DE19613867C1 - Verfahren zur kontinuierlichen elektromigrativen Hüllstromfraktionierung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Einrichtung zur kontinuierlichen elektromigrativen Hüllstromfraktionierung nach dem Oberbegriff des Anspruchs.

Elektrophorese ist ein Verfahren zur Trennung von geladenen Partikeln mit Hilfe eines elektrischen Feldes. Dabei wird die von Partikelspezies zu Partikelspezies unterschiedliche Eigenschaft der elektrophoretischen Mobilität oder des isoelektrischen Punktes zu einer Auftrennung in die einzelnen Spezies ausgenutzt. Elektrophorese kann sowohl in einem stabilisierenden Trägermedium (Gel) als auch ohne Trägermedium, d. h. im freien Elektrolyten durchgeführt werden. Bei der Kapillarelektrophorese wird die Trennung in einer Kapillare durchgeführt, in der die vorhandenen Oberflächenladungen zu einem Transport der gesamten Flüssigkeitssäule d. h. zur Elektroosmose führt.

Es ist bekannt, zur Fraktionierung aus der Kapillarelektrophorese das Ende der Kapillare auf eine Fraktionierfläche aufzusetzen, die gleichzeitig als Elektrophoreseelektrode dient. Die Fraktionierung erfolgt durch Bewegung der Kapillare rechtwinklig zur Elektrodenoberfläche. Von Nachteil bei dieser Fraktionierung ist jedoch die Einbeziehung der Analytteilchen in die Redoxreaktion an der Elektrodenoberfläche, da die Analytteilchen hierdurch so verändert werden können, daß sie für nachfolgende analytische oder präparative Verwertung nicht mehr geeignet sind. Weiterhin ist bekannt, zur Fraktionierung den Elektrophoresestrom kurzzeitig zu unterbrechen, und dann mittels einer über die Länge der Trennkapillare angelegten Druckdifferenz einen Teil des Kapillareninhalts auf einen Fraktionenträger zu fördern. Von Nachteil bei dieser Methodik ist jedoch die aus dem Hagen-Poiseuille-Strömungsprofil resultierende Auflösungsverminderung der Trennung, da die Zonen der Probeteilchen die Kapillarwandung berühren.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Probeteilchen aus der Elektrophoresekapillare unter nur geringem Verlust an analytischer Auflösung und ohne elektrochemische Veränderung auf einen Fraktionenträger zu fraktionieren.

Diese Aufgabe wird bei einer gattungsgemäßen Einrichtung durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Die Überführung der Probeteilchen in einen feldfreien Bereich erfolgt nach Anspruch 1, um die Abwesenheit einer Potentialdifferenz bei der Übertragung auf den Fraktionenträger zu gewährleisten, so daß die Probeteilchen keiner elektrochemischen Reaktion unterliegen. Die Verstärkung des Hüllflüssigkeitsstroms erfolgt nach Anspruch 2, um auch Diaphragmen großer Porosität und kleiner Festladungskonzentration einzusetzen. Die Fraktionierung erfolgt nach Anspruch 3, um elektrochemische Veränderungen zu vermeiden, die eine nachfolgende Verwendung der Probeteilchen in analytischen oder präparativen Verfahren verhindern. Mindestens ein Reagens wird über das Diaphragma nach Anspruch 4 den Probeteilchen zugemischt, um die Probeteilchen für eine nachfolgende analytische oder präparative Verwendung zu stabilisieren. Die Umspülung des Diaphragmas erfolgt nach Anspruch 5, um Zonen veränderter Elektrolytkonzentration von der Außenseite des Diaphragmas zu entfernen, so daß die aus dem Elektrodenraum in das Diaphragma eintretende Flüssigkeit eine hohe Ionenkonzentration aufweist.

Die mit der Erfindung erzielbaren Vorteile bestehen in der erweiterten Einsetzbarkeit des analytischen Trennverfahrens Kapillarelektrophorese auch zur mikropräparativen Aufreinigung, ohne eine elektrochemische Veränderung der Analytteilchen durch die Fraktionierung und ohne nennenswerten Verlust an analytischer Auflösung bei der Fraktionierung in Kauf nehmen zu müssen, so daß auch kapillarelektrophoretisch gereinigte Nucleinsäure-, Peptid- und Proteinpräparate hergestellt werden können. Einen besonderen Vorteil der Erfindung für den biotechnologischen und gentechnologischen Bereich bietet die Möglichkeit, den Fraktionenträger als Probenträger in der Laserdesorptionsmassenspektrometrie einzusetzen. Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in der Zeichnung dargestellt und wird im folgenden näher beschrieben.

Es zeigen

Fig. 1 Übersichtsdarstellung einer Einrichtung zur Kapillarelektrophorese mit der Vorrichtung zur kontinuierlichen elektromigrativen Hüllstromfraktionierung,

Fig. 2 Längsschnitt der Vorrichtung zur kontinuierlichen elektromigrativen Hüllstromfraktionierung.

Es folgt die Erläuterung der Erfindung anhand der Zeichnungen nach Aufbau und Wirkungsweise der dargestellten Erfindung. In der Übersichtsskizze (Fig. 1) ist eine Einrichtung zur Kapillarelektrophorese mit der kathodenseitig angebrachten Fraktioniereinrichtung prinzipiell dargestellt. Die Probe wird auf der Anodenseite aufgegeben, wobei üblicherweise nach der elektrophoretischen oder pneumatischen Probenaufgabe das Ende der Trennkapillare (2) in das Anodenpuffergefäß mit eingetauchter Elekrophoreseanode (3) eingetaucht wird. Während der elektrophoretischen Auftrennung der Probe in der Trennkapillare, wobei die elektrische Feldstärke E größer als Null ist, erfolgt ein elektroosmotischer Transport des Kapillareninhalts in Richtung der Kathode (Fig. 2), wobei das elektroosmotische Strömungsprofil (11) rechteckig ist, da die bewegende Kraft an einem Zylindermantel in der Nähe der Wandung in der Flüssigkeit angreift.

Die Trennkapillare (2) mündet in das hohlzylinderförmige Diaphragma (7), welches sich im Inneren eines Gefäßes befindet, welches den Kathodenelektrolyt enthält. Eine weitere Kapillare, die Fraktionierkapillare (5), ist von der entgegengesetzten Seite in das Diaphragma eingelassen, wobei der Abstand der beiden Kapillaren innerhalb des Diaphragmas den ein- bis zweifachen Außendurchmesser der Kapillaren beträgt. Dieser Abstand ist so gewählt, damit einerseits der Bereich erweiterten Innendurchmessers im System in Achsialrichtung so kurz wie möglich ist, andererseits die Fläche für den Durchtritt des Elektrophoresestromes groß genug ist, um das Diaphragma nicht einer zu großen Erwärmung durch den elektrischen Strom auszusetzen. Die elektrische Feldstärke E ist innerhalb der Fraktionierkapillare aufgrund der Anbringung der Elektrophoreseelektroden und der isolierten Montage des Fraktionenträgers gleich Null.

Das Diaphragma generiert unter dem Einfluß des elektrischen Stromes an der Innenwandung eine Ionenanreicherungszone (J. Heinrich und H. Wagner, in Cell Electrophoresis, ed. J. Bauer, CRC Press London Tokyo, 1995, Seiten 103-112). Die ionenanreichernde Wirkungsweise des Diaphragmas ergibt sich aus der Ladung der unbeweglichen Diaphragmenmatrix und der Stromrichtung (J. Heinrich, H. Wagner, Electrophoresis, 14, 99, 1993). Die Ionenanreicherungszone verhindert die Wanderung der Analytteilchen in das Diaphragma, da aufgrund der hohen Ionenkonzentration die elektrophoretische Effektivmobilität der Analytteilchen innerhalb der Anreicherungszone sehr klein wird. Weiterhin wird durch die Wahl des Diaphragmamaterials über den sogenannten elektrophoretischen Effekt ein Netto- Flüssigkeitstransport in die Kapillare erzielt. Gemeinsam mit dem vom elektrischen Feld hervorgerufenen elektroosmotischen Flüssigkeitstransport in Längsrichtung der kapillaren Anordnung resultiert ein Hüllflüssigkeitsstrom (12) hoher Ionenkonzentration, der die Probenzonen vom direkten Kontakt mit der Innenwand der Fraktionierkapillare abhält und damit zu einer Erhaltung der analytischen Trennschärfe beiträgt, da das druckdifferenzbedingte, in der feldfreien Fraktionierkapillare auftretende Hagen-Poiseuille-Strömungsprofil (14) im Zentrum der Kapillare flach ist. Die am Ende der Fraktionierkapillare austretenden Probeteilchen werden auf einen relativ zum Kapillarende rechtwinklig bewegten Fraktionenträger (6) kontinuierlich fraktioniert. Dicht bei der Fraktioniereinrichtung kann an der Trennkapillare ein Detektor (10) zur Detektion von Probenteilchen angebracht sein, der Informationen über die Auftrennung vor der Fraktionierung liefert.

Claims (9)

1. Verfahren zur kontinuierlichen elektromigrativen Hüllstromfraktionierung, bei welcher die zu fraktionierenden Probeteilchen, die sich durch Elektrophorese unter dem Einfluß des zur elektrophoretischen Auftrennung einer Probe im Inneren einer Trennkapillare angelegten elektrischen Feldes in Richtung einer der Elektroden bewegen, auf einen festen, gelförmigen oder flüssigen Träger fraktioniert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Probeteilchen mittels eines unter der Einwirkung eines Elektrophoresestromes von einem hohlzylinderförmigen Diaphragma erzeugten Hüllflüssigkeitsstroms hoher Ionenkonzentration aus dem Bereich des elektrischen Feldes kontinuierlich in eine feldfreie Fraktionierkapillare gefördert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Hüllflüssigkeitsstrom hoher Ionenkonzentration durch eine von außen über das Diaphragma angelegte Druckdifferenz verstärkt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierung auf einen festen, gelförmigen oder flüssigen Träger erfolgt, der keine Potentialdifferenz gegenüber dem Ende der Flüssigkeitssäule in der Fraktionierkapillare aufweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Puffer mindestens ein Reagens enthält, welches den Probeteilchen kontinuierlich im Hüllflüssigkeitsstrom zugemischt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Diaphragma zur Entfernung einer Ionen-Verarmungszone von einem Puffer ständig umspült wird.

6. Vorrichtung zur kontinuierlichen elektromigrativen Hüllstromfraktionierung nach mindestens einem der Ansprüche 1-5, bestehend aus einem Elektrodenanschlußblock (1), einer Trennkapillare (2), einer Gegenelektrode (3) mit Puffer- bzw. Probegefäß (4), dadurch gekennzeichnet, daß das Diaphragma (7) die Trennkapillare (2) mit der Fraktionierkapillare (5) verbindet.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß am Elektrodenanschlußblock (1) Anschlüsse für die Zirkulation des Elektrodenpuffers (8, 9) vorgesehen sind.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Bewegungsrichtung der Probeteilchen vor der Fraktionierung ein Detektor (10) für mindestens eine Spezies der in der Kapillare enthaltenen Probeteilchen angebracht ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierkapillare so dicht über einen festen, flüssigen oder gelförmigen rechtwinklig zur Fraktionierkapillare beweglichen Fraktionenträger angebracht ist, daß die am Ende der Fraktionierkapillare austretende Flüssigkeit auf dem Fraktionenträger abgestreift werden kann.