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DE19727932A1 - Verfahren und Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore - Google Patents

Verfahren und Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore

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DE19727932A1
DE19727932A1 DE19727932A DE19727932A DE19727932A1 DE 19727932 A1 DE19727932 A1 DE 19727932A1 DE 19727932 A DE19727932 A DE 19727932A DE 19727932 A DE19727932 A DE 19727932A DE 19727932 A1 DE19727932 A1 DE 19727932A1
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Timo Dr Hillebrand
Bernd Prof Dr Med Doerken
Gerhard Dr Med Wolff
Peter Dr Bendzko
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur molekularen Charakterisierung und möglichen Früherkennung bösartiger Tumore auf der Basis des Nachweises von Mutationen des Bax-Genes sowie einen Testkit.
Apoptose oder programmierter Zelltod spielt eine entscheidende, physiologische Rolle in der Regulation von Zellen und Geweben. Dysregulationen in diesem fein ausbalancierten System von Aktivatoren und Inhibitoren der Apoptose haben entscheidenden Anteil in der Entstehung von bösartigen Tumoren. Diese sind dadurch gekennzeichnet, daß Inaktivatoren der Apoptose überreguliert und Aktivatoren der Apoptose inaktiviert und/oder mutiert oder deletiert sind. Daraus ergibt sich, daß die exakte, molekularbiologische Analyse der Schädigung von beteiligten Molekülen, wichtige Informationen über die Pathogenese von malignen Erkrankungen liefert. Darüber hinaus ermöglicht die Erfassung von Schädigungen in den relevanten Genen diejenigen zu identifizieren, welche im Rahmen einer Gentherapie substituiert werden sollten, um eine kausale Therapie zu ermöglichen. Ein entscheidender Aktivator der Apoptosevermittlung wird durch das Bax-Protein repräsentiert. Dieses Molekül gehört zur Familie der bc1-2 verwandten Gene, welche die Apoptosefähigkeit einer Zelle regulieren. Während z. B. das Protein bc1-2 zu den Inhibitoren der Apoptose zählt, wird Bax den Apoptose-fördernden Genen zugerechnet. Die Bax mRNA wird in drei unterschiedlichen Splicevarianten exprimiert, Bax-alpha, Bax-beta und zwei Bax-gamma Formen. Von spezieller Bedeutung zur Induktion des programmierten Zelltodes ist Bax-alpha. Für das Bax-Gen konnte kürzlich gezeigt werden, daß in Tumoren des Verdauungstraktes eine spezifische Schädigung der DNA-Sequenz vorliegt ("frame shift mutation")/Somatic frameshift mutations in the BAX gene in colon cancers of the microsatellite mutator phenotype;Rampino-N; Yamaiaoto-H; Ionov- Y; Li-Y; Sawai-H; Reed-JC; Perucho-M;Science. 1997 Feb. 14; 275(5302): 967-9/.
Die Aufdeckung dieser DNA-Schädigung ist von wesentlicher Bedeutung nicht nur für die Erklärung der Entstehung von Tumoren. Daher stellt das Bax-Gen auch ein Kandidatengen dar für die molekulare Diagnostik von bösartigen Tumoren, welches im Rahmen von Gentherapiestrategien ersetzt werden sollte, um die Tumorzelle dem programmierten Zelltod wieder zuzuführen.
Im Rahmen bisheriger Strategien zur molekularen Diagnostik von malignen Erkrankungen standen Gene im Vordergrund, die entweder mutiert oder inaktiviert sind (z. B. p16 oder p53). Diese Gene stehen im Rahmen der Zellzykluskaskade und/oder Apoptoseinduktion relativ proximal in der Signaltransduktion. Im Sinne einer Ja- oder Nein-Antwort ist davon ausgegangen worden, daß durch Substitution dieser Gene es zu einer Therapie, d. h. zu einem programmierten Zelltod der Tumorzelle kommt. Es zeigte sich jedoch, daß die Regulation des programmierten Zelltodes wesentlich komplexer ist, und daß vor allem distal von den beschriebenen Genen zahlreiche weitere Regulationsschaltstellen liegen.
Der Neuheitsgrad und die Orginärität unserer Methode leitet sich von einem anderen konzeptionellen Ansatz ab. Unabhängig von der Art der therapeutischen Induktion einer Apoptose (z. B. Pharmaka, Strahlung oder genetisches Molekül) muß das entsprechende biologisch, chemisch und/oder physikalisch induzierte Signal mit Hilfe einer Signaltransduktionskaskade (Moleküle des Zellzyklus und/oder des Apoptosesignaltransduktionsweges) einem genetisch determiniertem Effektormolekül zugeführt werden ("final executer"), welches durch Auslösung metabolischer Prozesse zum letztendlichen programmierten Zelltod führt. Da Tumorzellen in mehreren Genen dysreguliert sind ist es entscheidend, so distal in der Signaltransduktionskaskade die molekulare Diagnostik, am Effektorgen, anzusetzen. Als ein solcher "final executer" ist das Apoptose-vermittelnde Bax-Gen beschrieben worden.
Eine weitere Besonderheit unseres Ansatzes leitet sich aus der Art der Mutationsmöglichkeit im Bax-Gen ab. Die "frame-shift" Muation in den 8 Guanosinbasen der genetischen Sequenz erlaubt die Entstehung sowohl von 7 als auch von 9 Guanosinbasen, in deren Folge es zum Ablesefehler, d. h. zur Nichtexpression eines funktionstüchtigen Bax-Proteines kommt. Das bedeutet, daß die im Gegensatz zu anderen Mutationen hier eine Flexibilität im Sinne einer "Vorwärts- und/oder Rückwärtsmutation" vorliegt, die erst dann auftritt, wenn die betroffene Zelle unter Selektionsdruck, z. B. durch therapeutische Ansätze unterschiedlicher Natur, gerät ("Konzept der Feldkarzinogenese" Slaughter et al. 1954. Cancer 6: 968-968). Klinisch gesehen bedeutet daß, das am Anfang einer Therapie eine funktionelles Bax-Gen vorliegt, während der Therapie sich durch den Selektionsvorteil der "frame-shift"-Mutanten (keine Apoptose- Vermittlung) ein klonales Wachstum herausbildet, welches durch Apoptoseresistenz gekennzeichnet ist. Da Bax transkriptionell durch p53 aktiviert wird, gilt dieser Mechanismus nicht nur für chemotherapeutische, sondern auch gentherapeutische Ansätze.
Mutative Veränderungen im Bax-Gen wurden bisher nur in einer hochspezifischen Gruppe von Tumoren des Verdauungstraktes nachgewiesen, welche allerdings prozentual nur ca. 10% dieser Tumorklasse manifestieren.
Der Nachweis dieser "frame-shift Mutationen" (Insertion bzw. verlust einer Guanosinbase einem Guanosin-Repeat-Trakt des Bax-Genes) /Rampino-N et.al/ über die enzymatische Vervielfältigung eines DNA-Fragmentes erbracht, innerhalb dessen sich die zu untersuchende Zielsequenz befand und einer sich anschließenden Auftrennung des generierten DNA-Fragmentes in einem Polyacrylamidgel zur Analyse der Längenabweichung von einem Bax-Wildtypfragment. Die Visualisierung der mutierten DNA-Fragmente erfolgte dabei mittels einer radioaktiven Methode auf einem Röntgenfilm.
Ein solches Verfahren ist aber sehr zeitaufwendig und somit für eine Routinediagnostik nicht anwendbar. Aufgrund des Einsatzes radioaktiver Stoffe ist es außerdem sehr gesundheits- und umweltgefährdend.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, eine klinisch nutzbare Nachweismethode zur molekularen Charakterisierung auf mutative Veränderungen im Bax-Gen zu entwickeln, welches die Nachteile radioaktiver Methoden vermeidet und für eine Routinediagnostik eingesetzt werden kann.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird genomische DNA aus den zu untersuchenden klinischen Proben isoliert, indem die Probe mit einem Lyse-Bindungspuffer, wie z. B. Guanidinisothiocyanat, Lithiumchlorid oder Guanidinhydrochlorid gegebenenfalls in Kombination mit Detergenzien und Alkoholen, sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung der genomischen DNA inkubiert wird. Anschließend wird die genomische DNA nach Durchführung von Waschschritten vom Trägermaterial wieder abgelöst.
Als mineralisches Trägermaterial werden vorzugsweise an sich bekannte Silicamaterialien < 50 nm eingesetzt, besonders bevorzugt nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße von 7 nm-1 µm.
In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens wird die unter Lyse-Bindungspuffer am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer Porengröße von 0,05 bis 1 µm, vorzugsweise von 0,2 µm-0,5 µm, aufgetragen. Durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration wird anschließend das Trägermaterial mit der genomischen DNA auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers aus Ethanol, Natriumchlorid und Tris-HCl auf der Membran gewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer aus Tris-HCl und EDTA eluiert.
Der auf "frame shift" Mutationen zu untersuchenden Guanosin- Repeat-Trakt innerhalb der kodierenden Region des Bax-Genes (Sequenzbereich 114-121) wird mit einem Primerpaar enzymatisch vervielfältigt, wobei einer der Primer mit einer Fluoreszenzmarkierung versehen ist. Nach der enzymatischen Vervielfältigung ist somit auch das vervielfältigte DNA- Fragment mit der Fluoreszenzmarkierung versehen. Das Primerpaar wird so ausgewählt, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und 120 Basenpaaren beträgt. Diese ermöglicht nachfolgend eine hochempfindliche elektrophoretische Auftrennung des amplifizierten DNA-Fragmentes.
Bevorzugt wird ein Primerpaar der Sequenz:
Primer 1: 5'-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGC-3
eingesetzt.
Als Fluoreszenmarkierungen werden kommerziell verfügbare Farbstoffe wie z. B. Hex oder Rox (Handelsname) eingesetzt welche mittels DNA-Sequenzierautomaten detektiert werden können. Das über die Amplifikationsreaktion generierte DNA-Fragment wird zur Analyse seiner exakten Länge auf einem Sequenziergel aufgetrennt und mittels des DNA-Sequenzierautomaten analysiert. Eine solche Auftrennung ermöglicht den hochsensitiven Nachweis der exakten Länge. Es können Unterschiede von nur einem Nukleotid nachgewiesen werden.
Die zu detektierende Abweichungen von einem Basenpaar (Insertion oder Deletion einer Base) von der Bax-Wildtypsequenz können so hochspezifisch erkannt werden.
Das erfinderische Verfahren löst in idealer Weise die aufgeführten Probleme radioaktiver Techniken und gestattet eine einfache und schnelle Analytik des Bax-Genes und somit eine molekulare Charakterisierung bösartiger Tumore.
Es ist extrem zeitsparend, einfach in der Durchführung und gesundheits- und umweltschonend, da es auf die Verwendung radioaktiver Chemikalien verzichtet.
Zudem können durch Verwendung einer idealen Isolierungstechnik der genomischen DNA eine Vielzahl von Proben gleichzeitig analysiert werden. Da DNA-Sequenzierautomaten zur Standard-Ausstattung von diagnostischen Laboratorien gehören, ermöglicht die Erfindung schnell und reproduzierbar, Mutationen im Bax-Gen nachzuweisen.
Die Erfindung ist auch darüber hinaus geeignet nichtinvasiv gewinnbare Probenmaterialien einer Mutationsuntersuchung im Bax-Gen zuzuführen, das bedeutet, daß über den Nachweis von Mutationen im Bax Gen auch eine diagnostische Früherkennung maligner Veränderungen möglich wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in diesem Zusammenhang insbesondere zum frühen Nachweis von Lungentumoren, wofür als Ausgangsmaterialien zur Isolierung von genomischer DNA auch nichtinvasiv gewinnbare Ausgangsmaterialien wie Ausatemluft oder Bronchallavage verwendet werden.
Es basiert dabei insbesondere auf den eigenen neuen Erkenntnissen eines Nachweises von Insertions- und Deletionsmutationen innerhalb der beschriebenen Guanosineinheit des Bax-Gens in nichtkleinzelligen epithelialen Tumoren der Lunge. So konnte bei Lungentumoren überraschend eine sehr viel höhere Mutationsfrequenz, als diese für Tumoren des Verdauungstraktes beschrieben sind, festgestellt werden.
Das Verfahren ist darüber hinaus auch vorteilhaft für die molekulare Charakterisierung von anderen soliden Tumoren einsetzbar, indem andere klinische Proben untersucht werden, so z. B. zum Nachweis von Mammatumoren, Kolontumoren u. a. aus entsprechenden Gewebeproben oder aus für eine diagnostische Früherkennung interessanten klinische Ausgangsmaterialien (Stuhl, Plasma, Blut u. a.).
Dies ist entscheidend für eine mögliche Früherkennung maligner Veränderungen und für die Planung notwendiger Therapiemaßnahmen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Testkit für die Untersuchung klinischer Proben auf Mutationen im Bax-Gen, welcher alle notwendigen Reagenzien für die Untersuchung von Mutationen im Bax-Gen enthält. Mittels eines solchen Testkits kann die DNA-Extraktion aus unterschiedlichsten Probenmaterialien und die Erzeugung eines fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmentes erreicht werden. Darüberhinaus enthält ein solcher Testkit auch notwendige Positiv und Negativkontrollen sowie einen Fragmentlängenstandard.
Der erfindungsgemäße Testkit ist gekennzeichnet durch:
  • 1. DNA Extraktionssystem
  • 2. Primermix mit einem Hex-markierten Primer
  • 3. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz
  • 4. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax
  • 5. Fragmentlängenstandard (Rox-markiert) für die exakte Zuordnung der auf dem Sequenziergel aufgetrennten Amplifikate.
Ein solcher Testkit erlaubt damit auch molekularbiologisch nicht hochspezialisierten Personen die Durchführung einer Bax-Gen-Diagnostik in einem Laborroutinebetrieb. Das der Erfindung zu Grunde liegende Verfahren und die Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens ermöglichen es, Mutationen im Bax-Gen routinemäßig nachzuweisen. Das bedeutet einen entscheidenden Schritt für den gezielten perspektivischen Einsatz der Gentherapie zur Behandlung epithelialer Tumoren und zur möglichen Früherkennung von Tumoren.
Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel dargestellt.
Beispiel Nachweis von Insertions- oder Deletionsmutationen im Bax-Gen Bax nichtkleinzelligen Lungentumoren
Es werden ca. 1-2 mg Tumorgewebe in einem Lysepuffer unter Zusatz von Proteinase K bei 60°C für ca. 30 min inkubiert. Die Lysesuspension wird mit einem Puffer versetzt, welcher ein mineralisches Trägermaterial, eine chaotrope Komponente (Guanidinhydrochlorid), ein Detergenz (Triton X-100) und einen Alkohol (Isopropanol) enthält, und kurz geschüttelt. Anschließend wird das Gemisch auf eine Zentrifugationssäule mit einer Membran aus Polysulfonether gegeben und bei Maximalgeschwindigkeit für 2 min zentrifugiert. Das Zentrifugat wird verworfen und dann erfolgt die Zugabe von 600 µl einer Waschlösung (70% Ethanol; NaCl, Tris-HCl) und eine erneute Zentrifugation für 2 min bei Maximalgeschwindigkeit. Das Filtrat wird verworfen und der Waschschritt wiederholt. Nach einer nochmaligen 1 minütige Zentrifugation wird die Zentrifugationssäule in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 100-200 µl eines auf 70°C vorgewärmten Elutionsmittels (10 mM tris-HCl; 0.1 mM EDTA; pH 9.0) inkubiert und für 1 min bei Maximalgeschwindigkeit zentrifugiert.
Die isolierte genomische DNA aus der Tumorprobe ist Ausgangsmaterial für die selektive Vervielfältigung des zu untersuchenden DNA-Abschnittes des Bax-Genes.
Für die Vervielfältigungsreaktion werden 1-5 µl DNA eingesetzt. Für die enzymatische Vervielfältigungsreaktion wird ein Primer eingesetzt, welcher mit einer Standard-Fluoreszenzmarkierung versehen ist (Hex-Markierung). Nach der Vervielfältigungsreaktion werden 0, 5 µl des erzeugten DNA-Fragmentes mit 2 µl Wasser und 2 µl Formamid gemischt und für 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Dieser Ansatz wird auf einem 6-10%igem denaturierenden Polyacrylamid-Sequenziergel aufgetragen und auf einem Sequenzierautomaten (ABI 373) bei 2500 V, 25 mA und 30 Watt für 2 Stunden aufgetrennt.
Als Kontrollen dienen zwei DNA-Fragmente, welche aus Tumorzellinien amplifiziert wurden und dabei zum einen den Bax-Wildtyp und zum anderen sowohl eine Insertionsmutation und auch eine Deletionsmutation enthalten.

Claims (9)

1. Verfahren zum Nachweis von bösartigen Tumoren dadurch gekennzeichnet, daß man genomische DNA aus klinischem Probenmaterialien isoliert und Insertions-und Deletionsmutationen im humanen Bax-Gen in einem Guanosin-Repeat-Trakt der Nukleotidregion innerhalb der kodierenden Region des Gens im Bereich der Nukleotide mit Guanosinbasen untersucht, indem man diesen DNA-Abschnitt mittels eines Primerpaares amplifiziert, wobei das Primerpaar so ausgewählt ist, daß die Amplifikationslänge zwischen 90 und 120 Basenpaaren beträgt und ein Primer mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, das amplifizierte DNA-Fragment auf ein Sequenzierungsgel aufträgt, auftrennt und die Insertionen und Deletionen über die Fragmentlänge nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA aus den zu untersuchenden klinischen Proben, isoliert wird, indem die Probe mit einem Lyse-Bindungspuffer sowie mit einem mineralischen Trägermaterial zur Bindung genomischer DNA inkubiert werden und nach Durchführung von Waschschritten die genomische DNA vom Trägermaterial wieder abgelöst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als mineralisches Trägermaterial Silicamaterialien < 50 nm, vorzugsweise nichtporöses Siliziumdioxyd mit einer Teilchengröße von 7 nm-1 µm verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die am Trägermaterial fixierte genomische DNA auf eine Membran aus Polysulfonether mit einer Porengröße von 0,05 µm bis 1 µm, vorzugsweise von 0,2 µm-0,5 µm, aufgetragen und durch einen Zentrifugationsschritt oder eine Vakuumfiltration das Trägermaterial auf der Membran fixiert, durch Zugabe eines Waschpuffers auf der Membran gewaschen und mit einem Niedrigsalzpuffer eluiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Insertions- und Deletionsmutationen in einem Guanosin- Repeat-Trakt der Nukleotidregion mit 8 Guanosinbasen innerhalb der kodierenden Region des Gens im Bereich der Nukleotide 114-121 untersucht werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Primerpaare der Sequenz:
Primer 1: 5'-TTCATCCAGGATCGAGCAGG-3
Primer 2: 5'-TCCACCAAGAAGCTGAGC-3
eingesetzt werden.
7. Testkit zum Nachweis bösartiger Tumore auf der Basis des Nachweises von Insertions-und Deletionsmutationen im Bax-Gen umfassend:
  • 1. DNA Extraktionsmodul
  • 2. Primermix (mit einem Hex-markiertem Primer)
  • 3. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation der Bax-Wildtypsequenz
  • 4. Kontrollzellinien-DNA zur Amplifikation von mutiertem Bax
  • 5. Fragmentlängenstandard (Rox-markierte Fragmentleiter).
8. Testkit nach Anspruch 7 zur molekularen Charakterisierung und Nachweis Nachweis von Lungentumoren unter Verwendung von Gewebeproben aus der Lunge, Biopsien oder Atemluft.
9. Testkit nach Anspruch 7 zum Nachweis für die molekulare Charakterisierung von soliden Tumoren vorzugsweise Colon, Mamma unter Verwendung entsprechender Gewebeproben.
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