DE19648131A1 - Verfahren zum Bestimmen einer Komponente des LDL, insbesondere des Cholesterins - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen einer Komponente des LDL, ins­ besondere des Cholesterins, in einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum oder Blutplasma.

Die Standardmethode zum Bestimmen einer Komponente des LDL (Low Density Lipo­ protein) ist die Ultrazentrifugation. Es wird zuerst das VLDL (Very Low Density Lipo­ protein) vom LDL und HDL (High Density Lipoprotein) abgetrennt, dann mit gesteigerter Zentrifugalbeschleunigung das LDL vom HDL. In dem isolierten LDL kann die Kompo­ nente unmittelbar analysiert werden.

Das Verfahren trennt scharf und ist störungsfrei. Es ist jedoch zweitaufwendig; die benötigte Apparatur ist sehr teuer.

Ferner werden verschiedene Fällungsmethoden angewandt. Die LDL-Fraktion wird z. B. durch Polyvinylsulfonat, Heparin bei saurem pH oder hochmolekulares Dextransulfat gefällt. Nach einer Inkubationszeit wird die Probe zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Beides ist sehr arbeitsintensiv. Die Menge der Komponente in dem LDL wird als Differenz zwischen der Gesamtmenge und der Menge im Fällungsüberstand gefunden, die beide analysiert werden.

Ein Fällen der beiden anderen Fraktionen, bei dem das LDL übrig bleibt und sein Gehalt an der Komponente analysiert werden kann, ist bekannt unter der Bezeichnung Immun­ präzipitation. Dieses Verfahren, bei dem Antikörper als Fällungsmittel verwendet wer­ den, ist sehr teuer.

Vorgeschlagen worden ist der gleiche Abscheidungsmechanismus auch schon als Immunadsorption in einer Säule mit einer Packung, in der die Antikörper auf eine Trä­ gerfaser aufgebracht sind. Letzteres bedeutet noch einmal eine Verteuerung. Praktiziert wird das Verfahren nicht.

Bei allen vorstehenden Verfahren außer der Ultrazentrifugation wird außerdem die Bestimmung des LDL-Cholesterins gestört, wenn höhere Gehalte an Triglyceriden vor­ liegen.

Weitere bekannte Verfahren trennen nicht zwischen LDL und VLDL. Hierzu zählt das Verfahren nach der DE-OS 30 10 400.

In dieser ist vorgeschlagen, als Adsorbens ein auf einen Träger aufgebrachtes sulfatier­ tes Polysaccharid zu verwenden. Nach dem Adsorptionsvorgang wird die Säule mit einer ersten pH-Wert-Pufferlösung (pH 6,2) gewaschen und das die erste Fraktion dar­ stellende Eluat, das den HDL-Anteil der Probe enthält, gesammelt. Anschließend wird mit einer zweiten pH-Wert-Pufferlösung (pH 6,5) der LDL- und VLDL-Anteil ausge­ waschen. In beiden Fraktionen wird die Konzentration an Cholesterin oder anderen Komponenten bestimmt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Bestimmen von Kompo­ nenten des LDL in einer Körperflüssigkeit - Cholesterin, Triglyceride, Apolipoproteine usw. - zu finden, das einfach und schnell, in hohem Maße selektiv und darüber hinaus kostengünstig ist.

Gemäß der Erfindung wird diese Aufgabe in der Weise erfüllt, daß eine Probe mit einem das LDL bindenden Adsorbens behandelt wird, das aus einer auf einen Träger aus Poly­ acrylamid-Gel geschichteten Polyacrylsäure besteht, und der Gehalt des Eluats an der Komponente analysiert wird und der Gehalt des LDL an der Komponente durch Diffe­ renzbildung mit dem gleichfalls analysierten Gesamtgehalt einer Parallelprobe an der Komponente ermittelt wird.

Benutzt wird ein solches Adsorbens zur Blutwäsche in einem extrakorporalen Kreislauf als Vorbeugung gegen Herzinfarkt. Es wird von der Fresenius AG, Werk St. Wendel, vertrieben im Rahmen eines "DALI-System" benannten Hämoadsorptionsgerätes.

Nach der Erfindung wird das LDL einfach beispielsweise im Durchlauf einer Probe des Blutplasmas durch eine das Adsorbens enthaltende Packung im wesentlichen vollstän­ dig abgetrennt - die Anlagerung an den Adsorber vollzieht sich schnell und auch aus dem Blutplasma heraus - ohne eine Mitnahme von VLDL oder HDL. Die Adsorption wird nicht gestört durch Triglyceride; das Verfahren ist sicher und zuverlässig. Der Meßbereich ist weit, er steht dem der Ultrazentrifugation nicht nach. Das Adsorbens ist kostengünstig.

Besonders vorteilhaft ist ferner die Möglichkeit, das Verfahren mit einer einfachen Vor­ richtung durchzuführen, die in einem preiswerten, alle zur Durchführung einer Bestim­ mung benötigten Teile und Mittel aufweisenden Geräte- und Reagenziensatz zur Ver­ fügung gestellt werden kann.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens ist gekennzeich­ net durch ein längliches, an beiden Enden durchströmbares, vorzugsweise leicht koni­ sches Gefäß, das mit der Packung gefüllt ist.

Das Gefäß wird nach Art einer Chromatographiesäule durchströmt.

In der Regel wird es einen die Packung haltenden, durchströmbaren Boden, vorzugs­ weise auch eine durchströmbare Decke, aufweisen, etwa in Form einer eingesetzten Fritte.

In einer ersten Variante weist das Gefäß zur Durchströmung von oben nach unten am oberen Ende einen Einfüllraum auf, und es ist mit einem Auffanggefäß baulich kombi­ niert, vorzugsweise mit einem Kragen deckelartig auf das Auffanggefäß aufsetzbar.

In einer zweiten Variante weist das Gefäß zur Durchströmung von unten nach oben am oberen Ende einen Auffangraum auf, und es ist mit einem Probegefäß derart baulich kombiniert, vorzugsweise auf das Gefäß aufsetzbar oder mit einem ringförmigen Schwimmer in das Gefäß einsetzbar, daß es einschließlich seines Auffangraumes in die Füllung des Probegefäßes taucht.

Aus dem Auffangraum kann die Flüssigkeit abpipettiert werden oder von einem auto­ matisierten Probeanalyser abgesaugt werden. Die Variante mit dem Schwimmer hat den Vorteil, eine definierte Eintauchtiefe des Gefäßes in die Körperflüssigkeit sicher­ zustellen.

In einer dritten Variante weist das Gefäß zur Durchströmung von unten nach oben, ggf. anschließend zurück, am oberen Ende einen Auffangraum auf, und es ist als eine Pipet­ tenspitze gestaltet, die an eine Kolbenhubpipette ansetzbar ist.

Diese Variante kombiniert die Adsorbtion mit einem Transportvorgang.

Nach einer Weiterbildung der Erfindung ist die Vorrichtung mit einem trockenchemi­ schen Träger, insbesondere zur Bestimmung des Cholesterins, kombiniert derart, daß die Probe nach Durchströmen der Packung auf den trockenchemischen Träger gelangt.

Es kann auch ein trockenchemischer Träger unmittelbar mit dem Adsorbens kombiniert werden derart, daß die Probe nach Durchwandern eines mit dem Adsorbens imprägnierten Abschnitts in einen die Reaktionszone bildenden Abschnitt des Trägers gelangt.

Weitere Maßnahmen, die zur vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung dienen können, sind in der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen angeführt.

Die Zeichnungen geben die Ausführungsbeispiele wieder jeweils in einem axialen Schnitt.

Fig. 1 zeigt ein Gefäß mit einer Packung,

Fig. 2 zeigt ein weiteres Gefäß mit einer Packung,

Fig. 3 zeigt das Gefäß nach Fig. 2 eingesetzt in ein Probegefäß,

Fig. 4 zeigt ein weiteres Gefäß mit einer Packung,

Fig. 5 zeigt das Gefäß nach Fig. 4 eingesetzt in ein Probegefäß,

Fig. 6 zeigt ein weiteres Gefäß mit einer Packung,

Fig. 7 zeigt das Gefäß nach Fig. 6 eingesetzt in ein Auffanggefäß,

Fig. 8 zeigt eine Pipettenspitze mit einer Packung,

Fig. 9 zeigt ein abnehmbares oberes Teil der Pipettenspitze für sich und

Fig. 10 zeigt die Korrelation erfindungsgemäß erhaltener Ergebnisse mit durch Ultra­ zentrifugation erhaltenen Ergebnissen.

Das Gefäß nach Fig. 1 hat die Form eines kurzen, leicht konischen Rohres 1, an dessen oberem, breiteren Ende außen ein flacher Hohlzylinder 2 angeformt ist. Eine nahe dem unteren Ende in dem Rohr 1 sitzende Fritte 3 bildet einen Boden. Darüber und den Raum bis zu einer wiederum aus einer Fritte bestehenden Decke 4 ausfüllend befindet sich eine Packung 5 eines Adsorbens.

Das Adsorbens besteht aus einer auf einen Träger aus Polyacrylamid-Gel geschichteten Polyacrylsäure.

Über der Decke 4 befindet sich ein Auffangraum 6.

In Fig. 2 ist das Rohr 1 durch eine Zwischenwand 7 unterteilt in ein Gefäß 8 und einen Kanal 9. Die Packung 5 befindet sich wiederum in dem Gefäß 8 zwischen einem durchströmbaren Boden 10 und einer durchströmbaren Decke 11, über der ein Auf­ fangraum 12 angeordnet ist.

In Fig. 3 ist der Gegenstand nach Fig. 2 mit dem Hohlzylinder 2 auf den Rand eines Probegefäßes 13 aufgesetzt. Das Rohr 1 taucht in die Probe, eine mit 14 bezeichnete Körperflüssigkeit.

Die Körperflüssigkeit 14 ist durch die Packung 5 nach oben geströmt. Dabei ist das LDL adsorbiert worden. In dem Auffangraum 12 steht die LDL-freie Körperflüssigkeit an. Sie kann von oben her entnommen, d. h. abgesaugt, werden. Ebenso kann die unveränderte Körperflüssigkeit in dem Kanal 9 entnommen werden.

In gleicher Weise ist das Probegefäß nach Fig. 1 zu handhaben, ausgenommen die Ent­ nahme der unveränderten Körperflüssigkeit, die man in diesem Falle schon vor dem Einsetzen des Gefäßes in das Probegefäß 13 oder an anderer Stelle durchführt.

Das in Fig. 4 dargestellte Gefäß 15 gliedert sich in einen schwach konischen Rohrab­ schnitt 16, einen stark konischen Rohrabschnitt 17 und einen zylindrischen Rohrab­ schnitt 18, auf dem ein ringförmiger Schwimmer 19 angeordnet ist. Der Rohrabschnitt 16 ist mit einem Boden 20, einer Decke 21 und der Packung 5 versehen.

Das Gefäß 15 wird, wie in Fig. 5 dargestellt, ebenfalls in ein Probegefäß 13 eingesetzt. Es schwimmt jedoch mit dem Schwimmer 19 auf der Körperflüssigkeit 14.

Mit dieser Maßnahme ist unabhängig von der Füllhöhe des Probegefäßes 13 eine auf die Größe der Packung 5 abgestimmte Menge der die Packung 5 durchströmenden Körperflüssigkeit 14 genau vorgegeben. Die Menge richtet sich nach der Stelle, an der der Schwimmer 19 auf dem Rohrabschnitt 18 angebracht ist. Im dargestellten Falle füllt sie etwa den Rohrabschnitt 17.

Das in Fig. 6 dargestellte, mit 22 bezeichnete Gefäß weist über einem konischen unte­ ren Abschnitt 23 einen schwächer oder nicht konischen oberen Abschnitt 24 auf. Auf diesen ist ein Kragen 25 klemmend aufgeschoben. Wiederum sind ein Boden 26, eine Packung 5 und eine Decke 27 vorhanden. Über dieser befindet sich ein Einfüllraum 28. Ein nur schematisch dargestellter Deckel 29 ist abnehmbar.

In Fig. 7 ist das Gefäß 22 mit dem Kragen 25 deckelartig auf ein Auffanggefäß 30 aufgesetzt.

Die Körperflüssigkeit wird in den Einfüllraum 28 gegeben, durchläuft die Packung 5 nach unten und findet sich dann bei 31 in dem Auffanggefäß 30.

In Fig. 8 ist eine Pipettenspitze 32 mit einem Boden 33, einer Packung 5 und einer Decke 34 versehen; mit einer Steckverbindung 35 ist ein einen Auffangraum 36 hinzu­ fügendes Ergänzungsteil 37 angesetzt. Das Ergänzungsteil 37 ist seinerseits an eine Kolbenhubpipette ansetzbar.

Hier wird die Körperflüssigkeit aus einem Probegefäß angesaugt und durch die Packung 5 hindurchgesaugt in den Auffangraum 36. Nach Trennen der Steckverbindung 35 kann die LDL-freie Körperflüssigkeit dem Auffangraum 36 unmittelbar entnommen werden. Sie könnte aber auch unter nochmaliger Durchströmung der Packung 5 aus der Pipettenspitze 32 ausgestoßen werden.

Das Ergänzungsteil 37 könnte beispielsweise einen trockenchemischen Träger zur Bestimmung des HDL- und VLDL-Gehaltes enthalten.

Alle Vorrichtungsteile bestehen aus Kunststoff.

Nach Möglichkeit können in großer Stückzahl und entsprechend preiswert hergestellte handelsübliche Teile verwendet werden, z. B. als das Probegefäß 13 eine "Serum- Monovette", als das Auffanggefäß 30 ein "Hitachi-Cup", als das Gefäß 22 ein "Eppendorf-Cup", dessen Spitze unten abgeschnitten worden ist und als die Pipetten­ spitze 32 eine "Eppendorf-Pipette".

In Fig. 10 ist die Korrelation erfindungsgemäß erhaltener Ergebnisse (im Durchlauf durch die Packung von oben nach unten) mit durch Ultrazentrifugation erhaltenen Ergebnissen dargestellt.

Die Punkte bezeichnen jeweils mit ihrem Wert auf der Abszisse den nach der Erfindung gefundenen Gehalt an LDL-Cholesterin und mit ihrem Wert auf der Ordinate den mittels Ultrazentrifugation gefundenen Gehalt. Die Regressionsgerade ist durchgezogen gezeichnet, die Winkelhalbierende gestrichelt. Die Regressionsgerade folgt der Bezie­ hung y = 1,097x - 5,93. Der Korrelationskoeffizient beträgt 0,941.

In der nachstehenden Tabelle sind zusätzlich die Gesamtgehalte der Proben an Cholesterin und Triglyceriden angegeben.

Claims (19)

1. Verfahren zum Bestimmen einer Komponente des LDL, insbesondere des Cho­ lesterins, in einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blutserum oder Blutplasma, bei dem eine Probe mit einem das LDL bindenden Adsorbens behandelt wird, das aus einer auf einen Träger aus Polyacrylamid-Gel geschichteten Polyacrylsäure besteht, und der Gehalt des Eluats an der Komponente analysiert wird und der Gehalt des LDL an der Komponente durch Differenzbildung mit dem gleichfalls analysierten Gesamtgehalt einer Parallelprobe an der Komponente ermittelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens des DALI-Systems der Fresenius AG, Bad Homburg, verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Blutplasma oder Blutserum unmittelbar mit dem Adsorbens behandelt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe durch eine das Adsorbens enthaltende Packung geführt wird.

5. Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch ein längliches, an beiden Enden durchströmbares, vorzugs­ weise leicht konisches, Gefäß (1; 8; 15; 22; 32), das mit der Packung (5) gefüllt ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß einen die Packung (5) haltenden, durchströmbaren Boden (3; 10; 20; 26; 33), vorzugsweise auch eine durchströmbare Decke (4; 11; 21;27; 34), aufweist, vorzugsweise als Einsatzteil(e).

7. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß (22) zur Durchströmung von oben nach unten am oberen Ende einen Einfüllraum (28) aufweist und mit einem Auffanggefäß (30) baulich kombi­ niert, vorzugsweise mit einem Kragen (25) deckelartig auf das Auffanggefäß (30) aufsetzbar, ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß (1; 8; 15) zur Durchströmung von unten nach oben am oberen Ende einen Auffangraum (6; 12; 17, 18) aufweist und mit einem Probegefäß (13) derart baulich kombiniert, vorzugsweise auf das Gefäß (30) aufsetzbar oder mit einem ringförmigen Schwimmer (19) in das Gefäß (30) einsetzbar, ist, daß es einschließ­ lich des Auffangraumes (6; 12; 17, 18) in die Füllung des Probegefäßes (30) taucht.

9. Vorrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß (32) zur Durchströmung von unten nach oben, ggf. anschließend zurück, am oberen Ende einen Auffangraum (36) aufweist und als eine Pipetten­ spitze (32, 37) gestaltet ist, die an eine Kolbenhubpipette ansetzbar ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefäß (22) über einem konischen unteren Abschnitt (23) einen schwächer oder nicht konischen oberen Abschnitt (24) aufweist, vorzugsweise ein handels­ übliches Gefäß ("Eppendorf-Cup") ist, dessen Spitze unten abgeschnitten worden ist, und daß der Kragen (25) auf den oberen Abschnitt, vorzugsweise klemmend, aufgeschoben ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Auffanggefäß (30) ein handelsübliches Gefäß ("Hitachi-Cup") ist.

12. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß neben dem Gefäß (8) die unveränderte Füllung des Probegefäßes (13) zugäng­ lich ist, vorzugsweise in einem in Baueinheit mit dem Gefäß (3) gestalteten Kanal (9).

13. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Probegefäß (13) ein handelsübliches Gefäß ("Serum-Monovette") ist.

14. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Pipettenspitze (32, 37) zwischen der Packung (5) und dem Auffangraum (36) trennbar ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Pipettenspitze (32, 37), im Falle der trennbaren Pipettenspitze (32, 37) der die Packung aufnehmende Teil (32), die Pipettenspitze (32) einer handelsüblichen Kolbenhubpipette ("Eppendorf-Pipette") ist.

16. Vorrichtung nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den voneinander trennbaren Teilen (32; 37) der Pipettenspitze eine Steckverbindung (35) vorgesehen ist.

17. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einem trockenchemischen Träger, insbesondere zur Bestimmung des Cholesterins, kombiniert ist derart, daß die Probe nach Durchströmen der Packung auf den trockenchemischen Träger gelangt.

18. Vorrichtung zum Durchführen eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein trockenchemischer Träger, insbesondere zur Bestimmung des Cholesterins, mit dem Adsorbens kombiniert ist derart, daß die Probe nach Durchwandern eines mit dem Adsorbens imprägnierten Abschnitts in einen die Reaktionszone bildenden Abschnitt des Trägers gelangt.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Durchführung einer Bestimmung benötigten Teile und Mittel vollständig in einem Geräte- und Reagenziensatz zusammengestellt sind.