DE19718066A1

DE19718066A1 - Verwendung wasserlöslicher Selbstklebemassen

Info

Publication number: DE19718066A1
Application number: DE19718066A
Authority: DE
Inventors: Joachim Buenger; Florian Dr Wolf; Manfred Dr Spies
Original assignee: Beiersdorf AG
Current assignee: Beiersdorf AG
Priority date: 1996-11-28
Filing date: 1997-04-29
Publication date: 1998-06-04

Description

Die Erfindung betrifft insbesondere neue Verfahren zur Probenahme und Isolie rung von Zellen, insbesondere des Stratum Corneum (Corneozyten), die es gestatten, diese funktional intakt für in vitro Untersuchungen zugänglich zu ma chen.

Die zur Zeit bekannten Methoden zur Gewinnung von Corneozyten liefern nur fest an Trägermaterialien gebundene Corneozyten, die nicht für in vitro Unter suchungen, bei denen Zellsuspensionen notwendig sind, verwendet werden können. Die Probenahme entsprechender Zellen ist z. Zt. mit den folgenden Methoden üblich:

- mit Klebebändern,
- mit Cyanacrylat-Strips
- mit Harz.

Mit adhäsiven Klebemassen auf polymeren Trägermaterialien können die su perfiziell liegenden Zellen des Stratum corneum durch "tape-stripping" gewon nen werden. Die isolierten Zellen bleiben für alle weiteren Unter suchungsschritte auf der Klebemasse haften. Eine Untersuchung kann nur an hand von Färbungen (Morphologie), der Zellzahl oder der physikalischen Ei genschaften (Absorption) und nicht getrennt vom Trägermaterial durchgeführt werden. Dieses Verfahren wird für die Bestimmung der Hauttrockenheit und zur Untersuchung der Wirkung von topisch applizierten Kosmetika und Rohstoffen auf die Ablösbarkeit von Zellen des Stratum corneums benutzt.

Bei Cyanoacrylatstrips werden mit einem Cyanoacrylatkleber auf einem festem Trägermaterial mehrere Zellschichten des Stratum corneums gleichzeitig von der Haut entnommen. Darüber hinaus werden alle eventuell auf der Haut be findlichen Dermatophyten zwischen dem Kleber und dem transparenten Trä germaterial eingeschlossen. Zellen, die mit Cyanoacrylatstrips gewonnen wur den, können auf ihre Morphologie, Anfärbbarkeit und Schichtdicke hin unter sucht werden, um so Veränderungen der Keratinisierung (Parakeratosis, Dyskeratosis), der Bildung neoplastischer Zellen und Entzündungsreaktionen zu diagnostizieren.

Zur Gewinnung von Zellen des Stratum corneum wurde auch schon ein speziel les Harz entwickelt. Die mit dem Harz von der Haut abgezogenen Corneozyten werden mit Aceton aus dem Harz herausgelöst und anschließend wird die Oxi dation der Hautproteine und die Katalase-Aktivität bestimmt.

Bei allen Methoden liegen die zu untersuchenden Zellen nicht isoliert vor. Im Falle der Gewinnung mit Harz können die Corneozyten durch ein entsprechen des organisches Lösungsmittel zwar aus der betreffenden Matrix herausgelöst werden, der Lösungsmittelkontakt beeinflußt jedoch die Oberflächenstruktur und die chemische Zusammensetzung der Zellen derart, daß nicht immer mit sicheren Untersuchungsergebnissen gerechnet werden kann. Die Veränderung der Hautzellen unter Lösungsmitteleinfluß kann zur völligen Zerstörung der Zellstruktur führen.

Die mit normalem Klebeband (tape-stripping) gewonnenen Zellen sind für alle folgenden Untersuchungen auf dem nicht in Wasser löslichen Klebeband fest in der Klebemasse gebunden und deshalb nur für spezielle Untersuchungen geeignet.

Mit allen Verfahren des Standes der Technik können also keine für die in vitro Verwendung geeigneten ganzen, funktional intakten Zellen erhalten werden, die sich z. B. in einer wäßrigen Suspension befinden.

Aufgabe der Erfindung war es, hier Abhilfe zu schaffen, insbesondere eine ge eignete Matrix zu finden, die die Nachteile des Standes der Technik nicht auf weist, und dennoch einfach zu handhaben ist.

Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer wasserlöslichen Selbst klebemasse, insbesondere zum Aufnehmen von Proben, insbesondere Zellen, von Oberflächen, insbesondere Körperoberflächen, wobei die Selbstklebema sse gegebenenfalls auf einem Träger aufgebracht ist.

Gegenstand der Erfindung ist also die Verwendung einer wasserlöslichen Selbstklebemasse zum Aufnehmen von Proben, insbesondere Zellen, von Oberflächen, insbesondere Körperoberflächen, die vorzugsweise auf einem Träger aufgebracht ist, aber auch allein verwendet werden kann.

Besonders bevorzugt ist diese Verwendung für das Aufnehmen von Haut proben oder Hautzellen oder darauf befindlichen Proben, beispielsweise von chemischen Verbindungen oder Mikroorganismen, von der Hautoberfläche.

Zur leichteren und schnelleren Handhabung ist es zweckmäßig, die erfin dungsgemäße Selbstklebemasse auf einen Träger aufzubringen, beispiels weise blattförmige oder bahnförmige Materialien, die starr oder flexibel sein können. Auf diese Weise kann man Klebebänder oder Klebestreifen oder Kle beplättchen oder auch Vorrichtungen, gegebenenfalls mit einer Handhabe er halten, z. B. in der Art eines Stempels, wobei auf die Stempelfläche eine erfin dungsgemäße Klebemasseschicht aufgebracht ist.

Geeignete Trägermaterialien sind z. B. Glas, Polymere, insbesondere blatt- oder bahnförmige Polymerfilme, oder Papier, z. B. Papierbänder oder Papier blätter.

Mit der wasserlöslichen Klebmasse z. B. eines Klebebandes können Proben, beispielsweise superfiziell liegende Zellen des Stratum corneum durch "tape-stripping" gewonnen werden. Die auf der Klebmasse haftenden Proben oder Zellen werden mit Wasser, gegebenenfalls mit einem Zellpuffergehalt, aus der Klebmasse herausgelöst, weil sich die wasserlösliche Selbstklebemasse auf löst, und können anschließend in vitro z. B. als gewaschene Zellsuspensionen eingesetzt werden. Auf diese Weise können Proben, z. B. Zellen, insbesondere Zellen des Stratum corneum, unabhängig von einem Trägermaterial und einem Kleber oder einer Selbstklebemasse untersucht werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur in vitro Unter suchung intakter Proben oder Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß unter Verwendung wasserlöslicher Selbstklebemassen, die gegebenenfalls auf einem Träger angebracht sind, Proben oder Zellproben, z. B. Dermatophyten, genommen werden und diese durch anschließendes Auflösen der Selbst klebemasse in Wasser freigegeben und gegebenenfalls isoliert werden.

Die Selbstklebemassen lösen sich nach Wasserzugabe auf und geben die Probe frei. Werden Hautzellen isoliert, ist es zweckmäßig einen Zellpuffer, bei spielsweise einen Phosphatpuffer zu verwenden. Papierträger können bevor sie zerfallen zweckmäßigerweise aus der Zellsuspension herausgenommen werden.

Die Probe kann dann in bekannter Weise, abhängig von Probenmaterial und Verwendungszweck, weiter aufgearbeitet werden, z. B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, z. B. Dichtegradientenzentrifugation oder differentielles Zentri fugieren.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Gewinnung von Zellen des Stratum corneum, z. B. für die quantitative Bestimmung der Adhäsion von Mi kroorganismen an Human-Corneozyten. Diese Zellgewinnungsmethode er möglicht eine Bestimmung der antiadhäsiven Wirkung von Substanzen und Substanzgemischen. Erstens kann man durch die Quantifizierung der Bakterien adhäsion in Hemmversuchen mit potentiellen Antiadhäsinen die Adhäsions mechanismen untersuchen, und zweitens kann untersucht werden, wie diese Antiadhäsiva aus Produkten heraus wirksam sind, z. B. um eine unerwünschte Bakterienbesiedlung auf der Haut zu blockieren. Hierbei würden die Bakterien also dann durch spezifische Hemmsubstanzen kompetitiv an der Hautadhäsion gehemmt werden.

Zur Gewinnung von Zellen des Stratum corneum (Corneozytenstripping) mit erfindungsgemäßen Klebemassen geht man insbesondere wie folgt vor.

Auf die Hautoberfläche des Probanden wird ein Klebestreifen aufgeklebt und die Haftung der Klebemasse auf der Haut durch das Abrollen einer Metallwalze auf dem Klebestreifen erhöht. Nach dem vorsichtigen Abziehen des Streifens von der Haut werden Plättchen mit einer definierten Fläche ausgestanzt.

Die erhaltenen Corneozytenstrips werden mit der Klebseite nach unten auf z. B. einen Zellpufferlösung in eine Petrischale gelegt. Hierbei wird die Klebemasse mit den anhaftenden Zellen gelöst und die Corneozyten werden freigegeben. Die vom Streifen abgelösten Zellen werden zentrifugiert und der Überstand mit den Resten der Klebemasse wird verworfen.

Die Anzahl der gewaschenen und sedimentierten Corneozyten wird in der Neubauerkammer (Fa. Blaubrand) bestimmt.

Mit den bisher angewandten Gewinnungsmethoden für Zellen des Stratum cor neum ist es nicht möglich, mikroskopisch und funktional intakte Zellen für in vitro Untersuchungen zu bekommen. Die herkömmlichen Methoden zur scho nenden Isolierung der Corneozyten bieten nur fest an Trägermaterial immobili sierte Corneozyten, die nicht für in vitro Versuche, bei denen eine Zellsuspen sion notwendig ist, verwendet werden können. Durch organische Lösungsmittel würde die Corneozytenoberfläche verändert werden. Die Zellgewinnung sollte aber zu keinerlei Veränderung der Zellen führen, damit die Zellen möglichst der in vivo Situation entsprechen. Erfindungsgemäß werden wasserlösliche Kle bemassen auf Papier oder Folie als Trägermaterial verwendet, mit denen funk tional intakte Zellen des Stratum corneum in hoher Zellzahl isoliert werden können.

So werden z. B. für die Untersuchung von Adhäsionsmechanismen morpholo gisch und funktional, im Vergleich zu der in vivo Situation, möglichst unverän derte Zellen benötigt. Um gesunde Probanden nicht direkt mit Bakterien zu beimpfen, wird die Adhäsion von Staphylococcus epidermidis an Human-Cor neozyten in vitro durchgeführt. Für die Quantifizierung der Bakterienadhä sion im Durchflußphotometer müssen die Corneozyten mit adhärierten Bakterien einzeln in Suspensionen vorliegen. Mit der quantitativen Bestimmung der Bakterienadhäsion im Durchflußphotometer können sowohl Adhäsionsmecha nismen als auch Substanzen auf ihre antiadhäsiven Eigenschaften hin unter sucht werden.

Für die beschriebene Anwendung können bekannte, übliche Klebebänder ein gesetzt werden, bei denen sich die Klebemasse vorzugsweise quantitativ in Wasser auflöst. Diese Produkte werden häufig bei der Papierherstellung und bei Druckvorgängen zum Zusammenfügen des Endes einer Papierrolle mit dem Anfang einer anderen Papierrolle eingesetzt. In der Vergangenheit ist eine re lativ große Anzahl von wasserlöslichen Klebmassen mit den daraus resultie renden Produkten beschrieben worden.

Die folgenden Systeme können prinzipiell für die erfindungsgemäße Anwen dung als Selbstklebemassen verwendet werden.

Die US-Patentschrift 2,838,421 beschreibt eine wasserlösliche Klebmasse auf Basis von Polyacrylsäure, die mit wasserlöslichen Weichmachern wie Poly ethylenglycolen oder Polypropylenglycolen als Klebrigmacher gemischt wird, und der anschließend Epoxide als Vernetzungsagens zugesetzt werden.

In US 3,096,202 werden wasserlösliche Systeme basierend auf Polyvinyl pyrrolidon als Gerüstpolymer und damit verträglichen Weichmachern aus der Gruppe der Polyole und Polyalkylglycolether in Kombination mit polyfunktio nellen monomeren Vernetzungssystemen beschrieben.

US 3,441,430 und US 3.575,911 beschreiben wasserlösliche Klebemassen, die durch Copolymerisation von Acrylsäure oder Metacrylsäure mit Alkoxyalkyl estern wie z. B. 2-Ethoxyethylacrylat hergestellt werden. Den Gerüstpolymeren werden anschließend wasserlösliche Ether wie z. B. Polyethylenglycolmono phenylether und polyfunktionelle Vernetzer zugemischt, um die klebtech nischen Eigenschaften einzustellen. Die Wasserlöslichkeit wird durch Neutrali sation mit Hydroxiden oder entsprechenden Neutralisationsmitteln eingestellt.

DE-A-15 94 190 beschreibt wasserlösliche Klebemassen bestehend aus Gemi schen aus Polyvinylalkohol und Polyethyleniminen mit oder ohne Zusatz einer Säure.

In US 3,661,874 werden wasserlösliche Klebemassen auf Basis eines epoxi dierten Kautschuks beschrieben, dem ein wasserlösliches sekundäres Mono amin zu gemischt wird.

DE 23 11 746 beschreibt wasserlösliche Klebemassen auf Basis von Mischun gen aus einem Methylvinylether-Maleinsäure-Copolymerisat und einem Alkyl phenol-Polyethylenoxid-Kondensat.

DE 23 60 441 beschreibt wasserlösliche Selbstklebemassen auf Basis von Acrylsäure und Acrylsäureestern nicht tertiärer Alkylalkohole, der wasser lösliche Weichmacher vom Typ Alkanolamin und Polyoxyalkylen bzw. Harz klebrigmacher zugemischt werden, wobei ein Teil der vorhandenen Carboxyl gruppen neutralisiert wird.

In DE 29 04 233 werden wasserhaltige Selbstklebemassen auf Basis eines Copolymers aus Acrylsäurealkylestern und einer α,β-ungesättigten Mono carbonsäure beschrieben, bei dem der Säureanteil des Copolymerisates weit gehend unter Verwendung eines organischen Aminderivates neutralisiert wird.

DE 31 05 894 beschreibt Haftklebemassen auf Basis eines Gemisches aus Acrylsäureester-Vinylcarbonsäure Copolymerisaten und wasserlöslichen Weichmachern vom Typ eines ethoxylierten Alkylmono- oder -diamins, oder ethoxylierten Alkylammonium-Verbindungen, bei denen der Säureanteil des Copolymerisates zum überwiegenden Teil neutralisiert ist.

DE 33 18 600 beschreibt Haftklebemassen auf Basis von Copolymeren aus Acrylsäure mit Fumarsäure-di-(alkoxyalkyl)-estern und Vinylestern, die mit wasserlöslichen Weichmachern haftklebrig eingestellt werden.

In EP-A-22 339 werden Lösungspolymerisate auf Basis wasserlöslicher Mono meren wie z. B. Acrylsäure in Gegenwart alkoholischer Weichmacher (Polyetherpolyole) beschrieben. Die Pfropfcopolymerisate werden mittels eines weiteren wasserlöslichen Weichmachers haftklebrig eingestellt.

Solche und ähnliche Produkte sind erfindungsgemäß geeignet.

Untersuchungen haben ergeben, daß Klebebänder wie in DE-A-43 30 362 be schrieben, eine ganz besonders gute Eignung für den obengenannten Zweck zeigen. Mit diesen Produkten konnten in Zellgewinnungsversuchen noch er heblich höhere Konzentrationen an funktional intakten Zellen des Stratum cor neums gewonnen werden. Ein besonders bevorzugtes Klebeband dieser Art ist unter der Bezeichnung "tesa 51441" im Handel erhältlich (Fa. Beiersdorf AG, Hamburg).

Besonders geeignet sind repulpierbare Klebebänder bzw. Klebebänder mit re pulpierbaren Eigenschaften.

In DE-A-43 30 362 wird ein voll repulpierbares Produkt beschrieben, das aus einem repulpierbaren Papierträger, einer repulpierbaren Acrylatklebemasse, die mit ethoxylierten Aminen weichgemacht wird, und einem repulbierbaren silikonfreien Releasesystem besteht. Diese Klebebänder mit repulpierbaren Eigenschaften bzw. repulpierbaren Klebebänderwerden bevorzugt.

Durch Zusatz von Alkylarylpolyetheralkoholen, insbesondere der folgenden Formel

worin -Ph- eine para-substituierte Phenylgruppe bedeutet und worin X=1 bis 70, insbesondere 5 bis 30 betragen kann, zu wasserlöslichen Selbstklebe massen, insbesondere zu den vorstehend genannten oder beschriebenen Selbstklebemassen, läßt sich die Konzentrationen an funktional intakt gewinn baren Zellen weiter steigern. Die Menge an zugesetzten Alkylarylpolyetheral koholen kann beispielsweise in einem Bereich zwischen 0,001 und 25 Gew.-%, vorzugsweise 0,01 und 10 Gew.-% liegen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Klebemasse.

Alkylarylpolyetheralkohole haben die Fähigkeit, die Ablösung von Corneozyten aus dem Zellverband des Stratum corneum in Wasser, insbesondere in phos phatgepufferter Lösung, zu begünstigen. Die Corneozytenverbindungen wer den dabei untereinander gelöst, ohne daß dabei Moleküle aus der Corneo zytenoberfläche herausgelöst werden, wie es bei Zusatz anderer Verbindungen oder Detergenzien wie z. B. organischen Lösungsmittel der Fall wäre. Alkylaryl polyetheralkohole verhindern weiterhin die unspezifische Bindung der Corneo zyten an die Gefäßwand von z. B. Glas- oder Kunststoffgefäßen.

Durch Zusatz dieser Verbindungen zu der Klebemasse wird des weiteren das zerstörungsfreie Herauslösen der gewonnenen Zellen aus der Klebemasse begünstigt.

Gleiche günstige Eigenschaften wie die Alkylarylpolyetheralkohole zeigen ethoxylierte Alkylmono- oder -diamine.

Bevorzugt werden ethoxylierte Cocosfettsäureamine, z. B. solche der Ethome en^R-C-Reihe (Hersteller Akzo). Ethomeen C-25^R wird besonders bevorzugt.

Bevorzugt werden Cocosfettsäureamine mit einem Ethylenoxidgehalt von 2-50, insbesondere 10-20, ganz besonders bevorzugt 15, Mol Ethylenoxid pro Mol Fettsäureamin. Diese Produkte sind in der Literatur beschrieben. Die Men ge an eingesetzten ethoxylierten Alkylmono- oder -diaminen ergibt sich z. B. aus dem Aufbau der in DE-A-43 30 362 verwendeten Klebemassen und kann beispielsweise in einem Bereich zwischen 10 und 90 Gew.-%, vorzugsweise 30 und 70 Gew.-% liegen, bezogen auf das Gesamtgewicht der Klebemasse. Es hat sich des weiteren gezeigt, daß mit silikonfreien Klebebändern höhere Zellzahlen bei der Isolierung funktional intakter Zellen erreicht werden können, als mit silikonhaltigen Produkten, was jedoch deren prinzipielle Eignung für die oben angegebene Verwendung nicht weiter einschränkt. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Selbstklebemasssen, Träger und Releasebeschichtungen silikonfrei. Silikonfreie Produkte hergestellt gemäß DE-A-43 30 362 sind daher bevorzugt.

Die bevorzugten Klebebänder der DE-A-43 30 362 sind durch die folgenden Trägermaterialien, Selbstklebemassen und Release-Systeme gekennzeichnet.

Träger

Als Trägermaterialien kommen hochgeleimte Papiere in Betracht. Es können Papiere mit unterschiedlichen Flächengewichten eingesetzt werden, wobei Flächengewichte zwischen 50 und 100 g/m² zu bevorzugen sind. Die nach dem Clupak-Verfahren hergestellten Papiere entsprechen voll den gewünschten Anforderungen, da sie anschmiegsamer als imprägnierte Papiere sind.

Selbstklebemassen

Als Selbstklebemassen können, wie schon genannt, vorzugsweise die in DE-A-43 30 362 aufgeführten und auch übliche repulpierbare Systeme verwendet werden, wie z. B. in DE 23 60 441 A1, DE 31 05 894 C2, oder DE 33 18 600 A1 beschrieben.

Diese Klebemassen bestehen insbesondere aus bestimmten Gerüstpolymeren, basierend auf Acrylsäure und anderen Comonomeren, und aus einem zum Teil erheblichen Anteil an Weichmachern bzw. Harzen. Der Weichmacher- bzw. Harzzusatz führt dazu, daß die häufig nicht oder nur schwachklebende Ge rüstpolymeren adhäsive Eigenschaften erlangen.

Bevorzugt werden solche Massen mit einem polaren Charakter.

Erfolgt bei der Herstellung von Rollenware ein Kontakt zwischen der Klebmasse und der Trägerrückseite, so führt dieser Kontakt ohne Verwendung eines Releasesystems zu einem unerwünschten Verkleben.

Für repulpierbare Selbstklebemassen, die meist polarer Natur sind, werden üblicherweise silikonhaltige Systeme als Trennmittel verwendet. Die bekannten silikonfreien Trennmittel versagen häufig in Verbindung mit polaren wasser löslichen Klebemassen. DE-A-43 30 362 schließt diese Lücke. In vielen Anwen dungsfällen für Haftklebebänder ist eine definierte Restadhäsion zwischen der Klebemasse und dem Releasesystem erwünscht. Durch Variation der Weich machersysteme und der Verhältnisse der Releasebestandteile können die Ab rollkräfte beeinflußt werden.

Releasesysteme

Setzt man gemäß DE 28 45 541 Copolymere aus Amid/Styrol, insbesondere Maleinsäure-mono-(N-stearyl)-amid und Styrol im Gemisch mit Filmbildnern, insbesondere Polyvinylalkoholen mit unterschiedlichem Molekulargewicht und Verseifungsgrad ein, so erhält man Trennsysteme, die in Kombination mit übli chen wasserlöslichen Klebemassen mit polarem Charakter sich als voll funkti onstüchtig erweisen und die des weiteren hervorragend bedruckbar und repul pierbar sind. Der Polyvinylalkohol dient hierbei als Filmbildner und verhindert des weiteren ein zu starkes Eindringen des Releasesystems in das häufig saugfähige Trägermaterial.

Als Filmbildner können Polyvinylalkohole mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis 400.000, bevorzugt 2000 bis 150.000 eingesetzt werden. Releasesy steme mit Polyvinylalkoholen niedrigen Molekulargewichtes neigen stärker zu einem Eindringen in ein saugfähiges Trägermaterial als höhermolekulare Vari anten. Mischungen von Polyvinylalkoholen unterschiedlichen Molekulargewich tes können ebenfalls erfolgreich eingesetzt werden. Der Verseifungsgrad der verwendeten Polyvinylalkohole ist variabel.

In Abhängigkeit von der verwendeten Klebemasse kann der Gehalt an Poly vinylalkohol bei Kombinationen mit den genannten Copolymeren, insbesondere denen aus Maleinsäure-mono-(N-stearyl)-amid und Styrol in einem Bereich zwischen 5 und 95% bezogen auf den Feststoffgehalt variieren, bevorzugt zwischen 25 und 65%.

Der Masseauftrag des Releasesystems liegt insbesondere in einem Bereich zwischen 0,5 und 15 g, bevorzugt in einem Bereich zwischen 2 g und 6 g pro m².

Alle Mengenangaben, Prozentangaben oder Teile beziehen sich, soweit nicht anders angegeben, auf das Gewicht, insbesondere auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen oder der jeweiligen Mischung.

Im folgenden soll die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne diese aber dadurch einschränken zu wollen.

Beispiel 1 Methode zur Corneozytengewinnung

Auf die Unterarminnenseite des Probanden wird ein 15 cm langer Klebefilm streifen (tesa 51441) aufgeklebt und zwanzigmal mit einer 1 kg schweren Metallwalze überrollt. Nach dem vorsichtigen Abziehen des Kle befilms von der Haut werden Klebefilmplättchen mit einer Fläche von 4,16 cm² ausgestanzt. Die Corneozytenstrips werden mit der Klebemassenseite nach unten auf 3 ml Phosphat-gepufferte Lösung (0,15 M, PBS, pH 7,5) in eine Zell kulturschale (Corning Ltd., New York) gelegt und 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT) auf dem Schüttler (IKA-Schüttler MTS4) inkubiert. Hierbei wird die Klebe masse mit den anhaftenden Zellen gelöst und die Corneozyten werden freige geben. Die vom Klebefilm abgelösten Zellen werden mit einer Eppendorfpipette in 1,5 ml Eppendorfgefäße überführt, 10 min. bei 12.000 g und RT zentrifugiert. Anschließend wird der Überstand mit den Resten der Klebemasse verworfen und zum Waschen werden die Zellen in 500 µl PBS resuspendiert und noch mals 10 min. bei 12.000 g zentrifugiert (Eppendorf-Centrifuge 5415C). Die se dimentierten Corneozyten werden in 50 µl PBS-Lösung aufgenommen. Die An zahl der gewonnenen Zellen wird in der Neubauerkammer bestimmt.

Die Gewinnung der Hautzellen mit wasserlöslichen Klebemassen ermöglicht morphologische Untersuchungen einzelner Zellen im Transmissions elektronenmikroskop (TEM, SEM), im "Atomic Force Microscope" und im Lichtmikroskop. Mit Hilfe dieser mikroskopischen Untersuchungen konnte die Struktur der Bakterienkapsel, Zellfortsätze sowie Auflagerungen (z. B. aus Po lysacchariden) analysiert werden. Außerdem wurde ein Strukturvergleich der Hautzellen von Probanden mit normal, gesunder Haut zu kranker Haut durch geführt.

Vergleich der Corneozytengewinnung mit verschiedenen Klebemassen

Im folgenden Beispiel wurde untersucht welche Klebemasse für die Gewinnung von möglichst vielen Zellen des Stratum corneum gut geeignet ist.

Material

Klebemassen A-D allein oder auf Trägermaterial, Human-Corneozyten des Unterarmes, Kunststoffzylinder (22 mm Durchmesser), Teflonspatel, Petrischa lenplatte mit 6 Vertiefungen (Corning Ltd.), Metallstanze, IKA-Schüttler MTS4, Brutschrank (Heraeus), Eppendorf-Centrifuge 5415C (Eppendorf Gerätebau), Lichtmikroskop (Leitz Dialux 20), Neubauerkammer (Brand), Coulter Epics Profile II (Coulter Electronics GmbH), Propidium-Iodid (Sigma), Natriumcitratlö sung (1,12%) in Aqua dest., Blut-Agar-Basis (Oxoid), 1,5 M phosphatgepufferte Lösung (PBS) pH 7,5 1150 mOsm (ohne Calcium u. ohne Magnesium).

a) Corneozytengewinnung und Bestimmung der Zellzahl

(Wie beschrieben).

Legende

Versuch zur Hautzell-Gewinnung mit verschiedenen Klebemassen auf unterschiedli chem Trägermaterial. Die Graphik zeigt die Zellzahl pro 4,16 cm², welche mit ver schiedenen Klebemassen gewonnenen wurde. (A-D) getestete Klebemassen die sich hinsichtlich ihrer Zusammensetzung (unterschiedliche Polymere, verschiedene Lö sungsmittel und Farbstoffzusätze) unterschieden. Der Versuch wurde fünfmal (n=5) wiederholt und der Medianwert dargestellt.

Die Graphik zeigt, daß mit einer gemäß dieser Erfindung aufgebauten Klebe masse (Selbstklebemasse D entsprechend Beispiel 2 oder 3) deutlich mehr Zellen isoliert werden konnten, als mit den anderen erfindungsgemäßen Pro dukten.

Methode zur Bestimmung der Adhäsionseigenschaften von Staph. epi dermidis-Bakterien an Corneozyten

Durch die beschriebene Methode der Hautzellgewinnung ist es möglich die Adhäsion von Mikroorganismen an die zuvor isolierten Hautzellen quantitativ zu bestimmen, sowie Untersuchungen zur Bindungsspezifität an die Hautzellen in Hemmversuchen durchzuführen. Die Quantifizierung soll im folgendem am Beispiel von Staphylococcus epidermidis an Human-Cor neozyten dargestellt werden.

Methode a) Anzucht der Bakterien

Die Staph. epidermidis-Bakterien werden auf einer Agar Platte ausgestrichen und über Nacht (ÜN) bei 37°C im Brutschrank (Heraeus B5060E) inkubiert. Die angewachsenen Kolonien werden mit 2 ml PBS abgespült und in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Anschließend wird die Bakterienkonzentration mit Hilfe der Neubauerkammer (Blaubrandt) auf eine Konzentration von 5×10⁸ Bakterien pro ml eingestellt.

b) Färbung der Bakterien

1 ml der Bakteriensuspension wird 6 min. bei 2.000 g zentrifugiert (Eppendorf-Cen trifuge 5415C) und der Niederschlag in 100 µl 70%igem Ethanol/Aqua dem. resuspendiert und für 30 min. bei 4°C zum fixieren der Bakterien inku biert. Die sedimentierten Bakterien werden dann in 100 µl Propidium-Iodid-Lö sung (50 µg Propidium Iodid (Fa. Sigma)/ml Natriumcitrat 1,12%) aufge nommen und 30 min. bei RT inkubiert. Dann werden die gefärbten Bakterien dreimal mit jeweils 100 µl PBS pH 7,5 gewaschen und anschließend in 400 µl PBS pH 7,5 resuspendiert.

c) Corneozytengewinnung

(Wie beschrieben).

d) Inkubation von Corneozyten und Bakterien

Die Corneozyten werden 10 min. bei 12.000 g zentrifugiert (Eppendorf-Cen trifuge 5415C) und der Überstand wird verworfen. Die sedimentierten Bakterien werden in 100 µl PBS resuspendiert, auf die Corneozyten pipettiert, gut gemischt und 2 Stunden bei RT im Dunkeln unter ständigem Schwenken inkubiert. Für die Hemmversuche wurden die vermutlich anti-adhäsiv wirkenden Testsubstanzen in einer Konzentration von 1% (w/v) zugegeben.

e) Isolierung der Corneozyten mit adhärierten Bakterien

Die Corneozyten/Bakteriensuspension wird auf einen Ficoll-400 Stufen gradienten (2 ml 5%ige und 2 ml 2%ige Ficoll 400-Lösung) pipettiert, 10 min. bei 2.000 g und 4°C zentrifugiert (Megafuge 1.0R, Heraeus) und anschließend wird der Überstand abpipettiert. Die sedimentierten Corneozyten mit adhärier ten Bakterien wurden zum Messen in 150 µl Abspülpuffer resuspendiert.

f) Fluoreszenzmessung

Messen der Corneozyten mit an die Oberfläche adhärierten und fluoreszenz gefärbten Bakterien im Durchflußzytometer (FACS-Calibur, Becton Dickonson).

g) Auswertung

Legende

Hemmversuche mit Alkylpyranosiden. Hemmwirkung (%) der Alkylglucopyranoside α-Octylglucopyranosid (a), β-Octylglucopyranosid (b), β-Nonylglucopyranosid (c), N-Decylglucopyranosid (d), β-Undecylglucopyranosid (e), β-Dodecylglucopyranosid (f), Dodecyl-β-D-Maltosid (g). Für die Kontrolle (K) wurden die Bakterien ohne Inhibitor inkubiert. Die Konzentration der Testsubstanzen betrug jeweils 1% (w/v). Der Ver such wurde (n=3) durchgeführt.

Mittels der in der Erfindung beschriebenen Gewinnungsmethode für Zellen, konnte hier die Hemmung der Adhäsion von Staphylococcus epidermidis an Human-Corneozyten durch eine Auswahl an Alkylpyranosen bestimmt werden. Die Adhäsion von Staphylococcus epidermidis an Hautzellen konnte durch 13-Undecylglucopyranosid und 13-Dodecylglucopyranosid im Vergleich zur Kontrol le (100%) auf 14 bzw. 15% gehemmt werden. Außerdem konnte in den Hemmversuchen die Abhängigkeit der Anti-Adhäsiven Wirkung von der Koh lenstoffkettenlänge der Alkylpyranoside gezeigt werden. Die Hemmversuche geben anhand der gemessenen Reduktion der Bakterienadhäsion Hinweise auf die Molekülstrukturen, welche zur Vermittlung der Adhäsion an Hautzellen auf den Zelloberflächen wichtig sind.

Beispiel 2 Herstellung geeigneter Klebebänder analog DE-A-43 30 362 Lackierung

In einem 20 l fassenden Gefäß werden 6,5 kg einer 30%igen wäßrigen Dis persion eines Copolymeren aus Maleinsäure-mono-(N-stearyl)-amid und Styrol gemäß DE 28 45 541 und 3,5 kg einer 30%igen wäßrigen Lösung aus Polyviol V03.140 (Polyvinylalkohol der Firma Wacker, Pn » 300) sorgfältig homogeni siert. Die so erhaltene silikonfreie voll repulpierbare Trennschicht wird im Voll strich kontinuierlich mit einer Schichtdicke von etwa 3-5 g/m² auf einen hochgeleimten nach dem Clupak-Verfahren hergestellen Papierträger (Wisaforest, ungebleicht, Trägergewicht 65 g/m²) aufgetragen.

Um einer Verwellung des Trägermaterials entgegenzuwirken, wird die nicht lackierte Seite vor der Beschichtung mit Wasser durch mehrere nebeneinander liegende Düsen (etwa 0,5 l/h, bezogen auf eine Düse) befeuchtet.

Technische Bedingungen

Maschinendaten: Kanalbeschichtungsmaschine mit Gummituchrakel
Rakelmesser: 4 mm
Trägerbahngeschwindigkeit: 50 m/min.

Das mit dem Trennlack beschichtete Trägermaterial wird anschließend ther misch in 10 unterschiedlichen Trockenkanälen getrocknet.
(Trockentemperatur: 2×100°C, 2×120°C, 2×140°C, 4×160°C).

Nachstrich

Das lackierte Trägermaterial wird in einem zweiten Arbeitsgang auf der nicht lackierten Seite mit einer üblichen repulpierbaren Selbstklebemasse beschich tet, wie z. B. in DE 23 60 441, DE 33 18 600 oder DE 31 05 894 beschrieben. Hierzu werden in einem 20 l fassenden Gefäß 5,99 kg eines 30%igen radika lisch polymerisierten Gerüstpolymeren aus 47% Acrylsäure, 48% Butylacrylat und 5% Vinylcaprolactam in Benzin/Aceton mit 3,97 kg Ethomeen C-25 (Akzo) und 0,029 kg Aluminiumchelat abgemischt. Die so hergestellte Haftklebemasse wird als 30%ige Lösung in Benzin/Aceton mit einer Schichtdicke von etwa 40-50 g/m² auf die nichtlackierte Seite des Trägermaterials aufgetragen.

Technische Bedingungen

Maschinendaten: Hängebeschichtungsanlage
Streicheinstellung: 183 Skt.
Trägerbahngeschwindigkeit: 50 m/min.

Die Klebmasse wird anschließend thermisch in 4 unterschiedlichen Trockenka nälen getrocknet und vernetzt.
(Trockentemperatur: Vorkanal 50°C, Zone 1 70°C, Zone 2 80°C Zone 3 90°C, Zone 4 90°C.

Man erhält so ein Produkt, das sich z. B. in einer für ein Verpackungsband ge wünschten Art und Weise einwandfrei zur Rolle wickeln und auch von dieser wieder abrollen läßt.

Das erhaltene Produkt erweist sich nach der Prüfmethode Tappi UM 213 A als voll repulpierbar.

Beispiel 3 Herstellung geeigneter Klebebänder analog DE-A-43 30 362 Lackierung

In einem 20 l fassenden Gefäß werden 7,5 kg einer 30%igen wäßrigen Disper sion eines Copolymeren aus Maleinsäure-mono-(N-stearyl)-amid und Styrol ge mäß DE 28 45 541 und 3,75 kg einer 20%igen wäßrigen Lösung aus Mowiol 18-88 (Polyvinylalkohol der Firma Hoechst, Pn » 2700) sorgfältig gemischt. Die so erhaltene silikonfreie voll repulpierbare Trennschicht wird im Vollstrich kon tinuierlich mit einer Schichtdicke von etwa 4 g/m² auf einen hochgeleimten nach dem Clupak-Verfahren hergestellten Papierträger (Wisaforest, gebleicht, Trägergewicht 85 g/m²) aufgetragen.

Um einer Verwellung des Trägermaterials entgegenzuwirken, wird die nicht lackierte Seite von der Beschichtung mit Wasser durch mehrere nebeneinan der liegende Düsen (etwa 0,5 l/h, bezogen auf eine Düse), befeuchtet.

Technische Bedingungen

Maschinendaten: Zylinderbeschichtungsmaschine
Rakelmesser: 3 mm
Trägerbahngeschwindigkeit: 25 m/min.

Das mit dem Trennlack beschichtete Trägermaterial wird mittels eines auf 100°C temperierten Zylinders (Durchmesser 2,5 m) getrocknet.

Nachstrich

Das Trägermaterial wird in einem zweiten Arbeitsgang auf der nicht lackierten Seite mit einer repulpierbaren Selbstklebemasse beschichtet. Hierzu werden in einem 20 l fassenden Gefäß 5,99 kg eines 30%igen radikalisch polymerisierten Gerüstpolymeren aus 47% Acrylsäure, 48% Butylacrylat und 5% Vinyl caprolactam in Benzin/Aceton mit 3,97 kg Ethomeen C-25 (Akzo) und 0,029 kg Aluminiumchelat abgemischt. Die so hergestellte Haftklebemasse wird als 35%ige Lösung in Benzin/Aceton mit einer Schichtdicke von etwa 40 g/m² auf die nichtlackierte Seite des Trägermaterials aufgetragen.

Technische Bedingungen

Maschinendaten: Hängebeschichtungsanlage
Streicheinstellung: 183 Skt
Trägerbahngeschwindigkeit: 40 m/min.

Die Klebemasse wird anschließend thermisch in 4 unterschiedlichen Trocken kanälen getrocknet und vernetzt.
Trockentemperaturen: Vorkanal 50°C, Zone 1 70°C, Zone 2 80°C, Zone 3 90°C, Zone 4 90°C.

Claims

1. Verwendung einer wasserlöslichen Selbstklebemasse, insbesondere zum Aufnehmen von Proben, insbesondere Zellen, von Oberflächen, insbesondere Körperoberflächen, wobei die Selbstklebemasse gegebenenfalls auf einem Träger aufgebracht ist.

2. Verfahren zur in vitro Untersuchung intakter Proben oder Zellen, das da durch gekennzeichnet ist, daß unter Verwendung wasserlöslicher Selbst klebemassen, die gegebenenfalls auf einen Träger aufgebracht sind, Proben oder Zellproben genommen werden und diese durch anschließendes Auflösen der Selbstklebemasse in Wasser freigegeben und gegebenenfalls isoliert wer den.

3. Verwendung oder Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß Klebebänder mit repulpierbaren Eigenschaften gewählt werden.

4. Verwendung oder Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die wasserlösliche Selbstklebemasse einen Alkylaryl polyetheralkohol und/oder ein ethoxyliertes Alkylmonoamin oder ethoxyliertes Alkyldiamin enthält.

5. Verwendung oder Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Selbstklebemasse auf einen Träger, insbesondere auf einen Papierträger oder einen Polymerfilm aufgebracht ist.

6. Verwendung oder Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß Selbstklebemassen, Träger und Releasebeschichtungen silikon frei sind.

7. Verwendung oder Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß Hautproben, Hautzellen oder darauf befindliche Proben von der Hautoberfläche aufgenommen werden.

8. Verwendung oder Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß Zellen des Stratum corneum von der Hautoberfläche genommen werden und die Zellen gegebenenfalls zur quantitativen Bestimmung der Ad häsion von Mikroorganismen an Human-Corneozyten verwendet werden.

9. Verfahren zur in vitro-Untersuchung intakter Proben oder Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß unter Verwendung wasserlöslicher Selbstklebemassen, die gegebenenfalls auf einem Träger angebracht sind, Proben oder Zellproben wie z. B. Dermatophyten genommen werden und diese durch anschließendes Auflösen der Selbstklebemassen in Wasser freigegeben und gegebenenfalls isoliert werden.