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DE19612807A1 - New benzaldehyde derivatives from Hericeum erinaceus - Google Patents

New benzaldehyde derivatives from Hericeum erinaceus

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Publication number
DE19612807A1
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Authority
DE
Germany
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erinaceus
compound according
hericeum
double bond
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19612807A
Other languages
German (de)
Inventor
Heike Dipl Ing Stump
Wilhelm Dr Stahl
Joachim Dr Wink
Irvin Dr Winkler
Herbert Dr Kogler
Juergen Prof Dr Backhaus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
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Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
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Priority to JP9534897A priority patent/JP2000507447A/en
Priority to EP97914303A priority patent/EP0891319A1/en
Priority to PCT/EP1997/001504 priority patent/WO1997036852A1/en
Publication of DE19612807A1 publication Critical patent/DE19612807A1/en
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/74—Unsaturated compounds containing —CHO groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
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Abstract

The present invention relates to a compound of formula (I) R<1> to R<10> are hydrogen or methyl, where two R<1> to R<10> on adjacent carbon atoms together with a C-C single bond may stand for a C-C double bond, provided that, in the carbon chain substituted by R<1> to R<10>, only one of the substituents R<1> to R<10> is methyl and only an adjacent pair of said substituents contribute to a C-C double bond, a process for its production and its use as a medicament, especially for treating diseases produced by an HIV infection.

Description

Die Erfindung betrifft neue Benzaldehyd-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur prophylaktischen und therapeutischen Behandlung des menschlichen Körpers.The invention relates to novel benzaldehyde derivatives, a process for their Production and its use for prophylactic and therapeutic Treatment of the human body.

Die Erkrankungen des menschlichen Körpers, die durch den Human Immunodeficiency Virus (HIV) hervorgerufen, werden, sind lebensbedrohend und gehen mit einer Vielzahl von Sekundär-Erkrankungen einher. Die Stärke der Erkrankung ist direkt mit dem Virus-Titer, also der Zahl der im Körper vorhandenen Viren, verbunden. Eine Reduzierung des Virus-Titers stellt eine Möglichkeit dar, den Ausbruch der Krankheit zu verhindern oder den Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen. Essentiell für die Vermehrung des Virus ist das Enzym Reverse Transkriptase. Mit Inhibitoren dieses Enzyms konnte gezeigt werden, daß die Virus-Vermehrung deutlich verlangsamt (z. B. Azidothymidin).The diseases of the human body, caused by the human Immunodeficiency virus (HIV), are life-threatening and are associated with a variety of secondary diseases. The strength of Disease is directly related to the virus titer, that is the number of in the body existing viruses, connected. A reduction of the virus titer provides a Possibility to prevent the onset of the disease or the course of the disease Positively influence the disease. It is essential for the multiplication of the virus the enzyme reverse transcriptase. With inhibitors of this enzyme could be shown be that the virus proliferation significantly slows down (eg Azidothymidin).

Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung, Inhibitoren der HIV Reversen Transkriptase und damit zur Behandlung von Erkrankungen, welche durch HIV-Infektionen hervorgerufen werden, bereitzustellen.It is an object of the present application, inhibitors of HIV Reverse transcriptase and thus for the treatment of diseases which caused by HIV infections.

Von verschiedensten synthetischen und natürlichen Stoffen ist bekannt, daß sie die HIV Reverse Transkriptase inhibieren (vgl. z. B. die Übersicht von G.T. Tan et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 185, 370-378) und damit eine Grundvoraussetzung für die Behandlung von HIV-Infektionen erfüllen. Darüberhinaus ist bekannt, daß Basisiomyceten Sekundärmetabolite mit biologischer Wirkung wie z. B. die Strobilurine (vgl. z. B. S. Zapf et al. Angew. Chemie (1995), 107, 255) bilden. Speziell der Fruchtkörper des Basisiomyceten Hericeum erinaceus bildet als Sekundärmetabolite die Hericenone und das Hericerin, deren Wirkungen mit cytotoxisch bzw. das Auswachsen von Neuriten aus Nervenzellend stimulieren beschrieben wird (vgl. H. Kawagishi et al, Tetrahedr. Lett. (1990), 31, 373).Various synthetic and natural substances are known to be inhibit HIV reverse transcriptase (see, for example, the review by G. T. Tan et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 185, 370-378) and thus a Basic condition for the treatment of HIV infections. Moreover, it is known that Basisiomyceten with secondary metabolites biological activity such. The strobilurins (see, for example, S. Zapf et al., Angew. Chemistry (1995), 107, 255). Especially the fruiting body of the Basisiomyceten Hericeum erinaceus forms the hericenone and the secondary metabolites  Hericerin, their effects with cytotoxic or the outgrowth of neurites from stimulating nerve cells (see H. Kawagishi et al, Tetrahedr. Lett. (1990), 31, 373).

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch aus dem Mycel des Basisiomyceten Hericeum erinaceus Sekundärmetabolite isoliert werden können, die die HIV Reverse Transkriptase inhibieren und sich deshalb zur Behandlung von HIV Infektionen eignen. Die Verbindungen sind bislang unbekannt und sind durch folgende Struktur (Formel I) gekennzeichnetSurprisingly, it has now been found that also from the mycelium of Basic myomataete Hericeum erinaceus secondary metabolites can be isolated which inhibit HIV reverse transcriptase and therefore for treatment of HIV infections. The compounds are so far unknown and are characterized by the following structure (formula I)

worin R¹ bis R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl bedeuten oder zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R¹ bis R¹⁰ stehen zusammen mit einer C-C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung mit der Maßgabe, daß in der mit R¹ bis R¹⁰ substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R¹ bis R¹⁰ Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Doppelbindung beiträgt.wherein R¹ to R¹⁰ are hydrogen or methyl or two to adjacent carbon atoms R¹ to R¹⁰ are together with a C-C single bond for a C-C double bond with the proviso that in each of the R¹ to R¹⁰ substituted carbon chain only one of Substituents R¹ to R¹⁰ is methyl and in each case only one adjacent pair this substituent contributes to a C-C double bond.

Vorzugsweise bedeutet R⁵ in Formel I Methyl.Preferably, R⁵ in formula I is methyl.

Besonders bevorzugt bedeuten R³ und R⁶ (beispielsweise Formel 1) oder R⁶ und R⁷ (beispielsweise Formel 2) zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C-Dop­ pelbindung.Particularly preferred are R³ and R⁶ (for example, formula 1) or R⁶ and R⁷ (for example, formula 2) together with the between them substituted C-C single bond is a C-C-dop  pelbindung.

Vorzugsweise liegt die Doppelbindung dieser Verbindungen in Z-Konfiguration vor.Preferably, the double bond of these compounds is in Z configuration in front.

Die neue Verbindung der Formel I, insbesondere die Verbindungen 1 und 2, zeichnen sich durch ihre Wirkung gegen die HIV Reverse Transkriptase aus, die derjenigen von anderen Metaboliten aus Basisiomyceten deutlich überlegen ist, wie die Tabelle zeigt.The novel compound of the formula I, in particular the compounds 1 and 2, are distinguished by their action against HIV reverse transcriptase, which clearly superior to other metabolites of basic myomycetes, as the table shows.

Substanzsubstance IC₅₀ [µM]IC₅₀ [μM] (HIV-RT)(HIV-RT) HyphodontalHyphodontal 7777 Mniopetal BMniopetal B 9191 Mniopetal DMniopetal D 5454 Hericenal AHericensal A 0,370.37

Weiterhin gehören zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen. Ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus, vorzugsweise Hericeum erinaceus DSM 10600, in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindungen anschließend isoliert und gereinigt werden.Furthermore, the subject of the present invention, the methods for the preparation of the compounds mentioned. A method for producing the mentioned compounds is characterized in that the microorganism Hericeum erinaceus, preferably Hericeum erinaceus DSM 10600, in one aqueous medium is cultivated and the target compounds then isolated and be cleaned.

Der Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 ist am 20. März 1996 nach den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt worden.The microorganism Hericeum erinaceus DSM 10600 is on March 20, 1996 deposited under the provisions of the Budapest Treaty.

Anstelle des Stammes DSM 10600 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie Verbindungen der Formel I synthetisieren können. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N-Methyl- N′-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden.Instead of the strain DSM 10600 can also its mutants and Variants are used, as far as they are compounds of the formula I. can synthesize. Such mutants can be prepared in a manner known per se by physical means, for example irradiation, such as with ultraviolet or X-rays, or chemical mutagens, such as Ethyl methanesulfonate (EMS), 2-hydroxy-4-methoxy-benzophenone (MOB) or N-methyl N'-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) can be produced.

Die im folgenden beschriebenden Fermentationsbedingungen gelten für Hericeum erinaceus und das hinterlegte Isolat. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Milliliter- und Litermaßstab) oder im industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) erfolgen.The fermentation conditions described below apply to Hericeum erinaceus and the deposited isolate. The fermentation can in Laboratory scale (milliliter and liter scale) or industrial scale (Cubic meter scale).

In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Henricium erinaceus, insbesondere H. erinaceus DSM 10600, die Verbindung der Formel I.In a nutrient solution containing a carbon source and a nitrogen source as well contains the usual inorganic salts, produces Henricium erinaceus, in particular H. erinaceus DSM 10600, the compound of formula I.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D-Mnanit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phasphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.Preferred carbon sources for aerobic fermentation are assimilable carbohydrates and sugar alcohols such as glucose, lactose or D-mnanit and carbohydrate-containing natural products such. B. malt extract. When  Nitrogenous nutrients are considered: amino acids, peptides and Proteins and their degradation products, such as peptones or tryptones, further Meat extracts, ground seeds, for example of maize, wheat, beans, Soybean or cotton plant, distillation residues from alcohol production, Meat flours or yeast extracts, but also ammonium salts and nitrates. On Inorganic salts, the nutrient solution, for example, chlorides, carbonates, Sulfates or Phasphate the alkali or alkaline earth metals, iron, zinc, cobalt and Manganese included.

Die Bildung der Verbindung der Formel I mit H. erinaceus, bevorzugt DSM 10600, verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die 0,1 bis 2%, bevorzugt 0,5-1%, Cornstep, 0,5 bis 10% bevorzugt 1 bis 5% Tomatenpaste, 0,1 bis 5% bevorzugt 0,5 bis 3% Hafermehl 0,1 bis 5% bevorzugt 0,5 bis 3% Glucose sowie Spurenelemente (% Angaben jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung) enthält. Die Spurenelementlösung kann folgende Zusammensetzung aufweisen:The formation of the compound of formula I with H. erinaceus, preferably DSM 10600, runs particularly well in a nutrient solution, the 0.1 to 2%, preferably 0.5-1%, cornstep, 0.5 to 10%, preferably 1 to 5% tomato paste, 0.1 to 5% preferably 0.5 to 3% oatmeal 0.1 to 5%, preferably 0.5 to 3% Glucose and trace elements (% data in each case based on the weight the entire nutrient solution). The trace element solution can be the following Composition include:

Die Kultivierung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren oder in Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Wasserstoff. Sie wird in einem Temperaturbereich von 15 bis 30°C, vorzugsweise von 20 bis 30°C, insbesondere von 23 bis 28°C, durchgeführt werden. Der pH-Wert liegt von pH 1 bis 7, vorteilhaft von pH 2,5 bis 4,5. Man kultiviert den Pilz unter diesen Bedingungen über einen Zeitraum von 100 bis 300 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden.Cultivation is aerobic, for example, submersed with shaking or Stirring or in fermenters, optionally with the introduction of air or Hydrogen. It is in a temperature range of 15 to 30 ° C, preferably from 20 to 30 ° C, in particular from 23 to 28 ° C, carried out become. The pH is from pH 1 to 7, preferably from pH 2.5 to 4.5. you cultivates the fungus under these conditions for a period of 100 to  300 hours, preferably 120 to 168 hours.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 100 bis 200 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm 7 bis 40 Tage, bevorzugt 10 bis 20 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz- Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.Advantageously cultivated in several stages, d. H. you first set one or several precultures in a liquid nutrient medium, which are then introduced into the actual production medium, the main crop, for example in the Volume ratio 1: 10, to be inoculated. The preculture is obtained z. B., by inoculating mycelium in a nutrient solution and about 100 to 200 hours, preferably 120 to 168 hours, grow. The mycelium can, for example can be obtained by the strain 7 to 40 days, preferably 10 to 20 Days, on a solid or liquid nutrient medium, for example yeast-malt Agar or potato dextrose agar.

Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand des pH-Wertes der Kultur oder des Mycelvolumens sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindung der Formel I ist überwiegend im Kulturfiltrat enthalten.The fermentation process can be determined by the pH of the culture or the mycelium volume and by chromatographic methods, such. B. Thin Layer Chromatography or High Pressure Liquid Chromatography, be monitored. The compound of the formula I is predominantly in the culture filtrate contain.

Die Isolierung der Verbindung der Formel I aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, Ionenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewendet werden.The isolation of the compound of formula I from the respective culture medium carried out by known methods, taking into account the chemical, physical and biological properties of the products. It can z. B. the adsorption, ion exchange or gel filtration method used become.

Ethylacetat/Methanol/Wasser-Mischungen werden als Laufmittel in dem Fachmann bekannten Konzentrationen, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielsweise auch UV-Löschung und Färbereagentien wie Anisaldehyd, Tetraozolblau oder Orcin gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt. Ethyl acetate / methanol / water mixtures are used as eluents in the Expert known concentrations, applied. The detection at the For example, thin-layer chromatographic separation can also be UV-quenching and staining agents such as anisaldehyde, tetraozole blue or orcin optionally additives and / or auxiliaries in or a suitable Dosage form brings.  

In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.In the following examples, the invention will be further explained. Percentages are by weight, mixing ratios Liquids are by volume unless otherwise stated were made.

Die Hericenale können sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet sich die Hauptmenge im Kulturfiltrat. Es ist deshalb zweckmäßig, die Zellmasse durch Filtration oder Zentrifugation vom Filtrat zu trennen. Das Filtrat wird lyophilisiert und das Lyophilisat mit einem Lösungsmittel wie Methanol oder Acetonitril oder 1-Butanol extrahiert. In gleicher Weise können Hericenale aus dem Mycel extrahiert werden. Die Extraktionen können über einen weiten pH-Bereich durchgeführt werden, zweckmäßig ist ein Bereich von pH 3.0-pH 7.5.The hericenals can occur both in the mycelium and in the culture filtrate, usually the major part is in the culture filtrate. It is because of that appropriate, the cell mass by filtration or centrifugation of the filtrate to separate. The filtrate is lyophilized and the lyophilisate with a solvent such as methanol or acetonitrile or 1-butanol. In the same way Hericenals can be extracted from the mycelium. The extractions can be carried out over a wide pH range, appropriate is an area of pH 3.0-pH 7.5.

Eine andere Methode der Isolierung ist die Lösungs-Verteilung in an sich bekannter Weise.Another method of isolation is the solution distribution in itself known way.

Eine weitere Methode der Reinigung ist die Chromatographie an Adsorptionsharzen wie z. B. an Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), an Amberlite® XAD 7 (Rohm und Haas, USA) an Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA), oder an ähnlichen Trägern. Geeignet sind darüberhinaus zahlreiche reversed-phase Träger, z. B. RP-18, wie sie in der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie allgemein verwendet werden. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit für die Hericenale besteht in der Verwendung sogenannter straight-Phase Träger wie z. B. Kieselgel oder Aluminiumoxid oder anderen in an sich bekannter Weise. Geeignet zur Elution sind viele Lösungsmittel wie z. B. Chloroform/Methanol- oder Dichlormethan/n-Butanol- Gemische.Another method of purification is chromatography Adsorption resins such. To Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo), Amberlite® XAD 7 (Rohm and Haas, USA) to Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA), or similar carriers. Beyond that are suitable numerous reversed-phase carriers, eg. B. RP-18, as described in the High pressure liquid chromatography are commonly used. A further cleaning possibility for the hericenals is in the use so-called straight-phase carrier such. As silica or alumina or others in a known manner. Many are suitable for elution Solvents such. Chloroform / methanol or dichloromethane / n-butanol Mixtures.

Ein alternatives Verfahren zur Isolierung der Texenomycine ist die Verwendung sog. Molekularsiebe, wie z. B. Fractogel® TSK HW-40, Sephadex® LH-20 und andere in an sich bekannter Weise. Es ist darüberhinaus auch möglich, die Texenomycine aus angereichertem Material durch Kristallisation zu gewinnen. Geeignet hierzu sind z. B. organische Lösungsmittel und ihre Gemische, wasserfrei oder mit Wasserzusatz. Ebenso können Zusätze von Säuren, wie z. B. Trifluoressigsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Ameisensäure oder andere von Vorteil sein.An alternative method of isolating the texenomycins is use So-called molecular sieves, such. Fractogel® TSK HW-40, Sephadex® LH-20 and  others in a known manner. It is also possible, the To recover texenomycins from enriched material by crystallization. Suitable for this purpose are z. As organic solvents and their mixtures, anhydrous or with added water. Likewise, additives of acids, such as. B. Trifluoroacetic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, formic acid or others of Be an advantage.

Die Verbindungen der Formel I sind ferner als Therapeutikum gegen Krankheiten geeignet, welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen werden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch die Verbindung der Formel I zur Verwendung als Arzneimittel, vorzugsweise zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.The compounds of formula I are also used as a therapeutic against diseases suitable, which are caused by HIV infection. Accordingly, further relates to the present invention also relates to the compound of Formula I for use as a medicament, preferably for the preparation of a Drug for the treatment of a disease caused by HIV infection is caused.

Die Arzneimittel können eine oder mehrere Verbindungen der Formel I und pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten.The medicaments may contain one or more compounds of the formula I and contain pharmaceutical excipients.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.The present invention further relates to Hericeum erinaceus DSM 10600 as well its mutants and variants.

BeispieleExamples 1. a) Herstellung von Mycel des Produzentenstammes H. erinaceus DSM 106001. a) Production of mycelium of the producer strain H. erinaceus DSM 10600

100 ml Nährlösung (20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH₄)₂HPO₄ in 1 l Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7427 beimpft und 240 Stunden bei 25°C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden [Kartoffelinfus 4,0 g/l (Infus aus 200 g Kartoffel in 1000 ml H₂O), 20,0 g D-Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6] dem zusätzlich 15 g Agar/l zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 21 Tage bei 25°C inkubiert. Das nach dieser Zeit entstandene Mycel eines Kolben wird mit einer sterilen Impfnadel abgenommen, sofort weiterverwendet oder bei -4°C in Wasser aufbewahrt.100 ml nutrient solution (20 g malt extract, 2 g yeast extract, 10 g glucose, 0.5 g (NH₄) ₂HPO₄ in 1 liter of tap water, pH before sterilization 6.0) in one 500 ml of sterile Erlenmeyer flasks are inoculated with strain DSM 7427 and 240 hours at 25 ° C and 140 rpm on a rotating Shaking machine incubated. Subsequently, 20 ml of culture liquid in a sterile 500 ml Erlenmeyer flask containing the nutrient medium [potato infus  4.0 g / l (infus from 200 g potato in 1000 ml H₂O), 20.0 g D-glucose, pH before the sterilization 5.6] the additional 15 g agar / l added for solidification was evenly distributed and decanted. The cultures will be 10 to 21 days incubated at 25 ° C. The resulting after this time mycelium of a piston taken with a sterile needle, immediately reused or at -4 ° C stored in water.

b) Herstellung einer Vorkultur des Produzentenstammesb) Production of a preculture of the producer strain

Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit einem 1 Quadratzentimeter großen Agarstück angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25°C inkubiert. Die maximale Produktion einer Verbindung der Formel I ist nach ca. 168 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 4 (500 ml in 200 ml Erlenmeyer) genügt eine 168 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5%) aus der gleichen Nährlösung.A sterile 500 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml of the one described under a) Nutrient solution is used with a culture grown on a slant tube or seeded with a 1 square centimeter piece of agar and on a Shaker at 140 rpm and 25 ° C incubated. The maximum production a compound of formula I is reached after about 168 hours. To inoculate of 4 (500 ml in 200 ml Erlenmeyer) a 168 hour old one is sufficient Submerged culture (inoculation amount approx. 5%) from the same nutrient solution.

2. Herstellung der Verbindungen der Formeln 1 und 22. Preparation of the compounds of the formulas 1 and 2

Ein 2000 ml Erlenmeyer Schüttelkolben wird unter folgenden Bedingungen betrieben:A 2000 ml Erlenmeyer shake flask is used under the following conditions operated:

5 g/l Cornstep
4 g/l Tomatenpaste
10 g/l Hafermehl
pH 6,8 (vor der Sterilisation)
10 g/l Glucose
10 ml/l Spurenelementlösung.5 g / l cornstep
4 g / l tomato paste
10 g / l oatmeal
pH 6.8 (before sterilization)
10 g / l glucose
10 ml / l trace element solution.

Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCl eingestellt.The pH is adjusted with aqueous 2 N NaOH or HCl.

Inkubationszeit: 168 Stunden
Inkubationstemperatur: 25°C
Schüttelgeschwindigkeit: 140 Rpm.Incubation time: 168 hours
Incubation temperature: 25 ° C
Shaking speed: 140 rpm.

SpurenelementlösungTrace element solution

CompositionComposition amount in percentamount in percent FeSO47 H₂OFeSO 4 7 H₂O 0,1000,100 MnSO41 H₂OMnSO 4 1 H₂O 0,1000,100 CuCl22 H₂OCuCl 2 2 H₂O 0,00250.0025 CaCl22 H₂OCaCl 2 2 H₂O 0,0100,010 H3BO₃H3BO₃ 0,00560.0056 (NH₄) 6Mo70244 H₂O(NH₄) 6Mo70244 H₂O 0,00190.0019 ZnSO47 H₂OZnSO 4 7 H₂O 0,0200,020

Comments: Spurenelementlösung für Dokument 5158Comments: Trace element solution for document 5158

Sterilisation-DetailsSterilization Details 3. Isolierung der Hericenale3. Isolation of the hericenals

Die nach Beispiel 2 gewonnene Kulturlösung wird abzentrifugiert und die Zellmasse wird gefriergetrocknet. Das klare Kulturfiltrat wird an Mitsubishi Diaion® CHP20 adsorbiert Säulenmaße 30 × 6 cm) und mit einem Isopropanol Gradienten 0-70% Isopropanol eluiert (Fluß 50 ml/min). Die die Hericenale enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bis auf die Wasserphase eingeengt und lyophilisiert. The culture solution obtained according to Example 2 is centrifuged off and the Cell mass is freeze-dried. The clear culture filtrate will be sent to Mitsubishi Diaion® CHP20 adsorbs column dimensions 30 × 6 cm) and with an isopropanol Gradient 0-70% isopropanol eluted (flow 50 ml / min). The hericenals containing fractions are combined, in vacuo to the water phase concentrated and lyophilized.  

4. Reinigung der Hericenale4. Purification of the hericenals

270 mg des in Beispiel 3 erhaltenen Rohgemisches werden in 20% wäßr. Acetonitril gelöst und zunächst an einer Säule mit Nucleosil® 100-12 C₁₈ mit einem Gradienten von 25-40% Acetonitril in Wasser mit 0.05% Trifluoressigsäure (Säulenmaße 250 × 32 mm, Fluß 50 ml/min) chromatographiert. Die Fraktionen, die die Hericenale enthalten, werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und an Nucleosil® 100-10 C₁₈ AB mit dem gleichen Gradienten endgereinigt (Säulenmaße 250 × 20 mm, Fluß 25 ml/min). Nach Konzentration der Fraktionen und Lyophilisation werden 17,6 mg eines Gemisches aus Hercenal A und Hericenal B. Das Gemisch wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Merck, 0,015-0,040 mm, Säulenvolumen 5 ml) mit Dichlormethan/n-Butanol 20 : 1 als Eluens in die Einzelkomponenten getrennt.270 mg of the crude mixture obtained in Example 3 are in 20% aq. Acetonitrile dissolved and first on a column with Nucleosil® 100-12 C₁₈ with a gradient of 25-40% acetonitrile in water at 0.05% Trifluoroacetic acid (column dimensions 250 × 32 mm, flow 50 ml / min) Chromatograph. The fractions containing the hericenals will become concentrated, concentrated in vacuo and Nucleosil® 100-10 C₁₈ AB with the same gradient (column dimensions 250 × 20 mm, flow 25 ml / min). After concentration of the fractions and lyophilization, 17.6 mg of a Mixture of Hercenal A and Hericenal B. The mixture is replaced by Column chromatography on silica gel 60 (Merck, 0.015-0.040 mm, Column volume 5 ml) with dichloromethane / n-butanol 20: 1 as eluent in the Individual components separated.

Claims (13)

1. Verbindung der Formel I worin R¹ bis R¹⁰ Wasserstoff oder Methyl bedeuten oder zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R¹ bis R¹⁰ stehen zusammen mit einer C-C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung mit der Maßgabe, daß in der mit R¹ bis R¹⁰ substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R¹ bis R¹⁰ Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Dop­ pelbindung beiträgt.1. Compound of formula I wherein R¹ to R¹⁰ are hydrogen or methyl or two located on adjacent carbon atoms R¹ to R¹⁰ together with a CC single bond for a CC double bond with the proviso that in the R¹ to R¹⁰ substituted carbon chain only one of the substituents R¹ to R¹⁰ is methyl and only one adjacent pair of these substituents contributes to a CC double bond. 2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R⁵ Methyl bedeutet.2. A compound according to claim 1, characterized in that R⁵ is methyl means. 3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R³ und R⁶ zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C-Dop­ pelbindung bedeuten.3. A compound according to claim 2, characterized in that R³ and R⁶ together with the between them substituted C-C single bond is a C-C-dop meaning pelbindung. 4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelbindung in Z-Konfiguration vorliegt. 4. A compound according to claim 3, characterized in that the Double bond in Z configuration is present.   5. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R⁶ und R⁷ zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C-Dop­ pelbindung bedeuten.5. A compound according to claim 2, characterized in that R⁶ and R⁷ together with the between them substituted C-C single bond is a C-C-dop meaning pelbindung. 6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelbindung in Z-Konfiguration vorliegt.6. A compound according to claim 5, characterized in that the Double bond in Z configuration is present. 7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindung anschließend isoliert und gereinigt wird.7. A process for the preparation of a compound according to any one of the claims 1 to 6, characterized in that the microorganism Hericeum erinaceus is cultured in an aqueous medium and the Target compound is then isolated and purified. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Hericeum erinaceus DSM 10600 eingesetzt wird.8. The method according to claim 7, characterized in that Hericeum erinaceus DSM 10600 is used. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 eingesetzt werden.9. The method according to claim 8, characterized in that mutants or Variants of the microorganism Hericeum erinaceus DSM 10600 be used. 10. Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Arzneimittel.10. A compound according to any one of claims 1 to 6 for use as Drug. 11. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.11. Use of a compound according to any one of claims 1 to 6 for Preparation of a medicament for treating a disease which caused by HIV infection. 12. Arzneimittel enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und pharmazeutische Hilfsstoffe.12. Medicaments containing at least one compound according to one of Claims 1 to 6 and pharmaceutical excipients. 13. Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.13. Hericeum erinaceus DSM 10600 and its mutants and variants.
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