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DE19616509A1 - Neue spezifische Immunophilin-Liganden als Antiasthmatika, Immunsuppressiva - Google Patents

Neue spezifische Immunophilin-Liganden als Antiasthmatika, Immunsuppressiva

Info

Publication number
DE19616509A1
DE19616509A1 DE19616509A DE19616509A DE19616509A1 DE 19616509 A1 DE19616509 A1 DE 19616509A1 DE 19616509 A DE19616509 A DE 19616509A DE 19616509 A DE19616509 A DE 19616509A DE 19616509 A1 DE19616509 A1 DE 19616509A1
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DE
Germany
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groups
acid
indoline
carboxylic acid
boc
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19616509A
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English (en)
Inventor
Dietmar Dr Reichert
Bernhard Dr Kutscher
Holger Dr Bang
Kay Prof Dr Brune
Gerhard Prof Dr Quinkert
Hans-Guenter Schaible
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Asta Medica GmbH
Original Assignee
Asta Medica GmbH
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Publication date
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Description

Die Erfindung betrifft neue spezifische Immunophilin-Liganden der Formel
Die Reste R₁, R₂, R₄, X, Y, A, B und D haben folgende Bedeutung:
R₁ Wasserstoff, (C₁-C₁₂)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkyloxygruppen, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt ist und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, ein- oder mehrfach durch einen Phenylring substitutiert sein kann.
Dieser Phenylring kann selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluor­ methylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein.
R₁ kann außerdem der Aminrest von folgenden Aminosäuremethylestern sein: Histidin, Leucin, Valin, Serin(Bzl), Threonin, Pipecolinsäure, 4-Piperidincarbonsäure, 3-Piperidincarbonsäure, ε-NH₂-Lysin, ε-Z-NH-Lysin, ε-(2Cl-Z)-NH-Lysin, 2-Pyridylalanin, Phenylalanin, Tryptophan, Glutaminsäure, Arginin(Tos), Asparagin, Citrullin, Homocitrullin, Ornithin, Prolin, 2-Indolincarbonsäure, Octahydrindolincarbonsäure, Tetrahydroisochinolincarbonsäure, 5-Aminovaleriansäure, 8-Aminoctansäure
R₂ Wasserstoff, (C₁-C₁₂)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkyloxygruppen, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt ist und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, ein- oder mehrfach durch einen Phenylring substitutiert sein kann.
Dieser Phenylring kann selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluor­ methylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein.
R₃ Wasserstoff, Butyloxycarbonyl, Carboxybenzyl, mono- bi- oder tricyclisches Carbonyl-Aryl oder Carbonyl-Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wobei Aryl bzw. Heteroaryl selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoyl­ gruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann. Ferner kann R₃ sein Carboxy-(C₁-C₆)-alkyl, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, bzw. ein- oder mehrfach durch einen Phenylring substitutiert sein kann, wobei dieser Phenylring selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)- Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁- C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann.
R₃ kann ferner der Säurerest folgender Aminosäuren sein: Histidin, Leucin, Valin, Serin(Bzl), Threonin, Pipecolinsäure, 4-Piperidincarbonsäure, 3-Piperidincarbonsäure, ε-NH₂-Lysin, ε-Z-NH-Lysin, ε-(2Cl-Z)-NH-Lysin, 2-Pyridylalanin, Phenylalanin, Tryptophan, Glutaminsäure, Arginin(Tos), Asparagin, Citrullin, Homocitrullin, Ornithin, Prolin, 2-Indolincarbonsäure, Octahydrindolincarbonsäure, Tetrnhydroisochinolin-carbonsäure, 5-Aminovaleriansäure, 8-Aminoctansäure, wobei der N-Terminus der Aminosäuren durch Butyloxycarbonyl, Carboxybenzyl oder durch den Säurerest von mono- bi- oder tricyclischen Aryl- oder Heteroarylcarbonsäuren mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Methoxyphenylessigsäure, Naphthylessigsäure, Pyridylessigsäure, Chinazolinonylessigsäure, Indazolylessigsäure, Indolylgloyxylsäure, Phenylglyoxylsäure, Isobutylglyoxylsäure, 2-Aminothiazol-4-glyoxylsäure bzw. durch Carboxy-(C₁- C₁₂)-alkyl, Carboxycyclopentan, Carboxycyclohexan, Benzoyl, das ein oder mehrfach substituiert sein kann durch Halogen, Methoxygruppen, Aminogruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, substituiert sein kann.
R₄ H, F, OR₅
R₅ = Wasserstoff, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, (C₁ -C₆)-Alkyl oder Carboxy-(C₁-C₆)-Alkyl, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann und durch einen mono­ bi- oder tricyclisches Carbonyl-Aryl oder Carbonyl-Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wobei Aryl bzw. Heteroaryl selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl, Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann.
A = aromatisch, nicht aromatisch, aromatisch heterocyclisch mit 1-2 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, nicht aromatisch heterocyclisch mit 1-2 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O,
B = CH₂
D = CH
B-D = CH=C
X = O, S, H₂
Y = C, Einfachbindung.
Weiterhin betrifft die Erfindung die physiologisch verträglichen Salze der Verbindungen gemäß Formel I, die Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Formel I und ihre pharmazeutische Verwendung.
Cyclosporin A (CsA) oder FK 506 sind immunsuppressive, von Pilzen stammende Naturstoffe, die den Ca+2-abhängigen Signalübertragungsweg in einigen Zelltypen inhibieren. In T-Zellen inhibieren beide Agentien die Transkription einer Reihe von Genen, einschließlich des Gens für IL-2, das durch Stimulierung der T-Zell- Rezeptoren (TCR) aktiviert wird. FK 506 und CsA binden beide mit hoher Affinität an lösliche Rezeptorproteine (G. Fischer et al., Nature 337, 476-478, 1989; M. W. Harding et al., Nature 341, 755-760, 1989). Der FK 506-Rezeptor wurde FKBP, der CsA-Rezeptor Cyclophilin (Cyp) genannt. Beide Proteine katalysieren die Isomerisierung von cis- und trans-Amidbindungsrotameren von Peptiden und werden auch häufig als Immunophiline bezeichnet.
Das Übermolekül aus CsA-Cyp bzw. FK 506-FKBP bindet Calcineurin (CN) und inhibiert dessen Phosphataseaktivität. Als zelluläres Zielmolekül von CN wurde die cytosolische, phosphorylierte Komponente des Transkriptionsfaktors NF-AT erkannt, das bei fehlender CN-Aktivität für die Wirkung im Zellkern nicht dephosphoryliert und somit der aktive Transkriptionskomplex am IL-2-Promoter nicht angeschaltet werden kann. (M. K. Rosen, S. L. Schreiber, Angew. Chem. 104 (1992), 413-430; G. Fischer, Angew. Chem. 106 (1994), 1479-1501.
Den allergischen, asthmatischen Erkrankungen liegt eine entzündliche Reaktion zugrunde, die von T-Zellen und ihren Mediatoren gesteuert wird. Corticosteroide stellen immer noch das Mittel der Wahl in der Behandlung vieler allergischer Erkrankungen dar. Auch CsA und FK 506 erwies sich sowohl im Tierexperiment als auch in klinischen Studien beim bronchiale Asthma und zugrunde liegende Entzündungen als günstiges Therapeutikum. Im Tierexperiment konnte die Blockade von verschiedenen Cytokinen wie IL-2, IL-4 und IL-5, die allergisch induzierte Entzündungen hervorrufen, gezeigt werden.
Trotz der Vielzahl von Ansätzen zur Identifikation neuer aktiver Immunophilin- Inhibitoren konnten bisher keine wirksameren Strukturen als CsA, FK 506, Rapamycin bzw. Derivate von diesen Naturstoffen hergestellt bzw. isoliert werden. Das hohe inhibitorische Potential von CsA, FK 506, Rapamycin wird jedoch ganz erheblich durch die mannigfaltigen Nebenwirkungen, insbesondere der Nieren und Neurotoxizität, reduziert. (N. H. Sigal et al., J. Exp. Med. 173, 619628, 1991). Hintergrund dieser Tatsache ist die Unspezifität der Wechselwirkung zwischen Immunophilin-Liganden und den zellspezifischen Bindungsproteinen. Dadurch ist die bekannte medizinisch-therapeutische Wirkung dieser Immunsuppressiva erheblich eingeschränkt. Ferner erweist sich die fehlende Selektivität der Verbindungen gerade in der Langzeittherapie als problematisch.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit wertvollen pharmakologischen Eigenschaften zu finden und durch gezielte Synthese bereitzustellen.
Eine völlig neuartige Substanzklasse, die Immunophiline überraschenderweise spezifisch bindet und die IL-2-Proliferation überraschenderweise inhibiert, wird durch die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I dargestellt. Diese Klasse von Verbindungen und deren pharmazeutisch akzeptablen Salze weist eine hohe Affinität zu Immunophilinen wie CypA, CypB, CypC und FKBP12 auf.
Diejenigen Verbindungen der Formel I, die asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten und deshalb in der Regel als Racemate anfallen, können in an sich bekannter Weise beispielsweise mit einer optisch aktiven Säure in die optisch aktiven Isomeren getrennt werden. Es besteht aber auch die Möglichkeit, von vornherein optisch aktive Ausgangsubstanzen einzusetzen, wobei dann als Endprodukt entsprechende optisch aktive bzw. diastereoisomere Verbindungen erhalten werden.
Die Erfindung umfaßt also von Verbindungen der Formel I, die ein asymmetrisches Kohlenstoffatom enthalten, die R-Form, die S-Form und R, S-Mischungen, sowie im Falle mehrerer asymmetrischer Kohlenstoffatome die diastereoisomeren Formen.
In Abhängigkeit der Verfahrensbedingungen und Ausgangsstoffe können die Verbindungen der Formel I als freie Verbindungen oder in Form ihrer Salze erhalten werden. Die erhaltenen Salze können in an sich bekannter Weise beispielsweise mit Säuren, Alkali oder Ionenaustauschern in die freien Basen bzw. Säuren überführt werden.
Die so freigesetzten Verbindungen der Formel I lassen sich mit anorganischen oder organischen Säuren bzw. Basen in die entsprechenden physiologisch verträglichen Säureadditionssalze überführen.
Sowohl die freien Basen als auch ihre Salze sind biologisch aktiv. Die Verbindungen der Formel I können in freier Form oder als Salz mit einer physiologisch verträglichen Säure bzw. Base verabreicht werden. Die Applikation kann peroral, parenteral, intravenös, transdermal oder inhalativ erfolgen.
Weiter betrifft die Erfindung pharmazeutische Zubereitungen mit einem Gehalt an wenigstens einer Verbindung der Formel I oder deren Salze mit physiologisch verträglichen anorganischen oder organischen Säuren bzw. Basen und gegebenenfalls pharmazeutisch verwendbare Träger- und Hilfsstoffe.
Als Applikationsformen eignen sich beispielsweise Tabletten oder Dragees, Kapseln, Lösungen bzw. Ampullen, Suppositorien, Pflaster oder in Inhalatoren einsetzbare Pulverzubereitungen.
Die Dosierung der vorgenannten pharmazeutischen Zubereitungen hängt vom Zustand des Patienten und von der Applikationsform ab. Die tägliche Wirkstoffdosis beträgt zwischen 0.01-100 mg pro kg Körpergewicht und Tag.
Die Herstellung der unter Formel I dargestellten Verbindungen gelingt beispielsweise nach der Festphasensynthese nach B. Merrifield, vorzugsweise an einem unlöslichen Polymeren wie zum Beispiel in organischen Lösungsmittel quellbares Polystyrolharz in Perlenform (beispielsweise ein Copolymerisat aus Polystyrol und 1% Divinylbenzol), nach Standardpeptidkupplungsmethoden der Peptid-Festphasensynthese.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I stellt man so dar, daß man zunächst zwei der Funktionalitäten (α-Amino-, evtl. ε-Amino- und α-Carbonsäuregruppe) mit Schutzgruppen versieht und dann die freie dritte Funktionalität in geeigneter Weise umsetzt. Gegebenenfalls kann man auch, wo dies zu besseren Ergebnissen führt, im ersten Schritt intermediäre Schutzgruppen einführen, die man nach dem zweiten Schritt gegen die gewünschte Funktionalität austauscht. Geeignete Schutzgruppen und Verfahren zum Anbringen derselben sind im Fachgebiet bekannt. Beispiele für Schutzgruppen sind in "Principles of Peptide Synthesis", Springer Verlag 1984), im Lehrbuch "Solid Phase Peptide Synthesis" J.M. Stewart and J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, III, 1984, und in G. Barany and R.B. Merrifield "The Peptides", Ch.1, S. 1-285, 1979, Academic Press Inc. beschrieben.
Der stufenweise Aufbau erfolgt zum Beispiel, indem man zunächst die Carboxy­ terminale Aminosäure, deren α-ständige Aminogruppe geschützt ist, an einen hierfür üblichen unlöslichen Träger kovalent bindet, die α-Amino-Schutzgrnppe dieser Aminosäure abspaltet, an die so erhaltene freie Aminogruppe die nächste geschützte Aminosäure über ihre Carboxy-Gruppe bindet, und in dieser Weise Schritt für Schritt die übrigen Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids in der richtigen Reihenfolge verknüpft, und gegebenenfalls weitere vorhandene Seitenfunktions-Schutzgruppen abspaltet und nach Verknüpfung aller Aminosäuren den fertigen Liganden als immobilisierte Verbindung auf Cyp bzw. FKBP-Bindung hin untersucht. Die stufenweise Kondensation erfolgt durch Synthese aus den entsprechenden, in üblicher Weise geschützten Aminosäuren in herkömmlicher Weise. Ebenfalls ist die Verwendung automatischer Peptid-Synthesizer, zum Beispiel Typ Labortec SP 650 von Fa. Bachem, Schweiz, möglich unter Verwendung der im Handel erhältlichen geschützten Aminosäuren.
Als Beispiel für Verbindungen der Formel I seien genannt:
Beispiel 1
N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäurn-[S-(N-ε- Boc)-Lysin-methylester]-amid
Beispiel 2
N-[Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(ε-NH₂)- Lysinmethyl-ester]-amid
Beispiel 3
N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N-- ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid
Beispiel 4
N-[Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(ε-NH₂)- Lysin-methylester]-amid
Beispiel 5
N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-(N-- ε-Z)-Lysinmethylester)-amid
Beispiel 6
1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-(N-ε-Z)-Lysinmethylester)-amid
Beispiel 7
1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-Phenylalaninmethylester)-amid
Beispiel 8
N-[N′-(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäuremethylester (als Vorstufe zur Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I)
Beispiel 9
N-(4-Methoxyphenylacetyl)-Indolin-2-(R,S)-carbonsäuremethylester (als Vorstufe zur Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I)
Beispiel 10
N-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-4-Piperidyl-amid
Beispiel 11
N-Boc-Indolin-2-(R,S)-4-carbonsäure-[Piperazino-essigsäure-morpholid-]- amid.
Beispiel 12
N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[Pipernzi-no­ essigsäuremorpholid]-amid
Beispiel 13
N-[N′-(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung können die Verbindungen der Formel auch nach folgendem Verfahren hergestellt werden.
Erfindungsgemäß werden Verbindungen der Formel I, in der R₁, R₂, R₃, R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, hergestellt, indem man ein Indolderivat der Formel II, worin R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, mit einem Alkanol III der Kettenlänge C₁-C₁₂ zu einem Indolderivatalkylester IV, worin R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, umsetzt, diesen Ester IV in einer weiterführenden Reaktion mit einer Verbindung V, worin R₃, X und Y die genannte Bedeutung haben, zu einer Verbindung VI, worin R₃, R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, umsetzt, anschließend diese Verbindung VI einer Verseifung zu einer Verbindung VII, worin R₃, R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, unterzieht und danach die Verbindung VII mit einer Verbindung VIII, worin R₁ und R₂ die genannte Bedeutung haben, zu der Zielverbindung umsetzt.
Zur Herstellung der physiologisch verträglichen Salze werden die Verbindungen der Formel I mit anorganischen oder organischen Säuren, wie z. B. Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Essigsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Milchsäure oder Embonsäure, oder mit anorganisch oder anorganischen Basen in bekannter Weise umgesetzt.
Pharmazeutische Zubereitungen enthalten mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder deren Salze mit physiologisch verträglichen anorganischen oder organischen Säuren oder Basen und gegebenenfalls pharmazeutisch verwendbare Träger- und Hilfsstoffe.
Die Verbindung der Formel I können in freier Form oder als Salz mit einer physiologisch verträglichen Säure oder Base peroral, parenteral, intravenös, transdermal oder inhalativ appliziert werden.
Als Applikationsformen sind beispielsweise Tabletten oder Dragees, Kapseln, Lösungen bzw. Ampullen, Suppositorien, Pflaster oder in Inhalatoren einsetzbare Pulverzubereitungen geeignet.
Die Dosierung dieser vorgenannten pharmazeutischen Zubereitungen hängt ab vom Zustand des Patienten und von der Applikationsform. Die tägliche Wirkstoffdosis beträgt zwischen 0.01-100 mg pro kg Körpergewicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel (I) zeichnen sich durch Immunophilin-Bindung aus und hemmen deren Isomeraseaktivität. Diese Prolyl­ lsomerase-Aktivität wird nach einem weltweit üblichen Enzym-Test geprüft: G. Fischer, H. Bang, A. Schellenberger, Biochim. Biophys. Acta, 791, 87-97,1984; D. H. Rich et al., J. Med. Chem. 38, 4164-4170, 1995).
Ohne daß in jedem Fall die Peptidyl-cis-trans-Isomerase-Aktivität der Immunophiline beeinflußt wird, inhibieren solche Verbindungen überraschenderweise spezifisch die IL-2-Proliferation aus Mastzellen, Makrophagen und aktivierten T-Zellen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich wie Cyclosporin A (Sandimmun®, CsA), FK 506 bzw. Rapamycin (Tacrolimus) als Immunsuppressiva (R. Y. Calne et al., Br. Med. J. 282, 934-936, 1981), zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen (R. H. Wiener et al., Hepatology 7, 1025, Abst. 9, 1987; L. Fry, J. Autoimmun. 5, 231-240, 1992, G. J. Feutren J. Autoimmun. 5, 183-195, 1992, EP 610,743), allergischer Entzündungen (P. Zabel et al., Lancet 343, 1984), Asthma (C. Bachert, Atemw.-Lungenkrkh. 20, 59, 1994), Insulin abhängiger Diabetes Mellitus (C. R. Stiller, Science, 223, 1362-1367, 1984), Sepsis und auch in Kombination mit bekannten Immunophilin-Liganden wie CsA, FK 506 oder Rapamycin einsetzen. (M. J. Wyvratt, N. H. Sigal, Perspectives in Drug Discovery and Design, Immunosuppression, 2,1, 1994; WO 92/21313, US 5 330 993).
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die verwendeten Abkürzungen hierzu sind:
AcOEt: Essigester
Boc: tert.Butyloxycarbonyl
(Boc)₂O: tert.Butyloxycarbonyl-Anhydrid
CN: Calcineurin
CsA: Cyclosporin A
Cyp: Cyclophilin
DMAP: N,N-Dimethylaminopyridin
EA: Elementaranalyse
EE: Essigester
FKBP: FK 506-Bindungsprotein
HPLC: Hochdruckflüssigkeitschromatographie
i.ÖPV: im Ölpumpenvakuum
Lsg.: Lösung
MeOH: Methanol
PPlase: Peptidyl-Prolin-cis-trans-Isomerase
i.RV: im Rotationsverdampfer
i.V.: im Vakuum
RT: Raumtemperatur
rac: recemisch
ent: enantio
TFA: Trifluoressigsäure
Z: Benzyloxycarbonyl.
Beispiel 1 Synthese von: N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid Stufe 1: (R,S)-Indolin-2-arbonsäuremethylester × HCl
In einem 100 ml Dreihalskolben wurden 5.3 g (32.5 mmol) (R,S)-2- Indolincarbonsäure in 70 ml wasserfreiem Methanol gelöst und bei Zimmertemperatur mit 4.25 g (35.75 mmol) Thionylchlorid versetzt. Das gelbe Reaktionsgemisch wurde 5h unter Rückfluß erhitzt und nach dem Abkühlen i.V.i.RV. vom Lösungsmittel befreit. Nach dem Trocknen i.ÖPV erhielt man das Rohprodukt als kristallinen Feststoff, der mit Diethylether verrührt und abgesaugt wurde.
Ausbeute: 5.4 g (78%)
Stufe 2: Boc-Piperidin-4-carbonsäure
In einem 250 ml Einhalskolben wurden 7 g (54 mmol) Piperidin-4- carbonsäure in 50 ml Dioxan und 40,5 ml 2 N NaOH gelöst und auf 0°C gekühlt. Dazu wurden innerhalb von 30 min 12,99 g (59.4 mmol) (Boc)₂O gelöst in 30 ml Dioxan zugetropft. Anschließend wurde für 24 h bei Raumtemp. gerührt. Es fiel ein weißer Niederschlag aus. Das Dioxan wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand mit gesättigter KHSO₄-Lsg. aufgenommen. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. wurden 11,93 g (96%) eines weißen Pulvers erhalten.
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,25-1,5 (m, 11, Boc, 2-Pip); 1,8 (m, 2 Pip); 2,4 (m, 1, H-C4); 2,8 (t, 2, H-C3, H-C5); 3,8 (d, 2, H-C2, H-C6); 12,25 (s, 1, COOH).
EA: berechnet für C₁₁H₁₉N₁O₄ (229,1): C 57,62; H 8,29; N 6,11 gefunden: C 57,89; H 8,36; N 5,86.
Stufe 3: N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäuremethyl-est-er
4,6 g (22 mmol) (R,S)-Indolin-2-carbonsäuremethylester × HCl und 7.4 g (32 mmol) Boc-Pipeddin-4-carbonsäure wurden in 50 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 9.27 g (36 mmol) 2-Chloro-1-methylpyridiniumjodid und 8.06 ml (58 mmol) Triethylamin in 40 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit wäßriger halb gesättigter KHSO₄-Lsg., zweimal mit wäßriger 2 N NaOH-Lsg. und einmal mit wäßriger gesättigter NaCl- Lsg. gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂ Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. wurde nach dem Trocknen i.ÖPV. 4,61 g (54%) eines hellbraunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 54-56°
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,61
¹H-NMR(DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,35-1,85 (m, 15, Boc, 6 Pip); 2,7-2,8 (m, 2, H-C3, H-CS); 3,25 (m, 1, H-C3-Ind); 3,65 (m, 1, H-C3′-Ind); 3,8 (s, 3, COOCH₃); 3,95 (m, 2, H-C6-Pip); 5,45 (d, 1, H-C2-Ind); 7,05 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1, Ar).
EA: berechnet für C₂₁H₂₈N₂O₅ (388,47): C 64,92; H 7,27; N 7,21 gefunden: C 65,20; H 7,49; N 7,38.
MS: (ESI+): berechnet 388,3, gefunden 389,2.
Stufe 4: N-[1-Boc-Pipendyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure
In einem 50 ml Einhalskolben wurden 3,3 g (8,51 mmol) N-[1-Boc- Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäuremethylester in 25 ml MeOH gelöst, mit 2.14 g (51 mmol) LiOH × H₂O versetzt und 2,5 h bei Raumtemp. gerührt. Die Lösung wurde mit halb gesättigter wäßriger KHSO₄-Lsg. auf pH = 5 angesäuert und zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel i.V.i.RV. entfernt. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 3,09 g (97%) eines hellbraunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 118-119°
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,14
H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,35-1,85 (m, 15, Boc, 6 Pip); 2,7-2,85 (m, 2, H-C3, H-C5); 3,2 (m, 1, H-C3-Ind); 3,65 (m, 1, H-C3′-Ind); 3,95 (m, 2, H-C6-Pip); 5,45 (d, 1, H-C2-Ind); 7,05 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1, Ar); 13,0-13,3 (s, 1, COOH).
MS: (ESI+): berechnet 374,3; gefunden: 375,1.
Stufe 5: N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid
2 g (5,35 mmol) N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbon­ säure und 1.59 g (5,35 mmol) N-ε-Boc-Lysinmethylester × HCl wurden in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 2.81 g (11 mmol, 2,73 g) 2-Chloro-1-methylpyridinium­ jodid und 1.62 g (16 mmol) Triethylamin in 30 ml CH₂ Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter wäßriger KHSO₄ -Lösung, zweimal mit wäßriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach erneutem Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 2,61 g (79%) eines hellbraunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 83-84°
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,48
FT-IR (KBr): 3365w (N-H); 2976w (C-H); 1744m (C=O); 1684s (CONH); 1540w (C-O); 1407m (C-H); 11 70s (C-O); 755m (C=C);
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,25-1,9 (m, 28,18 Boc + 3 CH₂-Lys + 4 Pip); 2,7-3,05 (m, 5, e-CH₂-Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 3,9-4,1 (m, 2, Pip); 4,15-4,3 (m, 1, H-C3-Ind); 5,15 (m ,1, H-C2- Ind); 6,8 (m, 1, Ar-Ind); 7,0 (m, 1, Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind + α-NHCO); 8,1 (d,1, Ar-Ind); 8,7-8,9 (dd, 1, NHCO-Boc).
MS: (ESI+): berechnet 616,4 gefunden: 617,5
HPLC: 2 Peaks bei 24,25 und 24,63 min
EA: (berechnet für C₃₂H₄₈N₄O₈: 616,4): C 62,34; H 7,47; N 9,09 gefunden: C 62,08; H 7,67; N 8,86.
Beispiel 2 Synthese von: N-[1-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(ε-NH₂)-Lysinmethyl-ester]-amid
500 mg (0,812 mmol) N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R, S)-carbon-säure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid wurden in einem 25 ml Einhalskolben in 2,8 ml CH₂Cl₂ gelöst. Dazu wurden 15 äq (0,0122 mol, 0,93 ml) Trifluoressigsäure gegeben und zwei Stunden bei Raumtemp. gerührt. Zu der Lösung wurden 10 ml Diethylether gegeben, es fiel ein weißer Niederschlag aus, der abgesaugt und 6 mal mit Diethylether gewaschen wurde. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 513 mg (98%) eines weißen Pulvers erhalten.
Schmp.: 164-165°
DC (RP): CH₃CN/H₂ O 1 : 1,1% TFA Rf = 0,61
FT-IR (KBr): 3435w (N-H); 3049w (C-H); 1740w (C=O); 1676s (CONH); 1420m (C-H); 1205m, 1135s (C-O);
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,2-2,05 (m, 10, 3 CH₂-Lys + 4 Pip); 2,7-3,15 (m, 5, ε-CH₂-Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 4,1-4,25 (m, 1, C3-Ind); 5,15 (d ,1, H-C2-Ind); 6,95 (m, 1, Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind); 7,7-7,85 (s, 3, NH₃⁺); 8,1 (d, 1, Ar- Ind); 8,7-8,9 (m, 2, NH₂⁺).
MS: (ESI+): berechnet 418,2 gefunden: 417,3 und 209,1 für m/2
HPLC: 2 Peaks bei 11,54 und 12,65 min.
Beispiel 3 Synthese von: N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N--ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid Stufe 1: Boc-(R,S)-Indolin-2-carbonsäure
In einem 250 ml Einhalskolben wurden 5 g (30.8 mmol) (R,S)-Indolin-2- carbonsäure in 30 ml Dioxan und 23 ml 2 N NaOH gelöst und auf 0°C gekühlt. Dazu tropfte man innerhalb von 30 min eine Lösung aus 7.39 g (33.9 mol) (Boc)₂ O in 20 ml Dioxan und rührte 24 h bei Raumtemperatur. Es fiel ein weißer Niederschlag aus. Das Dioxan wurde am i. V. i. RV. entfernt, der Rückstand mit gesättigter KHSO₄-Lsg. aufgenommen und zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 7,76 g (96%) eines braunen Pulvers erhalten.
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 + 1% NEt₃ Rf = 0,91
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,4-1,7 (s, 9, Boc); 3,1 (m, 1, H-C3); 3,5 (m, 1, H-C3′); 4,9 (m, 1, H-C2); 7,0 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 7,5-7,9 (m, 1, Ar) 11,5 (m, 1, COOH)
EA: berechnet für C₁₄H₁₇N₁ O₄ (263,2) C 63,88; H 6,46; N 5,32 gefunden: C 64,05; H 6,53; N 5,41.
Stufe 2: N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)carbonsäure-methyl-ester
5 g (0,023 mol) (R,S)-Indolin-2-carbonsäuremethylester × HCl und 12.11 g (46 mmol) Boc-Indolin-2(R,S)-carbonsäure wurden in 40 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 12.92 g (51 mmol) 2-Chloro-1-methylpyridiniumjodid und 10.23 ml (74 mmol) Triethylamin in 40 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter wäßriger KHSO₄-Lösung, zweimal mit wäßriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit wäßriger gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 5,01 g (51%) eines dunkelbraunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 86°C
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,67 und 0,7
FT-IR (KBr): 3448w (N-H); 2976w (C-H); 1751s, 1707s (C=O); 1680s (CONH); 1485s (C-H); 1168m (C-O); 1020m (C-O); 752s (C=C);
MS: (ESI+) berechnet: 422,4 gefunden: 423,3
EA( berechnet für C₂₄H₂₆N₂O₅ (422,4): C 68,25; H 6,16; N 6,64 gefunden: C 67,96; H 6,17; N 6,4.
Stufe 3: N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure
In einem 50 ml Einhalskolben wurden 2,84 g (6,77 mmol) N-[1-Boc- Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäuremethylester in 20 ml MeOH gelöst. Dazu wurden 1.71 g (41 mmol) LiOH × H₂O gegeben und 2,5 h bei Raumtemp. gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit halb gesättigter KHSO₄-Lsg. auf pH = 5 angesäuert und zweimal mit EE extrahiert. Die organische Phase wurde einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel i.V.i.RV. entfernt. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 2,71 g (98%) eines dunkelbraunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 118-119°
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,14
MS: (ESI+) berechnet: 408,2 gefunden: 409,3.
Stufe 4: N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N--ε-Boc)-Lysin-methylester]-amid
2 g (4,9 mmol) N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure und 1.45 (4,9 mmol) N-ε-Boc-S-Lysinmethylester × HCl wurden in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 2.51 g (9,8 mmol) 2-Chloro-1- methylpyridiniumjodid und 2.04 ml (14.7 mmol) Triethylamin in 30 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß erwärmt. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit wäßriger halb gesättigter KHSO₄-Lösung, zweimal mit wäßriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit wäßriger gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 2,21 g (69%) eines braunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 78-80°
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,51
FT-IR (KBr): 3504w (N-H); 2975w (C-H); 1749s, 1690s (CONH, C=O); 1490s (C-H); 1407m (C-H); 1170s (C-O); 757m (C=C);
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,2-1,8 (m, 24,18 Boc, 3 CH₂-Lys); 2,8-3,0 (m, 3, ε-CH₂-Lys, H-C3-Ind); 3,0-3,2 (m, 1, H-C3-Ind); 3,4-3,5 (m, 1, H-C3-Ind); 3,5-3,7 (m, 3, COOMe); 4,2-4,3 (m, 1, H-C3-Ind); 4,7-4,9 (m, 1, H-C2-Ind); 5,0-5,5 (m, 1, H-C2-Ind); 6,7-6,8 (m, 1, Ar-Ind); 6,85-7,3 (m, 6, Ar-Ind); 7,7-8,9 (m, 3, NHCO, Ar-Ind, α-NHCO).
MS: (ESI+) berechnet: 650,2, gefunden: 651,4
HPLC: 4 Peaks bei 24,82 min, 29,9 min, 30,3 min, 31,2 min.
Beispiel 4 Synthese von: N-[Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-arbonsäure-[S-(ε-NH₂)-Lysin-methylester]-amid
500 mg (0,812 mmol) N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin-methyIester]-amid wurden in einem 25 ml Einhalskolben in 2,8 ml CH₂Cl₂ gelöst. Dazu wurden 15 äq (0,0122 mol, 0,93 ml) Trifluoressigsäure gegeben und zwei Stunden bei Raumtemp. gerührt. Zu der Lösung wurden 10 ml Diethylether gegeben, es fiel ein weißer Niederschlag aus, der abgesaugt und 6 mal mit Diethylether gewaschen wurde. Nach Trocknen i.ÖPV. wurden 513 mg (98%) eines weißen Pulvers erhalten.
Schmp.: 164-165°
DC(RP):CH₃CN/H₂O 1 : 1,1% TFA Rf = 0,61
FT-IR (KBr): 3435w (N-H); 3049w (C-H); 1740w (C=O); 1676s (CONH); 1420m (C-H); 1205m, 1135s (C-O);
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,2-2,05 (m, 10, 3 CH₂-Lys + 4 Pip); 2,7-3,15 (m, 5, ε-CH₂-Lys + H-C3-Ind + 2 Pip); 3,55-3,7 (m, 3, COOMe); 4,1-4,25 (m, 1, C3-Ind); 5,15 (d, 1, H-C2-Ind); 6,95 (m, 1, Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 2, Ar-Ind); 7,7-7,85 (s, 3, NH₃⁺); 8,1 (d, 1, Ar-Ind); 8,7-8,9 (m, 2, NH₂⁺).
MS: (ESI+): berechnet 418,2 gefunden: 417,3 und 209,1 für m/2
HPLC: 2 Peaks bei 11,54 und 12,65 min.
Beispiel 5 Synthese von: N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-(N--ε-Z)-Lysin-methylester)-amid
2,5 g (6,13 mmol) N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbon-säure und 2.03 g (6,13 mmol) N-ε-Z-Lysinmethylester × HCl wurden in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 2.35 g (9,2 mmol) 2-Chloro-1-methyl­ pyridiniumjodid und 2.13 ml (15 mmol) Triethylamin in 30 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter KHSO₄ -Lsg., zweimal mit 2 N NaOH-Lsg. und einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 2,57 g (61%) eines braunen Pulvers erhalten.
Schmp.: 68°
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,48
FT-IR (KBr): 3329w (N-H); 2935w (C-H); 1701s (C=O); 1485s (C-H); 1260m (C-O); 1149m, 1020m (C-O); 753m (C=C);
MS: (ESI+) berechnet: 684,5, gefunden: 685,4
EA (berechnet für C₃₈H₄₄N₄O₈ (684,5): C 66,67; H 6,43; N 8,19 gefunden: C 64,15; H 6,5; N 7,88.
Beispiel 6 Synthese von: 1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester)-amid
6,36 g (0,0242 mol) 1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure und 8.0 g (24.2 mmol) N-ε-Z-Lysinmethylester × HCl wurden in 70 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 9.27 g (36.3 mmol) 2-Chloro-1-methylpyridiniumjodid und 8.41 ml (60.4 mmol) Triethylamin in 60 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde 8 h unter Rückfluß gekocht. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter KHSO₄-Lsg., zweimal mit 2 N NaOH-Lsg. und einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 10,91 g (84%) eines hell-braunen Pulvers erhalten.
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,74
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,3-1,75 (m, 15, 9 Boc + 6 CH₂-Lys); 2,8-3,0 (m, 3, CH₂-Lys + H-C3-Ind); 3,4-3,55 (m, 1, H-C3′-Ind); 3,65 (s, 3, COOCH₃); 4,2 (m, 1, Hα-C-Lys); 4,8 (m, 1, H-C2-Ind); 5,0 (s, 2, CH₂- Z); 6,85 (m, 1, Ar-Ind); 7,15 (t, 2, Ar-Ind); 7,2-7,4 (m, 5, Ph-Z); 7,7 (m, 1, NHCO); 8,4 (m, 1, Ar-Ind)
EA: berechnet für C₂₉H₃₇N₃O₇ (539,4) C 64,56; H 6,86; N 7,79 gefunden: C 64,61; H 7,06, N 7,67;
MS: (ESI+) berechnet: 539,4, gefunden: 540,3.
Beispiel 7 Synthese von: 1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-Phenylalaninmethylester)-amid Stufe 1: S-Phenylalaninmethylester × HCl
In einem 100-ml-Einhalskolben wurden zu einer Suspension von 8.0 g (48.4 mmol) S-Phenylalanin in 50 ml MeOH innerhalb von 30 min bei Raumtemp. 5.3 ml (72.6 mmol) Thionylchlorid zugetropft. Anschließend wurde 3 h zum Rückfluß erhitzt. Methanol und überschüssiges Thionylchlorid wurden zuerst mit Wasserstrahlvakuum, dann am Rotationsverdampfer abdestilliert. Der Rückstand wurde in 50 ml MeOH gelöst und mit 800 ml Diethylether versetzt. Es fiel ein weißer Niederschlag aus. Das Lösungsmittel wurde über eine Fritte abgesaugt, es wurden 7,93 g (75%) eines weißen Pulvers erhalten.
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 3,0-3,2 (m, 2, CH₂); 3,65 (s, 3, COOMe); 4,35 (m, 1, Ha-C); 7,2-7,4 (m, 5, Ph); 8,5-8,7 (m, 3, NH₃⁺).
Stufe 2: N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-(S-Phenylalaninmethylester)-amid
3,5 g (16.2 mmol) S-Phenylalaninmethylester-Hydrochlorid und 4.27 g (16.2 mmol) wurden in 70 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 6.21 g (24.3 mmol) 2-Chloro-1- methyl-pyridiniumjodid und 5.32 ml (40.5 mmol) Triethylamin in 60 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch 8 h unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt, der Rückstand in 200 ml EE aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter KHSO₄-Lsg., zweimal mit 2 N NaOH-Lsg. und einmal mit gesättigter NaCl-Lsg. gewaschen. Das Lösungsmittel wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Nach erneutem Entfernen des Lösungsmittels i.V.i.RV. und Trocknen i.ÖPV. wurden 7,71 g (62%) eines hell-gelben Pulvers erhalten.
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,87
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,2-1,5 (m, 9, Boc); 2,3-2,45 (m, 0,5, H- C3-Ind); 2,8-3,5 (m, 3,5, C3-Ind + CH₂); 3,65 (d, 3, COOMe); 4,4-4,65 (m, 1, C2-Ind); 4,8 (m, 1, Ha-C); 6,8-7,3 (m, 8, 5 Ph + 3 Ar-Ind); 7,7 (m, 1, Ar- Ind); 8,55 (m, 1, NH).
EA: berechnet für C₂₄H₂₈N₂O₅ (424,3) C 67,92; H 6,6; N 6,6 gefunden: C 67,94; H 6,79; N 6,59
MS: (ESI+): berechnet: 424,4 gefunden: 425,2.
Beispiel 8 Synthese von: N-[N′-(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R, S)-carbonsäuremethylester (Diese Verbindung kann als Vorstufe für die Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I eingesetzt werden)
1.2 g (3.0 mmol) N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure-methylester wurden bei RT in 30 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 1.14 g (10 mmol) TFA versetzt und 24 h lang rühren lassen. Das Reaktionsgemisch wurde i.V.i.RV eingeengt, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 3 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase trocknete man über MgSO₄ und entfernte das Lösungsmittel i.V.i.RV. Der Rückstand wurde in 30 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 1.01 g (10 mmol) Triethylamin, mit 366 mg (3.0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin versetzt, auf 0°C gekühlt und mit einer Lösung von 606 mg (3.3 mmol) 4-Methoxyphenylacetylchlorid in 10 ml CH₂Cl₂ versehen. Nach 24 h Rühren wurde das Reaktionsgemisch i. V. i. RV. vom Lösungsmittel befreit, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit 1 n HCl- Lösung, 2 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i.V.i.RV. wurde der Rückstand an 80 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und i. V. i. RV. vom Lösungsmittel befreit und i.ÖPV getrocknet. Man erhielt 1.1 g Produkt als weißen Schaum.
DC: AcOEt, Rf = 0,22
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 1,35-1,85 (m, 13, Boc, 4 Pip); 2,7-2,8 (m, 4, H-C(3), H-C(5)); 3,25 (m, 1, H-C(3)-Ind); 3,65 (m, 1, H-C(3′)-Ind); 3,8 (s, 3, COOCH₃); 3,95 (m, 1, H-C(4)-Pip); 5,45 (d, 1, H-C(2)-Ind); 7,05 (m, 1, Ar); 7,1-7,3 (m, 2, Ar); 8,1 (d, 1, Ar).
EA: berechnet für C₂₅H₂₈N₂O₅ (436.51) C 68.70; H 6,47; N 6,42 gefunden: C 69.97; H 6,98; N 5.27.
Beispiel 9 Synthese von: N-(4-Methoxyphenylacetyl)-Indolin-2-(R,S)-carbonsäuremethylester (Diese Verbindung kann als Vorstufe für die Herstellung eines Amides der allgemeinen Formel I eingesetzt werden)
In einem 100 ml Einhalskolben mit Septum wurden 1 g (R,S)-Indolin-2- carbonsäuremethylester × HCl und 1.14 g (9,36 mmol) DMAP in 25 ml trocknem CH₂Cl₂ vorgelegt. Bei 0°C wurden unter Rühren innerhalb von 30 min 1.04 g (856 µl) 4-Methoxyphenylacetylchlorid mit einer Spritze zugetropft. Anschließend ließ man 3 h bei Raumtemp. rühren. Das Lsgm. wurde i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an 150 g Flash-Kieselgel (CH₂Cl₂ /MeOH 9 : 1) gereinigt. Nach Entfernen des Lsgm. i.V.i.RV. wurden 830 mg (59%) eines hell-grauen Pulvers erhalten.
DC: CH₂Cl₂; Rf = 0,31
¹H-NMR (DMSO-d⁶, 270 MHz): 3,15-3,3 (m, 1, H-C(3)-Ind); 3,5-3,7 (m, 3, CH₂ + H-C(3′)-Ind); 5,0 (m, 1, H-C(2)-Ind); 6,85 (m, 2, Ar-Ind); 7,0 (m, 1, Ar-Ind); 7,1-7,3 (m, 4, Phenyl); 8,25 (d, 1, Ar-Ind)
EA: berechnet für C₁₉H₁₉N₁O₄ (325,3): C 70,15; H 5,85; N 4,31 gefunden: C 70,34; H 5,78; N 4,22
MS: (ESI+) berechnet: 325,3, gefunden: 326,1.
Beispiel 10 Synthese von: N-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-4-Pipendyl-amid
In einem 100 ml Einhalskolben wurden 2.63 g (10.0 mmol) 1-Boc-(R,S)- Indolin-2-carbonsäure mit 1.13 g (12.0 mmol) 4-Aminopyridin, 1.47 g (12.0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 30 ml CH₂Cl₂ bei 0°C vorgelegt und mit einer Lösung aus 2.48 g (12.0 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml CH₂Cl₂ versetzt. Nach 48 h wurde das Reaktionsgemisch über Celite filtriert, i.V.i.RV. vom Lösungsmittel befreit, der Rückstand mit 100 ml Essigester aufgenommen, 2 mal mit 10% wäßriger HCl-Lösung, 2 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand an 50 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand aus AcOEUEther kristallisiert, wobei man 2.4 g des Produktes erhielt.
DC: CH₂Cl₂ /MeOH = 9515; Rf = 0,19
¹H-NMR (CDCl₃, 270 MHz): 1,58 (s, 9H, Boc); 3,43-3,54 (m, 2H, H-C(3)- Ind); 5,0 (m, 1, H-C2-Ind); 7,02 (m, 1H, H-C(7)-Ind); 7,17-7,26 (m, 3H, H- C(6), H-C(5), H-C(4)-Ind); 7,45 (q, 2H, H-C(3), H-C(5)-Py); 7,57 (NH); 8,47 (q, 2H, H-C(2), H-C(6)-Py).
EA: berechnet für C₁₉H₂₁N₃O₃ (339.40): C 67.84; H 6.29; N 12.49; gefunden: C 67.75; H 6.33; N 12.53.
Beispiel 11 Synthese von: N-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[Pipernzino-essigsäure-morpholid]--amid
In einem 100 ml Einhalskolben wurden 2.63 g (10.0 mmol) 1-Boc-(R,S)- Indolin-2-carbonsäure mit 2.56 g (12.0 mmol) Piperazinoessigsäure­ morpholid, 1.47 g (12.0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 30 ml CH₂Cl₂ bei 0°C vorgelegt und mit einer Lösung aus 2.48 g (12.0 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml CH₂Cl₂ versetzt. Nach 48 h wurde das Reaktionsgemisch über Celite filtriert, i.V.i.RV. vom Lösungsmittel befreit, der Rückstand mit 100 ml Essigester aufgenommen, 2 mal mit 10%iger wäßriger HCl-Lösung, 2 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃- Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand an 50 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand aus AcOEt/Ether kristallisiert, wobei man 2.4 g des Produktes erhielt.
DC: CH₂Cl₂ /MeOH = 9515; Rf = 0,19
¹H-NMR (CDCl₃, 270 MHz): 1.48-1.58 (d, 9H, Boc); 3,21 (s, 2H, H- C(2′′)); 3,42-3,69 (m, 16H); 5,1 (br, 2H, H-C(3)-Ind); 6,48 (q, 1H); 6,90 (q, 1H); 7,14 (m, 1H), 8,22 (q, 1H).
EA: berechnet für C₂₄H₃₄N₄O₅ (458.56): C 62.86; H 7.47; N 12.21; gefunden: C 63.21; H 7.48; N 13.61.
Beispiel 12 Synthese von: N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[Piperazi-noessigsäure-morpholid]-amid
458.56 mg (1.0 mmol) 1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[Piperazino­ essigsäuremorpholid]-amid wurden bei RT in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 1.14 g (10 mmol) TFA versetzt und 24 h lang rühren lassen. Das Reaktionsgemisch wurde i.V.i.RV. eingeengt, mit 10 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase trocknete man über MgSO₄ und entfernte das Lösungsmittel i.V.i.RV. Der Rückstand wurde in 10 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 505 mg (5 mmol) Triethylamin, mit 320.7 mg (1.4 mmol) 4-Boc-Piperidincarbonsäure und mit 357.7 mg (1.4 mmol) 2-Chlor-1-methyl-pyridiniumhydrochlorid versetzt, 8 h auf Rückflußtemperatur erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde i.V.i.RV. vom Lösungsmittel befreit, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit Wasser, einmal mit 10%iger wäßriger HCl-Lösung, 2 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i.V.i.RV. wurde der Rückstand aus Essigester/Isopropanol kristallisiert.
EA: berechnet für C₂₅H₂₈N₂O₅ (557.70): C 62.46; H 7.77; N 12.56 gefunden: C 61.56; H 7.62; N 11.96.
Beispiel 13 Synthese von: N-[N-(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-c-arbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid Stufe 1: N-[1-Boc-Pipendyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid
3.74 g (10 mmol) N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure und 3.31 g (10 mmol) N-ε-Z-Lysinmethylester × HCl wurden in 20 ml CH₂Cl₂ gelöst und innerhalb von 30 min bei Raumtemp. zu einer Suspension von 5.11 g (20 mmol) 2-Chloro-1-methylpyridiniumjodid und 4.04 g (40 mmol) Triethylamin in 30 ml CH₂Cl₂ zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde nach 8 stündigem refluxieren i.V.i.RV. vom Lösungsmittel befreit. Der Rückstand wurde in 200 ml Essigester aufgenommen und die organische Phase einmal mit Wasser, zweimal mit halb gesättigter wäßriger KHSO₄-Lösung, zweimal mit wäßriger 2 N NaOH-Lösung und einmal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dein Trockenen über MgSO₄ wurde das Lösungsmittel i.V.i.RV. entfernt und der Rückstand durch Chromatographie an 400 g Kieselgel mit CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittels i.V.i.RV. entfernt. Nach dem Trocknen i.ÖPV. wurden 4.2 g eines hellbraunen Pulvers erhalten.
DC: CH₂Cl₂ /MeOH 95 : 5 Rf = 0,41
EA: (berechnet für C₃₂H₄₈N₄O₈: 650,78): C 64.60; H 7.13; N 8.61; gefunden: C 64.73; H 7.01; N 8.64.
Stufe 2: N-[N′-(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)--carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid
3.25 g (5.0 mmol) N-[1-Boc-Pipendyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid wurden bei RT in 50 ml CH₂Cl₂ gelöst, mit 2.28 g (20 mmol) TFA versetzt und 4 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde i.V.i.RV. eingeengt, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 3 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase trocknete man über MgSO₄ und entfernte das Lösungsmittel i.V.i.RV. Der Rückstand wurde in 30 ml CH₂ Cl₂ gelöst, mit 1.01 g (10 mmol) Triethylamin, mit 366 mg (3.0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin versetzt, auf 0°C gekühlt und mit einer Lösung von 1.01 g (5.5 mmol) 4- Methoxyphenylacetylchlorid in 10 ml CH₂Cl₂ versehen. Nach 24 h Rühren wurde das Reaktionsgemisch i. V. i. RV. vom Lösungsmittel befreit, mit 100 ml Essigester aufgenommen und 2 mal mit wäßriger 1 n HCl-Lösung, 2 mal mit gesättigter wäßriger NaHCO₃-Lösung und 1 mal mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels i. V. i. RV. wurde der Rückstand an 80 g Flashgel mit n-Hexan/AcOEt chromatographiert. Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt und i.V.i.RV. vom Lösungsmittel befreit, i.ÖPV getrocknet, wobei das Produkt als weißer Schaum verblieb.
EA: berechnet für C₃₉H₄₆N₄O₈ × H₂O (716.84): C 65.35; H 6.75; N 7.82; gefunden: C 65.47; H 6.89; N 7.81.
Die aufgeführten Beispiele 1-7 und 10-13 erwiesen sich überraschenderweise als stark bindende Immunophilin-Modulatoren, die als trägerfixierte Form geeignet und in der Lage sind, pathogen wirkende Immunophiline aus Flüssigkeiten, insbesonders Körperflüssigkeiten, zu binden.
Zum Auffinden von stark bindenden Cyp B bzw. FKBP-Liganden der Formel I wurden die immobilisierten Liganden einem SDS-PAGE (Abbildung 1) mit Zellhomogenat unterzogen. Trägerfixierte Liganden, die eine besondere Affinität gegenüber den Immunophilinen aufweisen, binden diese spezifisch mit einer Affinität, die höher ist als CsA beziehungsweise FK 506. Die hohe Affinität von den mit Formel I dargestellten, trägerfixierten Liganden gegenüber Immunophilinen läßt sich an einem SDS-PAGE zeigen.
Erklärung zum SDS-PAGE
a) Zellhomogenat
  • b) Zellhomogenat-Eluat nach Equilibrierung mit trägerfixierten Liganden der allgemeinen Formel I
  • c) Ablösung des Cyclophilin B mit SDS von der unter b) genannten Matrix bei 25°C
  • d) SDS-Kontrolle
  • e) Ablösung des Cyclophilin B mit, SDS von der unter b) genannten Matrix bei 95°C
  • f) Proteinstandard (Sigma: 12 kDa, 18kDa, 25 kDa, 45 kDa, 66 kDa)
  • g) Zellhomogenat-Eluat nach Equilibrierung mit immobilisiertem CsA
  • h) Ablösung des Cyclophilin B von der unter g) genannten CsA-Matrix mit SDS bei 25°C
  • i) Ablösung des Cyclophilin B von der unter g) genannten CsA-Matrix mit SDS bei 95°C
  • k) SDS-Kontrolle.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen gemäß Formel (I) zeichnen sich überraschenderweise durch Immunophilin-Bindung aus und hemmen deren Peptidyl- Prolyl-cis-trans-Isomerase (PPlase)-Aktivität. Für das Eingangsscreening (1 µmol/l Substanz) wird die Inhibition des humanen Cyclophilin B im PPlase-Test bestimmt.
Diese PPlase-Aktivität wird nach einem weltweit üblichen Enzym-Test geprüft: G. Fischer, H. Bang, C. Mech, Biomed. Blochim. Acta, 43, 1101-1111; G. Fischer, H. Bang, A. Schellenberger, Biochim. Biophys. Acta, 791, 87-97, 1984; D. H. Rich et al., J. Med. Chem. 38, 4164-4170, 1995).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden zusammen mit 10 mmol Cyp B für 15 min. bei 4°C präinkubiert. Die Enzymreaktion wird nach Zugabe von Chymotrypsin und HEPES-Puffer mit dem Testpeptid Suc-Ala-Ala-Pro- Phe-Nan gestartet. Anschließend wird die Extinktionsänderung bei 390 nm verfolgt und ausgewertet. Die photometrisch ermittelte Extintinktionsänderung resultiert aus zwei Teilreaktionen: a) die schnelle chymotryptische Spaltung des trans-Peptides; b) die nicht-enzymatische cis-trans-Isomerisierung, die durch Cyclophiline katalysiert ist. Die entsprechende PPlase-Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel sind in Tabelle 1 dargestellt:
Tabelle 1
Für die bekannten iminunsuppressiven Effekte von CsA scheint die Bildung des Übermoleküles aus CsA-Cyp B-Calcineurin (Ca2+-abhängige Phophatase) verantwortlich zu sein. Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden für die Untersuchung auf die Wechselwirkung mit diesem Übermolekül aus CsA-Cyp B beziehungsweise CsA-Cyp B-Calcineurin mit Zellhomogenate einer humanen T-Zellinie mit ³H-CsA (100 nmol) inkubiert. Nach der Gelfiltration an Superose 12 wurde die Radioaktivität der eluierten Fraktionen gemessen und mit der unbehandelten Kontrolle verglichen. Die entsprechende Verdrängung von ³H-CsA durch die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I aus dem Übermolekül Cyp B-CsA und Cyp-CsA-Calcineurin ist in Tabelle 2 dargestellt:
Tabelle 2
Der II-2-Proliferationstest beruht auf dem Einbau von H-Thymidin in mit OKT-3 (humane anti-CD-3-Antikörper) stimulierte T-Zellen und wird folgendermaßen durchgeführt:
100 000 T-Zellen werden in 150 µl Kulturmedium pro Well in Mikrotiterplatten ausgesäht, durch Zugabe von OKT-3 (1 µg/ml) stimuliert und für 45 h mit jeweils einer der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit werden in jedes Well 10 µl der ³H-Thymidin-Lösung (0.5. µCi) pipettiert. Danach wird 6 h bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre inkubiert. Nach dem Ernten der Zellen wird die Radioaktivität im β-Counter quantifiziert. Die entsprechende CD3-induzierte Proliferationshemmung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I sind in Tabelle 3 dargestellt:
Tabelle 3
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I zeigen wie CsA, FK 506 beziehungsweise Rapamycin im Tierexperiment die Blockade von Cytokinen wie IL-2, IL-4 und IL-5, die im Krankheitsfalle die allergisch induzierten Entzündungen hervorrufen.
Zur Bestimmung der Zellteilungshemmung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I wurden 50 000 humane Tumorzellen in Gegenwart der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I 48 h lang kultiviert, mit 10 µl gelbem Tetrazoliuin-Salz-Lösung (MTT) versehen und weitere 4 h bei 37°C in einer CO₂-Atmosphäre inkubiert. Die resultierende violette Färbung wurde photometrisch bei 570 nm analysiert. Nach Zugabe von je 100 µl SDS-Lösung wurde nach über Nacht-Inkubation die Färbung photometrisch quantifiziert. Eine allgemeine Zelltoxizität der erfindungsgemäß Verbindungen der allgemeinen Formel I konnte nicht festgestellt werden.

Claims (19)

1. Neue spezifische Immunophilin-Liganden der Formel I worin R₁, R₂, R₃, R₄, X, Y, A, B und D die folgende Bedeutung haben:
R₁ Wasserstoff, (C₁-C₁₂)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkyloxygruppen, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt ist und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, ein- oder mehrfach durch einen Phenylring substitutiert sein kann, wobei dieser Phenylring selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluor-methylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann,
R₁ kann außerdem der Aminrest von folgenden Aminosäureinethylestern sein: Histidin, Leucin, Valin, Serin(BzI), Threonin, Pipecolinsäure, 4-Piperidincarbonsäure, 3-Piperidincarbonsäure, ε-NH₂-Lysin, ε-Z-NH-Lysin, ε-(2Cl-Z)-NH-Lysin, 2-Pyridylalanin, Phenylalanin, Tryptophan, Glutaminsäure, Arginin(Tos), Asparagin, Citrullin, Homocitrullin, Ornithin, Prolin, 2- Indolincarbonsäure, Octahydrindolincarbonsäure, Tetrahydroisochinolincarbonsäure, 5-Aminovaleriansäure, 8-Aminoctansäure;
R₂ Wasserstoff, (C₁-C₁₂)-Alkyl oder (C₂-C₆)-Alkyloxygruppen, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt ist und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, ein- oder mehrfach durch einen Phenylring substitutiert sein kann, wobei dieser Phenylring selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluor-methylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl, Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann;
R₃ Wasserstoff, Butyloxycarbonyl, Carboxybenzyl, mono- bi- oder tricyclisches Carbonyl-Aryl oder Carbonyl-Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wobei Aryl bzw. Heteroaryl selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoyl­ gruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl, Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann, ferner kann R₃ sein Carboxy-(C₁-C₆)-alkyl, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann und durch ein mono- oder bicyclisches Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Morpholin, Piperazin, Piperidin, Indol, Indazol, Phthalazine, Thiophen, Furan, Imidazol, bzw. ein- oder mehrfach durch einen Phenylring substitutiert sein kann, wobei dieser Phenylring selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann,
R₃ kann ferner der Säurerest folgender Aminosäuren sein: Histidin, Leucin, Valin, Serin(Bzl), Threonin, Pipecolinsäure, 4-Piperidincarbonsäure, 3-Piperidincarbonsäure, ε-NH₂-Lysin, ε-Z-NH-Lysin, ε-(2Cl-Z)-NH-Lysin, 2-Pyridylalanin, Phenylalanin, Tryptophan, Glutaminsäure, Arginin(Tos), Asparagin, Citrullin, Homocitrullin, Ornithin, Prolin, 2-Indolincarbonsäure, Octahydrindolincarbonsäure, Tetrahydroisochinolin-carbonsäure, 5-Aminovaleriansäure, 8-Aminoctansäure, wobei der N-Terminus der Aminosäuren durch Butyloxycarbonyl, Carboxybenzyl oder durch den Säurerest von mono- bi- oder tricyclischen Aryl- oder Heteroarylcarbonsäuren mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wie Methoxyphenylessigsäure, Naphthylessigsäure, Pyridylessigsäure, Chinazolinonylessigsäure, Indazolylessigsäure, Indolylgloyxylsäure, Phenylglyoxylsäure, Isobutylglyoxylsäure, 2-Aminothiazol-4-glyoxylsäure bzw. durch Carboxy- (C₁-C₁₂)-Alkyl, Carboxycyclopentan, Carboxycyclohexan, Benzoyl, das ein oder mehrfach substituiert sein kann durch Halogen, Methoxygruppen, Aminogruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, substituiert sein kann;
R₄ H, F, OR₅;
R₅ = Wasserstoff, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, (C₁-C₆)-Alkyl oder Carboxy-(C₁-C₆)-Alkyl, wobei die Alkylgruppe geradkettig oder verzweigt sein kann und durch einen mono­ bi- oder tricyclisches Carbonyl-Aryl oder Carbonyl-Heteroaryl mit 1-4 Heteroatomen, vorzugsweise N, S, O, wobei Aryl bzw. Heteroaryl selbst ein- oder mehrfach durch Halogen, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₇)-Cycloalkyl, durch Carboxylgruppen, mit geradkettigen oder verzweigten (C₁-C₆)-Alkanolen veresterten Carboxylgruppen, Carbamoylgruppen, Trifluormethylgruppen, Hydroxylgruppen, Methoxygruppen, Ethoxygruppen, Benzyloxygruppen, Aminogruppen, die selbst wieder durch Benzyl, Benzoyl, Acetyl substituiert sind, substituiert sein kann;
A = aromatisch, nicht aromatisch, aromatisch heterocyclisch mit 1-2 Heteroatomen,
vorzugsweise N, S, O, nicht aromatisch heterocyclisch mit 1-2 Heteroatomen,
vorzugsweise N, S, O;
B = CH₂;
D = CH;
B-D = CH=C;
X = O, S, H₂;
Y = C, Einfachbindung.
2. N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N-ε-Boc)-Lysin­ methylester]-amid.
3. N-[Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S(ε-NH₂)-Lysinmethyl­ ester]-amid.
4. N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(N--ε-Boc)- Lysin-methylester]-amid.
5. N-[Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[S-(ε-NH₂)-Lysin­ methylester]-amid.
6. N-[1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-(N--ε-Z)- Lysinmethylester)-amid.
7. 1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-(N-ε-Z)-Lysinmethylester)-amid.
8. 1-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-(S-Phenylalaninmethylester)-amid.
9. N-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-4-Piperidyl-amid.
10. N-Boc-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[Piperazino-essigsäure-morpholid]--amid.
11. N-[1-Boc-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)-carbonsäure-[Piperazi-no-essig­ säure-morpholid]-amid.
12. N-[N′-(4-Methoxyphenylacetyl)-Piperidyl-4-carbonyl]-Indolin-2-(R,S)- carbonsäure-[S-(N-ε-Z)-Lysin-methylester]-amid.
13. Verwendung der Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines fertigen Arzneimittels.
14. Verwendungen der Verbindungen gemäß Anspruch 13, zur Herstellung eines Arzneimittels mit antiasthmatischer und immunsuppressiver Wirkung oder in Kombination mit therapeutisch bekannten Antiasthmatika bzw. Immunsuppressiva.
15. Trägerfixierte Formen, enthaltend Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Anwendung, pathogen wirkende Immunophiline aus Flüssigkeiten, insbesonders Körperflüssigkeiten, zu binden.
16. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 neben üblichen Träger- und/oder Verdünnungs- beziehungsweise Hilfsstoffen.
17. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 mit gebräuchlichen pharmazeutischen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln beziehungsweise sonstigen Hilfsstoffen zu pharmazeutischen Zubereitungen verarbeitet beziehungsweise in eine therapeutisch anwendbare Form bringt.
18. Arzneimittel gemäß den Ansprüchen 1 bis 14, 16 und 17 in Form von Tabletten oder Dragees, Kapseln, Lösungen beziehungsweise Ampullen, Suppositorien, Pflastern oder Inhalatoren einsetzbaren Pulverzubereitungen.
19. Verfahren zur Herstellung von neuen spezifischen Immunophilin-Liganden der Formel I gemäß Anspruch 1, worin R₁, R₂, R₃, R₄, X, Y, A, B und D die im Anspruch 1 genannte Bedeutung haben, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Indolderivat der Formel II, worin R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, mit einem Alkanol III der Kettenlänge C₁-C₁₂AIOH IIIzu einem Indolderivatalkylester IV, worin R₄, A, B, D, X und Y die genannte Bedeutung haben, umsetzt, den Ester IV mit einer Verbindung V, worin R₃, X und Y die genannte Bedeutung haben, zu einer Verbindung VI, worin R₃, R₄, A, B, D, X und Y genannte Bedeutung haben, umsetzt, anschließend diese Verbindung VI verseift zu einer Verbindung VII, worin R₃, R₄, A, B, D, X und Y genannte Bedeutung haben, und danach die Verbindung VII mit einer Verbindung VIII, worin R₁ und R₂ die genannte Bedeutung haben, zu der Zielverbindung der Formel I umsetzt.
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