DE19630322A1

DE19630322A1 - Dunkelfeld-Auflicht-Fluoreszenzmikroskop

Info

Publication number: DE19630322A1
Application number: DE1996130322
Authority: DE
Inventors: Yuichi Tamura
Original assignee: Laboratory of Molecular Biophotonics
Current assignee: Laboratory of Molecular Biophotonics
Priority date: 1995-07-28
Filing date: 1996-07-26
Publication date: 1997-01-30
Also published as: JPH0943147A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Dunkelfeld-Auflicht- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung, bei welcher ein fluoreszie rendes Material mit anregendem Licht unter Auflichtbeleuch tung bestrahlt wird, wobei die von dem fluoreszenten Material ausgesandte Fluoreszenz im Dunkelfeld betrachtet wird.

Als Fluoreszenzmikroskope, bei denen eine ein fluoreszieren des Material enthaltende Probe mit Anregungslicht so bestrahlt wird, daß die von dem fluoreszierenden Material ausgesandte Fluoreszenz beobachtet wird, gibt es konventionellerweise das Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop, das Fluoreszenz mikroskop mit externer Beleuchtung, das Dunkelfeld-Transmis sions-Fluoreszenzmikroskop, das Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungs-Fluoreszenzmikroskop, und das abtastende konfokale Fluo reszenzmikroskop. Stand der Technik in bezug auf das Dunkel feld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop ist in dem japanischen offengelegten Patent Nr. 3-266809 und anderswo beschrieben.

Bei dem Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop gelangt von einer Lichtquelle ausgesandtes Anregungslicht durch ein An regungsfilter, wird von einem dichroitischen Spiegel reflek tiert, gelangt durch das Innere einer Objektivlinse, und be strahlt dann eine Probe. Andererseits wird von einem fluores zierenden Material in der Probe ausgesandte Fluoreszenz durch die Objektivlinse hindurchgeleitet, und gelangt dann durch den dichroitischen Spiegel und ein Absorptionsfilter, um schließlich einem Betrachtungsabschnitt zugeführt zu werden.

Hierbei überträgt das Anregungsfilter selektiv eine Anregungs lichtkomponente in dem von der Lichtquelle ausgesandten Strah lenbündel. Der dichroitische Spiegel reflektiert das Anre gungslicht, während er die Fluoreszenz durchläßt. Das Absorp tionsfilter blockiert die Fluoreszenz, während es das Anre gungslicht durchläßt.

Bei dem Mikroskop mit externer Beleuchtung wird eine Probe mit Anregungslicht von außen beleuchtet, während von einem fluoreszierenden Material in der Probe ausgesandte Fluores zenz durch eine Objektivlinse und ein Absorptionsfilter hin durchgeht, um dann einem Betrachtungsabschnitt zugeführt zu werden.

Bei dem abtastenden, kofokalen Mikroskop gelangt, wie bei dem Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop, von einer Lichtquelle ausgesandtes Anregungslicht durch ein Anregungs filter, wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert, gelangt durch eine Objektivlinse, und bestrahlt dann eine Probe. Andererseits wird von einem fluoreszierenden Material in der Probe ausgesandte Fluoreszenz durch die Objektivlinse hindurchgelassen, und gelangt dann durch den dichroitischen Spiegel und ein Absorptionsfilter, um dann einem Beobachtungs abschnitt zugeführt zu werden. Da ein feines Loch verwendet wird, kann ein tomographisches Bild mit höherem Kontrast be züglich der Fluoreszenz erfaßt werden, verglichen mit dem Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop.

Bei dem Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikros kop, welches in der voranstehend erwähnten Veröffentlichung beschrieben wird, nämlich in dem japanischen offengelegten Patent Nr. 3-266809, ist der optische Pfad von einer Licht quelle zu einer Probe getrennt von dem optischen Pfad für Fluoreszenz, die von einem fluoreszierenden Material in der Probe ausgesandt wird. Das Strahlenbündel, welches von der Lichtquelle ausgesandt wird, und die Anregungslichtkomponen te enthält, wird durch eine Sammellinse und eine Kollimator linse in ein paralleles Strahlenbündel umgewandelt, wogegen das Anregungslicht selektiv durch ein Anregungsfilter durch gelassen wird, so daß durch eine Abschirmplatte Zonenlicht erzeugt wird. Das Zonenlicht wird von einem dichroitischen Spiegel reflektiert, und erreicht die Probe über die Außen seite einer Objektivlinse. Andererseits wird das von dem fluoreszierenden Material in der Probe ausgesandte Fluores zenzlicht durch das Innere der Objektivlinse hindurchgelas sen, und gelangt dann durch den dichroitischen Spiegel und ein Absorptionsfilter, um dann einem Beobachtungsabschnitt zugeführt zu werden.

Bei dem Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop weist im allgemeinen das den Beobachtungsabschnitt erreichende Licht nicht nur die Fluoreszenz auf, die von dem fluoreszierenden Material in der zu beobachtenden Probe erzeugt wird, sondern auch verschiedene Arten von Rauschlicht. Beispiele für Rausch licht, welches einen Fluoreszenzerfassungsabschnitt erreicht, der als Beobachtungsabschnitt angeordnet ist, umfassen die nachstehend erläuterten Bestandteile. Obwohl das in dem opti schen Beleuchtungssystem angeordnete Anregungsfilter selektiv die Anregungslichtkomponente in dem von der Lichtquelle aus gesandten Licht durchläßt, kann es die anderen Wellenlängen komponenten nicht vollständig abblocken, so daß diese teil weise durchgelassen werden. Und obwohl der dichroitische Spie gel, der für die Auflicht-Beleuchtung vorgesehen ist, das von dem Anregungsfilter herstammende Anregungslicht reflektiert, ist diese Reflexion nicht vollständig, wodurch ein Teil des Lichts durch den Spiegel als Kriechlicht hindurchgeht, wäh rend Fluoreszenzrauschen dort erzeugt wird.

Wenn das Anregungslicht von dem dichroitischen Spiegel durch die Objektivlinse hindurchgeht, wird darüber hinaus in der Objektivlinse Fluoreszenzrauschen erzeugt. Weiterhin wird in der Probe Fluoreszenzrauschen durch andere Materialien als das zu beobachtende, fluoreszierende Material erzeugt. Wäh rend das durch die Probe gestreute Anregungslicht erneut durch die Objektivlinse hindurchgeht, tritt auch dort Fluo reszenzrauschen auf. Obwohl das von der Objektivlinse ausge gebene Anregungslicht von dem dichroitischen Spiegel reflek tiert wird, ist diese Reflexion unvollständig. Während das durch den dichroitischen Spiegel durchgelassene Anregungs licht von dem Absorptionsfilter abgeblockt wird, ist diese Blockierung nicht vollständig, wodurch ein Teil des Anregungs lichts durch das Filter durchgeht, und so den Fluoreszent erfassungsabschnitt erreicht. Wenn ein Teil des Anregungs lichts durch den dichroitischen Spiegel hindurchgeht und eine Objektivtubuswand des Mikroskops bestrahlt, wird auch an der Objektivtubuswand Fluoreszenzrauschen erzeugt, während ein Teil des Anregungslichts hierdurch reflektiert und gestreut wird.

Da die Fluoreszenzrauschkomponenten, reflektierte und ge streute Lichtkomponenten des Anregungslichts, und Kriech lichtkomponenten, wie voranstehend geschildert, den Fluoreszenzerfassungsabschnitt erreichen, der vor dem Beob achtungsabschnitt angeordnet ist, zusammen mit der Fluores zenz, die von dem jeweils interessierenden fluoreszierenden Material in der Probe erzeugt wird, erzeugen sie bei der Be obachtung Rauschen, wodurch die Meßempfindlichkeit beein trächtigt wird. Wenn die Anzahl an Teilen aus fluoreszie rendem Material in der Probe klein ist, oder das Fluores zenzverhältnis klein ist, kann die von dem interessierenden fluoreszierenden Material erzeugte Fluoreszenz nicht erfaßt werden.

Bei dem extern beleuchteten Mikroskop wird das Anregungs licht, welches von der Probenoberfläche gestreut wurde, so wie das Fluoreszenzrauschen, welches von der Objektivlinse und dergleichen erzeugt wird, wenn das so gestreute Anregungs licht durch die Objektivlinse hindurchgeht, bei der Beobach tung zu Rauschen. Weiterhin ist es schwierig, eine Objektiv linse mit einer großen numerischen Apertur zu verwenden, wo durch sich ein geringer Sammelwirkungsgrad und eine niedrige Empfindlichkeit ergeben. Darüber hinaus ist der Betriebsab lauf zum Bestrahlen der Probe mit dem Anregungslicht von außen kompliziert.

Bei dem abtastenden, konfokalen Mikroskop erfordert es, zu sätzlich zu den voranstehend geschilderten Argumenten, die bei dem Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop zutref fen, infolge der Tatsache, daß die Bestrahlung nur in der beugungsbegrenzten Fläche stattfindet, viel Zeit zum Durch suchen des Fluoreszenzmaterials in der Probe. Wenn das fluo reszierende Material eine Brown′sche Molekularbewegung oder dergleichen durchführt, ist es darüber hinaus schwierig, den Zustand einer derartigen Bewegung zu beobachten.

Andererseits erreicht bei dem Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungs-Fluoreszenzmikroskop das Anregungslicht die Probenober fläche ohne Zuhilfenahme der Objektivlinse, wodurch verhin dert wird, daß die Objektivlinse Rauschlicht erzeugt, bevor die Probe bestrahlt wird. Dennoch wird das Anregungslicht in folge der Tatsache dunkler, daß nur der Umfangsabschnitt des Strahlenbündels des Anregungslichts genutzt wird, ist das Sammeln des Lichts so schwierig, daß ein größerer Bereich als die angestrebte Fläche beleuchtet wird, usw. Weiterhin kön nen das Fluoreszenzrauschen, das erzeugt wird, wenn das als Kriechlicht durch den dichroitischen Spiegel hindurchgegange ne Anregungslicht die Innenwand des Objektivtubus bestrahlt, und die Fluoreszenz, die erzeugt wird, wenn das durch die Probenoberfläche gestreute Anregungslicht durch die Objektiv linse, usw. hindurchgeht, den Beobachtungsabschnitt erreichen und bei der Beobachtung Rauschen erzeugen, wodurch die Em pfindlichkeit der Beobachtung beeinträchtigt wird.

Obwohl häufig Licht mit einer kurzen Wellenlänge, beispiels weise Ultraviolettlicht, als Anregungslicht verwendet wird, ist in diesem Fall das voranstehend geschilderte Rauschen (Fluoreszenzrauschen, welches von dem optischen System selbst erzeugt wird und als "Eigenfluoreszenz" bekannt ist) beson ders groß, wodurch es unmöglich wird, die Fluoreszenz von dem zu messenden, fluoreszierenden Material zu messen.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereit stellung einer Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenz mikroskopvorrichtung, welche die Lichtmenge der Fluoreszenz, die von dem gewünschten, fluoreszierenden Material in einer Probe ausgesandt wird, oder die Fluoreszenz mit hoher Empfind lichkeit messen kann. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Dunkelfeld-Auf licht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung, welche auch eine quantitative Messung, eine Beobachtung einer Bewe gung, und die Bearbeitung fluoreszierender Materialien ermög licht.

Um diese Vorteile zu erreichen, stellt die Dunkelfeld-Auf licht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung eine Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung dar, die zur Beobachtung, im Dunkelfeld, von Fluoreszenz dient, die durch ein fluores zierendes Material in einer Probe unter Auflicht-Beleuchtung erzeugt wird, und weist auf (i) ein optisches Dunkelfeld- Auflichtsystem, welches auf es einfallendes Licht auf die Probe als Anregungslicht schickt und hierdurch eine vorbe stimmte Fläche bestrahlt; (ii) ein optisches Objektivsystem, welches die Fluoreszenz sammelt, die von der Probe ausge strahlt wird, die mit dem Anregungslicht durch das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem bestrahlt wird; und (iii) einen Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt, der die von dem optischen Objektivsystem ausgesandte Fluoreszenz erfaßt; wo bei das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem, wel ches das Anregungslicht der Probe über die Außenseite des optischen Objektivsystems zuführt, als zonales Licht, zum Festhalten einer Lichtmenge des Anregungslichts ausgebildet ist, und wobei das optische Objektivsystem (a) ein Absorp tionsfilter aufweist, welches bei dem auf es von der Probe einfallenden Licht eine Lichtkomponente blockiert, deren Wel lenlänge im wesentlichen gleich jener des Anregungslichts ist, sowie (b) ein erstes optisches System, welches das auf es zum Absorptionsfilter einfallende Licht auf den Fluores zenzerfassungsabschnitt führt, und das so geführte Licht in einem vorbestimmten Bereich sammelt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das von der Lichtquelle ausgesandte Anregungslicht durch das optische Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungssystem geführt, und bestrahlt die Probe. Die Fluoreszenz, die von dem fluoreszierenden Material in der Probe dann erzeugt wird, wenn das Anregungslicht deren Ober fläche bestrahlt, wird gesammelt, wenn es sich nacheinander durch das Absorptionsfilter und das erste optische System des optischen Objektivsystems ausbreitet. Da das Absorptionsfil ter die Lichtkomponente abblockt, die im wesentlichen diesel be Wellenlänge aufweist wie das Anregungslicht, erfaßt hier bei der Fluoreszenzerfassungsabschnitt nur die von dem opti schen Objektivsystem durchgelassene Fluoreszenz.

Vorzugsweise weist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein zonales Faseroptikbündel auf, welches gleichmäßig auf der Einlaß-Endseite gebündelt ist, während es wie ein Ringband auf der Auslaß-Endseite um den optischen Pfad herum gebündelt ist, der von dem optischen Objektivsystem ausgeht, und von dem Auslaßende als zonales Licht das Anregungslicht aussen det, welches am Einlaßende als gleichmäßiges Licht einfällt, sowie ein Zonenlinsensystem, welches das von dem Auslaßende des zonalen Faseroptikbündels ausgesandte, zonale Licht sam melt und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das Anregungslicht, das auf das Einlaßende des zonalen Faseroptikbündels einfällt, von dessen Auslaßende als zonales Licht in Richtung auf das Zonenlinsensystem ausgesandt. Dieses Zonenlinsensystem sam melt das zonale Licht und bestrahlt die Probe mit dem so ge sammelten Licht.

Vorzugsweise weist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Er findung das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem einen ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegel auf, der durch einen ersten reflektierenden Spiegel gebildet wird, der eine konische oder konisch abgestumpfte Seitenoberfläche als reflektierende Oberfläche aufweist, und durch einen zweiten reflektierenden Spiegel gebildet wird, der eine abgeschnitte ne konische Innenwand gegenüberliegend der reflektierenden Oberfläche des ersten reflektierenden Spiegels als reflektie rende Oberfläche aufweist, und als zonales Licht von dem zweiten reflektierenden Spiegel das Anregungslicht aussendet, das auf den ersten reflektierenden Spiegel als gleichmäßiges Licht einfällt; einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht, welches von dem ein zonales Strahlenbündel er zeugenden Spiegel ausgesandt wird, um es der Probe zuzuführen; und ein Zonenlinsensystem, welches das von dem zonal reflek tierenden Spiegel reflektierte, zonale Licht sammelt und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das Anregungslicht, welches von der Lichtquelle auf den ein zonales Strahlenbün del erzeugenden Spiegel einfällt, nacheinander durch den er sten reflektierenden Spiegel und den zweiten reflektierenden Spiegel reflektiert, um so in Richtung auf den zonal reflek tierenden Spiegel als zonales Licht ausgesandt zu werden. Der zonal reflektierende Spiegel reflektiert dieseszonale Licht in Richtung auf das Zonenlinsensystem, wogegen das zonale Linsensystem das zonale Licht sammelt, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Vorzugsweise weist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein ein zonales Strahlenbündel erzeugendes Prisma auf, welches durch ein erstes Prisma gebildet wird, das eine konkav-koni sche Form oder eine konkav-kegelstumpfförmige Form aufweist, und ein zweites Prisma, welches kegelstumpfförmig ist und dem ersten Prisma gegenüberliegt, und als zonales Licht von dem zweiten Prisma das Anregungslicht aussendet, welches auf das erste Prisma als gleichmäßiges Licht einfällt; einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht reflektiert, welches von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prisma ausgesandt wird, um so dieses Licht auf die Probe zu führen; und ein Zonenlinsensystem, welches das zonale Licht sammelt, welches von dem zonal reflektierenden Spiegel reflektiert wurde, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das Anregungslicht, welches von der Lichtquelle auf das ein zonales Strahlenbün del erzeugende Prisma einfällt, von dem ersten Prisma und dem zweiten Prisma gebrochen, so daß es als zonales Licht auf den zonal reflektierenden Spiegel geschickt wird. Der zonal reflektierende Spiegel reflektiert dieses zonale Licht in Richtung auf das Zonenlinsensystem, wogegen das zonale Lin sensystem das zonale Licht sammelt, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Vorzugsweise weist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Er findung das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein ein zonales Strahlenbündel erzeugendes Beugungsgitter auf, welches durch ein erstes Beugungsgitter gebildet wird, welches eine Zonenform des Reflexionstyps aufweist, und ein zweites Beugungsgitter, welches eine Scheibenform des Refle xionstyps aufweist, und dem ersten Beugungsgitter gegenüber liegt, wobei als zonales Licht von dem zweiten Beugungsgit ter das gleichförmig auf das erste Beugungsgitter auffallende Anregungslicht ausgesandt wird; einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht reflektiert, das von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beugungsgitter ausgesandt wird, um dieses Licht der Probe zuzuführen; und ein Zonen linsensystem, welches das zonale Licht sammelt, das von dem zonal reflektierenden Spiegel reflektiert wird, und die Pro be mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das von der Lichtquelle auf das ein zonales Strahlenbündel erzeugende Beugungsgitter einfallende Licht reflektiert und von dem zweiten Beugungs gitter gebeugt, und dann von dem ersten Beugungsgitter reflek tiert und gebeugt, so daß es zum zonal reflektierenden Spie gel als zonales Licht ausgesandt wird. Der zonal reflektie rende Spiegel reflektiert dieses zonale Licht in Richtung auf das Zonenlinsensystem, wogegen das Zonenlinsensystem das zonale Licht sammelt, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Vorzugsweise weist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung das optische Dunkelfeld-Beleuchtungssystem ein ein zona les Strahlenbündel erzeugendes Beugungsgitter auf, welches durch ein erstes Beugungsgitter gebildet wird, welches Schei benform des Transmissionstyps aufweist, und ein zweites Beu gungsgitter, welches Zonenform des Transmissionstyps auf weist, dem ersten Beugungsgitter gegenüberliegend angeordnet ist, und als zonales Licht von dem zweiten Beugungsgitter das auf das erste Beugungsgitter einfallende Anregungslicht als gleichförmiges Licht aussendet; einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht reflektiert, das von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beugungsgitter ausgesandt wird, um dieses Licht der Probe zuzuführen; und ein Zonen linsensystem, welches das zonale Licht sammelt, das von dem zonal reflektierenden Spiegel reflektiert wird, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das von der Lichtquelle auf das ein zonales Strahlenbündel erzeugende Beugungsgitter einfallende Anregungslicht durch das erste Beugungsgitter hindurchgelassen und gebeugt, und dann durch das zweite Beu gungsgitter hindurchgelassen und gebeugt, so daß es in Rich tung auf den zonal reflektierenden Spiegel als zonales Licht ausgesandt wird. Der zonal reflektierende Spiegel reflektiert dieses zonale Licht in Richtung auf das Zonenlinsensystem, wogegen das Zonenlinsensystem das zonale Licht sammelt, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

Vorzugsweise besteht bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem aus einem nicht-fluoreszierenden Material, welches bei Bestrah lung mit dem Anregungslicht keine Fluoreszenz erzeugt. Bei einer derartigen Vorrichtung wird keine Fluoreszenz hervor gerufen, wenn das Anregungslicht durch das optische Dunkel feld-Auflicht-Beleuchtungssystem hindurchgeht. Es wird daher keine Fluoreszenz erzeugt, bevor die Probe mit dem Anregungs licht bestrahlt wird.

Vorzugsweise ist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung das Absorptionsfilter auf der Oberfläche des optischen Teils angeordnet, das sich an der Eingangsstufe des ersten optischen Systems befindet. Bei einer derartigen Vorrichtung kann, da das von der Oberfläche der Probe gestreute Anregungs licht von dem Absorptionsfilter absorbiert wird, die Eigen erzeugung der Fluoreszenz in dem ersten optischen System we sentlich verringert werden.

Vorzugsweise ist in diesem Fall das optische Teil, das an der Eingangsstufe des ersten optischen Systems vorgesehen ist, eine Linse, die den Lichtbeugungseffekt nutzt. Bei einer der artigen Vorrichtung absorbiert das optische Teil, das an der Eingangsstufe des ersten optischen Systems vorgesehen ist, das Anregungslicht, welches von der Oberfläche der Probe gestreut wird, während es als Linse arbeitet.

Vorzugsweise weist bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung das optische Objektivsystem weiterhin ein zweites opti sches System auf, welches ein Gesichtsfeld hat, das die vor bestimmte Fläche der Probe umfaßt, die mit dem Anregungslicht durch das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem be strahlt wird, und welches das von der Probe ausgesandte Licht sammelt, um das so gesammelte Licht dem Absorptionsfilter zu zuführen. Bei einer derartigen Vorrichtung wird die Auflösung der Messung von Fluoreszenzbildern verbessert, da die numeri sche Apertur des optischen Objektivsystems in bezug auf die Fluoreszenz zunimmt, die von der Probe durch das zweite opti sche System ausgesandt wird.

Vorzugsweise ist in diesem Fall das Absorptionsfilter auf der Oberfläche des optischen Teils angeordnet, das sich in der letzten Stufe des zweiten optischen Systems befindet. Da bei einer derartigen Vorrichtung das durch die Oberfläche der Pro be gestreute Anregungslicht von dem Absorptionsfilter absor biert wird, wird die Eigenerzeugung der Fluoreszenz in dem ersten optischen System wesentlich verringert.

Weiterhin ist vorzugsweise das optische Teil, das in der Ein gangsstufe des zweiten optischen Systems angeordnet ist, ei ne Linse, die den Lichtbeugungseffekt nutzt. Bei einer der artigen Vorrichtung absorbiert das optische Teil, das in der letzten Stufe des zweiten optischen Systems angeordnet ist, das Anregungslicht, welches von der Oberfläche der Probe gestreut wird, während es als Linse arbeitet.

Darüber hinaus besteht vorzugsweise das zweite optische System aus einem nicht-fluoreszierenden Material, welches bei Be strahlung mit Anregungslicht keine Fluoreszenz erzeugt. Da bei einer derartigen Vorrichtung die Eigenerzeugung der Fluores zenz in dem zweiten optischen System unterdrückt ist, wird die Erzeugung der Fluoreszenz in dem gesamten optischen Objektiv system unterdrückt.

Vorzugsweise weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluo reszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung weiterhin einen Lichtquellenabschnitt auf, der aus dem auf ihn von der Lichtquelle einfallenden Licht das Anregungslicht zur Bestrahlung der Probe erzeugt, und das Anregungslicht dem op tischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zuführt. Bei einer derartigen Vorrichtung können verschiedene Eigenschaf ten des Anregungslichts, welches auf das optische Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungssystem einfällt, durch den Lichtquellen abschnitt eingestellt werden.

Vorzugsweise weist in diesem Fall der Lichtquellenabschnitt einen Mechanismus zur Einstellung der Lichtmenge des Anre gungslichts auf, welches die Probe über das optische Dunkel feld-Auflicht-Beleuchtungssystem bestrahlt. Da die Lichtmenge des die Probe bestrahlenden Anregungslichts eingestellt wird, kann bei einer derartigen Vorrichtung die Erzeugung einer Verfärbung, einer Extinktion und dergleichen, in dem Fluores zenzbild unterdrückt werden.

Vorzugsweise weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluo reszenzmikroskopvorrichtung weiterhin einen Bearbeitungs steuerabschnitt auf, der eine Eigenschaft des Anregungslichts steuert oder regelt, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird. Bei einer derartigen Vorrichtung weist der Bearbeitungs steuerabschnitt den Lichtquellenabschnitt an, verschiedene Eigenschaften des Anregungslichts zu steuern oder zu regeln, welches auf das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs system einfällt. Beispielsweise steuert oder regelt der Be arbeitungssteuerabschnitt die Einstellung der Lichtmenge des Anregungslichts, welches die Oberfläche der Probe-beleuchtet, oder steuert oder regelt die Einstellung der Impulsbreite und der Dauer des gepulsten Anregungslichts.

Besonders bevorzugt weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung weiterhin einen An regungslicht-Erfassungsmechanismus auf, der die Lichtmenge des Anregungslichts mißt, welches von dem Lichtquellenab schnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird, während der Verarbeitungssteuerabschnitt ei nen Datenverarbeitungsabschnitt aufweist, der die Lichtmenge des Anregungslichts, die von dem Anregungslicht-Erfassungs mechanismus gemessen wird, und die Lichtmenge der Fluores zenz, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt erfaßt wird, miteinander vergleicht, sowie einen Anregungslicht-Steuerab schnitt, welcher auf der Grundlage der Verarbeitung durch den Datenverarbeitungsabschnitt die Eigenschaften des Anre gungslichts steuert oder regelt, welches von dem Lichtquel lenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs system zugeführt wird.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird die Lichtmenge des An regungslichts, welches von dem Lichtquellenabschnitt zu dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem geschickt wird, also die Lichtmenge des Anregungslichts, welches die Oberfläche der Probe bestrahlt, durch den Anregungslicht-Er fassungsmechanismus überwacht. Auf dieser Grundlage vergleicht in dem Verarbeitungssteuerabschnitt der Datenverarbeitungs abschnitt die Lichtmenge des Anregungslichts, die von dem Anregungslicht-Erfassungsmechanismus gemessen wird, und die Lichtmenge der Fluoreszenz, die von dem Fluoreszenz-Erfas sungsabschnitt gemessen wird, miteinander und führt beispiels weise einen Divisionsvorgang durch, während der Anregungs licht-Steuerabschnitt auf der Grundlage der Verarbeitung durch den Datenverarbeitungsabschnitt die Eigenschaften des Anregungslichts steuert oder regelt, welches von dem Licht quellenabschnitt zum optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungssystem ausgesandt wird.

Besonders bevorzugt weist der Anregungslicht-Erfassungs mechanismus eine optische Meßfaser auf, die ein Teil des An regungslichts abzweigt, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird, sowie einen Photodetektor, der die Lichtmenge des Anre gungslichts mißt, welches von der optischen Meßfaser ausge sandt wird. Da bei einer derartigen Vorrichtung das Anre gungslicht, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem opti schen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird, durch die optische Meßfaser abgezweigt und von dem Photo detektor gemessen wird, wird die Lichtmenge des gesamten An regungslichts überwacht.

Besonders bevorzugt stellt der Bearbeitungssteuerabschnitt die Intensität des Anregungslichts, welches die Probe beleuch tet, kleiner ein als auf eine Intensität, welche der Sätti gungs-Fluoreszenzintensität des in der Probe enthaltenen fluoreszierenden Materials entspricht. Bei einer derartigen Vorrichtung ist die an dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt gemessene Fluoreszenzintensität proportional zur Intensität des Anregungslichts, welches die Probe bestrahlt, und zur An zahl an Stücken aus fluoreszierendem Material in der Probe.

Auf der Grundlage der am Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt ge messenen Fluoreszenzintensität kann daher das fluoreszieren de Material in der Probe quantitativ bestimmt werden.

Besonders bevorzugt weist der Lichtquellenabschnitt einen Mechanismus zur Bestrahlung der Probe mit dem Anregungslicht in Form eines Impulses auf, über das optische Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungssystem, während der Bearbeitungssteuer abschnitt den Lichtquellenabschnitt anweist, die Pulszeit breite des Anregungslichts, welches die Probe bestrahlt, so einzustellen, daß die mittlere Bewegungslänge des in der Pro be enthaltenen fluoreszierenden Materials kleiner als die Meßauflösung des optischen Objektivsystems entsprechend der von der Probe ausgesandten Fluoreszenz ist. Bei einer der artigen Vorrichtung wird die mittlere Bewegungslänge des fluoreszierenden Materials innerhalb einer Impulszeit des Anregungslichts kleiner als die Auflösung des optischen Ob jektivsystems. Daher kann der Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt ein klares Fluoreszenzbild erhalten, auf der Grundlage der Fluoreszenzerfassung innerhalb einer Impuls zeit des Anregungs lichts.

Vorzugsweise weist der Lichtquellenabschnitt einen Mechanis mus zur Bestrahlung der Probe mit dem Anregungslicht als Im puls über das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem auf. Bei einer derartigen Vorrichtung kann die Intensität der von der Probe ausgesandten Fluoreszenz in Impulsform umgewan delt werden.

Besonders bevorzugt weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung weiterhin einen Fluo reszenz-Erfassungs-Verzögerungsmechanismus auf, welcher zu einem Zeitpunkt, der um einen vorbestimmten Zeitraum gegen über dem Zeitpunkt verzögert ist, wenn die Probe mit jedem der Impulse des Anregungslichts bestrahlt wird, das von dem Lichtquellenabschnitt ausgesandt wird, die Lichtmenge des von der Probe ausgesandten Lichts mißt. Nachdem bei einer derartigen Vorrichtung die kurzlebige Komponente, die von anderen Materialien als dem zu messenden, fluoreszierenden Material in der von der Probe ausgesandten Fluoreszenz sich abgeschwächt hat, kann die langlebige Komponente, die von dem zu messenden Fluoreszenzmaterial erzeugt wird, allein in dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt gemessen werden.

Weiterhin weist der Fluoreszenz-Verzögerungsmechanismus einen Strahlteiler auf, der einen Teil des Anregungslichts reflek tiert und abzweigt, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird; einen Photodetektor, der die Lichtmenge und Ankunfts zeit des Anregungslichts mißt, das von dem Strahlteiler re flektiert wird, und auf diese Weise gemessene Werte als An regungslichtinformation ausgibt; einen Verzögerungsgenera tor, der unter Bezugnahme auf die Ankunftszeit, die in der Anregungslichtinformation enthalten ist, die von dem Photo detektor eingegeben wird, Verzögerungsinformation mit einer vorbestimmten Zeitdauer nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit ausgibt; und eine Gate-Vorrichtung, welche in dem optischen Pfad der von der Probe ausgesandten Fluoreszenz angeordnet ist, und auf der Grundlage der von dem Verzögerungsgenerator eingegebenen Verzögerungsinformation die Fluoreszenz nur wäh rend einer vorbestimmten Zeitdauer nach Ablauf einer vorbe stimmten Zeit seit der Ankunftszeit des Anregungslichts durch läßt.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird ein Teil des Anregungs lichts, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird, durch den Strahlteiler reflektiert, während die Lichtmenge und die Ankunftszeit des Lichts von dem Photodetektor gemessen wer den. Der Verzögerungsgenerator erzeugt die Verzögerungsinfor mation auf der Grundlage der von dem Photodetektor eingegebe nen Anregungslichtinformation. Auf der Grundlage der Verzöge rungsinformation, die von dem Verzögerungsgenerator eingege ben wird, öffnet die Gate-Vorrichtung (Torvorrichtung) ihr Gate (Tor) nur während eines vorbestimmten Zeitraums nach Ab lauf einer vorbestimmten Zeit seit der Ankunftszeit des An regungslichts. Nur während einer vorbestimmten Zeitdauer nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit seit der Zeit, an welcher die Oberfläche der Probe mit einem Impuls des Anregungslichts bestrahlt wurde, erfaßt daher der Fluoreszenz-Erfassungs abschnitt die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz. Durch Steuern der Öffnungs- und Schließzeitpunkte und der Öffnungs- und Schließzeitpunkte des Gates der Gate-Vorrichtung kann da her der Verzögerungsgenerator zu einem vorbestimmten Zeit punkt in einem vorbestimmten Zeitraum die von der Probe aus gesandte Fluoreszenz erfassen.

Vorzugsweise weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung weiterhin eine Betriebslichtquelle zur Erzeugung von Betriebslicht auf, welches die Oberfläche der Probe bestrahlt, und eine Lichtteilervorrichtung, welche zwischen dem opti schen Objektivsystem und dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt angeordnet ist, und das von der Betriebslichtquelle auf sie einfallende Betriebslicht so reflektiert, daß das reflektier te Licht dem optischen Objektivsystem zugeführt wird, während sie die Fluoreszenz durchläßt, die auf sie von dem optischen Objektivsystem einfällt, so daß das durchgelassene Licht dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt zugeführt wird.

Bei einer derartigen Vorrichtung wird das Betriebslicht, wel ches von der Betriebslichtquelle ausgesandt wird, von der Lichtteilervorrichtung so reflektiert, daß es durch das opti sche Objektivsystem hindurchgeht, wodurch die Oberfläche der Probe bestrahlt wird. Gleichzeitig bestrahlt das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem die Probe mit dem An regungslicht. Hierbei gelangt die von dem fluoreszierenden Material in der Probe erzeugte Fluoreszenz nacheinander durch das optische Objektivsystem und die Lichtteilervorrichtung, um dann von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt erfaßt zu wer den. In dem Fluoreszenzbild kann daher die Differenz zwischen dem fluoreszierenden Material, welches mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, und dem fluoreszierenden Material, welches nicht mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, beobachtet wer den.

Vorzugsweise weist in diesem Fall die Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung weiterhin einen Strahlenbündel-Betriebsabschnitt auf, der durch die Lichttei lervorrichtung das auf ihn von der Betriebslichtquelle ein fallende Betriebslicht dem optischen Objektivsystem zuführt, um so eine vorbestimmte Position oder einen vorbestimmten Bereich in der Oberfläche der Probe zu bestrahlen. Bei einer derartigen Vorrichtung setzt der Strahlenbündel-Betriebsab schnitt die Position oder die Fläche in der Oberfläche der Probe fest oder bewegt diese, die mit dem von der Betriebs lichtquelle ausgesandten Betriebslicht bestrahlt wird. Auf der Grundlage des Betriebs des Betriebslichts durch den Strah lenbündel-Betriebsabschnitt kann daher ein spezifisches Mate rial in der Probe festgesetzt oder bewegt werden.

Vorzugsweise weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung weiterhin einen gekippten Spiegel mit einer konischen Innenwand auf, der das Kriech licht des Betriebslichts absorbiert, das durch die Lichttei lervorrichtung hindurchgelassen wird. Da bei einer derartigen Vorrichtung der gekippte Spiegel mit konischer Innenwand das Kriechlicht des Betriebslichts absorbiert, das von der Licht teilervorrichtung durchgelassen wird, wird die Lichtmenge des Betriebslichts klein, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsab schnitt erfaßt wird.

Die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung weist weiterhin ein weiteres Absorptionsfilter auf, welches sich von dem Absorptionsfilter unterscheidet, das in dem optischen Objektivsystem vorgesehen ist, und das Betriebslicht absorbiert, welches von der Oberfläche der Pro be gestreut und dann durch das Betriebslicht gesammelt wird, während die von der Probe ausgesandte Fluoreszenz hindurch geht und dann von dem optischen Objektivsystem gesammelt wird. Da bei einer derartigen Vorrichtung das andere Absorp tionsfilter das Betriebslicht oder dergleichen absorbiert, welches von der Oberfläche der Probe gestreut und dann durch das optische Objektivsystem hindurchgelassen wurde, wird die Lichtmenge des gestreuten Lichtanteils des Betriebslichts klein, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt erfaßt wird. Da das andere Absorptionsfilter die von dem fluoreszen ten Material der Probe erzeugte Fluoreszenz durchläßt, nimmt im Gegensatz hierzu die Lichtmenge der Fluoreszenz nicht ab, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt erfaßt wird.

Vorzugsweise weist die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluo reszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung weiterhin einen gekippten Spiegel mit konischer Innenwand auf, der auf der Seite gegenüberliegend dem optischen Objek tivsystem angeordnet ist, so daß er der Probe gegenüberliegt und das durch die Probe hindurchgelassene Licht absorbiert. Da bei einer derartigen Vorrichtung der gekippte Spiegel mit konischer Innenwand das Kriechlicht des Betriebslichts absor biert, das durch die Probe hindurchgelassen wurde, wird die Lichtmenge des Kriechlichts des Betriebslichts niedrig, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt erfaßt wird.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand zeichne risch dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert, aus welchen weitere Vorteile und Merkmale hervorgehen, und welche als beispielhaft zu verstehen sind und nicht die vor liegende Erfindung einschränken sollen.

Der weitere Umfang der Einsetzbarkeit der vorliegenden Erfin dung wird aus der nachstehenden, ins einzelne gehenden Be schreibung noch deutlicher. Allerdings wird darauf hingewie sen, daß die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, die zwar bevorzugte Ausführungsformen der Erfin dung darstellen, nur zur Erläuterung präsentiert werden, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Wesens und Umfangs der vorliegenden Erfindung Fachleuten auf diesem Gebiet aus der detaillierten Beschreibung deutlich werden. Es zeigt:

Fig. 1 eine Schnittansicht eines Aufbaus der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegen den Erfindung;

Fig. 2 eine Perspektivansicht eines Aufbaus eines optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystems in der Dun kelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung von Fig. 1;

Fig. 3 eine Perspektivansicht eines Aufbaus einer zonalen optischen Faser in dem optischen Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungssystem von Fig. 2;

Fig. 4 eine Aufsicht auf die Anordnung der zonalen opti schen Faser von Fig. 3, gesehen in einem anderen Blickwinkel als in Fig. 3;

Fig. 5 eine Schnittansicht eines Aufbaus der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der zweiten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung;

Fig. 6 eine Perspektivansicht, welche teilweise einen Auf bau eines optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungssystems in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 5 zeigt;

Fig. 7 eine Perspektivansicht eines Aufbaus eines ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegels in dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs system von Fig. 6;

Fig. 8 eine Schnittansicht eines Aufbaus des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegels von Fig. 7;

Fig. 9 eine Schnittansicht eines Aufbaus der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der dritten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung;

Fig. 10 eine Perspektivansicht eines Aufbaus eines ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prismas in dem Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikros kop von Fig. 9 in Explosionsdarstellung;

Fig. 11A eine Schnittansicht des Aufbaus des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prismas von Fig. 10;

Fig. 11B eine Seitenansicht des Aufbaus des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prismas von Fig. 10;

Fig. 11C eine Aufsicht des Aufbaus des ein zonales Strah lenbündel erzeugenden Prismas von Fig. 10, gesehen von der Austrittsoberflächenseite aus;

Fig. 11D eine Aufsicht des Aufbaus des ein zonales Strah lenbündel erzeugenden Prismas von Fig. 10, gesehen von der Einlaßoberflächenseite aus;

Fig. 12 eine Perspektivansicht eines Aufbaus eines gekipp ten Spiegels mit konischer Innenwand in der Dun kelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung von Fig. 9;

Fig. 13 eine Schnittansicht eines Aufbaus der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der vierten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung;

Fig. 14A eine Schnittansicht eines Aufbaus eines ersten Beispiels für ein ein zonales Strahlenbündel erzeu gendes Beugungsgitter in der Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 13;

Fig. 14B eine schematische Schnittansicht der Form des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beugungsgitters von Fig. 14A unter Vergrößerung;

Fig. 14C eine Schnittansicht eines Aufbaus eines zweiten Beispiels für das ein zonales Strahlenbündel erzeu gende Beugungsgitter in der Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 13;

Fig. 14D eine schematische Schnittansicht der Form des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beugungsgitters von Fig. 14C unter Vergrößerung;

Fig. 15A eine Schnittansicht eines ersten Beispiels für ein Absorptionsfilter und ein optisches Objektiv system in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 13;

Fig. 15B eine Schnittansicht eines zweiten Beispiels für das Absorptionsfilter und das optische Objektiv system in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 13;

Fig. 15C eine Schnittansicht eines dritten Beispiels für das Absorptionsfilter und das optische Objektiv system in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 13;

Fig. 15D eine Schnittansicht eines vierten Beispiels für das Absorptionsfilter und das optische Objektiv system in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 13;

Fig. 16 eine Schnittansicht eines Aufbau der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der fünften Ausführungsform der vorlie genden Erfindung;

Fig. 17 eine Perspektivansicht eines Aufbaus einer zonalen Faseroptik und einer Anregungslicht-Erfassungsvor richtung in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 16;

Fig. 18 eine Schnittansicht eines Aufbaus der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der sechsten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung;

Fig. 19 eine Schnittansicht eines Aufbaus der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der siebten Ausführungsform der vorlie genden Erfindung;

Fig. 20A eine Schnittansicht eines Aufbaus eines ersten Bei spiels für einen gekippten Spiegel mit konischer Innenwand in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 19;

Fig. 20B eine Schnittansicht eines Aufbaus eines zweiten Beispiels für den gekippten Spiegel mit konischer Innenwand in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 19; und

Fig. 20C eine Schnittansicht eines Aufbaus eines dritten Beispiels für den gekippten Spiegel mit konischer Innenwand in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung von Fig. 19.

Nachstehend werden Aufbauten und Betriebsabläufe verschiede ner Ausführungsformen der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung im einzelnen unter Bezugnahme auf die Fig. 1 bis 20C erläutert. Bei der Beschreibung der Zeichnungen werden glei che Bauteile mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet, so daß insoweit nicht unbedingt eine erneute Beschreibung erfolgt. Größenverhältnisse in den Zeichnungen entsprechen nicht immer der schriftlichen Beschreibung.

Erste Ausführungsform

Wie aus Fig. 1 hervorgeht, erzeugt in der Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vor liegenden Ausführungsform eine Lichtquelle 10 ein Strahlen bündel, welches eine Wellenlängenkomponente des Anregungs lichts enthält, die eine Probe 1 so bestrahlt, daß ein darin enthaltenes, fluoreszierendes Material Fluoreszenz B erzeugt. Als Lichtquelle 10 wird eine Quecksilberlampe, eine Halogen lampe, eine Xenonlampe oder dergleichen verwendet. Das von der Lichtquelle 10 ausgesandte Strahlenbündel wird in das In nere eines Objektivtubus 34 des Mikroskops eingeführt, durch eine Sammellinse 11 im wesentlichen in einen fokussierten Strahl umgewandelt, und dann einer Durchlaß/Blockier-Steue rung durch einen Verschluß 12 unterworfen.

Dieses Strahlenbündel wird entsprechend durch ein ND-Filter 13 absorbiert, wenn es dort hindurchgeht, um so an die Licht menge des Anregungslichts zur Bestrahlung der Probe 1 ange paßt zu werden, und wird dann durch eine Sammellinse 14 in Richtung auf ein Einlaßende 20a eines zonalen Faseroptikbün dels 20 gesammelt. Ein Anregungsfilter 15 ist vor dem Einlaß ende 20a des zonalen Faseroptikbündels 20 angeordnet und läßt die Wellenlängenkomponente des Anregungslichts in dem von der Lichtquelle 10 ausgesandten Strahlenbündel durch. Ein Licht quellenabschnitt, welcher die Sammellinse 11, den Verschluß 12, das ND-Filter 13, die Sammellinse 14 und das Anregungs filter 15 umfaßt, wandelt daher das von der Lichtquelle 10 ausgesandte Strahlenbündel in die Anregungslichtkomponente um, die auf das Einlaßende 20a des zonalen Faseroptikbündels 20 einfällt.

Hierbei kann als Lichtquelle auch eine Laserlichtquelle ver wendet werden. Entsprechend dem Zweck der Fluoreszenzmessung wird eine kontinuierliche Schwingung oder eine gepulste Schwingung eingesetzt. Falls die Laserlichtquelle als Licht quelle 10 verwendet wird, und es erforderlich ist, das von der Laserquelle 10 ausgesandte Strahlenbündel in ein breites paralleles Strahlenbündel umzuwandeln, so wird ein Strahlauf weiter statt der Sammellinse 11 und der Sammellinse 14 ver wendet. Wenn eine Lichtquelle, die nur die Anregungslichtkom ponente erzeugt, verwendet wird, so ist das Anregungsfilter 15 nicht erforderlich. Wenn eine Lichtquelle verwendet wird, welche die Impulsbreite oder die Impulsperiode steuern kann, so ist der Verschluß 12 unnötig. Wenn eine Lichtquelle ver wendet wird, welche die Lichtmenge steuern oder regeln kann, so ist das ND-Filter 13 unnötig.

Wie aus den Fig. 1 und 2 hervorgeht, weist das optische Dun kelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem bei dieser Ausführungs form das zonale Licht erzeugende zonale Faseroptikbündel 20 auf, eine zonale Sammellinse 21, die das von dem zonalen Fa seroptikbündel 20 ausgesandte, zonale Licht in im wesentli chen paralleles Licht umwandelt, und eine zonale Kondensor linse 22, welche das zonale Licht auf die Oberfläche der Pro be 1 fokussiert, die auf einer Stütze 35 befestigt ist.

Gemäß den Fig. 3 und 4 weist das zonale Faseroptikbündel 20 mehrere Faseroptiken auf. Ein Ende dieser mehreren Fasern ist so gebündelt, daß das Einlaßende 20a des zonalen Faser optikbündels 20 erzeugt wird, während das andere Ende wie ein ringförmiges Band geformt ist, das die Außenseite eines Objektivtubus 33 des Mikroskops so umgibt, daß ein Auslaßende 20b des zonalen Faseroptikbündels 20 gebildet wird. Hierbei ist der Objektivtubus 33 so angeordnet, daß er zwischen einer Öffnung 20c, die an einem gekrümmten Abschnitt des zonalen Faseroptikbündels 20 vorgesehen ist, und dem Auslaßende 20b so hindurchdringt, daß er die Faseroptiken teilt.

Das durch das Anregungsfilter 15 hindurchgegangene Anregungs licht läßt man auf das Einlaßende 20a des zonalen Faseroptik bündels 20 einfallen, und dann wird das Licht durch das Inne re des zonalen Faseroptikbündels 20 geführt, und schließlich vom Auslaßende 20b des zonalen Faseroptikbündels 20 in Rich tung auf die Probe 1 als zonales Licht ausgesandt. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, ist die zonale Kollimatorlinse 21 eine zonale Linse, die um den Objektivtubus 33 herum und vor dem Auslaßende 20b des zonalen Faseroptikbündels 20 angeordnet ist, und zonales Licht A, welches von dem zonalen Faseroptik bündel 20 ausgesandt wird, in im wesentlichen paralleles Licht umwandelt.

Die zonale Kondensorlinse 22 ist eine zonale Linse, welche um den Objektivtubus 33 herum angeordnet ist, und das zonale Licht A, welches hier von der zonalen Kollimatorlinse 21 aus angekommen ist, auf die Oberfläche der Probe 1 fokussiert, um diese zu bestrahlen. Wenn hierbei eine Faseroptik mit Kugelspitze verwendet wird, die ein kugelförmiges Auslaßende aufweist und paralleles Licht abgibt, kann die zonale Kolli matorlinse 21 weggelassen werden. Vorzugsweise bestehen das zonale Faseroptikbündel 20, die zonale Kollimatorlinse 21, und die zonale Kondensorlinse 22 aus einem Material mit ge ringerer Eigenfluoreszenz, beispielsweise aus synthetischem Quarz.

Die Probe 1 ist eine Flüssigkeit oder Zelle, die ein schwach fluoreszierendes Material oder ein fluoreszierend markiertes Molekül enthält, oder ein Festkörper, der ein schwach fluo reszierendes Material enthält. Wenn eine derartige, ein fluo reszierendes Material enthaltende Probe 1 mit dem Anregungs licht bestrahlt wird, wird die Fluoreszenz B von dem fluores zierenden Material ausgesandt. Wie aus den Fig. 1 und 2 her vorgeht, weist ein optisches Objektivsystem 30 ein Gesichts feld auf, welches sich über die gesamte Fläche oder ein Teil der Fläche auf der Oberfläche der Probe 1 erstreckt, die mit dem Anregungslicht bestrahlt wird. Im allgemeinen besteht es aus einer Gruppe aus mehreren Linsen. Ein Absorptionsfilter 31 ist an einer Position angeordnet, die zwischen mehreren Linsen liegt, welche das optische Objektivsystem 30 bilden. Das Absorptionsfilter 31 und ein Hilfs-Absorptionsfilter 32 blockieren die von der Probe 1 reflektierte Anregungslicht komponente, während sie die Fluoreszenz B durchlassen. Hier bei kann das Hilfs-Absorptionsfilter 32 weggelassen werden.

Die von dem fluoreszierenden Material ausgesandte Fluoreszenz B gelangt daher durch das optische Objektivsystem 30, das Absorptionsfilter 31 und das Hilfs-Absorptionsfilter 32 und erreicht dann einen Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40. Da der Anteil des Anregungslichts, der von der Oberfläche der Probe 1 reflektiert wird, von dem Absorptionsfilter 31 und dem Hilfs-Absorptionsfilter 32 absorbiert wird, erreicht er im Gegensatz hierzu nicht den Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40. Daher erreicht nur die Fluoreszenzkomponente den Fluores zenz-Erfassungsabschnitt 40. Vorzugsweise bestehen die das optische Objektivsystem 30 bildenden Linsen aus einem Mate rial mit geringerer Eigenfluoreszenz. Insbesondere die Lin sen, die zwischen dem Absorptionsfilter 31 und der Probe 1 angeordnet sind, bestehen vorzugsweise aus einem Material ohne Eigenfluoreszenz.

Hierbei enthält, wie in Fig. 1 gezeigt ist, der Objektivtubus 33 des Mikroskops das optische Objektivlinsensystem 30, das Absorptionsfilter 31 und das Hilfs-Absorptionsfilter 32 im Inneren und ist so ausgebildet, daß verhindert wird, daß das Anregungslicht oder Störlicht von außen aus den Fluoreszenz- Erfassungsabschnitt 40 erreicht. Der Fluoreszenz-Erfassungs abschnitt 40 erfaßt die dort ankommende Fluoreszenz. Als Fluo reszenz-Erfassungsabschnitt 40 wird ein hochempfindlicher Detektor verwendet, beispielsweise eine gekühlte CCD oder ei ne Photomultiplierröhre, welche eine Photonenzählung ermög licht. Um ein Bild der Fluoreszenz B aufzunehmen, wird eine gekühlte CCD eingesetzt.

Da der optische Weg, über welchen sich das Anregungslicht von der Lichtquelle 10 zur Probe 1 ausbreitet, und der optische Weg, durch welchen die von dem fluoreszierenden Material in der Probe 1 ausgesandte Fluoreszenz B den Fluoreszenz-Erfas sungsabschnitt 40 erreicht, voneinander getrennt sind, er zeugt bei der vorliegenden Ausführungsform das Anregungslicht vor Erreichen der Probe 1 keine Fluoreszenz durch das opti sche Objektivsystem 30 oder dergleichen. Da das Absorptions filter 31 zum Absorbieren des Anregungslichts, welches von der Probe 1 gestreut wird, in der Mitte des optischen Objek tivsystems 30 angeordnet ist, ist die Anzahl optischer Geräte auf dem optischen Weg von der Probe 1 zum Absorptionsfilter 31 , also die Anzahl optischer Geräte, an welchen das von der Probe 1 gestreute Anregungslicht ankommt, kleiner als beim Stand der Technik, wodurch diese optischen Geräte weniger Fluoreszenz infolge von Anregungslicht erzeugen, das von der Probe 1 gestreut wird. Aus der Fluoreszenzkomponente, welche den Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 erreicht, wird daher die von der Probe 1 ausgesandte Fluoreszenz mit hoher Empfind lichkeit erfaßt.

Zweite Ausführungsform

Diese Ausführungsform ist im wesentlichen ebenso aufgebaut wie die voranstehend geschilderte erste Ausführungsform, mit Ausnahme des optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs systems. Wie aus Fig. 5 hervorgeht, sind bei der Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform der Aufbau und die Betriebs weise der Abschnitte von der Lichtquelle 10 bis zum optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem und der Aufbau und die Betriebsweise der Abschnitte von der Probe 1 bis zum Fluores zenz-Erfassungsabschnitt 40 ebenso wie bei der voranstehend geschilderten ersten Ausführungsform.

Wie aus Fig. 5 hervorgeht, weist das optische Dunkelfeld-Auf licht-Beleuchtungssystem bei dieser Ausführungsform einen ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegel 24 zur Erzeu gung zonalen Lichts auf, einen zonal reflektierenden Spiegel 23, der dieses zonale Licht zur Probe 1 hin reflektiert, so wie die zonale Kondensorlinse 22. Gemäß den Fig. 6 bis 8 weist der ein zonales Strahlenbündel erzeugende Spiegel 24 einen reflektierenden Spiegel 24A auf, der eine konische oder kegelstumpfförmige Seitenoberfläche als reflektierende Ober fläche aufweist, sowie einen reflektierenden Spiegel 24B, der eine Seitenoberfläche einer kegelstumpfförmigen Innenwand aufweist, die dem reflektierenden Spiegel 24A als reflektie rende Oberfläche gegenüberliegt. Gemäß Fig. 8 wird das Strah lenbündel, das auf den ein zonales Strahlenbündel erzeugen den Spiegel 24 von dessen Einlaßende 24a einfällt, am Anfang durch den reflektierenden Spiegel 24A reflektiert, der an der Oberfläche der konischen Seite vorgesehen ist, und dann von dem reflektierenden Spiegel 24B reflektiert, der an der Sei tenoberfläche der kegelstumpfförmigen Innenwand angeordnet ist, und wird dann von einem Auslaßende 24b des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegels 24 als zonales Licht A ausgesandt.

Der zonale reflektierende Spiegel 23 ist ein ringförmig re flektierender Spiegel, der um den Objektivtubus 33 und schräg zu diesem angeordnet ist, und das zonale Licht A, das in dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegel 24 erzeugt wird, in Richtung auf die Probe 1 reflektiert. Ein Abschnitt 33A des Objektivtubus 33, durch welchen das zonale Licht A gelangt, besteht aus einem transparenten Teil oder ist unter brochen, so daß das zonale Licht A, das von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegel 24 ausgegeben wird, den zonal reflektierenden Spiegel 23 erreichen kann.

Die zonale Kondensorlinse 22 ist eine zonale Linse, die um das optische Objektivsystem 30 herum angeordnet ist, und das zonale Licht A, welches bei ihr von dem zonal reflektieren den Spiegel 23 angekommen ist, auf die Oberfläche der Probe 1 fokussiert, um auf diese Weise diese zu bestrahlen. Hierbei bestehen der ein zonales Strahlenbündel erzeugende Spiegel 24, der zonal reflektierende Spiegel 23 und die zonale Kon densorlinse 22 vorzugsweise aus einem Material mit geringerer Eigenfluoreszenz, beispielsweise aus synthetischem Quarz.

Dritte Ausführungsform

Diese Ausführungsform ist im wesentlichen ebenso aufgebaut wie voranstehend geschilderte erste Ausführungsform, abgese hen von dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem. Wie aus Fig. 9 hervorgeht, sind in der Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß dieser Aus führungsform die Anordnungen und Betriebsweisen der Abschnit te von der Probe 1 bis zum Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 ebenso wie bei der voranstehend geschilderten ersten Ausfüh rungsform.

Wie aus Fig. 9 hervorgeht, weist das optische Dunkelfeld-Auf licht-Beleuchtungssystem gemäß der vorliegenden Ausführungs form eine Blendenöffnung 80 auf, ein ein zonales Strahlenbün del erzeugendes Prisma 27, eine Sehfeldblende 81, die Feld linse 19, den zonal reflektierenden Spiegel 23, die zonale Kollimatorlinse 21, und die zonale Kondensorlinse 22. Darüber hinaus weist diese Ausführungsform zusätzlich eine Fliegen augenlinse (Integratorlinse) 18 auf.

Die Fliegenaugenlinse 18, bei welcher eine Anzahl stangenför miger Linsen zur Erzielung einer gleichmäßigen Beleuchtung zu einem Bündel vereinigt sind, weist ein Einlaßende auf, wel ches stromabwärts der Sammellinse 11 vorgesehen ist. Die Aper turblende 80 stellt das die Probe 1 bestrahlende Anregungs licht auf die geforderte Helligkeit ein. Die Aperturblende 80 und das Einlaßende des ein zonales Strahlenbündel erzeu genden Prismas 27 sind an einer Position (einer zur Pupille konjugierten Position) unmittelbar stromabwärts der Fliegen augenlinse 18 angeordnet. Die Sehfeldblende 81 ist an einer Position angeordnet, die zur Probe 1 konjugiert ist, und be grenzt die Bestrahlung mit dem Anregungslicht auf nur den er forderlichen Abschnitt auf der Oberfläche der Probe 1. Bei einem derartigen optischen System können eine variable Aper turblende und Gesichtsfeldblende so arbeiten, daß die Probe 1 am wirksamsten mit der erforderlichen und ausreichenden Fläche und Lichtmenge angeregt wird, wodurch eine Erfassung des interessierenden fluoreszierenden Materials mit niedrigem Rauschen und hohem Wirkungsgrad ermöglicht wird.

Wie aus den Fig. 10 bis 11D hervorgeht, weist das ein zona les Strahlenbündel erzeugende Prisma 27 ein konkav-konisches oder konkav-kegelstumpfförmiges Prisma 27A auf, ein gegen überliegendes, kegelstumpfförmiges Prisma 27B, ein undurch lässiges, im wesentlichen konkav-konisches Halterungsteil 27C zur Aufnahme des Prismas 27A, und ein lichtundurchlässiges, im wesentlichen konkav-kegelstumpfförmiges Halterungsteil 27D, das in dem Prisma 27B aufgenommen ist. Das Strahlenbün del, das auf das ein zonales Strahlenbündel erzeugende Pris ma 27 von dessen Einlaßende 27a aus einfällt, wird am Anfang durch das konkav-konische Prisma 27A gebrochen, und dann durch das gegenüberliegende kegelstumpfförmige Prisma 27B ge brochen, so daß es von einem Auslaßende 27b des ein zonales Strahlenbündel erzeugendes Prisma 27 als das zonale Licht A ausgegeben wird, welches ein verkleinertes Strahlenbündel bildet. Das ein zonales Strahlenbündel erzeugende Prisma 27 kann frei wählbar die Breite und den Durchmesser des zonalen Strahlenbündels A festlegen. Das zonale Licht A, welches von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prisma 27 ausge sandt wird, wird durch das ND-Filter 13 hindurchgelassen, welches die Lichtmenge auf einen geeigneten Wert verringert, durch das Anregungsfilter 15, welches selektiv nur einen er forderlichen Wellenlängenbereich durchläßt, und durch die Gesichtsfeldlinse 19, so daß es in Richtung auf den zonal reflektierenden Spiegel 23 ausgesandt wird.

Wie aus Fig. 9 hervorgeht, ist der zonal reflektierende Spie gel 23 ein wie ein ringförmiges Band reflektierender Spiegel, der um den Objektivtubus 33 herum und schräg in bezug auf diesen angeordnet ist, und das zonale Licht A, das in dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prisma 27 erzeugt wird, in Richtung auf die Probe 1 reflektiert. Ein Abschnitt des Objektivtubus 33, durch welchen das zonale Licht A gelangt, besteht aus einem transparenten Teil oder ist unterbrochen, so daß das zonale Licht A, welches von dem ein zonales Strah lenbündel erzeugenden Prisma 27 ausgegeben wird, den zonal reflektierenden Spiegel 23 erreichen kann.

Die zonale Kondensorlinse 22 ist eine zonale Linse, die um den Objektivtubus 33 herum angeordnet ist, und das zonale Licht A, welches dort von dem zonal reflektierenden Spiegel 23 aus angekommen ist, auf die Oberfläche der Probe 1 fokus siert, um so diese zu bestrahlen. Hierbei bestehen die Ge sichtsfeldlinse 19, der zonal reflektierende Spiegel 23, und die zonale Kondensorlinse 22 vorzugsweise aus einem Material mit geringerer Eigenfluoreszenz, beispielsweise aus synthe tischem Quarz.

Bei dieser Ausführungsform ist ein in Fig. 12 gezeigter Spie gel 73 mit gekippter konischer Innenwand unterhalb der Probe 1 angeordnet. Wenn die Probe 1 transparent ist, geht ein Teil des Anregungslichts durch die Probe 1 hindurch. Das so hin durchgelangte Anregungslicht wird wiederholt an der Innenwand des Spiegels 73 mit gekippter konischer Innenwand reflektiert. Das Anregungslicht, welches die Spitze des Spiegels 73 mit gekippter konischer Innenwand erreicht hat, wird zum Einfall auf eine Faseroptik 74 veranlaßt, die mit einem Loch verbun den ist, das an der Spitze vorgesehen ist, und nach Durchgang durch die Faseroptik 74 wird die Intensität des Anregungs lichts durch einen Photodetektor 75 gemessen. Die Reflexion und Streuung des Anregungslichts, das durch die Probe 1 hin durchgelangt ist, werden daher ausgeschaltet, und es wird das Anregungslicht gemessen. Auf der Grundlage des so gemessenen Wertes können der Verschluß 12, das ND-Filter 13 und die Aper turblende 80 so gesteuert oder geregelt werden, daß die geeig nete Anregungslichtmenge und Anregungszeit eingestellt werden.

Vierte Ausführungsform

Wie aus Fig. 13 hervorgeht, weist die Dunkelfeld-Auflicht-Be leuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung bei dieser Ausfüh rungsform als optisches Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem die Aperturblende 80 auf, ein ein zonales Strahlenbündel erzeugendes Beugungsgitter 28, die Gesichtsfeldblende 81, die Feldlinse 19, den zonal reflektierenden Spiegel 23, die zonale Kollimatorlinse 21, und die zonale Kondensorlinse 22. Weiterhin weist diese Ausführungsform die Fliegenaugenlinse (Integratorlinse) 18 auf, einen Überwachungsstrahlteiler 82, und einen Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42.

Wie aus den Fig. 14A und 14B hervorgeht, ist das ein zonales Strahlenbündel erzeugende Beugungsgitter 28 als Paar opti scher Teile des Reflexions- oder Transmissionstyps ausgebil det, die den Beugungseffekt nutzen, und jeweils aus einem Zonengitter bestehen, welches einen sägezahnförmigen Quer schnitt aufweist, und ein zonales Strahlenbündel erzeugen kann. Fig. 14A ist eine Schnittansicht eines Paars ein zona les Bündel erzeugender Beugungsgitter, welche den Reflexions beugungseffekt verwenden, wogegen Fig. 14B schematisch deren Querschnittsform in vergrößertem Maßstab zeigt.

In diesem Fall gelangt das Anregungslicht, das auf ein Ein laßende 28a des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beu gungsgitters 28 einfällt, durch ein Loch, das im Zentrum eines zonalen Beugungsgitters 28A vorgesehen ist, und wird dann reflektiert und gebeugt durch das andere scheibenförmi ge Beugungsgitter 28B. Das so gebeugte Anregungslicht wird durch das Beugungsgitter 28A reflektiert und gebeugt, und dann von einem Auslaßende 28b des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beugungsgitters 28 als das zonale Licht A abge geben.

Andererseits ist Fig. 14C eine Schnittansicht eines Paars ein zonales Strahlenbündel erzeugender Beugungsgitter, welche den Transmissions-Beugungseffekt verwenden, während Fig. 14D schematisch deren Querschnittsform in vergrößertem Maßstab zeigt. In diesem Fall wird das Anregungslicht, welches auf das Einlaßende 28a des ein zonales Strahlenbündel er zeugen den Beugungsgitters 28 einfällt, durch einen scheibenförmigen Gitterabschnitt, der im Zentrum eines Beugungsgitters 28C vorgesehen ist, durchgelassen und gebeugt. Das so gebeugte Anregungslicht wird erneut durch das andere zonale Beugungs gitter 28D durchgelassen und gebeugt, und dann von dem Aus laßende 28b des ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beu gungsgitters 28 als das zonale Licht A abgegeben.

Wie aus Fig. 13 hervorgeht, reflektiert der Überwachungs strahlteiler 82 einen Teil (beispielsweise 0,1%) des An regungslichts und führt es dem Anregungslicht-Erfassungsab schnitt 42 zu, wodurch die Lichtmenge dieses Anteils des An regungslichts durch den Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42 gemessen wird. Auf der Grundlage des Ergebnisses dieser Messung können der Verschluß 12, das ND-Filter 13 und die Aperturblende 18 so gesteuert oder geregelt werden, daß die geeignete Anregungslichtmenge und Anregungszeit eingestellt werden.

Wenn hierbei ein Laser als Lichtquelle 10 verwendet wird, wird ein Strahlaufweiter verwendet, wogegen das Anregungs filter 15 unnötig ist. Darüber hinaus besteht der Über wachungsstrahlteiler 82 vorzugsweise aus einem Material mit geringerer Fluoreszenz.

Da bei dem voranstehend geschilderten zweiten bis vierten Ausführungsformen, ebenso wie im Falle der ersten Ausfüh rungsform, der optische Weg, durch welchen sich das Anre gungslicht von der Lichtquelle 10 zur Probe 1 ausbreitet, und der optische Weg, durch welchen die Fluoreszenz B, die von dem fluoreszierenden Material in der Probe 1 ausgesandt wird, den Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 erreicht, von einander getrennt sind, veranlaßt das Anregungslicht vor Erreichen der Probe 1 nicht das optische Objektivsystem 30 und dergleichen zur Erzeugung von Fluoreszenz. In dem opti schen System auf dem optischen Weg stromaufwärts des Absorp tionsfilters 31 wird weniger Fluoreszenz durch das Anregungs licht erzeugt, das von der Probe 1 reflektiert wird. Weiter hin wird das von der Probe 1 reflektierte Anregungslicht durch das Absorptionsfilter abgeblockt. Der Fluoreszenz-Erfassungs abschnitt 40 erfaßt daher mit hoher Empfindlichkeit die von der Probe 1 ausgesandte Fluoreszenz B.

Nachstehend werden das Absorptionsfilter 31 und das optische Objektivsystem 30 mit weiteren Einzelheiten erläutert.

Fig. 15A ist eine Schnittansicht einer Anordnung, bei welcher ein Absorptionsfilter 31a an der Seite der Probe 1 einer Objektivlinse 30a angeordnet ist, die als optisches Objektiv system 30 ausgebildet ist. Es ist nützlich, wenn die numeri sche Apertur der Objektivlinse 30a klein ist, also wenn eine lange Entfernung zwischen der Objektivlinse 30a und der Pro be 1 sichergestellt werden kann. Da kein optisches Gerät sich zwischen dem Absorptionsfilter 31a und der Probe 1 befindet, tritt dort nämlich keine Fluoreszenz dazwischen auf, welche Rauschen hervorrufen könnte.

Fig. 15B ist eine Schnittansicht einer Anordnung, bei welcher bei mehreren Linsen 30b, 30c und 30a, die das optische Objek tivsystem 30 bilden, ein Absorptionsfilter 31b auf der Ober fläche der dritten Linse 30a auf der Seite der Probe 1 ange ordnet ist. In diesem Falle bestehen die erste Linse 30b und die zweite Linse 30c vorzugsweise aus einem nicht-fluoreszie renden Material.

Fig. 15C ist eine Schnittansicht einer Anordnung, bei welcher bei mehreren Linsen 30b, 30e, 30d und 30a, die das optische Objektivsystem 30 bilden, ein Absorptionsfilter 31c zwischen der dritten Linse 30d und der vierten Linse 30a angeordnet ist. In diesem Falle bestehen die erste Linse 30b, die zwei te Linse 30e und die dritte Linse 30d vorzugsweise aus einem nicht-fluoreszierenden Material.

Fig. 15D ist eine Schnittansicht einer Anordnung, bei welcher bei mehreren Linsen 30b, 30e, 30f und 30a, die das optische Objektivsystem 30 bilden, die dritte Linse 30f eine Linse (beispielsweise eine Fresnel-Zonenplatte oder Fresnel-Linse) ist, welche den Lichtbeugungseffekt nutzt, während ein Absorp tionsfilter 31d auf der Oberfläche der dritten Linse 30f auf der Seite der Probe 1 vorgesehen ist. In diesem Falle beste hen die erste Linse 30b und die zweite Linse 30e vorzugsweise aus einem nicht-fluoreszierenden Material.

Obwohl verschiedene Ausführungsformen für die Anordnungen des Absorptionsfilters 31 und des optischen Objektivsystems 30 zu sätzlich zu den voranstehend geschilderten Ausführungsformen vorhanden sein können, wird die Lichtmenge der Fluoreszenz, die von anderen Material als dem gewünschten fluoreszieren den Material erzeugt wird, kleiner, da die Anzahl optischer Geräte (Linsen, die das optische Objektivsystem 30 bilden), die zwischen der Probe 1 und dem Absorptionsfilter 31 vorhan den sind, kleiner ist, und die von den optischen Geräten er zeugte Fluoreszenz geringer ist, die zwischen der Probe 1 und dem Absorptionsfilter 31 vorhanden sind.

Nachstehend wird erläutert, wie die Meßempfindlichkeit für die Lichtmenge der Fluoreszenz B, die von dem fluoreszie renden Material in der Probe 1 in der Dunkelfeld-Auflicht- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung bei den voranstehenden er sten bis vierten Ausführungsformen ausgesandt wird, verbes sert ist, verglichen mit dem Falle des konventionellen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskops, wel ches in dem offengelegten japanischen Patent Nr. 3-266809 beschrieben ist. Hierbei ist das Absorptionsfilter 31 in der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der vorliegenden Erfindung das Absorptionsfilter 31a, das so wie in Fig. 15A gezeigt angeordnet ist. Hierbei wird also angenommen, daß das Absorptionsfilter 31 an einem Ort zwischen dem optischen Objektivsystem 30 und der Probe 1 angeordnet ist.

Bei beiden Vorrichtungen wird angenommen, daß das Anregungs licht, welches die Probe 1 bestrahlt, eine Einheitsintensität aufweist (mit einer Einheit von Photonen oder dergleichen). Es wird angenommen, daß das Fluoreszenzverhältnis (also die Anzahl der fluoreszierenden Photonen, geteilt durch die Anzahl der Photonen des Anregungslichts) F0 der Objektivlinse in dem konventionellen Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop 10^-7 beträgt, und daß das Fluoreszenzverhältnis F1 des opti schen Objektivlinsensystems in der Auflicht-Beleuchtungs- Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfin dung ebenfalls 10^-7 beträgt. Das Extinktionsverhältnis (Transmission der Anregungslichtenergie, geteilt durch Trans mission der Fluoreszenzenergie) γ des Absorptionsfilters 31 wird als 10^-5 angenommen. Das Streuverhältnis (also die Lichtmenge des Anregungslichts, gestreut von der Probe 1 so, daß es auf die Öffnung der Objektivlinse 30 gerichtet wird, geteilt durch die Lichtmenge des die Probe 1 bestrahlenden Anregungslichts) R wird mit 10^-3 angenommen. Dies sind typi sche Werte für derartige Teile, die momentan verfügbar sind.

Bei einer Berechnung mit diesen Werten beträgt die Fluores zenz, die von der Objektivlinse des konventionellen Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskops erzeugt wird:

F0 × R = 10^-7 × 10^-3 = 10^-10 (1)

Bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikros kopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung wird beinahe das gesamte Anregungslicht von dem Absorptionsfilter 31 ab sorbiert, wogegen das Anregungslicht kaum so durch das Absorp tionsfilter 31 hindurchgeht, daß es auf die Öffnung des opti schen Objektivsystems 30 einfällt. Die Fluoreszenz, die von dem optischen Objektivsystem 30 der Dunkelfeld-Auflicht-Be leuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorlie genden Erfindung erzeugt wird, beträgt:

F1 × γ × R = 10^-7 × 10^-3 × 10^-4 = 10¹⁵ (2)

Die Fluoreszenz, die von dem optischen Objektivsystem der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, ist da her um fünf Größenordnungen kleiner als jene Fluoreszenz, die von der Objektivlinse des konventionellen Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskops erzeugt wird.

Wenn andernfalls das Fluoreszenzmaterial in der Probe 1 dünn ist, und angenommen wird, daß die Anzahl an Teilen des Fluo resmaterials N beträgt, die Quantenausbeute des fluoreszie renden Materials Q, der Absorptionsquerschnitt des Anregungs lichts in der Probe σ (m²), und das Gesichtsfeld des Mikros kops S (m²), so wird die Fluoreszenz If, die von dem fluores zierenden Material in der Probe 1 ausgesandt wird, durch fol genden Ausdruck dargestellt:

If = N × Q × σ/S (3)

(vergleiche beispielsweise J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, 1983). Nimmt man hier folgende typische Werte an:

N=1 , Q=1, σ=10^-20 (m²), S=10^-7 (m²) (4)

so erhält man If zu:

If = 10^-12 (5)

Es wird darauf hingewiesen, daß der Wirkungsgrad des Sammelns und der Transmission bei dem optischen System im wesentlichen gleich 10^-1 ist. Die Intensität der den Detektor erreichen den Fluoreszenz beträgt daher praktisch 10^-13.

Daher ist bei dem konventionellen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungs-Fluoreszenzmikroskop die Lichtmenge der Fluoreszenz B, die von dem fluoreszierenden Material in der Probe ausgesandt wird, um drei Größenordnungen kleiner als die Lichtmenge der Fluoreszenz, die von der Objektivlinse erzeugt wird, was die Messung schwierig macht. Im Gegensatz hierzu ist bei der Dun kelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung die Lichtmenge der Fluores zenz B, die von dem Fluoreszenzmaterial in der Probe 1 ausge sandt wird, um zwei Größenordnungen größer als die Fluores zenz, die von dem optischen Objektivsystem 30 erzeugt wird, was die Messung ermöglicht.

In Fällen, in welchen das Absorptionsfilter 31 an den in den Fig. 15B bis 15D gezeigten Positionen angeordnet ist, ist die Lichtmenge der von dem optischen Objektivsystem 30 erzeugten Fluoreszenz geringer als jene, die von der Objektivlinse in dem konventionellen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluores zenzmikroskop erzeugt wird. Insbesondere dann, wenn die Lin sen, die das optische Objektivsystem 30 bilden, und zwischen dem Absorptionsfilter 31 und der Probe 1 vorhanden sind, aus einem nicht-fluoreszierenden Material bestehen, nimmt die Lichtmenge der von der Objektivlinse 30 erzeugten Fluoreszenz weiter ab.

Fünfte Ausführungsform

Wie aus Fig. 16 hervorgeht, ist die Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vor liegenden Ausführungsform im wesentlichen ebenso aufgebaut wie die voranstehend geschilderte erste Ausführungsform. Bei der Anordnung gemäß der vorliegenden Ausführungsform sind jedoch, zusätzlich zur Anordnung der ersten Ausführungsform, ein Anregungslicht-Erfassungsmechanismus vorgesehen, der ei ne Anregungslicht-Meßfaser 26 zum Abzweigen eines Teils des Anregungslichts aufweist, und einen Anregungslicht-Erfassungs abschnitt 42 zur Überwachung der Intensität des Anregungs lichts, sowie ein Verarbeitungssteuerabschnitt 50, der die Intensität und Impulsform des Anregungslichts steuert und ei ne arithmetische Verarbeitung des Meßergebnisses der Fluores zenzintensität oder dergleichen durchführt, und schließlich ein Anzeigeabschnitt 51 zur Anzeige des Ergebnisses der arith metischen Verarbeitung, die von dem Verarbeitungssteuerab schnitt 50 durchgeführt wird.

Wie in Fig. 17 gezeigt ist, ist ein Einlaßende 26a der An regungslicht-Meßphase 26 mit dem Einlaßende des zonalen opti 36384 00070 552 001000280000000200012000285913627300040 0002019630322 00004 36265 schen Faserbündels 20 zusammengebündelt, welches ein Teil des optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystems ist, und ist so angeordnet, daß ein Teil (beispielsweise 0,1%) des Anregungslichts, welches von der Seite der Lichtquelle 10 kommt, hierauf einfällt. Der Anregungslicht-Erfassungs abschnitt 42 mißt die Lichtmenge, die von einem Auslaßende 26b der Anregungslicht-Meßphase 26 ausgesandt wird, und ver wendet den so gemessenen Wert als Index für die Menge des Anregungslichtes, welches die Probe 1 bestrahlt.

Hierbei kann auch bei dieser Ausführungsform dann, wenn ei ne mit einer kugelförmigen Spitze versehene optische Faser eingesetzt wird, die ein kugelförmiges Auslaßende aufweist und paralleles Licht ausgibt, die zonale Kollimatorlinse 21 weggelassen werden. Vorzugsweise bestehen das zonale Faser optikbündel 20, die zonale Kollimatorlinse 21 und die zonale Kondensorlinse 22 aus einem Material mit geringer Eigenfluo reszenz, beispielsweise synthetischem Quarz.

Wie in Fig. 16 gezeigt ist, weist der Verarbeitungssteuer abschnitt 50 einen Datenverarbeitungsabschnitt 50A auf, der eine arithmetische Verarbeitung der Lichtmenge der Fluores zenz durchführt, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 gemessen wird, sowie der Lichtmenge des Anregungslichts, die beispielsweise von dem Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42 gemessen wird, berechnet deren Verhältnis zueinander, und überträgt das Ergebnis dieser Verarbeitung an den Anzeige ab schnitt 51; wogegen der Anzeigeabschnitt 51 das Ergebnis der Verarbeitung anzeigt. Weiterhin weist der Verarbeitungs- Steuerabschnitt 50 einen Anregungslicht-Steuerabschnitt 50B zum Steuern der Lichtmenge des Anregungslichts auf, welches von der Lichtquelle 10 ausgesandt wird und die Probe 1 be strahlt, um sie auf einem vorbestimmten Wert zu halten, oder um den Anregungslichtimpuls oszillieren zu lassen und die Impulsbreite oder Impulsperiode dieses Impulses zu steuern, um vorbestimmte Werte aufrechtzuerhalten. Für diese Steuerun gen wird der Betrieb der Lichtquelle 10 oder des Verschlusses 12 gesteuert. Wenn die Lichtquelle 10 eine steuerbare Impuls lichtquelle ist, können die Impulsbreite und die Impulsperio de direkt in bezug auf die Lichtquelle 10 gesteuert werden. Um die Lichtmenge des Anregungslichts zu steuern, kann das ND-Filter 13 durch ein anderes Filter ersetzt werden.

Hierbei kann ein Strahlteiler statt der Anregungslicht-Meß phase 26 dazu verwendet werden, einen Teil des Anregungs lichts zu reflektieren, wodurch das reflektierte Licht von dem Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42 gemessen werden kann, und der so gemessene Wert kann als Index für die Licht menge des Anregungslichts verwendet werden, welches die Pro be 1 bestrahlt.

Nachstehend erfolgt eine Erläuterung der quantitativen Mes sung fluoreszierenden Materials, bei welcher die Dunkelfeld- Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform verwendet wird.

Wenn die Intensität des Anregungslichts, welches die Probe 1 beleuchtet, gleich einem vorbestimmten Wert oder höher wird, ist die Intensität der Fluoreszenz B gesättigt, die von dem fluoreszierenden Material in der Probe 1 ausgesandt wird. Nimmt man an, daß diese gesättigte Fluoreszenzintensität Ifs beträgt, die Intensität des die Probe 1 bestrahlenden Anre gungslichts gleich Ii ist, die Anzahl an Teilen an fluoreszie rendem Material in der Probe 1 gleich N, die Quantenausbeute des fluoreszierenden Materials gleich Q, der Absorptionsquer schnitt des Anregungslichts in der Probe 1 gleich σ, und das Gesichtsfeld des Mikroskops gleich S, so ergibt sich die In tensität If der Fluoreszenz B unter Berücksichtigung der Sät tigung durch folgenden Ausdruck:

If = (N × Q × σ/S) × Ii × Ifs/(Ii + Ifs) (6)

(vergleiche beispielsweise K. Visscher, G. J. Brakenhoff, und T. D. Visser, "Fluorescence Saturation in Confocal Micros copy", Journal of Microscopy, Bd. 175 (1994), Teil 2, Sei ten 162-165).

Wenn hierbei die Intensität Ii des die Probe 1 bestrahlenden Anregungslichts und die gesättigte Fluoreszenzintensität Ifs in folgender Beziehung stehen:

Ii « Ifs (7)

so wird der Ausdruck (6) zu:

If = (N × Q × σ/S) × Ii (8)

Wenn nämlich die Intensität Ii des die Probe 1 bestrahlenden Anregungslichts kleiner als die gesättigte Fluoreszenzinten sität Ifs ist, so ist die Intensität der Fluoreszenz B, die von den fluoreszierenden Materialien in der Probe 1 ausgesandt wird, proportional zur Intensität Ii des die Probe 1 bestrah lenden Anregungslichts, und zur Anzahl an Teilen des fluores zierenden Materials N in der Probe 1.

Andererseits ist es wünschenswert, um die Messung der Fluores zenzintensität in dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 mit hoher Genauigkeit durchzuführen, daß die Intensität des die Probe 1 bestrahlenden Anregungslichts hoch ist. Wenn die In tensität des die Probe 1 bestrahlenden Anregungslichts zu nimmt, wird es allerdings wahrscheinlich, daß eine Verfärbung und eine Extinktion auftreten.

Wenn daher der Verarbeitungs-Steuerabschnitt 50 die Intensi tät des Lichtbündels, die von der Lichtquelle 10 ausgesandt wird, so einstellt, daß die Intensität des Anregungslichts, welches die Probe 1 bestrahlt, kleiner als die gesättigte In tensität Ifs ist, jedoch so hoch, daß keine Verfärbung und Extinktion auftreten, während darüber hinaus die Fluoreszenz- Intensität, die an dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 gemessen wird, durch die Anregungslichtintensität dividiert wird, die an dem Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42 gemes sen wird, so ergibt das Ergebnis dieser Division, daß von dem Anzeigeabschnitt 51 angezeigt wird, die Menge an fluores zierendem Material in der Probe 1. Daher kann das fluoreszie rende Material in der Probe 1 quantitativ gemessen werden.

Bei der tatsächlichen Messung ist es schwierig, die Bestrah lungsintensität Ii in bezug auf die Probe direkt zu messen. Daher werden unter Bezugnahme auf bekanntes, fluoreszierendes Material und Bedingungen (N, Q, σ und S), unter Umständen, bei welchen die Fluoreszenzintensität If und die Bestrahlungs überwachungsintensität Im, die an dem Anregungslicht-Erfas sungsabschnitt 42 gemessen werden, proportional zueinander sind, die Fluoreszenzintensität If und die Bestrahlungsüber wachungsintensität Im vorher gemessen. Aus folgenden Bezie hungen:

If = (N × Q × σ/S) × (Im/ki) (8a)

und

Im = ki × Ii (8b)

welche eine Abänderung des Ausdruck (8) darstellen, wird dann der proportionale Koeffizient Ki für diese Mikroskopvorrich tung bestimmt. Unter Bezugnahme auf diesen Proportionalitäts koeffizienten wird dann die Messung unter Umständen durchge führt, bei welchen die Fluoreszenz und die Bestrahlungsüber wachungsintensität proportional zueinander sind.

Nachstehend erfolgt eine Erläuterung der Beobachtung der Be wegung des fluoreszierenden Materials unter Verwendung der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrich tung gemäß der vorliegenden Erfindung. Hierbei wird als der Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 ein Detektor wie beispiels weise eine gekühlte CCD verwendet, welche das Fluoreszenz bild aufnehmen kann.

Um ein scharfes Fluoreszenzbild eines fluoreszierenden Mate rials aufzunehmen, welches eine Bewegung durchführt, bei spielsweise eine Brown′sche Molekularbewegung in der Probe 1, ist es erforderlich, daß der Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 das Bild mit einer geeigneten Bildaufnahmezeit t aufnimmt. Die mittlere Länge der Bewegung des fluoreszierenden Mate rials innerhalb der Bildaufnahmezeit t darf daher nicht größer als die Auflösung des Mikroskops sein. Nimmt man an, daß der Diffusionskoeffizient des fluoreszierenden Materials in der Probe gleich D ist, so ist die mittlere Bewegungslänge (Wur zel des quadratischen Mittelwerts der Bewegungslänge) inner halb der Bildaufnahmezeit t gleich (2 × D × t)^1/2. Nimmt man an, daß die Auflösung des Mikroskops gleich δ ist, so ist die Bedingung zur Aufnahme eines klaren Fluoreszenzbilds durch folgenden Ausdruck gegeben:

(2 × D × t)^1/2 < δ (9)

nämlich:

t < δ²/(2 × D) (10)

Die Auflösung δ des Mikroskops wird durch die numerische Apertur NA des Mikroskops und die Wellenlänge λ oder Fluores zenz B gemäß folgender Beziehung gegeben:

δ λ/(2 × NA) (11)

Weiterhin ist der Diffusionskoeffizient D des fluoreszieren den Materials durch die Boltzmann-Konstante k, die absolute Temperatur T, den Durchmesser a des fluoreszierenden Materi als, und den Viskositätskoeffizienten η der Probe 1 durch folgende Beziehung gegeben:

D = k × T/(6 × π × a × η) (12)

(vergleiche beispielsweise Fumiko Yonezawa, Buraun Undo (Brown′sche Bewegung), Kyoritsu Shuppan, 1986).

Nimmt man beispielsweise als typische Werte den Viskositäts koeffizienten η der Probe 1 zu 10^-3 Pa·s an, die absolute Temperatur T zu 300 K, die Auflösung δ des Mikroskops zu 200 nm, wobei die Boltzmann-Konstante k gleich 1,38 × 10^-23 J/K ist, so betragen geeignete Bildaufnahmezeiten für den Durch messer 1 nm, 2 nm, 4 nm, 10 nm, bzw. 100 nm des fluoreszie renden Materials 4,6 × 10^-5, 9,1 × 10^-5, 1,8 × 10^-4, 4,6 × 10^-4, und 4,6 × 10^-3 Sekunden oder weniger.

Der Verarbeitungs-Steuerabschnitt 50 steuert daher das Öffnen und Schließen des Verschlusses 12 auf solche Weise, daß die Zeit, in welcher der Verschluß 12 geöffnet ist, nicht länger ist als die durch den Ausdruck (10) angegebene Zeit. Wenn die Lichtquelle 10 eine steuerbare Impulslichtquelle ist, so wird die von der Lichtquelle 10 ausgesandte Impulsbreite direkt gesteuert. Weiterhin bestimmt der Bearbeitungs-Steuerabschnitt 50 die Impulsbreite des Anregungslichts aus der Änderung der Anregungslicht-Intensität im Verlauf der Zeit, gemessen an dem Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42, und koppelt dieses Ergebnis zur Steuerung des Anregungslichts zurück. Der Fluo reszenz-Erfassungsabschnitt 40 nimmt das Bild der Fluoreszenz B auf, die von dem fluoreszierenden Material in der Probe 1 ausgesandt wird, wogegen der Anzeigeabschnitt 51 dieses Fluo reszenzbild anzeigt.

Auf die voranstehend geschilderte Weise kann ein scharfes Bild als Fluoreszenzbild erhalten werden, welches auf dem Anzeigeabschnitt 51 angezeigt wird. Wenn die Probe 1 wieder holt mit einem wie voranstehend geschildert ausgebildeten Anregungslichtimpuls bestrahlt wird, und das Bild der von dem fluoreszierenden Material ausgesandten Fluoreszenz B für jeden Impuls aufgenommen wird, kann der Zustand der Bewegung des fluoreszierenden Materials in der Probe 1 beobachtet wer den.

Wenn hierbei das die Probe 1 bestrahlende Anregungslicht ei ne Intensität aufweist, die den Ausdruck (7) erfüllt, sowie eine Impulsform, die dem Ausdruck (10) genügt, während bei spielsweise eine gekühlte CCD als Fluoreszenz-Erfassungsab schnitt 40 benutzt wird, um so gleichzeitig die Lichtmenge und das Bild der Fluoreszenz B zu messen, können die quanti tative Messung und die Beobachtung der Bewegung des fluores zierenden Materials in der Probe 1 gleichzeitig durchgeführt werden.

Sechste Ausführungsform

Wie aus Fig. 18 hervorgeht, ist die Dunkelfeld-Auflicht-Be leuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorlie genden Ausführungsform zusätzlich zu den Bauteilen der voran stehend geschilderten ersten bis vierten Ausführungsformen mit dem Anregungslicht-Erfassungsabschnitt 42 versehen, dem Bearbeitungs-Steuerabschnitt 50, dem Anzeigeabschnitt 51 so wie einem Fluoreszenz-Erfassungsverzögerungsmechanismus, der einen Strahlteiler 60, einen Photodetektor 61, einen Verzöge rungsgenerator 62, eine Gate-Vorrichtung 63, und eine Über tragungslinse 64 aufweist.

In dieser Figur sind ein optisches System 2, das von der Lichtquelle 10 über das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungssystem bis zur Probe 1 reicht, sowie ein optisches Sy stem 3, das von der Probe 1 über die Objektivlinse 3 und das Absorptionsfilter 31 bis zur Gate-Vorrichtung 63 reicht, vereinfacht dargestellt. Weiterhin kann das optische Dunkel feld-Auflicht-Beleuchtungssystem eines der Systeme sein, die bei der ersten bis vierten Ausführungsform beschrieben wur den.

Ein Hauptteil des impulsförmigen Anregungslichts, das von der Lichtquelle 10 ausgesandt wird, wird durch den Strahlteiler 60 hindurchgelassen, so daß es durch das optische System 2 hindurchgelangt und dann ein fluoreszierendes Material in der Probe erregt, wodurch diese zur Erzeugung einer Fluoreszenz veranlaßt wird. Bei dem geringen Anteil des Anregungslichts, das von dem Strahlteiler 60 reflektiert wird, werden die Lichtmenge und die Ankunftszeit von dem Photodetektor 61 ge messen. Nach Empfang der Meßdaten von dem Photodetektor 61 weist der Verzögerungsgenerator 62 die Gate-Vorrichtung 63 an, ihr Gate nur während eines vorbestimmten Zeitraums seit einer Zeit zu öffnen, die vorher unter Bezugnahme auf die Zeit festgelegt wurde, an welcher das Anregungslicht an dem Photodetektor 61 angekommen ist.

Die Gate-Vorrichtung 63 öffnet das Gate nur während des fest gelegten Zeitraums seit der durch den Verzögerungsgenerator 62 festgelegten Zeit, und empfängt hierdurch ein Fluoreszenz bild. Die Übertragungslinse 64 überträgt das auf der Gate- Vorrichtung 63 erzeugte Fluoreszenzbild an den Fluoreszenz- Erfassungsabschnitt 40. Mit einem derartigen Verfahren kann nach Anregung mit einem ausreichend kurzen Erregungslicht impuls (beispielsweise mit einer Impulsbreite von etwa 1 Pico sekunde) die Fluoreszenzlichtmenge mit einer vorbestimmten Verzögerungszeit und Zeitdauer (beispielsweise in der Größen ordnung von einigen Nanosekunden) gemessen werden. Für diese Verzögerungsvorrichtung können, abgesehen von dem elektri schen Verfahren, das durch den voranstehend geschilderten Photodetektor 61 und den Verzögerungsgenerator 62 durchgeführt wird, ein optischer Strahlteiler und ein beweglicher reflek tierender Spiegel verwendet werden, während die Gate-Vorrich tung 63 den Kerr-Effekt oder einen sättigbaren Absorber ein setzen kann.

Wenn die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikros kopvorrichtung gemäß der vorliegenden Ausführungsform in ei nem Fall eingesetzt wird, in welchem die Fluoreszenz eben falls durch Materialien abgesehen von dem gewünschten fluo reszierenden Material in der Probe 1 erzeugt wird, und die Lebensdauer dieser Fluoreszenz kürzer ist als jene der Fluo reszenz B, die von dem erwünschten fluoreszierenden Material ausgesandt wird, wird die Intensität der Fluoreszenz B von dem angestrebten fluoreszierenden Material auf folgende Wei se gemessen.

Es wird angenommen, daß der Spitzenwert der Fluoreszenz-In tensität der Fluoreszenz B, die von dem angestrebten fluores zierenden Material ausgestrahlt wird, und die entsprechende Fluoreszenz-Lebensdauer mit Is bzw. τs bezeichnet ist. Wei terhin wird angenommen, daß der Spitzenwert der Fluoreszenz- Intensität jener Fluoreszenz, die als Hintergrundrauschen bezeichnet wird, und von anderen Materialien als dem erwünsch ten fluoreszierenden Material ausgesandt wird, und deren Fluoreszenz-Lebensdauer durch Ib bzw. τb gegeben ist. Nimmt man an, daß die Zeit, die unter Bezugnahme auf die Zeit ge messen wird, bei welcher die Probe 1 mit dem gepulsten An regungslicht bestrahlt wird, gleich t ist, so ist das SB-Ver hältnis folgendermaßen festgelegt:

S/B = (Is/Ib) exp(-(1/τs - 1/τb)t) (13)

Nimmt man hierbei beispielsweise an, daß Is/Ib = 0,1 ist, τs = 10 ns, und τb = 1 ns, so wird das SB-Verhältnis größer oder gleich 1 im Falle von τ 2,6 ns.

In einem Fall, in welchem gepulstes Anregungslicht von der Lichtquelle 10 ausgesandt wird, und die Lebensdauer der von dem gewünschten fluoreszierenden Material ausgesandten Fluo reszenz B groß ist, so kann dann, wenn der Verzögerungsgene rator 62 auf eine geeignete Verzögerungszeit eingestellt wird, und der Verschluß (das Gate) der Gate-Vorrichtung 63 geöffnet wird, die Intensität der Fluoreszenz B an dem Fluo reszenz-Erfassungsabschnitt 40 gemessen werden. Zu dem Zeit punkt, an welchem die Intensität der Fluoreszenz B von dem gewünschten fluoreszierenden Material größer wird als die Intensität der Fluoreszenz von den anderen Materialien, er reicht nämlich ein Signal von dem Verzögerungsgenerator 62 die Gate-Vorrichtung 63, wodurch das Gate nur zum festgeleg ten Zeitpunkt und während des festgelegten Zeitraums geöff net wird, um die Fluoreszenz hindurchzulassen.

Daher gelangt die Fluoreszenz B von dem gewünschten fluores zierenden Material durch die Gate-Vorrichtung 63 und weiter hin durch die Übertragungslinse 64 hindurch, so daß sie den Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 erreicht, wodurch ihr Fluoreszenzbild aufgenommen wird. Der Bearbeitungs-Steuerab schnitt teilt das Fluoreszenzbild, das an dem Fluoreszenz- Erfassungsabschnitt 40 aufgenommen wird, durch die Anregungs licht-Intensität, die an dem Anregungslicht-Erfassungsab schnitt 42 gemessen wird, wogegen der Anzeigeabschnitt 51 das entsprechende Ergebnis anzeigt.

Weiterhin kann bei der Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluo reszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung das Fluoreszenzbild zu jedem Zeitpunkt nach dem Impuls des Anregungslichts aufgenommen werden, falls das Strahlenbündel, welches den Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt 40 erreicht, nur aus der Fluoreszenz B besteht, die von dem fluoreszierenden Material in der Probe 1 ausgesandt wird, wenn die Intensität der Fluoreszenz B, die durch die Gate-Vorrichtung 63 hin durchgelassen wird, als Bild an dem Fluoreszenz-Erfassungs abschnitt 40 aufgenommen wird, während die Zeit zur Öffnung des Gates der Gate-Vorrichtung 63 pro Impuls des die Probe 1 bestrahlenden Anregungslichts geändert wird. Daher kann die Fluoreszenz-Lebensdauerverteilung gemessen werden.

Siebte Ausführungsform

Wie in Fig. 19 gezeigt ist, ist die Dunkelfeld-Auflicht-Be leuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvorrichtung gemäß der vorlie genden Ausführungsform zusätzlich zu den Bauteilen der vor anstehend geschilderten ersten Ausführungsform mit der An regungslicht-Meßfaser 26 versehen, dem Anregungslicht-Erfas sungsabschnitt 42, dem Bearbeitungs-Steuerabschnitt 50, dem Anzeigeabschnitt 51, einer Betriebslichtquelle 70, welche die Oberfläche der Probe 1 bestrahlendes Betriebslicht erzeugt, einem Strahlenbündel-Betätigungsabschnitt 71, der die Posi tion, die mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, auf der Ober fläche der Probe 1 einstellt, einer Lichtteilervorrichtung 17, die das Betriebslicht reflektiert, während sie die Fluo reszenz B hindurchläßt, einem Absorptionsfilter 64, welche das Betriebslicht blockiert, während es den Fluoreszenzanteil durchläßt, und zwei Spiegeln 72 und 73 mit gekippter koni scher Innenwand, welche das Betriebslicht so absorbieren, daß der letztgenannte Spiegel nicht erreicht wird.

Als Lichtteilervorrichtung 17 wird beispielsweise ein di chroitischer Spiegel oder ein Polarisationsstrahlteiler ver wendet. Die Transmission und Reflexion werden entsprechend der Wellenlänge des Lichts ausgewählt, wenn ein dichroiti scher Spiegel verwendet wird, wogegen sie entsprechend der Polarisationsrichtung des Lichts ausgesucht werden, wenn ein Polarisationsstrahlteiler eingesetzt wird.

Das von der Lichtquelle 11 ausgesandte Anregungslicht be strahlt die Oberfläche der Probe 1 über die Sammellinse 11, den Verschluß 12, das ND-Filter 13, die Gesichtsfeldlinse 14, das Anregungsfilter 15, das zonale optische Faserbündel 20, die zonale Kollimatorlinse 21 und die zonale Kondensor linse 22. Das Bild der von der Probe 1 ausgesandten Fluores zenz B wird über die Objektivlinse 30, das Absorptionsfilter 31, die Lichtteilervorrichtung 17 und das Absorptionsfilter 64 übertragen, und dann so von dem Fluoreszenz-Erfassungsab schnitt 40 aufgenommen, daß es auf dem Anzeigeabschnitt 51 angezeigt wird.

Andererseits ist die Betriebslichtquelle 70 beispielsweise eine Laserlichtquelle, und erzeugt Betriebslicht (Laserlicht) mit langer Wellenlänge. Daher erzeugt das optische System kaum eine Eigenfluoreszenz. Dieses Betriebslicht wird von der Lichtteilervorrichtung 17 durch den Betriebsstrahlenbün del-Betätigungsabschnitt 71 reflektiert, und gelangt so durch die Objektivlinse 30 und das Absorptionsfilter 31, daß es die Oberfläche der Probe 1 bestrahlt. Der Betriebsstrahlenbündel- Betätigungsabschnitt 71 stellt die Position ein, an welcher die Oberfläche der Probe 1 mit dem Betriebslicht oder derglei chen bestrahlt wird. Wenn die Oberfläche der Probe 1 mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, ändert sich daher eine Eigen schaft eines fluoreszierenden Materials in der Probe 1 inner halb der so bestrahlten Fläche. Da ein Bild der von dem fluo reszierenden Material ausgesandten Fluoreszenz B an dem Fluo reszenz-Erfassungsabschnitt 40 aufgenommen wird, und dann an dem Anzeigeabschnitt 51 betrachtet wird, können das Verhalten des mit dem Betriebslicht bestrahlten fluoreszierende Mate rials sowie das Verhalten jenes fluoreszierenden Materials, das nicht mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, miteinander verglichen werden. Nicht nur die gemittelte Information über die fluoreszierende Materialien, sondern auch das Verhalten einzelner fluoreszierender Materialien in mikroskopischem Maßstab können daher beobachtet werden.

Hierbei gelangt der Anteil des Betriebslichts, welches durch den Betriebsstrahlenbündel-Betätigungsabschnitt 71 hindurch gelassen wird, durch die Lichtteilervorrichtung 17 als Kriech licht hindurch, wodurch er den Spiegel 72 mit schräg angeord neter konischer Innenwand erreicht. Wie aus Fig. 20A hervor geht, wird beinahe das gesamte Kriechlicht, das auf den Spie gel 72 mit schräger konischer Innenwand einfällt, von dessen schräg angeordneter, konischen Innenwand absorbiert, während ein Teil des Kriechlichts hierdurch reflektiert wird. Der so reflektierte Anteil des Kriechlichts wird beinahe erneut durch die Innenwand absorbiert. Der Spiegel 72 mit schräg angeord neter konischer Innenwand wiederholt diese Schritte. Daher absorbiert der Spiegel 72 mit schräg angeordnet er konischer Innenwand einen Hauptanteil des Kriechlichts von der Licht teilervorrichtung 17, wodurch die Intensität des Kriechlichts des Betriebslichts, das von dem Spiegel 72 mit schräg ange ordnet er konischer Innenwand gestreut und dann von der Rück seite der Lichtteilervorrichtung 17 auf den Fluoreszenz-Er fassungsabschnitt 40 reflektiert wird, sehr klein wird.

Entsprechend ist ein Spiegel 73 mit schräg angeordnet er konischer Innenwand unterhalb der Probe 1 angeordnet. Wie in Fig. 20B gezeigt ist, erreicht dann, wenn die Probe 1 eine transparente Probe ist, praktisch das gesamte Anregungslicht und Betriebslicht, welche die Probe 1 bestrahlt haben und durch diese hindurchgegangen sind, den Spiegel 73 mit schräg angeordneter konischer Innenwand und werden durch diesen ab sorbiert. Daher ist die Lichtmenge, die durch die Probe 1 hindurchgelassen wird und von dem Spiegel 73 mit schräg angeordneter konischer Innenwand auf den Fluoreszenz-Erfas sungsabschnitt 40 reflektiert wird, sehr klein. Nimmt man im einzelnen an, daß das Absorptionsvermögen 90% und das Reflexionsvermögen 10% im Falle eines schrägen Einfalls be trägt, so wird das gestreute Licht nach zehnfacher Reflexion auf 10^-10 abgeschwächt. Verglichen mit einem senkrechten Einfall bei einem Absorptionsvermögen von 99,99% (Refle xionsvermögen von 0,01%), wird daher das Reflexionsrauschen auf 10^-6 verringert.

Diese Spiegel 72 und 73 mit schräg angeordneter konischer In nenwand können so ausgebildet sein, daß eine konische Innen wand auf ihrer Oberfläche mit einer solchen Neigung vorgese hen ist, wie in Fig. 20A gezeigt ist. Alternativ hierzu kön nen sie eine konische Innenwandform aufweisen, bei welcher die Achse des Kegels kurvenförmig ausgebildet ist, wie in Fig. 20B gezeigt ist. Weiterhin können sie eine zusammengesetzte Anordnung aufweisen, die aus einer Zylinderform und einer schräg angeordneten konischen Innenwand besteht, wie in Fig. 20C gezeigt. Weiterhin kann ein Loch an der Spitze der koni schen Innenwand vorgesehen sein, mit welchem die Faseroptik 74 verbunden sein kann, um so nach außen das Licht abzufüh ren, welches die Spitze der konischen Innenwand erreicht hat, um dann das Licht auszustrahlen, oder die Lichtmenge dieses Lichts über den Photodetektor 75 zu überwachen. Wenn der Zylinder so lang ist, daß ein Problem auftreten kann, kann darüber hinaus der optische Pfad durch einen reflektierenden Spiegel abgelenkt werden, bevor das Licht den Spiegel mit schräg angeordneter konischer Innenwand erreicht.

Weiterhin absorbiert das Absorptionsfilter 64 einen Hauptan teil des Betriebslichts, welches durch den Spiegel 72 mit schräg angeordneter konischer Innenwand gestreut wurde, ohne hierdurch absorbiert zu werden, und dann durch die Rückseite der Lichtteilervorrichtung 17 in Richtung auf den Fluores zenz-Erfassungsabschnitt 40 reflektiert zu werden, und ebenso einen Hauptanteil des Betriebslichts, welches von der Probe 1 reflektiert wurde, und dann durch die Objektivlinse 30 und das Absorptionsfilter 31 hindurchgegangen ist, so daß es durch die Lichtteilervorrichtung 17 als Kriechlicht hindurchgelangt. Daher ist der Anteil des Betriebslichts, welches durch das Absorptionsfilter 64 hindurchgegangen ist und den Fluoreszenz- Erfassungsabschnitt 40 erreicht, so klein, daß die Empfind lichkeit des Fluoreszenz-Erfassungsabschnitts hierdurch nicht verringert wird.

In diesem Zusammenhang sollte das Betriebslicht bei der vor liegenden Ausführungsform nicht auf Laserlicht beschränkt sein. Es kann jede Lichtquelle verwendet werden. Weiterhin kann beispielsweise ein gepulster Laser bis zur Beugungsgrenze des Lichts fokussiert werden, so daß er für die Fluoreszenz nach einer Zwei-Photonen-Anregung oder Photolyse eines einge fangenen Materials nach Zwei-Photonen-Anregung verwendet wird. Wenn die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikros kopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung und ein Spek trumanalysator in Kombination verwendet werden, kann darüber hinaus das Spektrum der von der Probe 1 ausgesandten Fluores zenz mit hoher Empfindlichkeit untersucht werden. Wenn die zuerst genannte Vorrichtung in Kombination mit einem Polari sationsanalysator verwendet wird, kann der Polarisationszu stand der von der Probe 1 ausgesandten Fluoreszenz mit hoher Empfindlichkeit untersucht werden.

Wie voranstehend erläutert, kann infolge der Tatsache, daß die Lebensdauer, das Spektrum, die Polarisation und derglei chen der von dem fluoreszierenden Material in der Probe 1 ausgesandten Fluoreszenz mit hervorragender Empfindlichkeit analysiert werden können, und auch der Bewegungszustand des fluoreszierenden Materials in der Probe 1 beobachtet werden kann, die Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikros kopvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Identi fizierung des fluoreszierenden Materials in der Probe 1 und darüber hinaus zu dessen Untersuchung oder dergleichen einge setzt werden.

Ohne auf die voranstehend geschilderten Ausführungsformen beschränkt zu sein, läßt sich die vorliegende Erfindung auf verschiedene Arten und Weisen abändern. Ohne auf die in den Fig. 15A bis 15B gezeigten Positionen eingeschränkt zu sein, kann beispielsweise das Absorptionsfilter an jedem Ort in Linsengruppen angeordnet werden, welche das optische Objektiv system bilden.

Da die vorliegende Erfindung ein optisches System mit Dunkel feld-Auflicht-Beleuchtung aufweist, bei welchem Anregungs licht eine Probe über die Außenseite des optischen Objektiv systems bestrahlt, ohne durch dieses hindurchzugehen, wogegen ein Absorptionsfilter, das die Anregungslicht-Komponente ab sorbiert, die von der Probenoberfläche gestreut wird, während es die Fluoreszenz hindurchläßt, die von einem fluoreszieren den Material in der Probe ausgesandt wird, zwischen mehreren Linsen angeordnet ist, welche das optische Objektivsystem oder die Probenseite des optischen Objektivsystems bilden, wird wie voranstehend im einzelnen geschildert die Erzeugung einer Fluoreszenz von anderen Materialien als dem fluoreszie renden Material in der Probe unterdrückt, wodurch die Fluo reszenz mit hoher Empfindlichkeit erfaßt werden kann, und es darüber hinaus ermöglicht wird, die Fluoreszenz von einem ein zelnen, fluoreszierenden Molekül zu erfassen.

Obwohl die Erzeugung von Fluoreszenz durch ein optisches Gerät wahrscheinlich ist, wenn eine Bestrahlung mit Anregungslicht mit kurzer Wellenlänge erfolgt, insbesondere beispielsweise Ultraviolettlicht, kann selbst in diesem Fall die Fluoreszenz mit hoher Empfindlichkeit gemessen werden. Da es ermöglicht wird, die Fluoreszenz mit hoher Empfindlichkeit zu erfassen, wird es möglich, quantitativ das fluoreszierende Material in der Probe zu messen, wenn die Probe mit Anregungslicht be strahlt wird, dessen Lichtmenge kleiner als die Fluoreszenz- Sättigungsintensität ist.

Wenn die Probe mit gepulstem Anregungslicht bestrahlt wird, dessen Impulsbreitendauer, innerhalb derer die mittlere Be wegungsentfernung des fluoreszierenden Materials kleiner als die Auflösung des Mikroskops ist, so kann ein Bild der Fluo reszenz betrachtet werden, die von einer nicht ortsfesten Fluoreszenzprobe ausgesandt wird. Wenn die Probe kontinuier lich mit gepulstem Anregungslicht bestrahlt wird, während das Bild der von der fluoreszierenden Probe ausgesandten Fluores zenz pro Impuls aufgenommen wird, kann darüber hinaus eine Beobachtung der Bewegung des fluoreszierenden Materials durch geführt werden.

Falls eine Gate- oder Tor-Vorrichtung auf dem optischen Weg angeordnet wird, über welchen die von dem fluoreszierenden Material in der Probe ausgesandte Fluoreszenz den Fluoreszenz- Erfassungsabschnitt erreicht, und das Gate oder das Tor der Gate- oder Tor-Vorrichtung nur während eines vorbestimmten Zeitraums nach einem vorbestimmten Zeitraum seit dem Zeitpunkt geöffnet wird, an welchem das Anregungslicht erzeugt wird, und die Lebensdauer der Fluoreszenz, die von dem interessie renden fluoreszierenden Material erzeugt wird, größer ist als die Lebensdauer jener Fluoreszenz, die von anderen Materialien als dem gewünschten fluoreszierenden Material erzeugt wird, so kann die Differenz ihrer Lebensdauern dazu eingesetzt wer den, selektiv die Fluoreszenz von dem interessierenden, fluo reszierenden Material zu messen.

Wenn die Intensität der Fluoreszenz von der Probe gemessen wird, nachdem die Probe mit dem gepulsten Anregungslicht be strahlt wurde, zu einem Zeitpunkt, an welchem die Intensität der von dem gewünschten Material erzeugten Fluoreszenz größer ist als die Fluoreszenz, die von anderen Materialien als dem gewünschten fluoreszierenden Material erzeugt wird, so kann die gewünschte Fluoreszenz gemessen werden. Wenn die Fluores zenz-Intensität zu jedem Zeitpunkt gemessen wird, nachdem ei ne Bestrahlung mit dem Anregungslichtimpuls erfolgte, so kann darüber hinaus die Fluoreszenz-Lebensdauer gemessen werden.

Wenn eine Probe mit Betriebslicht getrennt von dem Anregungs licht bestrahlt wird, so daß eine Eigenschaft eines fluores zierenden Materials in der Probe geändert wird, während ein Bild der von dem fluoreszierenden Material in der Probe auf genommen wird, so kann darüber hinaus das Verhalten des fluo reszierenden Materials, das mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, sowie das Verhalten des fluoreszierenden Materials, das nicht mit dem Betriebslicht bestrahlt wird, miteinander ver glichen werden. Nicht nur die gemittelte Information über die fluoreszierenden Materialien, sondern auch das Verhalten der einzelnen fluoreszierenden Materialien auf mikroskopischem Maßstab kann daher beobachtet werden.

Weiterhin kann die Vorgehensweise gemäß der vorliegenden Er findung auf die Identifizierung und Diagnose fluoreszieren der Materialien angewendet werden.

Aus der wie voranstehend geschildert beschriebenen Erfindung wird deutlich, daß sich die Erfindung auf zahlreiche Arten und Weisen abändern läßt. Derartige Abänderungen sollen nicht als Abweichung vom Wesen und Umfang der vorliegenden Erfindung verstanden werden, und es sollen sämtliche Abänderungen, die Fachleuten auf diesem Gebiet deutlich werden, als innerhalb des Wesens und Umfangs der vorliegenden Erfindung verstanden werden, die sich aus der Gesamtheit der vorliegenden Anmelde unterlagen ergeben, und von den beigefügten Patentansprüchen erfaßt sein sollen.

Die grundlegende japanische Anmeldung Nr. 193130/1995, die am 28. Juli 1995 eingereicht wurde, wird in die vorliegende An meldung durch Bezugnahme eingeschlossen.

Claims

1. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung zur Dunkelfeld-Beobachtung der Fluoreszenz, die von einem fluoreszierenden Material in einer Probe unter Auflicht-Beleuchtung erzeugt wird, wobei die Vor richtung aufweist:
ein optisches Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem, welches auf es einfallendes Licht auf die Probe als An regungslicht führt und hierdurch eine vorbestimmte Fläche beleuchtet;
ein optisches Objektivsystem, welches die Fluoreszenz sammelt, die von der Probe ausgesandt wird, welche von dem Anregungslicht durch das optische Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungssystem bestrahlt wird; und
einen Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt, der die von dem optischen Objektivsystem ausgesandte Fluoreszenz erfaßt;
wobei das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem das Anregungslicht der Probe über die Außenseite des opti schen Objektivsystems zuführt, als zonales Licht, welches durch Aufrechterhaltung einer Lichtmenge des Anregungs lichts erzeugt wird, und
das optische Objektivsystem aufweist:
ein Absorptionsfilter, welches bei dem auf es von der Probe einfallenden Licht eine Lichtkomponente blockiert, deren Wellenlänge im wesentlichen gleich der Wellenlänge des Anregungslichts ist, und
ein erstes optisches System, welches das auf es einfal lende Licht von dem Absorptionsfilter dem Fluoreszenz- Erfassungsabschnitt zuführt, und das so zugeführte Licht auf einer vorbestimmten Fläche sammelt.

2. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvor richtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein zona les Faseroptikbündel aufweist, welches auf seiner Einlaß endseite gleichmäßig gebündelt ist, während es wie ein Ringband auf seiner Auslaßendseite um einen optischen Weg herum gebündelt ist, der von dem optischen Objektivsystem ausgeht, und von dem Auslaßende als zonales Licht das An regungslicht aussendet, das auf dem Einlaßende als gleich förmiges Licht einfällt, sowie ein Zonenlinsensystem, wel ches das zonale Licht, das von dem Auslaßende des zonalen Faseroptikbündels ausgesandt wird, sammelt und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

3. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvor richtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem einen ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Spiegel aufweist, der durch einen ersten reflektierenden Spiegel gebildet wird, der eine konische oder kegelstumpfförmige Seitenoberfläche als reflektierende Oberfläche aufweist, und einen zwei ten reflektierenden Spiegel, der eine kegelstumpfförmige Innenwand aufweist, die der reflektierenden Oberfläche des ersten reflektierenden Spiegels als reflektierende Ober fläche gegenüberliegt, und als zonales Licht von dem zwei ten reflektierenden Spiegel das Anregungslicht aussendet, welches auf den ersten reflektierenden Spiegel einfällt, und zwar als gleichförmiges Licht, sowie einen zonale re flektierenden Spiegel, der das von dem Spiegel, der ein zonales Strahlenbündel bildet, ausgesandte Licht reflek tiert, um so das reflektierte, zonale Licht der Probe zu zuführen, und ein zonales Linsensystem, welches das zonale Licht, das von dem zonal reflektierenden Spiegel reflek tiert wird, sammelt und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

4. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein Prisma, welches ein zonales Strahlenbündel erzeugt, auf weist, welches durch ein erstes Prisma gebildet wird, wel ches eine konkav-konische Form oder eine konkav-kegel stumpfförmige Form aufweist, sowie ein zweites Prisma, welches eine kegelstumpfförmige Form aufweist und dem ersten Prisma gegenüberliegend angeordnet ist, und als zonales Licht von dem zweiten Prisma das Anregungslicht aussendet, welches auf das erste Prisma als gleichförmi ges Licht einfällt, sowie einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht reflektiert, das von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Prisma ausgesandt wird, um so das auf diese Weise reflektierte Licht der Probe zuzuführen, sowie ein zonales Linsensystem, welches das zonale Licht sammelt, das von dem zonal reflektieren den Spiegel reflektiert wird, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

5. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvor richtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein Beu gungsgitter, welches ein zonales Strahlenbündel erzeugt, aufweist, welches durch ein erstes Beugungsgitter gebildet wird, welches eine reflektierende Zonenform aufweist, so wie ein zweites Beugungsgitter, welches eine reflektierende Scheibenform aufweist, und dem ersten Beugungsgitter gegen überliegend angeordnet ist, und als zonales Licht von dem zweiten Beugungsgitter das Anregungslicht aussendet, wel ches auf das erste Beugungsgitter als gleichförmiges Licht einfällt, sowie einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht reflektiert, das von dem ein zonales Strahlenbündel erzeugenden Beugungsgitter ausgesandt wird, um so das zonal reflektierte Licht der Probe zuzuführen, sowie ein zonales Linsensystem, welches das zonale Licht sammelt, das von dem zonal reflektierenden Spiegel gesam melt wird, und die Probe mit dem so gesammelten Licht be strahlt.

6. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskopvor richtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem ein Beu gungsgitter aufweist, welches ein zonales Strahlenbündel erzeugt, und durch ein erstes Beugungsgitter gebildet wird, welches Scheibenform des Transmissionstyps aufweist, sowie ein zweites Beugungsgitter, welches zonal und vom Trans missionstyp ausgebildet ist, dem ersten Beugungsgitter gegenüberliegt und als zonales Licht von dem zweiten Beu gungsgitter das Anregungslicht aussendet, welches auf das erste Beugungsgitter als gleichförmiges Licht einfällt, einen zonal reflektierenden Spiegel, der das zonale Licht reflektiert, das von dem ein zonales Strahlenbündel erzeu genden Beugungsgitter ausgesandt wird, um das so reflek tierte zonale Licht der Probe zuzuführen, sowie ein zona les Linsensystem, welches das zonale Licht sammelt, das von dem zonal reflektierenden Spiegel reflektiert wird, und die Probe mit dem so gesammelten Licht bestrahlt.

7. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem aus einem nicht-fluoreszierenden Material besteht, welches bei Bestrahlung mit dem Anregungslicht keine Fluoreszenz erzeugt.

8. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsfilter auf einer Oberfläche eines opti schen Bauteils vorgesehen ist, das an einer Eingangsstufe des ersten optischen Systems angeordnet ist.

9. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das an der Eingangsstufe des ersten optischen Systems angeordnete optische Bauteil eine Linse ist, welche den Lichtbrechungseffekt verwendet.

10. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das optische Objektivsystem weiterhin ein zweites opti sches System aufweist, welches ein Gesichtsfeld aufweist, das den vorbestimmten Bereich der Probe umfaßt, der mit dem Anregungslicht durch das optische Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungssystem beleuchtet wird, wobei das zweite optische System das von der Probe ausgesandte Licht so sammelt, daß das so gesammelte Licht dem Absorptionsfil ter zugeführt wird.

11. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Absorptionsfilter auf einer Oberfläche eines opti schen Bauteils angeordnet ist, welches in einer letzten Stufe des zweiten optischen Systems angeordnet ist.

12. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein optisches Bauteil, das in einer Eingangsstufe des zweiten optischen Systems angeordnet ist, eine Linse ist, welche den Lichtbrechungseffekt nutzt.

13. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite optische System aus einem nicht-fluoreszieren den Material besteht, welches bei Bestrahlung mit dem An regungslicht keine Fluoreszenz erzeugt.

14. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin eine Lichtquelle vorgesehen ist, welche aus dem auf sie von der Lichtquelle einfallenden Licht das Anre gungslicht zum Bestrahlen der Probe erzeugt, und das An regungslicht dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungssystem zuführt.

15. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtquellenabschnitt einen Mechanismus zur Einstel lung der Lichtmenge des Anregungslichts aufweist, welches die Probe durch das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuch tungssystem bestrahlt.

16. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein Verarbeitungs-Steuerabschnitt vorgesehen ist, der eine Eigenschaft des Anregungslichts steuert, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dun kelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird.

17. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein Anregungslicht-Erfassungsmechanismus vor gesehen ist, welcher die Lichtmenge des Anregungslichts mißt, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird, wobei der Verarbeitungs-Steuerabschnitt einen Datenver arbeitungsabschnitt aufweist, der die Lichtmenge des An regungslichts, welches von dem Anregungslicht-Erfassungs mechanismus gemessen wird, und die Lichtmenge der Fluo reszenz, die von dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt er faßt wird, miteinander vergleicht, sowie ein Anregungs licht-Steuerabschnitt, der auf der Grundlage der Verarbei tung durch den Datenverarbeitungsabschnitt die Eigen schaften des Anregungslichts steuert, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht- Beleuchtungssystem zugeführt wird.

18. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Anregungslicht-Erfassungsmechanismus eine optische Meßfaser aufweist, welche einen Teil des Anregungslichts herausnimmt, das von dem Lichtquellenabschnitt dem opti schen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zugeführt wird, sowie einen Photodetektor, der die Lichtmenge des Anregungslichts mißt, welches von der optischen Meßfaser abgegeben wird.

19. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Verarbeitungs-Steuerabschnitt die Intensität des An regungslichts, welches die Probe bestrahlt, kleiner ein stellt als entsprechend der Fluoreszenz-Sättigungsinten sität des in der Probe enthaltenen fluoreszierenden Mate rials.

20. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtquellenabschnitt einen Mechanismus zur Bestrah lung der Probe mit dem Anregungslicht impulsförmig über das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem auf weist, wobei der Verarbeitungs-Steuerabschnitt den Licht quellenabschnitt anweist, eine Impulszeitbreite des die Probe bestrahlenden Anregungslichts einzustellen, so daß die mittlere Bewegungslänge des in der Probe enthaltenen fluoreszierenden Materials kleiner als die Meßauflösung des optischen Objektivsystems entsprechend der von der Probe ausgesandten Fluoreszenz ist.

21. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Lichtquellenabschnitt einen Mechanismus zur Bestrah lung der Probe mit dem Anregungslicht in Impulsform über das optische Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem auf weist.

22. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein Fluoreszenz -Erfassungsverzögerungsmechanis mus vorgesehen ist, der die von der Probe ausgesandte Lichtmenge mißt, zu einem Zeitpunkt, die um eine vorbe stimmte Zeit nach einem Zeitpunkt verzögert ist, wenn die Probe mit jedem Impuls des von dem Lichtquellenabschnitt ausgesandten Anregungslichts bestrahlt wird.

23. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenz-Verzögerungsmechanismus einen Strahlteiler aufweist, der einen Teil des Anregungslichts reflektiert und herausnimmt, welches von dem Lichtquellenabschnitt dem optischen Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungssystem zu geführt wird, einen Photodetektor, der die Lichtmenge und die Ankunftszeit des Anregungslichts mißt, welches von dem Strahlteiler reflektiert wird, und die auf diese Weise gemessenen Werte als Anregungslichtinformation aus gibt, einen Verzögerungsgenerator, der unter Bezugnahme auf die Ankunftszeit, die in der Anregungslichtinforma tion enthalten ist, die von dem Photodetektor eingegeben wird, Verzögerungsinformation mit einer vorbestimmten Zeitdauer nach Verstreichen einer vorbestimmten Zeit aus gibt, sowie eine Gate-Vorrichtung, die in einem optischen Lichtweg der von der Probe ausgesandten Fluoreszenz an geordnet ist, und auf der Grundlage der von dem Verzöge rungsgenerator eingegebenen Verzögerungsinformation die Fluoreszenz nur während eines vorbestimmten Zeitraums nach Ablauf einer vorbestimmten Zeit seit der Ankunfts zeit des Anregungslichts durchläßt.

24. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin eine Betriebslichtquelle vorgesehen ist, um Betriebslicht zu erzeugen, welches eine Oberfläche der Probe bestrahlt, sowie eine Lichtteilervorrichtung, die zwischen dem optischen Objektivsystem und dem Fluores zenz-Erfassungsabschnitt vorgesehen ist, wobei die Licht teilervorrichtung das Betriebslicht reflektiert, welches auf sie von der Betriebslichtquelle einfällt, um so das reflektierte Licht dem optischen Objektivsystem zuzufüh ren, aber das Fluoreszenzlicht durchzulassen, welches von dem optischen Objektivsystem einfällt, um so das durch gelassene Licht dem Fluoreszenz-Erfassungsabschnitt zu zuführen.

25. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein Strahlenbündel-Betätigungsabschnitt vorge sehen ist, der über die Lichtteilervorrichtung das ein fallende Betriebslicht von der Betriebslichtquelle dem optischen Objektivsystem zuführt, um so eine vorbestimm te Position oder eine vorbestimmte Fläche der Oberfläche der Probe zu bestrahlen.

26. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 24, gekennzeichnet durch einen Spiegel mit einer schräg angeordneten, konischen Innen wand, der Kriechlicht des Betriebslichts absorbiert, das von der Lichtteilervorrichtung hindurchgelassen wird.

27. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein zusätzliches Absorptionsfilter vorgesehen ist, welches sich von dem Absorptionsfilter unterschei det, das in dem optischen Objektivsystem enthalten ist, und das Betriebslicht absorbiert, das von der Oberfläche der Probe gestreut wird, und dann als Betriebslicht ge sammelt wird, wobei das weitere Absorptionsfilter die Fluoreszenz hindurchläßt, die von der Probe ausgesandt wird, und dann von dem optischen Objektivsystem gesammelt wird.

28. Dunkelfeld-Auflicht-Beleuchtungs-Fluoreszenzmikroskop vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin ein Spiegel mit einer schräg angeordneten, konischen Innenwand vorgesehen ist, der auf der Seite gegenüberliegend dem optischen Objektivsystem angeordnet ist, so daß er der Probe gegenüberliegend angeordnet ist, wobei der Spiegel das durch die Probe hindurchgelassene Licht absorbiert.