DE19717893A1

DE19717893A1 - Monofunktionelle Glycosyltransferasen

Info

Publication number: DE19717893A1
Application number: DE1997117893
Authority: DE
Inventors: Regine Dr Hakenbeck; Johanna Paik
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1997-04-28
Publication date: 1999-01-14

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine monofunktionelle Glycosyltransferase, eine dafür kodierende DNA und ein Verfahren zur Herstellung dieser. Ferner betrifft die Erfindung gegen das Protein gerichtete Antikörper sowie die Ver wendung des Proteins oder der DNA.

Glycosyltransferasen, die essentielle Schritte der bakteriellen Mureinbiosynthese katalysieren, kommen in den hochmolekularen Penicillin-bindenden Proteinen der Klasse A vor. Da Substanzen bekannt sind, die die Aktivität der Glycosyltrans ferasen inhibieren und antimikrobielle Wirkung zeigen, wird angenommen, daß die Glycosyltransferasen geeignete Targetproteine für neue Antibiotika und Chemotherapeutika darstellen. Das Problem besteht aber in der Darstellung dieses Enzyms in einer Form, die es einem Screening zugänglich macht.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb in der Bereitstellung einer neuen Glycosyltransferase, insbesondere in löslicher Form.

Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine monofunktionelle Glycosyl transferase, wobei diese die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz umfaßt.

Vom Anmelder wurde aus Ralstonia eutropha (früher: Alcaligenes eutrophus) ein Protein isoliert, das eine monofunktionelle Glycosyltransferase darstellt. Dieses Protein umfaßt die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unterschiedliche Aminosäuresequenz. Ferner hat der Anmelder erkannt, daß die Homologie dieses Proteins zu anderen verwandten Proteinen und Domänen dieser Klasse so hoch ist, daß es als Modellprotein gewertet werden kann. Durch Sequenzvergleiche ist es nunmehr möglich, die entsprechenden Domänen von penicillin-bindenden Proteinen zu definieren und mittels eines geeigneten Expressionssystems, davon lösliche Derivate herzustel len.

In der vorliegenden Erfindung wird vorstehendes Protein mit Mgt ("Monofunctio nale Glycosyltransferase) bezeichnet.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine für Mgt kodierende Nukleinsäure. Dies kann eine RNA oder eine DNA sein. Letztere kann z. B. eine genomische DNA oder eine cDNA sein. Bevorzugt ist eine DNA, die folgendes umfaßt:

(a) die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Basenpaare unterschiedliche DNA,
(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA, oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten genetischen Code verwandte DNA.

Der Ausdruck "hybridisierende DNA" weist auf eine DNA hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der DNA, mit einer DNA von (a) hybridisert.

Die DNA von Fig. 1 wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorgan ismen und Zellkulturen GmbH) als E. coli SG13009 pEM12-7 unter DSM 11519 am 22. April 1997 hinterlegt.

Nachstehend wird eine erfindungsgemäße DNA in Form einer cDNA beschrieben.

Diese steht beispielhaft für jede unter die vorliegende Erfindung fallende DNA.

Eine erfindungsgemäße cDNA kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Günstig ist es von einer bakteriellen Expressions-Bibliothek auszugehen und diese mit der DNA von Fig. 1, insbesondere mit Primern, die den Bereich der unterstrichenen DNA-Region betreffen, zu screenen. Als Hybridisierungs-Bedin gungen können übliche, insbesondere vorstehend angegebene, gewählt werden. Positive Klone können dann auf ihre Glycosyltransferase-Aktivität in üblichen Verfahren getestet werden.

Eine erfindungsgemäße cDNA kann in einem Vektor bzw. Expressionsvektor vorliegen. Beispiele solcher sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Ex pressionsvektors für E.coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate, pGEX-2T, pET3b, pQE-8 und pQE-12. Für die Expression in Hefe sind z. B. pY100 und Ycpad1 zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z. B. pKCR, pEFBOS, cDMB und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in Insektenzel len eignet sich besonders der Baculovirus-Expressionsvektor pAcSGHisNT-A.

Der Fachmann kennt geeignete Zellen, um eine erfindungsgemäße, in einem Expressionsvektor vorliegende cDNA zu exprimieren. Beispiele solcher Zellen umfassen die E.coli-Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, TB1 und SG 13009, den Hefe-Stamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero und HeLa sowie die Insektenzellen sf9.

Der Fachmann weiß, in welcher Weise eine erfindungsgemäße cDNA in einen Expressionsvektor inseriert werden muß. Ihm ist auch bekannt, daß diese DNA in Verbindung mit einer für ein anderes Protein bzw. Peptid kodierenden DNA inseriert werden kann, so daß die erfindungsgemäße cDNA in Form eines Fu sionsproteins, z. B. als His-Tag-Protein, exprimiert werden kann.

Des weiteren kennt der Fachmann Bedingungen, transformierte bzw. trans fizierte Zellen zu kultivieren. Auch sind ihm Verfahren bekannt, das durch die erfindungsgemäße cDNA exprimierte Protein zu isolieren und zu reinigen. Ein solches Protein, das auch ein Fusionsprotein sein kann, ist somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Von den Erfindern wurde gefunden, daß es besonders vorteilhaft ist, wenn man die erfindungsgemäße monofunktionelle Glycosyltransferase als Fusion mit einem Maltose-bindenden Protein in einem E. coli Expressionssystem exprimiert. Dabei hat es sich herausgestellt, daß, wenn die Expression bei einer niedrigen Temperatur induziert wird und die Zellen bei dieser Temperatur kultiviert werden, die monofunktionelle Glycosyltransferase in löslicher Form erhalten werden kann. Unter einer niedrigen Temperatur soll erfindungsgemäß eine Temperatur zwi schen 25 und 35°C, insbesondere 28 bis 30°C, verstanden werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein gegen ein vorstehen des Protein bzw. Fusionsprotein gerichteter Antikörper. Ein solcher Antikörper kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Er kann polyklonal bzw. monoklonal sein. Zu seiner Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklona len Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragment davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fu sions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten wurden. Für den monoklona len Antikörper werden Milzzellen der Tiere mit Myelomzellen fusioniert.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, auch in anderen penicillin-bindenden Proteinen entsprechende Domänen zu definieren und identifizieren.

Die vorliegende Erfindung stellt somit einen großen Beitrag zur Identifizierung geeigneter Targetproteine für neue Antibiotika und Chemotherapeutika dar.

Kurze Beschreibung der Figuren:

Fig. 1 zeigt die Basensequenz und die davon abgeleitete Aminosäurese quenz, die von einem erfindungsgemäßen Mtg-Gen aus Ralstonia eutropha umfaßt ist. Das 5'-Ende stellt ORF6 dar. Das hydrophobe N-terminale Peptid ist unterstrichen.

Fig. 2 zeigt die Konstruktion des MBP-Mgt-Fusionsproteins
Die umrandete Sequenz gibt die R. eutropha Mgt-Sequenz, die für die Aminosäuren 31-231 kodiert.
MBP: Maltose-bindendes Protein.

Fig. 3 zeigt die Expression der erfindungsgemäßen Mgt in E. coli. Exponentiell wachsende Zellen, die das Plasmid pPEC12 enthalten, wurden mit IPTG (2 mM) bei OD₆₀₀ = 0,7-0,8 behandelt und die Zellen nach 3 Stunden geerntet. Die Zellen wurden durch Ultrabe schallen lysiert, das zelluläre Gesamtprotein auf SDS-Polyacrylamid gelen abgetrennt und mit Coomassieblau angefärbt.

1 und 2: E. coli pPEC12
3: Kontrollzellen, die das Plasmid ohne Mgt-Insert enthal te
M: Molekulargewichtsmarker.

Der Pfeil zeigt die Position des Mgt-Derivats an.

Fig. 4 zeigt ein lösliches Mgt-Derivat
Die Überexpression des Fusionsproteins aus Maltose-bindendem Protein (MBP) und Mgt wurde in E. coli TB1, das das entsprechen de Plasmid pMPE enthielt, bei 28°C induziert. Das MBP-Mgt-Fu sionsprotein wurde durch Affinitätschromatographie gereinigt und mit Faktor Xa, wie nachstehend in Beispiel 3 beschrieben, behan delt. Mgt konnte nach der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese durch Western Blot und Immunanfärbung (Immunstaining) mit spezifischem Antiserum nachgewiesen werden. Es wurden 50 µg Fusionsprotein und 1 µg Faktor Xa verwendet. Die aufgetragenen Proben entsprachen ca. 12 µg. Die Inkubationszeiten waren:

(1) 0 Minuten
(2) 6 Stunden
(3) 12 Stunden
(4) 24 Stunden.

Fig. 5 zeigt das Vorhandensein von Mgt in R. eutropha
Zellen von R. eutropha wurden unter aeroben Bedingungen bis zu einer OD₄₃₆ = 10 wachsengelassen und dann zu Bedingungen eingeschränkter Sauerstoffzufuhr übergewechselt. Solubilisierte cytoplasmatische Membranproteine wurden verwendet (Spuren 5 und 7, Membranen; Spuren 6 und 8, lösliche Proteine). Weiter wur den Lysate ganzer Zellen von E. coli mit pPEM8 (exprimierend membrangebundenes Mgt) verwendet:

Spur 1: E. coli SG13009 mit Plasmid pQE8 ohne Insert
Spuren 2-4 Zellysate von E. coli/pPEM8 (Spur 3 : 1 : 20 der Menge von Spur 2; Spur 4 : 1 : 100 der Menge von Spur 2)
M Molekulargewichtsmarker

Die Pfeile an der linken Seite zeigen die Position von Mgt-His

(A): Coomassie-Blau gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel
(B): Immunoblot von (A) mit spezifischen Mgt-Antikörpern.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 Herstellung und Reinigung eines erfindungsgemäßen Mgt-Proteins

Zur Überexpression des Mgt-Proteins in E. coli wurde entweder das gesamte Gen oder ein kleineres lösliches Derivat, bei dem der hydrophobe N-terminale Teil deletiert worden war, in das pQE-Vektorsystem kloniert. (Die pQE-Derivate sowie der E. coli-Stamm SG13009, der das Repressorplasmid pREP4 enthielt, wurden von der Firma Qiagen (Hilden) erhalten.)

Die Mgt-Sequenzen wurden mittels PCR unter Verwendung folgender Oligonu kleotidprimer erhalten:

zur Amplifizierung des gesamten Mgt-Gens:

a) CGGGATCCA3628AAAGACTCTGGTCCGCCTTC3648 und
b) CCCAAG4322CTTACCTCAGCCTCAACGGCTCCA4297;
zur Amplifizierung eines Derivats, in dem die Aminosäuren Met 1 bis Ala 30 deletiert worden waren:
c) CGGGATC3713CAACCGGCAGCTGCCGTCGCTC3735 und
(b) wie oben.

Die Oligonukleotide waren so gewählt, daß BamHI bzw. HindIII-Schnittstellen an den Enden der PCR-Produkte erzeugt wurden, welche verwendet wurden, um die DNA-Fragmente in pQE8 (was zu einem Fusionsprotein mit einem N-termina len His-Tag führte) oder in pQE12 (ohne His-Tag) zu klonieren. Die PCRs wurden in einem Biomed Thermocycler für 30 Zyklen (Denaturierung: 30 Sek. 96°C; Annealing: 1 Min. 52°C; Extension: 1 Min. 72°C gefolgt von 5 Min. Extensions zeit bei 72°C) durchgeführt. Ein 100 µl Reaktionsgemisch enthielt 10 pmol jedes Oligonukleotidprimers, 0,8 mM Desoxynukleosidtriphosphate, 5-6 mM MgCl₂, 2,5 U Taq-Polymerase und Puffer gemäß Herstellerangabe. Die Plasmide, die die membrangebundenen Proteine enthielten, wurden pPEM8 bzw. pPEM12 genannt und solche, die die cytoplasmatischen Derivate enthielten, wurden pPEC8 bzw. pPEC12 genannt. Diese Plasmide wurden zur Transformation von E.coli SG 13009 (vgl. Gottesmann, S. et al., J. Bacteriol. 148, (1981), 265-273) ver wendet. Die Bakterien werden in einem LB-Medium mit 10 µg/ml Ampicillin und 25 µg/ml Kanamycin kultiviert und 4 h mit 60 µM Isopropyl-β-D-Thiogalacto pyranosid (IPTG) induziert. Bei der Induktion der Expression durch IPTG zeigte sich, daß die vermeintlich membran-assoziierten Proteine in ihrem Wachstum sofort stoppten, während solche, die das vermeintlich lösliche Derivat im Cyto plasma exprimierten, noch mindestens 1,5 Stunden weiter wuchsen. Während das cytoplasmatische Protein in einem hohen Maß als Einschlußkörper über exprimiert wurde, war das intakte Protein mit dem Membranteil assoziiert, was die Rolle des hydrophoben N-terminalen Peptids als Membrananker bestätigte.

Die das Mgt-Protein exprimierenden E. coli Zellen wurden mittels Ultraschall lysiert, das daraus freiwerdende Gesamtprotein auf einem 15% Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Coomassie-Blau angefärbt (vgl. Thomas, J.O. und Kornberg, R.D., J. Mol. Biol. 149 (1975), S. 709-733). In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 3 verwiesen, wo die Expression von Mgt in E. coli nachgewiesen wurde.

Beispiel 2 Herstellung und Nachweis eines erfindungsgemäßen Antikörpers

Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiels 1 wird einer 15% SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wird eine ca. 23 kD Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Gel-Stücke werden sedimentiert, bevor die Proteinkonzentration des Überstandes durch eine SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, der eine Coomassie-Blau-Färbung folgt, bestimmt wird. Mit dem Gel-gereinigten Fusionsportein werden Tiere wie folgt immunisiert:

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0 : 1 Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 14 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 28 : 3. Immunisierung (icFA)
Tag 56 : 4. Immunisierung (icFA)
Tag 80: Ausbluten.

Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird ein erfin dungsgemäßes Fusionsprotein von Beispiel 1 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelek trophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen), J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wird wie üblich durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter 1 h bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das herum des Kaninchens (1 : 20000 in PBS/Tween). Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Sigma Chemicals Co. St. Louis, USA) (1 : 5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Wasch schritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36 µm 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400 µM Nitroblau-tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.

Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.

Statt des Freund's Adjuvans hat sich inzwischen bewährt RIBI Adjuvant System der Firma RIBI ImmunoChem Research, Hamilton, Montana, USA einzusetzen.

Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn

Pro Immunisierung werden 40 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,8 ml PBS und 0,8 ml kompletten bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt.

Tag 0 : 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 50 : 3. Immunisierung (icFA).

Aus Eigelb werden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es werden erfindungsgemäße polyklonale Antikörper nachgewiesen.

Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus

Pro Immunisierung werden 12 µg Gel-gereinigtes Fusionsprotein in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung ist das Fusionsprotein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.

Tag 0 : 1. Immunisierung (komplettes Freund's Adjuvans)
Tag 28 : 2. Immunisierung (inkomplettes Freund's Adjuvans; icFA)
Tag 56 : 3. Immunisierung (icFA)
Tag 84 : 4. Immunisierung (PBS)
Tag 87: Fusion.

Überstände von Hybridomen werden im Western Blot getestet. Erfindungs gemäße monoklonale Antikörper werden nachgewiesen.

Beispiel 3 Herstellung eines löslichen Mgt-Derivats

Die DNA für R. eutropha Mgt, die nicht die Information für die ersten 30 Amino säuren enthielt, wurde an die DNA für Maltose-bindendes Protein (MBP) fusio niert und exprimiert (s. Fig. 2). Dazu wurde ein DNA-Segment, das für die Aminosäuren 31-231 von Mtg codiert, mit den Oligonukleotidprimern
d) A3715ACCGGCAGCTGCCGTCGCTCGACGCCCTC3745 und
c) [s. oben]
mittels PCR amplifiziert. Die Bedingungen dafür waren wie in Beispiel 1 angege ben.

Nach Ligation mit dem Plasmid pMALc2 (Maina et al., Gene 74 (1988), S. 365-373), das mit XmnI/HindIII geschnitten worden war, ergab sich das Plasmid pMPE, das in E. coli TB1 (Guan et al., Gene 67 (1987), S. 21-30) transformiert wurde. Die Proteinexpression wurde über Nacht mit 0,3 mM IPTG induziert. Wieder wurden Einschlußkörper gebildet, wenn das Protein bei 37°C induziert wurde. Überraschenderweise wurde jedoch bei einer Induktionstemperatur von 28°C das Fusionsprotein zu über 50% aus der löslichen Fraktion isoliert. In diesem Zusammenhang wurde bemerkt, daß das Zellwachstum von E. coli sofort nach Induktion des das Mgt-Fusionsprotein enthaltenden Vektors zurückging, wenn eine Temperatur von 28°C herrschte. Bei einer Temperatur von 37°C wuchsen die Zellen weiter, allerdings mit einer verringerten Generationszeit, was den Schluß nahelegt, daß die native Form der Mgt in einige zelluläre Funktionen eingreift, sogar wenn es nicht in der Membran translokalisiert ist.

Das Fusionsprotein wurde nach Aufbrechen der Zellen in einer French-Zellpresse und Abzentrifugieren des Zellysats vom Überstand unter Verwendung von Amylose-Affinitätschromatografie, wie vom Hersteller beschrieben (New England Biolabs, Schwalbach), gereinigt. Die lösliche Mgt wurde nach Inkubation des Fusionsproteins für 24 Stunden mit Faktor Xa (2% w/w) bei 4°C erhalten. In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 4 hingewiesen.

Beispiel 4 Expression von Mgt in R. eutropha

R. eutropha H16 (DSM 428; Yabuuchi et al., Microbiol. Immunol. 39 (1995), S. 897-904) wurde in einem Mineralsalzmedium (Schlegel et al., Arch. Mikrobiol. 38 (1961), S. 119-128) mit 1,5% Natriumgluconat als Kohlenstoffquelle aerob unter einem Luftzufluß von 500 ml/min. wachsen gelassen. Die Zellen wurden in einer French-Zellpresse aufgebrochen und die Membranen von der cytoplas matischen Fraktion durch Zentrifugation (60 min., 18.000 rpm, Sorvall Zen trifuge) abgetrennt. Die cytoplasmatischen Membranproteine wurden mit 2% Sarcosyl für 20 Minuten bei Raumtemperatur solubilisiert und die nichtsolubili sierten Außenmembranproteine sowie Zellwandbestandteile bei 18.000 rpm für 40 Minuten in einer Sorvall Zentrifuge sedimentiert. Die isolierte Mgt wurde auf einem Western Blot unter Verwendung von polyklonalen Mgt-Antikörpern bestimmt. Der Antikörper reagierte mit dem isolierten Membranprotein sowie mit dem rekombinanten Protein, das gemäß Beispiel 3 in E. coli exprimiert worden war. In diesem Zusammenhang wird auf Fig. 5 verwiesen. Dieses Beispiel zeigt, daß Mgt in der Tat ein Protein ist, das in R. eutropha exprimiert wird und mit der Membran von R. eutropha assoziiert ist.

Claims

1. Monofunktionelle Glycosyltransferase, die die Aminosäuresequenz von Fig. 1 oder eine hiervon durch eine oder mehrere Aminosäuren unter schiedliche Aminosäuresequenz umfaßt.

2. Glycosyltransferase nach Anspruch 1, wobei diese aus Ralstonia eutropha stammt.

3. DNA, kodierend für das Protein nach Anspruch 1 oder 2, wobei die DNA umfaßt:

(a) die DNA von Fig. 1 oder eine hiervon durch ein oder mehrere Ba senpaare unterschiedliche DNA,
(b) eine mit der DNA von (a) hybridisierende DNA oder
(c) eine mit der DNA von (a) oder (b) über den degenerierten geneti schen Code verwandte DNA.

4. Expressionsplasmid, umfassend die DNA nach Anspruch 3.

5. Transformante, enthaltend das Expressionsplasmid nach Anspruch 4.

6. Verfahren zur Expression des Proteins nach Anspruch 1 oder 2, umfas send die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 5 unter geeigne ten Bedingungen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Transformante E. coli ist und die Expression als Fusionsprotein bei Temperaturen von 25 bis 35°C erfolgt.

8. Antikörper, gerichtet gegen das Protein nach Anspruch 1 oder 2.

9. Verwendung des Proteins nach Anspruch 1 als Target für antimikrobielle Wirkstoffe.