DE19757144A1

DE19757144A1 - Dualer enzymatischer Test zum Nachweis von Mutationen in DNA beliebiger Herkunft durch Endonuklease VII

Info

Publication number: DE19757144A1
Application number: DE19757144A
Authority: DE
Inventors: Boerries Prof Dr Rer Na Kemper; Stefan Dipl Biol Golz; Karin Dr Birkenkamp-Demtroeder
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-12-20
Filing date: 1997-12-20
Publication date: 1999-06-24

Description

Der Nachweis von Mutationen gewinnt im klinischen Bereich zunehmend an Bedeutung, seitdem man mehr und mehr Gene findet, deren sprunghafte Veränderungen vielfältige Erbkrankheiten und Tumoren auslösen können. In breit angelegten Suchaktionen wird nach individuellen Genvarianten beim Menschen gesucht, deren Produkte als Ziel für maßgeschneiderte Therapie (Drugdesign) infrage kommen. Im wissenschaftlichen Bereich gehören Auslösung, Isolation, Kartierung und Charkaterisierung von Mutationen zur Routine in allen Organismen.

Normalerweise lassen sich Veränderungen im Genom durch Vergleiche der Sequenz von Wildtyp und Mutante genau feststellen. Die Sequenziertechnik ist jedoch trotz enormer Vereinfachung in den letzten Jahren immer noch verhältnismäßig zeitaufwendig und teuer. Sie ist an wartungsintensive Maschinen gebunden und erfordert giftige Chemikalien. Man hat dehalb seit langem nach einfachen und schnellen Nachweismethoden gesucht und ist dabei auf die enzymatische Methode zum Nachweis von Mutationen (EMD) gekommen.

Solche Methoden beruhen auf Enzymen, die normalerweise für die natürliche Reparatur von DNA-Schäden in den Zellen verantwortlich sind. Diese Enzyme erkennen u. a. Basenfehlpaarungen in der DNA, an die sie binden und dann selber oder mit Hilfsproteinen durch Schnitte in der Nachbarschaft zur Reparatur vorbereiten. Ein solches Enzym ist die Endonuklease VII des Phagen T4, das als bisher einziges bekanntes Enzym alle möglichen Basenfehlpaarungen erkennen, binden und schneiden kann.

Zum Zeitpunkt der Antragstellung steht die Auslieferung eines Kits zum vereinfachten Mutationsnachweis durch die Firma Pharmacia kurz bevor, der sich diese Fähigkeiten der Endo VII zunutze macht. Die neue, hier zur Patentierung vorgeschlagene Methode ist eine unabhängige Fortführung des alten, in dem Patent "Detection of Mutations by Resolvase Cleavage" (siehe Anlage) beschriebenen Verfahrens (siehe auch Stand der Technik).

Die alte Methode besteht aus mehreren Schritten:

a) Gewinnung von Test-DNA aus Zellen, Viren und Bakteriophagen.
b) Maximal zwei PCR-Amplifikationen von DNA des Wildtyps und der vermutlichen Mutante. Bei DNA von Heterozygoten genügt eine PCR-Reaktion, weil sich die mutierte Sequenz und die Wildtyp-Sequenz gleichzeitig in derselben Zelle befinden.
c) Isolation der PCR-Produkte.
d) Denaturierung und Reanturierung einer 1 : 1 Mischung von Mutanten-DNA^PCR und Wildtyp-DNA^PCR.
e) Verdau der Hybrid-DNA^PCR mit Endo VII.
f) Auftrennung und Vermessung der Fragmente auf einem Sequenziergel (s. Zeichnung).

Die Prozedur erfordert ab e) im günstigsten Fall 6 Stunden bei Verwendung normaler Polyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE). Bei Verwendung einer Sequenziermaschine ist der Aufwand der Maschinenvorbereitung und -betreuung hinzuzurechnen.

Eine Vereinfachung der zum Mutationsnachweis notwendigen PCR-Amplifikationsreaktionen und die nachfolgenden Schritte zur Reinigung der Fragmente und der Gewinnung von Heteroduplex-DNA^PCR ist derzeitig nicht möglich. Daher konzentrieren sich die Verbesserungsversuche auf die Sequenz der Ereignisse ab e) im obigen Schema. Die zur Patentierung vorgeschlagene neue Methode nutzt die Fähigkeit von Endo VII, vor jedem Schnitt an die den Schnitt auslösende Stelle in der Heteroduplex-DNA zu binden (duale Methode). Das hat eine erhebliche Vereinfachung der Prozedur bei gleichzeitigem Zeitgewinn zur Folge.

Die duale Meßmethode beinhaltet 9 sehr einfache Schritte, wobei die Bindungsfähigkeit von Endo VII an Basenfehlpaarungen im Vortest verwendet wird. Die Fähigkeit von Endo VII an denselben Basenfehlpaarungen zu schneiden wird im Folgetest auf die ausselektionierten positiven Kandidaten zur Bestätigung und zur Kartierung der Mutationen verwendet (s. auch Zeichnung in der Zusammenfassung):

I. Vortest

1. Endo VII wird unter EDTA (zur Inaktivierung der Schnittaktivität) an die Innenflächen von Vertiefungen in Mikrotiterplatten über 60 min gebunden.
2. Die zuvor gewonnene Heteroduplex-DNA wird zu der Adsorptionsmischung gegeben und weitere 60 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
3. Jede Vertiefung wird 5 mal mit dem Adsorptionspuffer nachgewaschen.
4. Die an die Innenflächen gebundenen Protein-DNA Gemische werden durch hohe Salzgaben eluiert und in zwei Aliquots A und B geteilt.
5. Aliquot A wird innerhalb eines Rasters auf ein Filterpapier aufgetropft, getrocknet und die Radioaktivität im Phosphorimager quantifiziert.
6. Alle Proben mit einem mindestens 1,25 mal höherem Gehalt an DNA im Vergleich zu dem aus mindestens fünf Kontrollproben mit gleicher Menge Homoduplex-DNA ermittelten Durchschnittswert werden als "vorläufig-positiv" eingestuft.

II. Folgetest

7. Aliquots B aller unter #5 als "vorläufig-positiv" identifizierten Proben werden mit 10mM MgCl₂ versetzt, für 15 min bei 37°C inkubiert und nach Stoppen der Reaktion durch EDTA und M Stopmix auf ein Sequenziergel aufgetragen.
8. Endgültige Identifikation der "endgültig-positiven" Proben.
9. Vermessen der entstandenen Fragmentlängen bzw. Kartierung der relativen Lage der Mutationen.

Das Verfahren wurde mit kurzen Heteroduplex-DNAs und einer cruciformen DNA, als typische Substrate für Endo VII, etabliert (siehe "DNA-Substrate" im Anschluß an diesen Abschnitt und Abb. 1). Die Empfindlichkeit der Methode lag bei 12,5% Gehalt an Heteroduplex-DNA mit einer C/C-Basenfehlpaarung in 87,5% Homoduplex-DNA ohne Fehlpaarungen (Abb. 2). Das ist doppelt so empfindlich als es in einer heterozygoten Realsituation mit 50% Heteroduplex-DNA (Mutante) und 50% Homoduplex-DNA (Wildtyp) erforderlich sein würde. Durch den anschließenden Folgetest können die im Verlauf des Vortests als positiv eingestuften Kandidaten überprüft und die Lage der jeweiligen Mutationen kartiert werden (Abb. 3).

Die Zuverläßigkeit des Verfahrens wurde in einem Blindtest geprüft (Abb. 4). Zwei positive Proben (A/4 und D/3) konnten unter 20 Kandidaten sicher erkannt werden. Bei unseren Vorversuchen wurden nur selten (<10% aller Kandidaten) Falsch-Positive im Vortest gefunden, niemals Falsch-Negative. Durch Weiterführung der Untersuchung aller im Vortest als "vorläufig-positiv" eingestuften Kandidaten lassen sich (theoretisch) alle Positiven mit hoher Sicherheit ermitteln.

SUBSTRATE

DNA-SUBSTRATE (Fortsetzung)

Stand der Technik (Kemper & Cotton, 1997; Übersetzung aus dem Englischen) Einleitung

Der Nachweis von Mutationen wird zunehmend wichtiger. Das hat verschiedene Gründe, insbesondere diese:

a) die Anzahl der beschriebenen Gene wächst ständig,
b) viele Tumore werden durch Mutationen in bestimmten Genen ausgelöst, und
c) mehr und mehr Gene werden auf eine Beziehung zu bestimmten Krankheiten der auf ihren wirtschaftlichen Nutzen hin untersucht.

Der Nachweis von Mutationen durch Sequenziertechniken ist zeitaufwendig und teuer, vor allem bei Genen mit langen codierenden Sequenzen oder solchen mit vielen Exons. Das hat zur Entwicklung von Methoden geführt, die ohne Sequenziertechniken auskommen und die gesamte Länge der DNA examinieren (für eine Übersicht, siehe Review 4). Die Tatsache daß es keine Methode gibt, die alle Ansprüche zufrieden stellt, wird dadurch unterstrichen, daß zur Zeit mindestens sechs verschiedene Methoden Verwendung finden, von denen jede ihre Vor- und Nachteile hat. Grundsätzlich gilt, je einfacher und billiger die Methode ist, umso geringer ist die Zahl der nachweisbaren Mutationen (Cotton, 1996) und umso mehr komplexere/teurere Methoden sind einzusetzen, um möglichst alle Mutationen erfassen zu können.

Es gibt zwei große Klassen von Methoden, die derzeit zum Nachweis unbekannter Mutationen eingesetzt werden:

a) physikalische Methoden und
b) Basenfehlpaarungen spaltende Methoden ("mismatch cleavage method").

Die physikalischen Methoden basieren auf der Erkenntnis, daß Mutationen die physikalischen Eigenschaften eines DNA-Fragments so verändern, daß es von der Wildtyp-DNA mit Hilfe von Elektrophorese abgetrennt werden kann. Hierdurch kann nicht nur die Mutation entdeckt werden, sondern es kann das DNA-Fragment auch gleichzeitig für eine spätere Sequenzierung gewonnen werden. Die größte Schwäche dieser Techniken liegt darin, daß nur relativ kurze DNA-Fragmente untersucht werden können und daß die Lage der Mutation nicht direkt erkennbar wird. Das wäre jedoch eine große Hilfe für den in Sequenziertechniken ungeübten Anwender.

Die Spaltung von Basenfehlpaarungen ("mismatch cleavage") beruht auf der Gewinnung von Heteroduplex-Molekülen mit DNA von Mutante und Wildtyp und deren nachfolgende Spaltung direkt an oder in unmittelbarer Nähe der Basenfehlpaarung. Dadurch läßt sich die Mutation gleichzeitig nachweisen und kartieren. Der Hauptvorteil dieser Methoden beruht darauf, daß sie 1-2 kb lange DNA-Stücke absuchen und die Lage der Mutationen bestimmen können.

Das ideale Enzym zur Spaltung von Basenfehlpaarungen würde eine Art "Restriktionsenzym für Basenfehlpaarungen" sein. Dieses Enzym würde an vielen Beispielen aller acht möglichen Basenfehlpaarungen ohne "star" Aktivität schneiden und keine falsch-positiven Signale in Homoduplex DNA hervorrufen. Viele Arbeitsgruppen haben in Richtung dieses Ideals gearbeitet und das Maß des erreichten Fortschritts hing weitgehend von der Art des gefundenen/studierten Enzyms ab.

Das erste vielversprechende Enzym dieser Art war die Ribonuclease (Myers et al., 1985). Die Methode beruht auf einer RNA Probe, einem offensichtlichen Nachteil, aber auch darauf, daß verschiedene Basenfehlpaarungen dann nicht geschnitten werden, wenn DNA mit der RNA Probe hybridisiert ist. Es gibt jedoch einen käuflichen Kit neueren Datums, der den Einsatz von mutierter und wildtyp RNA erforderlich macht um Heteroduplexes herzustellen und dadurch die Zahl der Basenfehlpaarungen erhöht, die gespalten werden können. Viele Laboratorien benutzen zur Zeit die Methode, und es wurde kürzlich ein Beispiel von Nash and Inderlied (Nash and Inderlied, 1996) publiziert, in dem diese Methode angewendet wurde.

Chemikalien wurden ebenfalls als Nachweis von Mutationen durch Spaltung von Basenfehlpaarungen eingesetzt (Cotton et al., 1988). Diese Methode sollte im Prinzip alle Mutationen nachweisen, da sie mindestens zwei Chancen zum Nachweis aller Mutationen hat, mit Ausnahme von 1/3 an T/G Basenfehlpaarungen, den einzigen nicht spaltbaren Basenfehlpaarungen, die jedoch über C/A Basenfehlpaarungen nachweisbar sind (siehe Cotton, 1997). Obwohl weit verbreitet (siehe zum Beispiel Verpy et al., 1994), ist die Methode wegen der Giftigkeit der Chemikalien, der vielen erforderlichen Einzelschritte und der Nichtverfügbarkeit eines Kits, nicht weit verbreitet.

Der offensichtlichste Platz, um nach Enzymen zu suchen, die zum Schneiden von Basenfehlpaarungen und damit zum Nachweis von Mutationen geeignet sind, liegt bei den Reparaturenzymen. Diese Quelle hat sich bisher jedoch als eher enttäuschend gezeigt. MUTY (Smith and Modrich, 1996) schneidet ausschließlich A/G und A/C Fehlpaarungen. Kürzlich wurde der komplette MUTS/MUTL Reparaturkomplex beschrieben und "scheint" ein ideales Restriktionsenzym für Basenfehlpaarungen darzustellen. Die Schnittstelle liegt jedoch bis zu mehreren Kilobasen von der Erkennungsstelle entfernt (Smith and Modrich, 1996).

Dieses enttäuschende Szenario hat zur Suche nach anderen potentiellen Enzymen geführt. Die durch T4 Endonuklease VII (T4 Endo VII) schneidbaren Substrate sind viel einfacher und schließlich können alle Basenfehlpaarungen geschnitten werden (siehe unten). Das hat zum Austesten dieses Enzyms als praktisches Werkzeug zur Mutationsnachweis über Basenfehlpaarungen geführt (Youil et al., 1995). Mashal et al (Mashal et al., 1995) haben das Potential diese Enzyms bestätigt.

Funktionen der Endonuklease VII in vivo

Endo VII ist das Produkt des Gens 49 vom Bakteriophagen T4 (Phage T4). Mutationen in diesem Gen bewirken schwere Defekte in der spät im Entwicklungszyklus ablaufenden DNA-Verpackung. Als Konsequenz von Infektionen mit 49⁻-Mutatanten werden lediglich teilweise gefüllte Köpfe und nicht-verpackbare Vorläufer DNA in der Wirtszelle angehäuft. Auf Grund dieses Phänotyps wurde das Gen ursprünglich als morphopoietisches Gen klassifiziert (Epstein et al., 1963). Die Defizienz von Gen 49 Mutanten, DNA vollständig in reifende Köpfe zu verpacken, wurde erst später mit dem Fehlen einer endonukleolytischen Funktion zur Auflösung verzweigter DNA-Moleküle in Verbindung gebracht (Epstein et al., 1963). Das Genprodukt 49 (gp49) wird zur Auflösung der DNA-Verzweigungen vor dem eigentlichen Verpackungsvorgang benötigt. In elektronenmikroskopischen Untersuchungen von aus 49⁻-Infektionen isolierten DNA-Vorläufer Molekülen ließen sich 3 bis 4 drei- bzw. vier-armig verzweigte, zufällig verteilte Strukturen pro Chromosom nachweisen. Diese Verzweigungen stammen offensichtlich aus früh im Entwicklungszyklus auftretenden Rekombinations- und Replikationsabläufen (Flemming et al., 1993). Zusammengefaßt beschrieben diese Beobachtungen das Produkt des Gens 49 als eine für die DNA-Verpackung essentielle Endonuklease, die später Endonuklease VII (Endo VII) genannt wurde (siehe unten).

Neben seiner Aufgabe als Auflöser von DNA-Verzweigungen während der DNA-Verpackung hat Endo VII auch noch austauschbare Hilfsfunktionen im frühen DNA-Metabolismus. Mutationen im Gen 49 wirken sich auf die homologe genetische Rekombination, die Reparatur von Basenfehlpaarungen und die Rekombinations abhängige DNA-Replikation aus (Mosig, 1994). Da diese Prozesse in Abwesenheit von gp49 nicht vollständig abgestellt sind, sondern mit reduizerter Effizienz weiterlaufen, muß der Phage Möglichkeiten haben, auf Backup-Mechanismen vom Wirt oder aus dem eigenen Gen-Repartoir zurückgreifen zu können.

Endo VII ist eine sehr potente Endonuklease, die bereits auf sehr niedrigem Expressionsniveau die intrazelluläre DNA mit hoher Wirksamkeit zerstört. Darum scheint es unabdingbar, daß die Aktivität des Enzyms in vivo einer ausbalancierten Kontrolle unterliegt. Gen 49 wird während des gesamten Infektionszyklus zunächst von einem frühen, dann von einem späten Promotor ausgehend transkribiert. Die Translation des frühen Transkripts ist jedoch dadurch herunter-reguliert, daß die Shine-Dalgarno Sequenz in der Faltung einer RNA-Sekundärstruktur schlecht für Ribosomen zugänglich ist. Die Transkripte der späten Promotoren bilden diese Sekundärstruktur in der mRNA nicht aus und Endo VII kann ungehindert translatiert werden (Barth et al., 1988).

Funktionen der Endonuklease VII in vitro

Endo VII wurde zunächst von Phagen-infizierten Zellen isoliert. Dazu wurde die aus 49⁻-infizierten Zellen isolierte hochverzweigte Vorläufer-DNA als Substrat für den Aktivitätstest eingesetzt. Ausbeuten und Reinheit des Proteins fielen jedoch unpraktisch niedrig aus. Heute wird das Protein in großen Mengen (mg-Mengen) bis zur Homogenität aus überexpremierenden E. coli isoliert. Die Aktivität von Endo VII wurde bis jetzt an einer großen Anzahl verschiedener DNA-Substrate überprüft. Die meisten dieser Substrate wurden in vitro synthetisch durch Hybridisierungen von Oligonukleotiden hergestellt. Eine Zusammenstellung aller bisher getesteten Substrate mit Literaturangaben ist im Anhang zu finden. Endo VII reagiert mit verzweigten Substraten wie vier- und drei-armigen Strukturen und Einzelstrang-überhängen. Weiterhin schneidet das Enzym an Basenfehlpaarungen von einzelnen Nukelotiden oder Heteroduplex-Schleifen, die durch Deletions- und Insertionsmutationen entstehen können. Endo VII schneidet an Einzestrangbrüchen, an Lücken, an chemisch veränderten Basen ("bulky adducts"), an Basenfehlstellen ("AP-sites") und an scharfen Knicken ("kinks"), immer 2-6 Basen entfernt, 3' von der Schadstelle in beiden Strängen. Die Spaltmuster und die Wirksamkeit der Spaltung hängt deutlich von den lokalen Sequenzgegebenheiten sowohl des Schadens wie auch der Nachbarschaft ab (Pottmeyer and Kemper, 1992).

Eine zeitliche Verzögerung zwischen dem ersten Schnitt in einem Strang und dem folgenden Schnitt im zweiten Strang ist groß genug, um der DNA Polymerase gefolgt von der DNA Ligase die Reparatur des Schadens zu ermöglichen (Solaro et al., 1993). Die Enzyme führen ausgehend vom ersten Schnitt eine Excisions-Reparatursynthese durch, in deren Verlauf zunächst die Basenfehlpaarung exonukleolytisch entfernt wird und die entstandene Lücke dann durch Neusynthese wieder aufgefüllt wird. Die letzte offene Stelle wird durch die Funktion der DNA Ligase geschlossen. Die Reparatur kann in beiden Strängen erfolgen. Die Wahl der Stränge hängt von der Lage des ersten Schnittes ab. Eine häufig beobachtete Bevorzugung des einen Stranges über den anderen Strang hängt von den die Basenfehlpaarungen flankierenden Sequenzen ab.

Bei der Suche nach einem einheitlichen Motiv für die Erkennung der DNA-Schäden durch Endo VII, wurde ein durch die Schäden selbst ausgelöster scharfe Knick ("kink") in doppelsträngiger DNA als die wahrscheinlichste Möglichkeit ausfindig gemacht. Das Auftreten plötzlicher Änderungen in der DNA-Sekundärstruktur wurden z. B. für Basenfehlpaarungen, "bulky-addcucts" und Thymin-Dimere beschrieben. Auch die Arme von verzweigten DNAs können vom Verzweigungspunkt ausgehende Knick-artige Konformationen annehmen, indem sich die Enden entgegengesetzter Arme im Raum nähern und zwischen sich einen Winkel bilden (Bhattacharyya et al., 1991). Untersuchungen haben ergeben, daß Endo VII jeweils an ein Paar der den Verzweigungspunkt flankierenden Arme bindet. Sind nur zwei Enden eines an sich linearen Moleküls vorhanden, so bindet Endo VII an die beiden die Stelle des Knicks flankierenden Schenkel.

Optimale Reaktionsbedingungen für Endo VII wurden in 45 mM Phosphatpuffer (pH 6.5), 10mM MgCl₂ bei 37°C gefunden. Die Zugabe von 1mM 2-Merkaptoäthanol (2-ME) ist optional. Aus historischen Gründen wurden die meisten Experimente jedoch unter suboptimalen Bedingungen in 10mM Tris-HCl Puffer bei pH 8.0, 10mM MgCl₂ und 1mM 2-ME durchgeführt. Die Endo VII Reaktionen zeigen ein breites Temperaturprofil mit einem Maximum bei 37°C mit nach rechts und links zu höheren bzw. tieferen Temperaturen abfallenden Verläufen. Darum können Endo VII Reaktionen mit immer noch guter Ausbeute (50%) auf Eis durchgeführt werden, was für die Stabilität von heteroduplex DNA von Vorteil sein kann. Bei Temperaturen oberhalb von 45°C werden die meisten synthetischen Substrate jedoch so instabil, daß Messungen nicht mehr praktikabel sind.

Das Protein Endonuklease VII

Endo VII ist ein Zink bindendes Protein von 157 Aminosäuren (aa) Länge und einem Molekulargewicht von 18kDa. In Lösung bildet Endo VII Dimere und unter bestimmten Bedingungen auch Multimere. Das Zink bindende Motiv enthält vier Cystein-Reste (Cys). Mutationen in einem der beiden äußeren oder der inneren Cys-Reste führt zum Verlust der Zinkbindung und der Aktivität (Giraud-Panis et al., 1995). Ob sich tatsächlich im Protein ein Zinkfinger ausbildet, wie es die Sequenz suggeriert, ist im Moment noch unklar. Die Bindung von Endo VII an DNA erfordert auch die endständigen aa am Carboxyterminus. So haben Messungen mit Deletionen von endständigen aa gezeigt, daß die Aktivität zwischen der aa 155 (50% Wildtyp Aktivität), 154 (20% Wildtyp Aktivität) und 150 (keine meßbare Aktivität) fließend verloren geht. Der Verlust der nukleolytischen Aktivität dieser Mutanten wird jedoch von dem Verlust der Fähigkeit an DNA zu binden, begleitet. Daß die Befähigung zum Schnitt in diesen Mutanten prinzipiell erhalten bleibt und der beobachtete Aktivitätsverlust lediglich eine Folge der Unfähigkeit, an DNA zu binden, ist, konnte durch in vifro Komplementationsexperimente bewiesen werden. Hierzu wurden Heterodimere des Proteins zwischen einer eindeutig Schnitt-inaktiven Punktmutation (N62D) und der Binde-inaktiven Deletionsmutation EVII-del150 mit Schnitt-Aktivität hergestellt.

Endo VII hat etwa 48% Sequenzähnlichkeiten zwischen aa 111 und 138 mit den Proteinen T4 Endonuklease V (Endo V), einem T4 kodierten DNA Reparaturenzym mit hoher Selektivität für Thymin-Dimere. Diese besondere Region wurde kürzlich in Endo VII durch die entsprechende Reglon von Endo V ausgetauscht, ohne daß die Spezifität für verzweigte DNAs verloren ging (Giraud-Panis et al., 1995).

Andere Cruciforme DNA auflösende Enzyme

Endo VII gehört zur Zeit zu den am besten untersuchten Endonukleasen seiner Art mit der Fähigkeit Basenfehlpaarungen zu schneiden. Andere Enzyme mit ahnlicher Funktion sind die Endonuklease I (Endo I) das Produkt des Gens 3 (gp3) des Phagen T7, ruvC und rus von E. coli und CCE1 von der Hefe S. cerevisiae. Eine Reihe weiterer, weniger gut untersuchter Aktivitäten wurden aus Bäckerhefe, menschlicher Placenta, Maus B-Zellen und Helazellen isoliert. Für keines dieser Enzyme sind heute jedoch detaillierte Studien zur Erkennung von Basenfehlpaarungen verfügbar.

Nachweis von Basenfehlpaarungen durch Endonuklease VII

Die Befähigung von Endo VII alle möglichen Basenfehlpaarungen in Heteroduplex-DNA zu erkennen und zu schneiden, hat das Enzym als ideal für den enzymatischen Nachweis von Mutationen (EMD) erscheinen lassen. Obwohl dieselbe Basenfehlpaarung in unterschiedlicher Umgebung mit unterschiedlicher Wirksamkeit erkannt wird (Abb. 1), ist ein Nichterkennen selten (unter 10%). Die Unterschiede in der Erkennbarkeit von Basenfehlpaarungen reflektieren minutiöse Unterschiede in der Sekundärstruktur der jeweiligen Heteroduplex-DNA wie sie sich in Analysen durch denaturierende Gelelektrophorese (DGGE) zu erkennen geben. Als Fausregel gilt, je geringer die Schmelztemperatur eines Heteroduplex ist, umso besser wird die Fehlpaarung durch Endo VII erkannt (Solaro et al., 1993).

Häufig beobachtetes Schneiden im Hintergrund linearer DNA ohne Basenfehlpaarungen wird einer, jeder DNA eigenen, strukturellen Variabilität des Moleküls gesehen. Dieser für das Testverfahren unerwünschte Hintergrund (Falsch-Positive) wird teilweise unterdrückt sobald die DNA durch eine Fehlpaarung als Heteroduplex vorliegt.

Weitere Untersuchungen und Anwendungen

Die für die Entwicklung des Mutationsnachweisverfahrens notwendigen, ausführlichen Untersuchungen wurden bisher dadurch behindert, daß nicht genügend Enzym verfügbar war. Das liegt einerseits daran, daß das Enzym kommerziell noch nicht angeboten wurde und einem breiten Kreis von interessierten Labors nicht frei zugänglich war. Zum anderen lassen sich größere Mengen des Enzyms nur mit Schwierigkeiten erhalten, weil es durch verfrühtes Abtöten der expremierende Wirtszellen nur in begrenzten Mengen synthetisiert wird. Es gibt jedoch zwei Studien, die die potentielle Nützlichkeit von Endo VII deutlich belegen.

In einer Studie wurden 81 von 81 bekannten Maus β-Globin Promotormutanten durch Endo VII-Schnitte erkannt (Youil et al., 1995). Das Hauptergebnis war, daß die Schnitte in ihrer Intensität von stark bis schwach eingruppiert wurden. Außerdem waren Schnitte im Hintergrund des Homoduplex zu erkennen. Das heißt für den Moment, daß eine Wildtyp-Kontroll DNA bei der Mutationssuche mitgeführt werden muß.

Die Anwendung der Methode auf Mutationen im menchlichen Tumorsuppressorgen p53 führte zum Nachweis neuer Mutationen (Giuntal et al., 1997).

Verbesserungen und Zukunftsaussichten

Die Bereitstellung eines Test-Kits im Laufe des Jahres 1997 durch die Firma Avitech Diagnostics (Malvern, USA) wird die Chancen für die Verbreitung und die Verwendung des Enzyms als Mutationssonde drastisch verbessern. Dieses auch deshalb, weil dann ein sehr einfaches Vier-Schritt-Ein-Reagenzgefäß Protokoll mitgeliefert wird. Verbesserungen einiger der oben erwähnten negativen Begleiterscheinungen von Endo VII werden voraussichtlich durch den Einsatz anderer, verwandter Enzyme und mögliches Engeneering der vorhandenen Enzyme sowie die Entwicklung alternativer Testverfahren bald behoben sein.

Referenzen

Barth, K.A., Powell, D., Trupin, M., and Mosig, G. (1988). Regulation of two nested proteins from gene 49 (recombination endonuclease VII) and of a lambda rexA-like protein of bacteriophage T4. Genetics 120, 329-343.
Bhattacharyya, A., Murchie, A.I.H., v.Kitzing, E., Diekmann, S., Kemper, B., and Lilley, D.M.J. (1991). Model for the interaction of DNA junctions and resolving enzymes. J. Mol. Biol. 221, 1191-1207.
Cotton, R.G., Rodrigues, N.R., and Campbell, R.D. (1988). Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401.
Cotton, R.G. (1996). Detection of unknown mutations in DNA: a catch-22 [editorial; comment]. Am. J. Hum. Genet. 59, 289-291.
Cotton, R.G.H. (1997). Mutatioan Detection. O. U. P. Oxford (in press)
Epstein, R.H., Bolle, A., Steinberg, C.M., Kellenberger, E., Boy La Tour, E., Chevalley, R., Edgar, R.S., Susman, M., Denhardt, G.H., and Lielausis, A. (1963). Physiologlcal studies of conditional lethal mutants of bacteriophage T4D. Cold Spring Habor Symp. Quant. Biol. 28, 375-394.
Flemming, M., Deumling, B., and Kemper, B. (1993). Function of gene 49 of bacteriophage T4 III. Isolation of Holliday-structures from very fast-sedimenting DNA. Virology 196, 910-913.
Giraud-Panis, M.J.E., Duckett, D.R., and Lilley, D.M.J. (1995). The modular character of a DNAjunction-resolving enzyme: A zinc-binding motif in bacteriophage T4 endonuclease VII. J. Mol. Biol. 252, 596-610.
Giuntal, C., Youil, R., Venter, D., Chow, C.W., Somers, G., Lafferty, A., Kemper, B., and Cotton, R.G.H. (1997). Rapid diagnosis of germline p53 Mutatons using the enzyme mismatch cleavage method. Diagnostic Molecular Pathodlogy (in press)
Mashal, R.D., Koontz, J., and Sklar, J. (1995). Detection ofmutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases. Nat. Genet. 9, 177-183.
Mosig, G. (1994). Homologous recombination. In Molecular biology of bacteriophage T4. J.D. Karam, ed. (Washington, D.C. ASM American Society for Microbiology), pp. 54-82.
Myers, R.M., Larin, Z., and Maniatis, T. (1985). Detection of single base substitutions by ribonuclease cleavage at mismatches in RNA:DNA duplexes. Science 230, 1242-1246.
Nash, K.A. and Inderlied, C.B. (1996). Rapid detection ofmutations associated with macrolide resistance in Mycobacterium avium complex. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 40, 1748-1750.
Pottmeyer, S. and Kemper, B. (1992). T4 endonuclease VII resolves cruciform DNA with nick and counter-nick and its activity is directed by local nucleotide sequence. J. Mol. Biol. 223, 607-615.
Smith, J. and Modrich, P. (1996). Mutation detection with MutH, MutL, and MutS mismatch repair proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 4374-4379.
Solaro, P.C., Birkenkamp, K., Pfeiffer, P., and Kemper, B. (1993). Endonuclease VII of phage T4 triggers mismatch correction in vitro. J. Mol. Biol. 230, 868-877.
Verpy, E., Biasotto, M., Meo, T:, and Tosi, M. (1994). Efficient detection of point mutations on color-coded strands of target DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1873-1877.
Youil, R., Kemper, B.W., and Cotton, R.G.H. (1995). Screening for mutations by enzyme mismatch cleavage using T4 endonuclease VII. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 87-91.

Neuheit der Erfindung Vorteile der Erfindung in technischer und wirtschaftlicher Hinsicht

Die Erfindung stellt eine wesentliche Vereinfachung bei gleichzeitiger Erweiterung der Möglichkeiten der patentierten Methode: "Detection of Mutations by Resolvase Cleavage", USSN 08/232,530 - Cotton et al. vom 16. September 1996, dar.

Die derzeit sicherste Art, Mutationen nachzuweisen, ist die Sequenzierung von DNA-Proben. Die sehr zuverläßige Methode hat jedoch die Nachteile, daß sie teuer und zeitaufwendig ist und den Einsatz giftiger Chemikalien erfordert.

Eine wesentlich einfachere Methode ist der Nachweis von Basenfehlpaarungen mit Hilfe des Enzyms Endonuklease VII (Endo VII). Der Nachweis erfolgt in Heteroduplex-DNA, die man zuvor mit Hilfe etablierter PCR-Techniken aus Wildty- und Mutanten-DNA gewinnt. Nach Behandlung der Heteroduplex-DNA mit Endo VII werden indikative Fragmente auf Sequenziermaschinen nachgewiesen und vermessen. Dadurch gelangt man zu einer raschen Ja/Nein-Antwort bei gleichzeitiger Abschätzung der Lage der Mutation in Relation zu den Enden des untersuchten Fragments. Im Vergleich zur Sequenzierung ist die Methode einfach, erfordert keine giftigen Chemikalien und kann in normalen Routinelabors durchgeführt werden. Nachteile liegen in dem immer noch relativ hohen Zeitaufwand und der Notwendigkeit, alle Proben ausnahmslos über Gele (Sequneziermaschinen) analysieren zu müssen. Im praktischen Fall, wenn nur wenige positiven Proben unter vielen negativen zu erwarten sind, bedeutet das einen entscheidenden Zeitverlust durch die vielen "Leerläufe".

Das bisherige Verfahren nutzt nur einen Teil der Eigenschaften von Endo VII zum Nachweis von Mutationen. Lediglich die nukleolytische Aktivität des Enzyms wird zur Indikation herangezogen, und man mißt die Spaltung von Heteroduplex-DNA im Bereich der Fehlpaarungen. Die Spaltungsreaktion wird ohne Einschränkung auf alle Proben (positiv wie negativ) angewendet.

Die neue Methode nutzt die im Schneide-Test inhärent verborgene, weitere Eigenschaft von Endo VII, nämlich an Basenfehlpaarungen zu binden und differenziert in einem Bindetest in Ja/Nein-Entscheidung zwischen negativen und positiven Proben. (Jede Schneidereaktion setzt die Bindung des Enzyms and die potentielle Schnittstelle voraus). Der Nachweis der gebundenen DNA gelingt durch Phosphorimaging von auf Filter aufgetropften prozessierten Proben. Die Auswertung läuft über das dem Phosphorimager zugeordnete Computerprogramm. Der optional durchführbare Nachtest berücksichtigt dann nur noch die zuvor ausgewählten positiven Proben. Er kann einerseits zur Absicherung der im Vortest erhaltenen Daten und/oder zum Kartieren der Mutationen verwendet werden. Hierzu wird die Schneideaktivität von Endo VII in den vom Vortest abgezweigten Aliquots durch Zugabe von Mg²⁺ aktiviert und die Fraginente neben Größenmarkern auf einem Polyacrylamidgel aufgetrennt.

Die Vorteile der neuen Methode liegen in:

a) Zeitgewinn
b) Einfache Handhabung
c) Wählbarkeit von Optionen (Ja/Nein-Entscheidung oder Kartierung)

bei gleichzeitiger unverminderter Zuverläßigkeit.

Die weitere Entwicklung der Methode in Richtung von Fluorescenzmarkierung mit nachfolgender automatischer Auswertung im Fluorescenz-Lesegerät sind denkbar.

Anwendungsmöglichkeiten und Zielbranchen, potentielle Lizenznehmer

Der Nachweis von Mutationen ist weltweit Routinearbeit in genetischen Labors öffentlicher Einrichtungen akademisch und angewandt orientierter Bereiche. Privatwirtschaftliche Einrichtungen setzen derzeit verstärkt auf die gentechnologischen Möglichkeiten Naturprodukte durch Genisolation bzw. Mutantengewinnung zu nutzen und zu verändern. Die wachsende Erkenntnis, daß viele (Erb)kranidieiten durch Veränderungen (Mutationen) in bekannten Genen begleitet, oft auch ausgelöst werden, macht die medizinisch diagnostische Verwertbarkeit einfacher Mutationsnachweisverfahren sowohl wissenschaftlich wie kommerziell interessant. Hier liegt DER prospektive Markt der Zukunft für das bereits bestehende Verfahren, und in besonderem Maße wegen der Einfachheit für das neue Verfahren.

Wir können uns vorstellen, daß Firmen mit medizinisch diagnostischen Produkten Interesse an der Neuentwicklung hätten und die Möglichkeit, das Mutationsnachweisverfahren durch Fluorescensmarkierung zu vereinfachen und z. B. zusammen mit entsprechender Hardware (Fluorescenz-Lesegeräte) anzubieten, eine interessante Bereicherung ihrer Produktpalette sehen. Firmen dieser Art gibt es in großer Zahl, z. B. Amershani/Pharmacia, Boehrihger, Perkin-Elmer, Applied Biosystem Incorporation (ABI) etc. Neben diesen "großen" Firmen sehen wir aber auch grundsätzlich eine gute Verwendbarkeit als Starterset für "kleine" Neugründungen im biotechnologischen Bereich, die in besonderem Maße jetzt auch in Deutschland gefördert werden und denen neue Geldquellen aus "Venture-Capital" und/oder Förderungsmaßnahmen des Bundesministeriums für Forschung und Technologie (BMFT) eröffnet werden.

Angaben zur Patentsituation

Wie im vorausgehenden Text bereits erwähnt, wurde die grundlegende Methode des Enzymatischen Nachweises von Mutationen durch Resolvasen in den USA unter dem Titel: "Detection Of Mutations By Reoslvase Cleavage" patentiert. Das Patent wurde durch die Firma Avitech Diagnostics in Malvern (Philadelphia, USA) im Zuge einer Abtretungsvereinbarung für Dr. R. Cotton (Melbourne, Australien) und Dr. B. Kemper (Köln, Deutschland) am 16. September 1996 angemeldet. Das Patent wurde kürzlich erteilt (Patent Number 5,698,400 vom 16. Dec. 1997).

Ein zweites Patent: "Overexpression of Recombinant Bacteriophage T4 Endonuclease VII and Uses Thereof" wurde später ebenfalls in Washington (USA) angemeldet und wurde kürzlich (Juni 1998) erteilt (U.S.S.N. 08/621,708).

Ein drittes Patent: "Mismatch Detection Technique" wurde zeitlich nach dem hier beantragten Patent am 4. Februar 1998 in Washington (USA) beantragt (Provisional Application No. 60/073,716). Der Sachverhalt dieses für die USA angemeldeten Patents ist derselbe wie der des hier für Deutschland beantragten Patents.

Angaben über bereits kontaktierte Unternehmen

Zwischen Avitech-Diagnostics und einem der Erfinder (B. Kemper) bestehen Vereinbarungen, Neuentwicklungen zunächst der Firma vorzustellen, um ihre Patentwürdigkeit und ihre für die Firma voraussehbare Nützlichkeit abzuschätzen. Entsprechende Nachrichten bezüglich der hier beschriebenen Neuentwicklung gingen deshalb bereits an die Firma.

Angaben zur Person

Name: Börries Kemper
Titel: Dr. rer. nat.
Beruf: Universitätsprofessor
Adresse: Institut für Genetik II, Zülpicher Straße 47, 50674 Köln
Tel.: 0221-470 5287
FAX: 0221-470 5172
e-mail: bkemper@genetik.uni-koeln.de
Erfahrungen auf dem Gebiet der Erfindung: Der Antragsteller arbeitet und lehrt seit 1972 ununterbrochen am Institut für Genetik in Köln auf dem Gebiet der molekularen Genetik von Prokaryonten und niederen Eukaryonten.
Spezialgebiet: Nachweis, Reinigung und Charakterisierung von DNA-Reparaturenzymen aus den benannten Organismen (siehe Jahrbuch des Instituts für Genetik).

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Genomen von Organismen mit Hilfe von Endonuklease VII (Endo VII),
dadurch gekennzeichnet,
daß Endo VII alle bekannten Basenfehlpaarungen in einem Heteroduplex DNAs erkennt und in ihrer unmittelbaren Nachbarschaft Phosphodiesterbindungen spaltet.

2. Endo VII nach Patentanspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß in zwei Stufen a) die Bindungsaffinität von nicht-aktiviertem Endo VII an Heteroduplex DNAs mit Basenfehlpaarungen zur selektiven Anreicherung solcher DNAs an einer Trägermatrix genutzt wird und b) nach Aktivierung der Endonuklease in den positiven Proben ein optionaler Schnittest zur Kartierung der Mutationen herangezogen wird.