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DE19618985A1 - System zum Nachweis der Inhibrierung des Wachstums tierischer und menschlicher Zellen - Google Patents

System zum Nachweis der Inhibrierung des Wachstums tierischer und menschlicher Zellen

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung von Cyclin-abhängigen Kinasen und deren Anwendung in einem System zur Inhibierung des Zellwachstums von tierischen oder menschlichen Zellen, insbesondere zur Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen und ein Verfahren zur Anwendung dieses Systems. Dieses System ist sowohl in der biologisch-medizinischen Grundlagenforschung als auch in der Biotechnologie und der pharmazeutischen Industrie einsetzbar.
Sowohl für die Aufklärung grundlegender biologischer Prozesse als auch für die Verwendung tierischer Zellen für biotechnologische Zwecke wird ein Replikationssystem benötigt, das es ermöglicht, die funktionellen Wechselwirkungen zwischen den an der Replikation beteiligten Proteinen und Enzymen zu untersuchen. In allen eukaryontischen Zellen sind die Synthese von chromosomaler DNA während der S-Phase und die chromosomale Segregation während der Mitose getrennte, kontrollierte Ereignisse des Zellzykluses. Während die Faktoren und Mechanismen der Kontrolle zellulärer DNA-Replikation kaum bekannt sind, sind die Grundkomponenten und ihre Wechselwirkungen, die die Mitose kontrollieren im allgemeinen bekannt.
Die Regulation und die Mechanismen der eukaryontischen DNA-Replikation wurden in verschiedenen Modellsystemen in vivo z. B. in S. pombe, S. cerevisiae und Drosophila und in vitro z. B. bei der DNA-Replikation in Xenopus Oocyten-Extrakten und SV40 DNA-Replikation untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, daß Proteinphosphorylierungen der Schlüsselschritt bei der Regulation der DNA-Replikation sind. Die funktionellen Wechselwirkungen der Kinasen mit den DNA-Replikationsproteinen ist jedoch bisher nicht verstanden. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Duplikation von eukaryontischen Chromosomen mindestens durch zwei Schritte reguliert wird:
  • 1. Der Beginn der DNA-Replikation wird streng kontrolliert, und die wachsenden Zellen können die DNA-Replikation nicht starten, bevor die Zellen alle nötigen Vorgänge abgeschlossen haben, zum Beispiel bevor die DNA-Schäden repariert sind. Genetische Daten aus Hefen legen nahe, daß Proteine, die Cycline genannt werden, die im Komplex mit Cdc2 oder Cdc28 jeweils in S. pombe oder S. cerevisiae vorliegen, die Transition aus der G₁- in die S-Phase regulieren/kontrollieren. In jüngster Zeit wurde diskutiert, daß das Cyclin E-Cdk2 die Transition von der G₁- in die S-Phase bei höheren Eukaryonten reguliert.
  • 2. Die DNA-Replikation in Eukaryonten erfolgt partiell von verschiedenen Replikationsstartpunkten aus, es ist aber keine Reinitiation von neu replizierter DNA vor der Zellteilung erlaubt, so daß chromosomale DNA einmal und nur einmal pro Zellzyklus zur Sicherstellung der Vollständigkeit der chromosomalen Information dupliziert werden darf.
Dieses Verhalten benötigt eine genaue und strikte Regulation, um die Reinitiation von schon replizierter DNA zu verhindern. Von Blow und Laskey wurde das "Licensing factor"-Modell vorgeschlagen, um die Verhinderung der Rereplikation zu erklären. In jüngster Zeit wurden im Xenopus-System und in S. cerevisiae einige Proteine, MCM2, MCM3 und MCM5 genannt, bestimmt, für die angenommen wird, daß sie als Komponenten dieses "Licensingsystems" fungieren. Außerdem zeigten neuere Erkenntnisse in vivo in verschiedenen Organismen, daß Replikation vorkommt, wenn Cyclin-abhängige Kinasen (Cdk) dereguliert sind.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung von Proteinen bzw. Enzymen, die die Initiation der DNA-Replikation in vitro bzw. in vivo inhibieren.
Die Replikation von SV40 DNA in vitro eignet sich als ein Modellsystem, um die eukaryontischer DNA-Replikation und deren Regulation zu analysieren. Es wurde kürzlich gezeigt, daß zehn Proteine oder Proteinkomplexe für die SV40 DNA-Replikation in vitro ausreichend sind. Biochemische Untersuchungen der Initiation von SV40 DNA-Replikation ermöglichten es, ein System für die Initiation zu entwickeln.
Dieses wird im folgenden kurz beschrieben:
Zunächst bindet das virale DNA-Bindeprotein T-Antigen CTAg an den SV40-Replikationursprung, dann bildet es in Gegenwart von ATP ein Doppelhexamer. Dieser TAg-Komplex entwindet die doppelsträngige DNA durch die eigene Helikaseaktivität in Gegenwart von RP-A, dem eukaryontischen einzelsträngigen DNA-Bindeprotein, und Topoisomerase I oder II. Im nächsten Schritt synthetisiert die Primaseaktivität des DNA-Polymerase α-Primase-Komplexes am Replikationsursprung RNA-Primer, die durch die DNA-Polymerase α verlängert werden. Diese RNA-DNA-Primer dienen als Anlagerungsmoleküle für die Replikationsklammer PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen), das dann zusammen mit der DNA-Polymerase δ den Replikationskomplex des Leitstranges bildet. Drei dieser Komponenten, T-Antigen, RP-A und DNA-Polymerase α-Primase, die für die Initiation von SV40 DNA-Replikation benötigt werden, sind Cdk-Substrate. Weil die zellulären Proteine, RP-A und DNA-Polymerase α-Primase, in zellzyklusabhängiger Weise phosphoryliert werden, wurde vorgeschlagen, daß ihre Phosphorylierung für die Regulation der S-Phase wichtig sein kann.
Um die funktionellen Wechselwirkungen der regulatorischen Cyclin-abhängigen Kinasen mit Replikationsproteinen zu bestimmen, wurde für die Initiation der SV40 DNA-Replikation in vitro mit aufgereinigten Proteinen verwendet. Obwohl alle vier Cyclin Cdk-Komplexe DNA-Polymerase α-Primase phosphorylieren, wurde überraschenderweise gefunden, daß nur Cyclin A-Cdc2 und Cyclin A-Cdk2 effizient die Initiation von SV40 DNA-Replikation in vitro verhindern, während Cyclin E-Cdk2 die Reaktion leicht stimuliert und Cyclin B-Cdc2 völlig unwirksam bei der Inhibierung der Initiationsreaktion ist.
Um die Funktion der Cyclin Cdk-Komplexe zu untersuchen, wurde hoch aktives rekombinantes Cyclin A-Cdc2, Cyclin A-Cdk2, Cyclin B-Cdc2 und Cyclin E-Cdk2 entweder mittels spezieller Immunoaffinitäts- oder Suc1-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die Kinasen, die durch beide Aufreinigungsmethoden erhalten wurden, zeigten ähnliche Zusammensetzungen und Enzymaktivitäten.
Die katalytischen Untereinheiten Cdc2 und Cdk2, die bis zur Homogenität aufgereinigt wurden, phosphorylierten Histon H1 oder DNA-Polymerase α-Primase nicht. Die aufgereinigten Cyclin Cdk-Komplexe wiesen reproduzierbar hohe Kinaseaktivität mit Histon H1 auf.
Die Cyclin Cdk-Komplexe waren ebenfalls bei Verwendung von DNA-Polymerase α-Primase als Substrat hoch aktiv. Der Polymerase α-Primase-Komplex besteht aus vier Untereinheiten mit den apparenten Molekulargewichten 180 kDa (p180 genannt), 68 kDa (p68), 58 kDa (p58) und 48 kDa (p48). Die beiden Untereinheiten p180 und p68 werden von den aufgereinigten Cdk′s in vitro und in vivo phosphoryliert. Es wurde die gleiche Menge an Histon-Kinase-Aktivität von jedem Komplex verwendet, um die DNA-Polymerase α-Primase zu phosporylieren. Während die Cyclin A-Cdc2- und Cyclin A-Cdk2-Kinasen die höchste Aktivität auf p68 aufwiesen, hatten Cyclin B-Cdc2 und Cyclin E-Cdk2 eine etwas geringere p68-Kinase-Aktivität. Die Cyclin Cdk-Komplexe phosphorylieren die p68-Untereinheit etwa 2 bis 3 Mal mehr als die p180-Untereinheit. Das Cyclin A-Cdk2 hat die höchste p180-Kinaseaktivität, während die Aktivität von Cyclin A-Cdc2, Cyclin B-Cdc2 und Cyclin E-Cdk2 nahezu identisch auf p180 war, aber etwas geringer als die von Cyclin A-Cdk2. Die Cyclin Cdk-Komplexe phosphorylieren die DNA-Polymerase α-Primase und Histon H1 in der gleichen Größenordnung nach Normalisierung des Einbaus von ³²P gegenüber dem Molekulargewicht von DNA-Polymerase α-Primase oder Histon H1.
Weil die DNA-Polymerase α-Primase durch alle vier Cyclin Cdk′s phosphoryliert wurde, war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, enzymatische oder funktionelle Unterschiede bei der phosphorylierten DNA-Polymerase α-Primase verglichen mit dem nicht-phosphorylierten Komplex nachzuweisen.
Dazu wurden die DNA-Polymerase a-Primase mit ansteigenden Mengen des Kinase-Komplexes inkubiert. Die DNA-Polymerase-Ak­ tivität der phosphorylierten DNA-Polymerase α-Primase ist unabhängig von der Menge an Kinase und ändert sich nicht durch erhöhte Menge an aufgereinigter Kinase. Im Gegensatz zu diesem Ergebnis erhöht sich jedoch die Primase-Aktivität der phosphorylierten DNA-Polymerase α-Primase auf einer Einzelstrang-DNA-Matrize bis zu 2 bis 3 Mal gegenüber der Aktivität der DNA-Polymerase α-Primase, die mit nicht­ spezifischen Bindeproteinen oder inaktiven Cdk2-Untereinheiten vorinkubiert wurde.
Dann wurde untersucht, ob der Inititationsschritt der SV40-DNA-Re­ plikation durch Phosphorylierung beeinflußt wird. Um die Funktion der verschiedenen Cyclin-Cdk-Komplexe zu untersuchen, wurde jeder Cyclin-Cdk-Komplex und Kontrollproteine direkt zu der Initiationsreaktion gegeben, während die hitzebehandelten Proteine als negative Kontrollen dienten. In diesem Versuch erniedrigt die Gegenwart von Cyclin A-Cdc2 oder Cyclin A-Cdk2 die Initiationsaktivität der DNA-Polymerase a-Primase um etwa 80%, was durch mikrodensitrometrisches Abtasten der Autoradiographie ermittelt wurde. In Gegenwart von Cyclin B-Cdc2 war die Reaktion etwas reduziert und mit den Kontrollproteinen waren die Initiationsprodukte fast unverändert, verglichen mit den hitzebehandelten Proteinen, während die Gegenwart von Cyclin E-Cdk2 die Initiationsaktivität der DNA-Polymerase α-Primase in reproduzierbarer Weise um 20% gegenüber dem Niveau erhöht, das in Gegenwart mit hitzebehandelten Proteinen bestimmt wurde.
Um zu untersuchen, ob nur die Phosphorylierung von DNA-Polymerase α-Primase die DNA-Replikation beeinflußt, wurde DNA-Polymerase α-Primase mit Cyclin-abhängigen Kinasekomplexes unter Kinase-Test-Bedingungen inkubiert, die vor­ phosphorylierte DNA-Polymerase α-Primase, die frei von irgendeiner nachweisbaren Kinaseaktivität war, gereinigt und die Initiationsaktivität dieser phosphorylierten DNA-Polymerase α-Primase bestimmt.
Fig. 1 zeigt die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen mit Histon H1 als Substrat, Säule 1 stellt den Einbau durch Cyclin A-Cdc2, Säule 2 Cyclin A-Cdk2, Säule 3 Cyclin B-Cdc2 und Säule 4 Cyclin E-Cdk2 dar. Als Kontrolle dienten Cdk2-Protein (Säule 5) und unspezifisch bindende Proteine (Säule 6).
Fig. 2 zeigt die Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinasen mit DNA-Polymerase α-Primase als Substrat mit den Untereinheiten p180 und p68, Säule 1 stellt den Einbau durch Cyclin A-Cdc2, Säule 2 Cyclin A-Cdk2, Säule 3 Cyclin B-Cdc2 und Säule 4 Cyclin E-Cdk2 dar. Als Kontrolle dienten Cdc2-Protein (Säule 5), Cdk2-Protein (Säule 6) und unspezifisch bindende Proteine (Säule 7).
Fig. 3 zeigt die Initiationsaktivität der DNA Polymerase α-Primase, wenn dem Testgemisch unterschiedliche Cyclin-abhängige Kinasen zugegeben wurden. Bahn 1 stellt die positive Kontrolle in Abwesenheit von Cyclin-abhängigen Kinasen dar. Bei dem Ergebnis in Bahn 2 wurde dem Testgemisch aktive Cyclin A-Cdc2 zugegeben, während Bahn 3 hitzeinaktivierte Cyclin A-Cdc2 enthielt. Bei den Ergebnissen in Bahnen 4 und 5 wurde zum Test aktive (4) oder hitzeinaktivierte (5) Cyclin A-Cdk2 zugesetzt. Bei den Ergebnissen in Bahnen 6 und 7 wurden dem Testgemisch aktive (6) und hitzeinaktivierte (7) Cyclin B-Cdc2 zugegeben. Bei den Ergebnissen in Bahnen 8 und 9 enthielt das Testgemisch aktive oder hitzeinaktivierte Cyclin E-Cdk2. Die Bahnen 10 bis 12 zeigen die Kontrollen, unbehandelte Kontrollproteine (Bahn 10), hitzebehandelte Kontrollproteine (Bahn 11) und Testgemisch ohne DNA-Polymerase α-Primase (Bahn 12).
Fig. 4 zeigt die Initiationsaktivität von 0,4 Units unbehandelter DNA-Polymerase α-Primase (Bahn 1), von 0,2 bzw. 0,4 Units mit Cyclin A-Cdk2 vorinkubierter DNA-Polymerase α-Primase (Bahn 2 bzw. Bahn 3), von 0,2 bzw. 0,4 Units mit Cyclin B-Cdc2 vorinkubierter DNA-Polymerase α-Primase (Bahn 4 bzw. Bahn 5) und von 0,2 bzw. 0,4 Units mit Cyclin E-Cdk2 vorinkubierter DNA-Polymerase α-Primase (Bahn 6 bzw. Bahn 7). Als Kontrolle dienten 0,2 bzw. 0,4 Units mit Kontrollprotein­ behandelte DNA-Polymerase α-Primase (Bahnen 8 und 9), sowie Bahn 10 Testgemisch ohne DNA-Polymerase α-Primase. In Bahn M sind die Marker-Oligonukleotide zu sehen.
Aufreinigung der Cyclin-abhängigen Kinase-Komplexe
Zur Aufreinigung der Cyclin-abhängigen Kinase-Komplexe wurden 10⁸-10¹⁰, vorzugsweise 2,5 × 10⁸ bis 3 × 10⁸ SF9-Zellen (ATCC CRL 1711) oder SF9X-Zellen (F. Stadlbauer, A. Brueckner, C. Rehfuess, C. Eckerskorn, F. Lottspeich, V. Förster, B.Y. Tseng und H.-P. Nasheuer (1994), Eur. J. Biochem. 222, 781-793) mit 10 Plaque forming Units/Zelle mit jedem Baculovirus infiziert und für 35 bis 72 Stunden, vorzugsweise 44 bis 48 Stunden bei 25 bis 30°C, vorzugsweise 27°C inkubiert. Die Zellen wurden dann in Lysepuffer (50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 5 mM NaF, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2% Nonidet- P40, 0,1 mM Leupeptin, 1% Trasylol® (Markenname, hergestellt von Bayer Leverkusen)) homogenisiert und die Komplexe mittels Affinitätschromatographie mit suc1-Sepharose 4B durch Überkopfrotation während einer Stunde bei 4°C gebunden. Der Proteinkomplex wurde mit 0,5 bis 20 mg/ml, vorzugsweise 5 mg/ml suc1-Lösung eluiert und gegen 50 mM KPi pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 50% Glycerin dialysiert. Ebenfalls kann Glutathiontransferase-sucI-Fusionsprotein zur Aufreinigung der Kinasen verwendet werden. Die Elution von der Glutathionaffinitätssäule folgt dann bei Glutathiontransferase­ sucI mit 0,1 bis 30 mM Glutathion, vorzugsweise 10 mM
Zur Aufreinigung von rekombinanter Cdc2 und Cdk2 durch die Hemaglutinin-Oligopeptid (HA-tag) wurden SF9X-Zellen, wie oben beschrieben, infiziert und lysiert. Diese Komplexe wurden durch Immunoaffinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern beladener 12CA5-Sepharose 4B (Boehringer, Mannheim) gereinigt. Das Säulenmaterial wurde mit 0,250 bis 2 M mono- oder divalentem Kationen-Puffer, vorzugsweise 0,4 M Kationen-Puffer bei einem pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise pH 7,2 gewaschen. Anschließend wurden die Komplexe mit 0,5 bis 20 mg/ml Haemaglutinin-Peptid (YPYDVPDYA), vorzugsweise 4 mg/ml Haemaglutinin-Peptid (YPYDVPDYA) in 50 mM Tris/HCl pH 7,5, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA eluiert. Die so hergestellten gereinigten Komplexe wurden gegen Dialysepuffer (50 mM KPi pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 Glycerin) dialysiert und bei -80°C gelagert.
Die Inhibierung des Wachstums tierischer oder menschlicher Zellen wurde mit folgendem Testsystem nachgewiesen:
Kinasetest:
Der Kinasetest wurde mit 1 bis 2 µg Histon H1 oder DNA-Polymerase α-Primase als Substrat in Histon-Kinase-Puffer, bestehend aus 20 mM HEPES/KOH pH 7,5, 1 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 4 mM EGTA, 5 mM NaF, 1 mM EDTA, 0,1 mg/ml BSA, 0,1 mM ATP, 1 µCi τ-³²P-ATP pro Test, durchgeführt. Das Substrat und der Puffer wurden für 15 Minuten bei 37°C jeweils mit dem gereinigten Cdk-Komplexes inkubiert. Die Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese getrennt und der Einbau an Phosphat wurde mittels Autoradiographie bestimmt. Für quantitative Ergebnisse wurden die Proteinbanden aus dem Gel herausgeschnitten und die Radioaktivität wurde mit flüssiger Scintillationsmessung bestimmt. Die Abbildungen in den Fig. 1 und 2 zeigen die Ergebnisse dieser Messung. Mit diesem Testsystem kann sofort in einfacher Weise die Kinaseaktivität nachgewiesen werden.
Die Messung des Einbaus kann auch mittels Präzipitationsfil­ tration durch Glasfiberfilter oder direkter Filtration des Testgemisches durch Nitrocellulosefilter ermittelt werden.
System zum Nachweis der Initiation und Inhibierung der DNA-Replikation:
Die Initiation der Replikation von beispielsweise SV40 DNA wurde in folgendem Test nachgewiesen. Die SV40-Initiation (40 µl) wurden auf Eis zusammengefügt und enthielt 0,25 µg pUC-HS-DNA (beinhaltet einen SV40-Replikationsursprung), 0,6 µg SV40-T-Antigen, und 0,5 µg RP-A (Säuger-Einzelstrang-DNA-Bin­ deprotein) in einem Puffer bestehend aus 30 mM HEPES/KOH pH 7,8, 7 mM MgAc, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 0,2 mM UTP, 0,2 mM GTP, 0,01 mM CTP, 4 mM ATP, 40 mM Kreatinphosphat, 1 µg Kreatinkinase, 0,3 µg Topoisomerase I, 0,2 mg/ml hitzebehandeltes BSA und 20 µCi [(α-³²P]CTP (3000 Ci/mMol). Die rekombinante Polymerase α-Primase wurde in der Größenordnung von 0,01 bis 10 Units, vorzugsweise 0,4 Units zugefügt.
Die Reaktionsprodukte wurden mit 0,8 M LiCl, 10 µg ultraschallbehandelte DNA und 120 µl reinen Ethanol versetzt, anschließend 15 Minuten auf Trockeneis gefällt. Nach der Zentrifugation wurde das Sediment zweimal mit 75% Ethanol und 25% destilliertes Wasser gewaschen. Danach wurde das erhaltene Sediment getrocknet und in Auftragspuffer, bestehend aus 45% Formamid, 5 mM EDTA, 0,09% Xylencyanol FF und 0,09% Bromphenolblau in Wasser, aufgenommen und bei 65°C für 30 Minuten inkubiert. Nach dem Erhitzen über 3 Minuten bei 95°C wurden die Proben auf einen denaturierenden 20%igen Polyacrylamidgel gegeben und über 3 bis 6 Stunden bei 600 V getrennt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Die in diesen Figuren gezeigten Ergebnisse zeigen eindeutig, daß das erfindungsgemäße Testsystem die Initiation der DNA-Replikation verhindert.

Claims (7)

1. System zur Nachweis der Inhibierung des Wachstums tierischer und humaner Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß das System als wirksames Protein eine Proteinkinase und einen Initiationskomplex der DNA-Polymerisation umfaßt.
2. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinkinase eine cyclinabhängige Proteinkinase ist.
3. System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclinabhängige Proteinkinase Cyclin A CdC2 oder Cyclin A Cdk2 ist.
4. System nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Initiationskomplex der Polymerase α-Primase-Komplex ist.
5. System nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich radioaktive Substanzen, fluorenzierende Substanzen oder Farbstoffe in dem Testsystem enthalten sind.
6. Verfahren zur Aufreinigung von rekombinanten cyclin­ abhängigen Kinasekomplexen, dadurch gekennzeichnet, daß SF9-Zellen (ATCC CRL 1711) oder SF9X-Zellen (Stadlbauer et al., Eur.J.Biochem. 222, 781-793, 1994) mit 10 Plaque forming Units/Zelle mit Baculovirus infiziert werden und über 35 bis 72 Stunden bei 25 bis 30°C inkubiert werden, anschließend die Zellen in Lysepuffer homogenisiert werden, danach die Komplexe entweder mit Affinitätschromatographiematerial bei 4°C über 1 Stunde gebunden werden und der Proteinkomplex mit 0,5 bis 20 mg/ml Puffer eluiert werden oder Immunoaffinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern beladener 12CA5-Sepharose 4B gereinigt, wobei das Säulenmaterial mit 0,250 bis 2 M mono- oder bivalentem Kationenpuffer bei einem pH-Wert von 6 bis 9 gewaschen und die Komplexe mit 0,5 bis 20 mg/ml Haemaglutinin- Peptid oder 0,5 bis 20 mg/ml TRIS/HCl pH 7, 200 mM NaCl und 1 mM EDTA eluiert werden.
7. Verwendung des Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als diagnostische Ausrüstung (Kit) zum Nachweis der Wirksamkeit von wachstumshemmenden Substanzen und Wirkungen.
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