in den sogenannten Cyanophycin-Granula gespeichert. Es ist ein Polymer aus den beiden AS L- Aspartat und L-Arginin (Multi-L-Arginyl-Poly-(L-Aspartat)), dessen molare Masse zwischen 25 und 125 kDa liegt. In Cyanobakterien wird gelegentlich auch L-Glutamat in Cyanophycin eingebaut, in E. coli führt die Expression des cyanobakteriellen Gens für die Cyanophycin- Synthetase auch zum Einbau von L-Lysin. Cyanophycin ist in schwachen Säuren oder Basen löslich, ein Abbau im Magen-Darm-Trakt des Verbrauchers wäre also zu erwarten.

Durch die Expression der Cyanophycinsynthetase werden die Aminosäuren Arginin, Aspartat und möglicherweise auch Lysin selektiv und ausschließlich in ein Protein eingebaut und dauerhaft gespeichert, so daß diese Aminosäuren weder zur Hemmung der Syntheseenzyme noch zum Abbau zur Verfügung stehen. Die entsprechenden Aminosäuren stehen der Pflanze also nicht mehr zur Verfügung. Es tritt ein spezieller Aminosäuremangel auf, der eine verstärkte Syntese der entsprechenden Aminosäuren durch pflanzeneigene Wege hervorruft. Auf diese Weise läßt sich eine beträchtliche Anreicherung der spezifischen AS erreichen.

Gleichzeitig kommt es zu einer deutlichen Erhöhung des pflanzlichen Proteingehalts. Pflanzliches Eiweiß gewinnt in Anbetracht des Bevölkerungswachstums und der Flächenverknappung immer mehr an Bedeutung. Um in verstärktem Maß auf tierisches Eiweiß verzichten zu können sollte der pflanzliche Proteingehalt erhöht werden. Die Neuheit des beschriebenen Ansatzes liegt in der Möglichkeit, ein stabiles Speicherprotein mit definierter Aminosäurezusammensetzung über nicht ribosomale Proteinsynthese in Pflanzen oder ihren Organellen herstellen zu lassen. Bisher wurde der Proteinanteil transgener Pflanzen nur unwesentlich über die Expression von Enzymen, die in den pflanzlichen Stoffwechsel eingreifen erhöht (1-5% mehr Protein, das nicht gespeichert wird). Eine Verbesserung des Proteingehalts wurde über eine Modifikation vorhandener Proteine erreicht. Hier wird ein im Stoffwechsel der Pflanze bisher unbekanntes Protein exprimiert, das zur Bildung eines neuen Speicherproteins führt. In Cyanobakterien kann das Cyanophycin bis zu 20% des Gesamtproteins ausmachen. Durch die Speicherung in den Organellen kann eine Stabilisierung des Proteins und damit eine beträchtliche verstärkte Anreicherung erreicht werden.

Die heterologe Expression der Cyanophycinsynthetasegens in E. coli führte zur Produktion von Cyanophycin, das in dem unterschiedliche physiologischen Hintergrund neben Aspartat und Arginin einen zusätzlichen Anteil Lysin enthält. Das Gen hat Sequenzähnlichkeiten zu einer Familie von Ligase, die die Biosynthese des Peptidanteils von Murein katalysieren, darunter auch den Einbau von Lysin. Mit diesem Hintergrund soll des Gen für die Cyanophycinsynthetase über gezielte und zufällige Mutagenese so verändert werden, das es zu einem verstärkten Einbau von Lysin oder anderen essentiellen Aminosäuren kommt.

Cyanophycin ist ein Polymer aus den beiden Aminosäuren L-Aspartat und L-Arginin (Multi- L-Arginyl-Poly-(L-Aspartat), dessen molare Masse zwischen 25 und 125 kDa liegt.

Durch Behandlung des aus Pflanzen isolierten Cyanophycins mit Essigsäure kann die Polyaspartatkette isoliert werden. Damit entsteht ein biologisch abbaubares Polymer, das aus Pflanzen gewonnen werden kann.

Ein erfindungsgemäßes Cyanophycinsynthetasegen wurde aus Synechocystis PCC 6803 oder Anabaena variabilis ATCC 29413 isoliert. Nach Ansequenzierung der Gene konnte die DNA Basen-Sequenz aus der Cyanobase-Datenbank entnommen werden. Der bisher keiner Funktion zugeordnete Leserahmen SLR 2002 (Tabelle 1) konnte als Cyanophycinsynthetase in Synechocystis PCC 6803 identifiziert werden.

Cyanophycin wird erfindungsgemäß in Nutzpflanzen direkt hergestellt und gespeichert. Cyanophycin ist eine gute Quelle für organischen Stickstoff, insbesondere für L-Arginin und L-Aspartat. Die möglicherweise therapeutische Wirkung von Arginin könnte sich durch die Speicherung in Cyanophycin als besonders nachhaltig erweisen, weil die AS hier in einer Art Depot vorliegen und dem Stoffwechsel nur nach und nach zugeführt werden. Cyanophycin wäre demnach einer direkten Zugabe der freien AS vorzuziehen.

Die Anreicherung von Cyanophycin beispielsweise in Amyloplasten der Kartoffel führt zu einem gentechnisch veränderten, gesundheitsfördernden Lebensmittel.

Auch im Futtermittel, wie z. B. Rapsschrot hat die Produktion von Cyanophyin eine positive Wirkung auf die Tiergesundheit und Futterverwertung und wirkt sich über die Verbesserung der Tierprodukte wie Milch, Eier und Fleisch auch auf die menschliche Gesundheit aus.

Gentechnische Modifikationen der Cyanophycin Synthetase führen zu einem verstärkten Einbau anderer AS wie zum Beispiel der essentiellen Aminosäure L-Lysin. Hier eröffnen sich weitere Möglichkeiten der Optimierung von Aminosäuregehalt und -zusammensetzung pflanzlicher Lebensmittel. Der Entzug spezifischer AS aus dem Stoffwechsel der Pflanze wird eine gesteigerte AS-Synthese bewirken. Glutamin ist eine der wesentlichen Ausgangssubstanzen für die AS-Synthese. Besonders bei der Speicherung von AS wie Arginin und Aspartat in Cyanophycin könnte es also zu Stickstoff bzw. Glutaminmangel kommen. Diesem Mangel wird über die Expression einer bakteriellen Glutaminsynthetase in den Pflanzen vorgebeugt. Konsequenz ist ein gesteigerter Ammoniumbedarf der Pflanze, der durch eine erhöhte Aufnahme aus dem Boden ausgeglichen wird. Pflanzen mit einer verbesserten Kapazität zur Ammoniumaufnahme und Speicherung von organischem Stickstoff sind auch zur Sanierung von Böden, die durch intensive Viehhaltung Ammonium verseucht sind, von Vorteil.

Glutaminsynthetasen sind in transgenen Pflanzen bereits exprimiert worden, das Resultat war aber eine ausschließliche Wachstumssteigerung der Pflanzen in frühen Entwicklungsphasen. In adulten Pflanzen kommt es nicht zu einer Glutaminlimitierung, so daß zusätzliches Glutamin weder fördernd noch störend wirkt. Durch die Bildung und Speicherung von Cyanophycin in der Pflanze wird aber eine künstliche Glutaminlimitierung hervorgerufen, die einen Wachstums-fördernden Effekt der zusätzlichgen Glutaminsynthetase erlaubt.

Tabelle 1

Claims (5)

1. Cyanophycinsynthetasegen mit mehr als 60%, vorzugsweise mehr als 70 oder mehr als 80% und insbesondere mehr als 90% identischen Basen in der DNA-Sequenz zu der in Tabelle 1 dargestellten Sequenz.

2. Verwendung des Cyanophycinsynthetasegens nach Anspruch 1 zur Erzeugung von Cyanophycin oder Cyanophycinderivaten.

3. Transgene Pflanze, die das Gen nach Anspruch 1 trägt, insbesondere transgene Pflanze, die in wirtschaftlich verwertbarer Menge Cyanophycin oder Cyanophycinderivate erzeugt.

4. Transgene Pflanze nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein Glutaminsynthetasegen trägt.

5. Verwendung der transgenen Pflanze nach Anspruch 3 als Lieferant für ein biologisch abbaubares Polymer.