DE19603767A1

DE19603767A1 - Pyrrolidinpropionsäurederivate mit bradykinin-antagonistischer Wirkung

Info

Publication number: DE19603767A1
Application number: DE1996103767
Authority: DE
Inventors: Adalert Dr Wagner; Gerhard Dr Breipohl; Holger Dr Heitsch; Hermann Dr Gerhards; Gerhard Dr Noelken; Klaus Dr Wirth; Bernward Prof Dr Schoelkens
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1996-02-02
Filing date: 1996-02-02
Publication date: 1997-08-07

Description

Die Erfindung betrifft nicht-peptidische Bradykinin Antagonisten.

In EP-A-622 361 und US 5,438,064 sind heterocyclische Bradykinin Antagonisten beschrieben.

Die vorliegende Erfindung beschreibt Pyrrolidinpropionsäurederivate mit bradykinin-antagonistischer Wirkung. Sie betrifft Verbindungen der Formel (I)

in welcher die Symbole folgende Bedeutung haben:

a) R¹
1. -OH,
2. -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl,
3. -O-(C₃-C₆)-Alkenyl,
4. -O-(C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. -NR⁶R⁷ bedeutet;
b) R²
1. (C₁-C₁₀)-Alkyl,
2. (C₂-C₁₀)-Alkenyl,
3. (C₃-C₁₀)-Alkinyl,
4. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
6. (C₄-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₁-C₄)-Alkyl,
7. (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkenyl,
8. (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkinyl,
9. -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵,
10. (C₆-C₁₀)-Aryl,
11. einem wie unter b) 1., 2., 3. oder 9. definierten Rest, der mit COR¹ monosubstituiert ist,
12. einem wie unter b) 1., 2., 3. oder 9. definierten Rest, worin 1 bis alle H-Atome durch Halogen substituiert sind, oder
13. den unter b) 4. und 10. definierten Rest, der am Aryl mit 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Resten aus der Reihe Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxy und Nitro, Cyano substituiert ist;
c) R³
1. Wasserstoff,
2. (C₁-C₈)-Alkyl,
3. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
4. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. (C₂-C₆)-Alkenyl,
6. (C₃-C₆)-Alkinyl,
7. R² und R³ zusammen (C₂-C₄)-Alkyl,
8. einen wie unter c) 7. definierten Rest der mit Halogen substituiert ist;
d) R⁴
1. Wasserstoff,
2. (C₁-C₆)-Alkyl,
3. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
4. (C₃-C₁₀)-Alkenyl,
e) R⁵
1. Wasserstoff,
2. ein Rest der Formel (II)
f) R⁶ und R⁷ gleich oder verschieden
1. Wasserstoff,
2. (C₁-C₁₀)-Alkyl,
3. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
4. (C₁-C₁₀)-Alkylamino,
5. (C₁-C₁₀)-Alkylguanidino bedeutet;
g) R⁸
1. (C₆-C₁₀)-Aryl,
2. (C₁-C₆)-Alkyl,
3. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
4. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. (C₂-C₆)-Alkenyl,
6. ein unter g) 1. und 4. definierter Rest, der mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe COR¹, Halogen, Nitro, Cyano, (C₁-C₄)-Alkoxy oder Amino substituiert ist;
h) R⁹
1. -NH-(CH₂)_o-NHR⁴
2. -O-(CH₂)_o-NH₂
i) A eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet;
j) B O, NR³ oder S ist;
k) Y eine direkte Bindung oder eine Aminosäure, bevorzugt Phenylalanin, 2-Chlorphenylalanin, 3-Chlorphenylalanin, 4-Chlorphenylalanin, 2- Fluorphenylalanin, 3-Fluorphenylalanin, 4-Fluorphenylalanin, Tyrosin, O-Methyltyrosin, β-(2-Thienyl)alanin, Glycin, Cyclohexylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Norleucin oder Phenylglycin, Serin oder Cystein bedeutet;
l) m eine Zahl 1-5,
m) n eine Zahl 1-5,
n) o eine Zahl 1-10 bedeutet,

sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

Alkyl, Alkenyl und Alkinyl können geradkettig oder verzweigt sein. Entsprechendes gilt für davon abgeleitete Reste wie z. B. Alkoxy.

Unter Cycloalkyl werden auch durch (C₁-C₈)-Alkyl substituierte Ringe verstanden.

(C₆-C₁₂)-Aryl ist beispielsweise Phenyl, Naphthyl oder Biphenylyl, vorzugsweise Phenyl. Entsprechend gilt auch für davon abgeleitete Reste, wie z. B. Aralkyl.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom oder Jod, vorzugsweise für Chlor.

Unter physiologisch verträglichen Salzen von Verbindungen der Formel (I) versteht man sowohl deren organische als auch anorganische Salze, wie sie in Remington′s Pharmaceutical Sciences (17. Auflage, Seite 1418 (1985)) beschrieben sind. Aufgrund der physikalischen und chemischen Stabilität und der Löslichkeit sind saure Gruppen unter anderem Natrium-, Kalium-, Calcium- und Ammoniumsalze bevorzugt; für basische Gruppen sind unter anderem Salze der Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder von Carbonsäuren oder Sulfonsäuren, wie z. B. Essigsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure und p-Toluolsulfonsäure bevorzugt.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin

a) R²
1. (C₁-C₆)-Alkyl,
2. (C₂-C₆)-Alkenyl,
3. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
4. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
5. (C₃-C₆)-Cycloalkyl-(C₁-C₃)-Alkyl bedeutet,
6. ein unter a) 3. und 5. definierter Rest, der mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe Halogen, Nitro, Cyano, (C₁- C₄)-Alkoxy, COR¹ oder Amino substituiert ist;
c) R⁸
1. (C₆-C₁₀)-Aryl,
2. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
3. ein unter c) 1. und 2. definierter Rest, der mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe Halogen, Nitro, Cyano, (C₁- C₄)-Alkoxy, Amino oder COR¹ substituiert ist, und

die übrigen Reste wie oben substituiert sind.

Ganz besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin

a) R¹ -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl;
b) R²
1. (C₆-C₁₀)-Aryl-CH₂-,
2. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
3. (C₃-C₈)-Cycloalkyl-CH₂-;
c) R³
1. (C₃-C₅)-Alkenyl,
2. Phenyl-(C₁-C₃)-Alkyl,
3. R² und R³ zusammen (C₂-C₃)-Alkyl;
d) R⁴
1. Wasserstoff,
e) R⁵
1. Wasserstoff,
2. ein Rest der Formel (II) bedeutet
f) R⁸
1. Phenyl,
2. Benzyl bedeutet;
g) R⁹
1. -NH-(CH₂)_o-NHR⁴,
2. -O-(CH₂)_O-NH₂, bedeutet;
h) A eine Einfach- oder Doppelbindung ist;
i) Y 1. eine Einfachbindung,
2. eine Aminosäure aus der Reihe Phenylalanin, β-(2- Thienyl)alanin, O-Methyltyrosin, Glycin, Cyclohexylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylglycin, Serin oder Cystein bedeutet;
j) o eine Zahl von 1-10 ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) eine Verbindung der Formel (III) mit einer Verbindung R³-X, worin
R³ Wasserstoff, (C₁-C₈)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl oder (C₃-C₆)-Alkinyl bedeutet und
X für eine Abgangsgruppe, wie Halogen, Mesylat oder Tosylat steht,
mit einer metallorganischen Base, wie n-Butyllithium, s-Butyllithium, Methyllithium oder Phenyllithium, Natriumamid sowie Alkalimetallsalzen von organischen Stickstoffbasen, wie Lithiumdiisopropylamid, in einem inerten Lösungsmittel wie THF, Ether, Toluol oder Dimethoxyethan, bevorzugt bei -78°C zu einer Verbindung der Formel IV worin R³ wie oben definiert ist, umsetzt;
b) die Verbindung der Formel IV mit einem Alkoholat der Formel R¹Na oder R¹K, worin
R¹ -OH, -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl, O-(C₃-C₆)-Alkenyl oder -O-(C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)- Alkyl bedeutet,
und dem entsprechenden Alkohol unter Rückfluß kocht, wobei man eine Verbindung der Formel V erhält, worin R¹ und R³ wie oben definiert sind;
c₁) falls in Formel I R² und R³ zusammen für (C₂-C₄)-Alkyl, das gegebenenfalls mit Halogen substituiert sein kann, stehen und in Formel V R³ (C₂-C₆)- Alkenyl bedeutet,
die Verbindung der Formel V mit J₂ oder radikalerzeugenden Reagenzien in Methylenchlorid oder THF bei Raumtemperatur zu einer Verbindung der Formel VI worin R Wasserstoff oder (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet und
R¹ wie unter b) definiert ist, umsetzt, und
c₂) die erhaltene Verbindung der Formel VI mit Raney-Nickel bei 1 atm H₂ und Diisopropylethylamin als Base 1 h bei Raumtemperatur zu einer Verbindung der Formel VII worin R Wasserstoff oder (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet und
R¹ wie unter b) definiert ist, umsetzt;
d) falls in Formel I R² und R³ zusammen nicht (C₂-C₄)-Alkyl, das gegebenenfalls mit Halogen substituiert sein kann, bedeutet eine Verbindung der Formel V worin
R¹-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -O-(C₃-C₆)-Alkenyl oder -O-(C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl bedeutet und
R³ Wasserstoff, (C₁-C₈)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl oder (C₃-C₆)-Alkinyl bedeutet,
mit einer Base, z. B. Natriumhydrid, deprotoniert und anschließend mit einer Verbindung R²-X, worin
R²(C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₄-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₁-C₄)-Alkyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl- (C₂-C₄)-Alkenyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkinyl, (CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, (C₆-C₁₀)-Aryl; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, die mit COR¹ monosubstituiert sind; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂- C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder (CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, worin 1 bis alle H- Atome durch Halogen substituiert sind; oder (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl oder (C₆-C₁₀)-Aryl, die am Aryl mit 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Resten aus der Reihe Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxy und Nitro, Cyano substituiert sind bedeutet,
B O, NR³ oder S ist,
m eine Zahl 1-5,
n eine Zahl 1-5,
R⁵ Wasserstoff oder einen Rest der Formel II bedeutet, und
X eine geeignete Abgangsgruppe, z. B. Halogen, Mesylat oder Tosylat, bedeutet,
zu einer Verbindung der Formel VIII umsetzt, worin R¹, R² und R³ wie unter d) definiert sind;
e) die Verbindung der Formel VIII mit einer Verbindung der Formel worin
Prot. für eine Aminoschutzgruppe, wie z. B. tert. Butoxycarbonyl, steht,
R⁴ Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₁₀)-Alkenyl, -C(O)-O-(C₁-C₆)-Alkyl,-C(O)-O-(C₁-C₆)-Alkyl-(C₆-C₁₀)Aryl, oder X eine geeignete Abgangsgruppe, z. B. Halogen, Mesylat oder Tosylat, bedeutet,
mit einer Base, z. B. Natriumhydrid, deprotoniert, und anschließend mit einer Verbindung der Formel VII oder VIII worin
R Wasserstoff oder (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet,
R¹ wie unter d) definiert ist,
R²(C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₄-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₁-C₄)-Alkyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl- (C₂-C₄)-Alkenyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkinyl, (CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, (C₆-C₁₀)-Aryl; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, die mit COR¹ monosubstituiert sind; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂- C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder (CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, worin 1 bis alle H- Atome durch Halogen substituiert sind; oder (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl oder (C₆-C₁₀)-Aryl, die am Aryl mit 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Resten aus der Reihe Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxy und Nitro, Cyano substituiert sind bedeutet,
B O, NR³ oder S ist,
m eine Zahl 1-5,
n eine Zahl 1-5,
R⁵ Wasserstoff oder einen Rest der Formel II bedeutet, und
R³ Wasserstoff, (C₁-C₈)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl oder (C₃-C₆)-Alkinyl bedeutet,
zu einer Verbindung der Formel IX umsetzt, worin
R¹, R², R³, R⁴ und Prot. wie unter e) definiert sind und
R² und R³ zusammen für (C₂-C₄)-Alkyl, das gegebenenfalls mit Halogen substituiert ist, stehen;
f) die Aminoschutzgruppe Prot nach bekannten Methoden, z. B. mit tert. Butoxycarbonyl (Boc) unter sauren Bedingungen, bevorzugt in Trifluoressigsäure (TFA) oder mit HCl in Dimethoxyethan, oder mit TFA in Dimethoxyethan oder Dichlormethan als bevorzugtem Lösungsmittel, abspaltet;
g) gegebenenfalls die erhaltene Verbindung der Formel X mit freier Aminogruppe worin R¹, R², R³ und R⁴ wie unter e) (Formel IX) definiert sind,
mit einer Verbindung der Formel II′ worin
R⁸ (C₆-C₁₀)-Aryl, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl; (C₆-C₁₀)-Aryl oder (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, die mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe COR¹, Halogen, Nitro, Cyano, (C₁-C₄)-Alkoxy oder Amino substituiert sind, bedeutet,
R⁹ -NH-(CH₂)_o-NHR⁴, -O-(CH₂)_o-NH₂ oder bedeutet,
R⁴ wie unter e) definiert ist,
o eine Zahl 1-10 ist, und
Y eine direkte Bindung oder eine Aminosäure bedeutet,
nach den allgemeinen Methoden der Peptidchemie kuppelt, so daß man eine Verbindung der Formel X′ erhält, worin R¹, R², R³ und R⁴ wie unter g) definiert sind und R⁵ worin R⁸, R⁹ und Y wie unter g) definiert sind, bedeutet;
h) gegebenenfalls die Doppelbindung der Formeln X oder X′ mit Natriumcyanoborhydrid in niederen Alkoholen, wie Methanol, bei Raumtemperatur und pH ∼5 zu einer Verbindung der Formel XI hydriert, worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ wie unter g) definiert sind und
A eine Einfachbindung bedeutet,
i) gegebenenfalls die Verbindungen der Formeln X, X′ oder XI unter sauren oder basischen Bedingungen verseift oder
mit HNR⁶R⁷, worin
R⁶ und R⁷ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₆-C₁₀)- Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₁-C₁₀)-Alkylamino oder (C₁-C₁₀)-Alkylguanidino bedeuten,
in hochsiedenden Lösungsmitteln, z. B. Xylol oder DMF, erhitzt, wobei man die Verbindungen der Formel I erhält; und
k) die Verbindungen der Formel I gegebenenfalls nach bekannten Methoden in ihre physiologisch verträglichen Salze überführt.

Die Bildung der Amidbindung aus Fragment X und II′ erfolgt dadurch, daß ein Fragment mit C-terminaler freier Carboxylgruppe oder dessen aktiviertes Derivat mit einem entsprechenden Fragment mit N-terminaler freier Aminogruppe um setzt und in der erhaltenen Verbindung gegebenenfalls eine oder mehrere zum Schutz anderer Funktionen temporär eingeführte Schutzgruppen abspaltet und die so erhaltenen Verbindungen der Formel I gegebenenfalls in ihr physiologisch verträgliches Salz überführt.

Die Kupplungen der Aminosäuren der vorliegenden Erfindung wurden nach allgemein bekannten Methoden der Peptidchemie, siehe z. B. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/2, Stuttgart 1974, durchgeführt.

Zur Verhinderung von Nebenreaktionen oder für die Synthese spezieller Peptide sind die funktionellen Gruppen der von Aminosäuren durch geeignete Schutzgruppen (siehe z. B. T.W.Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" Verlag: John Wiley, 2. Auflage 1991) geschützt.

Als Kupplungsreagenz können alle möglichen in der Peptidsynthese verwendeten Aktivierungsreagenzien, siehe z. B. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, Band 15/2, Stuttgart 1974, verwendet werden, insbesondere aber Carbodiimide wie z. B. N,N′-Dicyciohexylcarbodiimid, N,N′-Diisopropyl carbodiimid oder N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid. Die Kupplung kann dabei direkt durch Addition von Aminosäurederivat mit dem Aktivierungsreagenz und gegebenenfalls einem die Racemisierung unterdrückenden Zusatz wie z. B. 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) (W. König, R. Geiger, Chem. Ber. 103, 708 (1970)) oder 3-Hydroxy-4-oxo-3,4- dihydrobenzotriazin (HOObt) (W. König, R.Geiger, Chem.Ber. 103, 2054 (1970)) durchgeführt werden oder aber die Voraktivierung des Aminosäurederivats als symmetrisches Anhydrid oder HOBt- bzw. HOObt-Ester kann separat erfolgen und die Lösung der aktivierten Spezies in einem geeigneten Lösungsmittel zum kupplungsfähigen Amin gegeben werden.

Die Kupplung bzw. Aktivierung der Aminosäurederivate mit einem der oben genannten Aktivierungsreagenzien kann in Dimethylformamid, N-Methylpyrrolidon oder Methylenchlorid oder einer Mischung aus den genannten Lösungsmitteln durchgeführt werden.

Die Kupplung der Boc-geschützten Diamine an die Piperidinderivate unter Bildung einer Harnstoff-Funktionalität erfolgt bevorzugt unter Verwendung von Carbodiimiden, Phosgen oder Chlorkohlensäureester als aktivierten Carbonylreagenzien.

Die Synthese der Guanidino-Derivate erfolgt ausgehend von den entsprechenden Aminen mit Amidinogruppen-übertragenden Reagenzien, bevorzugt 1-H-Pyrazol carboxamidin.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben einzeln oder in Kombination eine bradykinin-antagonistische Wirkung, die in verschiedenen Modellen getestet werden kann (s. Handbook of Exp. Pharmacol. Vol. 25, Springer Verlag, 1970, S. 53-55), so z. B. am isolierten Rattenuterus, am Meerschweinchenileum oder an der isolierten Pulmonalarterie des Meerschweinchens.

Die Messung der Bindung an den Bradykinin B₂ Rezeptor vom Meerschweinchenileum ist im Folgenden beschrieben (R.B.Innis et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA; 17 (1981) 2630:

1. Ligand: ³H-BRADYKININ (von NEN Du Pont)

2. Pufferansätze:
a) TES-Puffer:
25 mM TES (SIGMA, Best.Nr.: T-4152)
1 mM 1,10-Phenanthrolin (SIGMA; Best.Nr.: P-9375)
b) Inkubations-Puffer:
25 mM TES (SIGMA; Best.Nr.: T-4152)
1 mM 1,10-Phenanthrolin (SIGMA; Best.Nr.: P-9375)
0,1% Albumin, Bovine (SIGMA; Best.Nr.: A-7906)
140 µg/ml Bacitracin (SIGMA; Best.Nr.: B-0125)
1 mM Dithiothreitol (SIGMA; Best.Nr.: D-0632)
1 µM Captopril → 1-[(2S)-3-Mercapto-2-methylpropionyl]-L-prolin
Beide Puffer werden mit 5 molarer NaOH auf pH 6,8 eingestellt.

3. Membranpräparation:
Meerschweinchen-Ilea werden durch vorsichtiges Ausstreichen grob vom Darm- Inhalt befreit und in 0,9%iger NaCl-Lösung gesäubert.

Die ca. 2 cm langen Ilea-Stücke werden in eiskalten TES-Puffer überführt (ca. 1g /10 ml) und mit dem Utraturrax ca. 30 sec. lang im Eisbad homogenisiert. Das Homogenat wird anschließend durch 3 Lagen Gaze gefiltert und das Filtrat bei 50.000 g/10 Minuten zentrifugiert.

Der Überstand wird verworfen, das Pellet in dem gleichem Volumen TES-Puffer rehomogenisiert und erneut bei 50.000 g/10 Minuten zentrifugiert.

Das Pellet wird in Inkubations-Puffer rehomogenisiert (ca. 1g/5 ml) und in Kryoröhrchen, 2 ml portioniert, bei -70°C eingefroren.

Die Proteinkonzentration der fertigen Membransuspension wird nach LOWRY bestimmt und sollte ca. 15 µg/100 µl betragen.

4. Bindungstest:
Alle Inkubationen werden bei Raumtemperatur für 60 Minuten auf Mikrotiterplatten (96×300 µl) in 200 µl Volumen durchgeführt. Alle Ansätze in Inkubations-Puffer. Dazu werden 50 µl des Radioliganden, 50 µl des zu prüfenden Präparats und 100 µl der Membransuspension nacheinander in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert.

a) Sättigungsexperimente (Heiße Sättigung):
Herstellung der ³H-Bradykinin-Lösung: Für die Sättigungsexperimente werden die Konzentrationen 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 und 3.0 nMol/l, das entspricht 0.05 bis 3.0 pMol/ml, eingesetzt. Nach der Herstellung der entsprechenden Verdünnungen werden je 50 µl pro Probe vorgelegt.

Unspezifische Bindung: Für jede Konzentration des radioaktiven Liganden muß die unspezifische Bindung bestimmt werden. Dies kann durch Zugabe einer hohen Konzentration (1-100 µMol) des nichtmarkierten Liganden, anderer Antagonisten oder Agonisten des Bradykinin-Rezeptors erreicht werden. In diesem Test wird Hoe 140 (10 µMol/l) verwendet. Dazu werden 1,862 mg in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, 1 : 25 mit Inkubationspuffer verdünnt und von dieser Lösung 50 µl zu den Proben in die Mikrotiterplatte gegeben. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 100 µl der Membransuspension gestartet.

b) Kompetitionsexperimente (IC₅₀):
Hier werden eine feste Größe des radioaktiven Liganden (0,25 bis 0,3 nMol/l ³H- Bradykinin) und verschiedene Konzentrationen der nichtmarkierten Agonisten oder Antagonisten eingesetzt. Zu jeweils 50 µl der ³H-Bradykinin-Lösung werden 50 µl der zu prüfenden Präparate bzw. Standards in den Konzentrationen 10^-5 bis 10^-10 Mol/l zugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 100 µl Membransuspension gestartet. Auch in diesem Test werden 3fach-Bestimmungen durchgeführt und drei Proben zur Bestimmung der unspezifischen Bindung mit 10 µMol/l Hoe 140 inkubiert.

Die auf Kompetition zu prüfenden Präparate werden grundsätzlich in einer Konzentration von 1 mMol/l in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, und anschließend mit DMSO weiterverdünnt. Diese Lösung wird dann 1 : 25 mit Inkubationspuffer verdünnt.

Nach der Inkubation werden die Proben im Skatron Zellharvester über einen vorher mit 0,1% PEI (Polyethylenimin) angefeuchteten Whatmann GF/B Filterpapierstreifen abfiltriert und mit, je Probe, 10 ml eiskaltem TES-Puffer nachgewaschen. Die noch feuchten Filter werden in Mini-Scintillationsröhrchen ausgestanzt und mit 3 ml Scintillator aufgefüllt. Nach ca. 12 Stunden Einweichzeit werden die Proben kurz aufgeschüttelt und im Beta-Counter gemessen.

c) Screening:
Im Primär-Screening werden im allgemeinen nur 1-2 Konzentrationen des Prüfpräparats (10^-5 und 10^-6 Mol/l) eingesetzt. Ist bei der höchsten Konzentration eine Verdrängung des Radioliganden von 50% oder mehr nachweisbar, wird eine vollständige Analyse (Kompetitions-Experiment) mit mind. 8 Konzentrationen vorgenommen.

4. Auswertung:
Die Auswertung erfolgt mittels des LIGAND-Programmpakets (Mc Pherrson, Minson & Rodbard, Vertrieb: Elsevier-BIOSOFT), das die notwendigen Berechnungen zur Bestimmung von IC₅₀ und K_i-Werten vornimmt. Dieses Programm führt außerdem grafische Darstellungen der Sättigungs- bzw. Verdrängungs-Kurven sowie den SCATCHARD-Plot, HILL-Plot oder HOFSTEE- Plot durch.

Die Bestimmungen der antagonistischen Wirkung auf die bradykinininduzierte Kontraktion des Meerschweinchen-Ileums erfolgt nach folgendem Protokoll:
Meerschweinchen im Gewicht von ca. 300 g (Morioth strain, ♂, ♀) werden durch Nackenschlag getötet und entblutet. Das Ileum wird in einer Länge von ca. 20 cm herauspräpariert, mit Tyrode-Lösung durchspült (Recordspritze) und so vom Darminhalt befreit. Nun wird es in 1,5 cm lange Abschnitte geteilt. Diese werden im 10 ml fassenden Organbädern, die mit Tyrode-Lösung gefüllt sind, fixiert und mit Dehnungsmeßstreifen (isometrische Kontraktionsmessung) verbunden. Die Vorlast beträgt 1g. Die Tyrode-Lösung wird in einem Wasserbad auf 37°C erwärmt und mit Druckluft durchperlt.

Nach einem Intervall von 30 min. wird mit dem Versuch begonnen. Nach Aufzeichnung der biologischen Null-Linie wird pro Organbad Bradykinin in einer Endkonzentration von 4×10^-8 mol/l zugesetzt und die Konzentration aufgezeichnet. Danach wird 3 min. mit Tyrode-Lösung gespült und nach einer Ruhepause von 20 min. wieder Bradykinin hinzugefügt. Das Maximum der Kontraktion ist erreicht (Kontrolle). Wieder spülen, Ruhepause. Nun wird der Bradykinin-Antagonist zugefügt (Einwirkungszeit 10 min.). Danach wird wieder Bradykinin zugesetzt und die nun erfolgende Kontraktion mit der der Kontrolle verglichen. Die Aufzeichnung des Versuchs erfolgt auf einem Tintenschreiber.

Tyrode-Lösung (mM):

NaCl
137
Glucose	5,05
KCl	2,68
NaHCO₃	11,9
NaH₂PO₄	0,47
MgCl₂ × 2 H₂O	0,49
CaCl₂ × 2 H₂O	0,68

Verstärker: TF6 V3 Fa. Fleck, Mainz
Tintenschreiber: Goerz Metrawatt SE 460, BBC
Bradykinin: Fa. Bachem

Tabelle 1*

Biologische Daten

Für die orale Anwendungsform oder zur Applikation auf die Schleimhäute werden die aktiven Verbindungen mit den dafür üblichen Zusatzstoffen wie Trägerstoffen, Stabilisatoren oder inerten Verdünnungsmitteln vermischt und durch übliche Methoden in geeignete Darreichungsformen gebracht, wie Tabletten, Dragees, Steckkapseln, wäßrige, alkoholische oder ölige Suspensionen oder wäßrige, alkoholische oder ölige Lösungen. Als inerte Träger können z. B. Gummi arabicum, Magnesia, Magnesiumcarbonat, Kaliumphosphat, Milchzucker, Glucose, Magnesiumstearylfumarat oder Stärke, insbesondere Maisstärke verwendet werden. Dabei kann die Zubereitung sowohl als Trocken- und Feuchtgranulat erfolgen. Als ölige Trägerstoffe oder Lösungsmittel kommen beispielsweise pflanzliche oder tierische Öle in Betracht, wie Sonnenblumenöl und Lebertran.

Ein Präparat für die topische Anwendung kann als wäßrige oder ölige Lösung, Lotion, Emulsion oder Gelee, Salbe oder Fettsalbe oder, falls möglich, in Sprayform vorliegen, wobei gegebenenfalls durch Zusatz eines Polymers die Haftung verbessert werden kann.

Für die intranasale Anwendungsform werden die Verbindungen mit den dafür üblichen Zusatzstoffen wie Stabilisatoren oder inerten Verdünnungsmitteln vermischt und durch übliche Methoden in geeignete Darreichungsformen gebracht, wie wäßrige, alkoholische oder ölige Suspensionen oder wäßrige, alkoholische oder ölige Lösungen. Wäßrigen intranasalen Zubereitungen können Chelatbildner, Ethylendiamin-N,N,N′,N′-tetraessigsäure, Citronensäure, Weinsäure oder deren Salze zugefügt werden. Die Applikation der Nasallösungen kann mittels Dosierzerstäuber erfolgen oder als Nasaltropfen mit viskositätserhöhendem Anteil bzw. Nasengels oder Nasencremes.

Der therapeutische Nutzen der erfindungsgemäßen Verbindungen umfaßt alle pathologischen Zustände, die durch Bradykinin und Bradykinin verwandte Peptide vermittelt, ausgelöst oder unterstützt werden. Dies beinhaltet u. a. Traumata, wie Wunden, Verbrennungen, Ausschläge, Erytheme, Ödeme, Angina, Arthritis, Asthma, Allergien, Rhinitis, Schock, Entzündungen, Pankreatitis, Arteriosklerose, Virus-Erkrankungen, niedriger Blutdruck, Schmerz, Juckreiz und veränderte Sperma-Motilität.

Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Verbindungen der Formel I als Heilmittel und pharmazeutische Präparate, die diese Verbindungen enthalten.

Pharmazeutische Präparate enthalten eine wirksame Menge des Wirkstoffs der Formel I - einzeln oder in Kombination - zusammen mit einem anorganischen oder organischen pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoff.

Die Anwendung kann enteral, parenteral - wie z. B. subkutan, i. m. oder i. v. -, sublingual, epikutan, nasal, rektal, intravaginal, intrabukkal oder per Inhalation erfolgen. Die Dosierung des Wirkstoffs hängt von der Warmblüter-Spezies, dem Körpergewicht, Alter und von der Applikationsart ab.

Die pharmazeutischen Präparate der vorliegenden Erfindung werden in an sich bekannten Lösungs-, Misch-, Granulier- oder Dragierverfahren hergestellt.

Für die inhalative Anwendung können Vernebler oder Druckgaspackungen unter Verwendung inerter Trägergase benutzt werden.

Zur intravenösen, subkutanen, epikutanen oder intradermalen Applikation werden die aktiven Verbindungen oder deren physiologisch verträgliche Salze, gewünschtenfalls mit den pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen, beispielsweise zur Isotonierung oder pH-Einstellung sowie Lösungsvermittler, Emulgatoren, oder anderen Hilfsstoffen, in Lösung, Suspension oder Emulsion gebracht.

Aufgrund der kurzen Halbwertszeiten einiger der beschriebenen Arzneistoffe in Körperflüssigkeiten ist der Einsatz von injizierbaren Retardzubereitungen sinnvoll. Als Arzneiformen können z. B. ölige Kristallsuspensionen, Mikrokapseln, Rods oder Implantate verwendet werden, wobei die letzteren aus gewebeverträglichen Polymeren, insbesondere bioabbaubaren Polymeren, wie z. B. auf der Basis von Polymilchsäure-Polyglykolsäure-Copolymeren oder Humanalbumin aufgebaut sein können.

Ein geeigneter Dosisbereich für topische und inhalative Anwendungsformen sind Lösungen mit 0,01-5 mg/ml, bei systemischen Applikationsformen sind 0,01-10 mg/kg geeignet.

Die für Aminosäuren verwendeten Abkürzungen entsprechen dem in der Peptidchemie üblichen drei Buchstaben-Code wie er in Europ. J. Biochem. 138, 9 (1984) beschrieben ist. Weitere verwendete Abkürzungen sind nachfolgend aufgelistet:
Cha: Cyclohexylalanin
Nle: Norleucin
Oic: 2S, 3aS, 7aS-Hexahydro-2-indolinyl-carbonsäure
Phg. Phenylglycin
Ser(t-But): O-tert.-Butyl-L-serin
D-Tic R-1,2,3,4-Tetrahydro-3-isochinolyl-carbonsäure
Thi: L-β(2-Thienyl)alanin
Boc: t-Butyloxycarbonyl
CH₂Cl₂: Dichlormethan
Cl: Chemical Ionisation
DCC: N,N-Dicyclohexylcarbodiimid
DCI: Desorption-Chemical Ionisation
DIP: Diisopropylether
DME: Dimethoxyethan
DMF: N,N-Dimethylformamid
EE: Ethylacetat
ESI: Electron Spray Ionisation
FAB: Fast Atom Bombardment
n-H: n-Heptan
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
MeOH: Methanol
MTB: Methyl-tert.-butylether
RT: Raumtemperatur
THF: Tetrahydrofuran
Totu: O-[Cyan(ethoxycarbonyl)methylenamino]-1,1,3,3- tetramethyluronium-tetra-fluoroborat
Die Erfindung wird durch nachstehende Beispiele erläutert.

Beispiel 1 2-(1-(4-t-Butyloxycarbonylaminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naph-thalin-2-yl- propionsäure-ethylester a) 2-(Pyrrolidin-2-yliden)-3-(naphthyl-2-yl)-propionsäureethylester

Zu Pyrrolidin-2-yliden-essigsäureethylester (18 g, 116 mmol) in DME (500 ml) wurde bei 0°C unter Argon Natriumhydrid (4,5 g einer 60% Suspension in Mineralöl) zugegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Kühlung entfernt und nach 40 min. wurde bei RT 2-Brommethylnaphthalin (228 g, 103 mmol) langsam zugetropft. Nach 2 h wurde H₂O (300 ml) zugegeben und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit 4 n HCl auf pH = 7 eingestellt und 3 mal mit Ethylacetat extrahiert, getrocknet (MgSO₄) und eingeengt. Nach Chromatographie an SiO₂ mit EE/H 1/2 als Eluens erhielt man die Titelverbindung als Öl.
R_f (EE/n-H 1/1) = 0,5.
MS (DCI) = 296 (M+H).

b) 4-t-Butyloxycarbonylaminomethyl-benzyl-alkohol

4-Aminomethylbenzoesäure (24 g, 159 mmol) wurde unter Argon zu einer Suspension aus Natriumborhydrid (15 g, 428 mmol) in DME (800 ml) gegeben. Nun wurde bei 6-10°C eine Lösung aus Jod (40.6g, 159 mmol) in DME (150 ml) zugetropft, wobei die Lösung stark schäumte. Nach Beendigung der Zugabe ließ man 2 h ohne Kühlung wirken, dann wurde 18 h unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen auf RT wurde Methanol (100 ml) zugetropft, wobei die Suspension anfangs stark schäumte. Nun wurde am Vakuum eingeengt und 20% wäßrige KOH (300 ml) zugegeben. Nach 18 h bei RT wurde 3 mal mit MTB (3×300 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden 1 mal mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt. Zum so erhaltenen Alkohol (14g, 102 mmol) in THF (150 ml) wurden Diisopropylethylamin (17,5 ml, 107 mmol) und Pyrokohlensäure-di-t-butylester (22 g, 107 mmol), gelöst in THF (100 ml), bei RT zugegeben. Nach 18 h wurde im Vakuum eingeerigt und in Ethylacetat aufgenommen. Die organische Phase wurde je 1 mal mit 5%-iger NaHSO₄-, gesättigter Na₂CO₃- und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit n-Heptan (100 ml) verrührt und abgesaugt und mit n-Heptan (200 ml) gewaschen, wobei die Titelverbindung als farbloses Pulver anfiel.
R_f (EE/n-H 2/1) = 0,45.
¹H-NMR (CDCl₃) δ = 7.25 (m, 4H), 4.8 (s(breit), 1H), 4.65 (m, 2H), 4.3 (d, J=6.0Hz, 2H), 1.25 (s, 9H).

c) (4-t-Butyloxycarbonylaminomethylbenzyl)-methansulfonat

Zu Titelverbindung 1b (10g, 30 mmol) und Triethylamin (8,7 ml, 63 mmol) in THF (100 ml) wurde Mesylchlorid (5,0 ml, 50 mmol) bei 0°C zugetropft. Nach 1h wurde ein pH = 7 eingestellt und im Vakuum eingeengt. Nun wurde Ethylacetat (300 ml) zugegeben und je 1× mit 5% NaHSO₄-, gesättigter NaHCO₃- und NaCl- Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und wiederum eingeengt, wobei die Titelverbindung als Öl anfiel.
R_f (EE/n-H 2/1) = 0,6.
¹H-NMR (CDCl₃) δ = 7.35 (m, 4H), 5.2 (s, 2H), 4.85 (s breit, 1H), 4.3 (d, J=6Hz, 2H), 2.9 (s, 3H), 1.2 (s, 9H).

d) 2-(1-(4-t-Butyloxycarbonylaminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-- naphthyl-2-yl-propionsäureethylester

Zur Titelverbindung gemäß Beispiel 1a (9,8g, 33 mmol) in DMF (150 ml) wurde bei 5°C Natriumhydrid (2.7 g; 60% in Mineralöl) gegeben. Nach Beendigung der Zugabe wurde 30 min. ohne Kühlung gerührt und die Titelverbindung 1c (10,5 g, 33 mmol), gelöst in DMF (10 ml), zugetropft. Nach 2 h bei RT wurde H₂O (20 ml) zugegeben und im Vakuum eingeengt. Zum Rückstand wurde H₂O (200 ml) gegeben und 3 mal mit je 200 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte wurden getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt. Chromatographie an SiO₂ mit EE/H 1/1 als Eluens lieferte die Titelverbindung als Öl.
R_f (EE/n-H 1/1) = 0,4. MS (DCI) = 515 (M+H).

e)2-(1-(4-t-Butyloxycarbonylaminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-na-phthalin- 2-yl-propionsäure-ethylester

Zur Titelverbindung gemäß Beispiel 1d (200 mg, 0,39 mmol) in Methanol (6 ml) wurde bei RT Natriumcyanoborhydrid (25 mg, 0,39 mmol) und eine Spatelspitze Bromkresolgrün zugegeben. Mit 0,1 n HCl wurde nun der pH auf dessen Umschlagpunkt eingestellt. Nach 18 h wurde eingeengt und H₂O (20 ml) zugegeben. Der pH wurde auf 10 eingestellt und 2× mit MTB (100 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, wobei die Titelverbindung als Öl anfiel.
R_f (EE/MeOH 5/1) = 0,2.
M (DCI) = 517 (M+H).

Beispiel 2 2-(1-(4-Aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthyl-2-yl- propionsäureethylester · Trifluoracetat

Zur Titelverbindung gemäß Beispiel 1d (14 mg, 1 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde bei 0°C Trifluoressigsäure (10 ml) zugegeben. Nach 4 h wurde eingeengt und 2 mal mit DIP (10 ml) digeriert und gefriergetrocknet, wobei die Titelverbindung als amorphes Pulver anfiel.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,3.
MS (ESI) = 415 (M+H).

Beispiel 3 2-(1-(4-Aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthalin-2-yl- propionsäureethylester · Di-trifluoracetat

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 1 (516 mg, 1 mmol) wurde analog Beispiel 2 umgesetzt, wobei die Titelverbindung als amorphes Pulver anfiel.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,15.
MS (ESI) = 417 (M+H).

Beispiel 4 2-(1-(4-Guanidinomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthalin-2-y-l- propionsäureethylester

Zur Titelverbindung gemäß Beispiel 2 (528 mg, 1mmol) in DMF (20 ml) und Diisopropylethylamin (0,44 ml, 2,6 mmol) wurde bei RT 1H-Pyrazol-1- carboxamidin Hydrochlorid (150 mg, 1,0 mmol) zugegeben. Nach 18 h wurde das Produkt durch Zugabe von DIP (100 ml) ausgefällt.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,4.
MS (ESI) = 457 (M+H).

Beispiel 5 2-(1-(4-Guaninomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthalin-2-yl- propionsäureethylester

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 3 (530 mg, 1 mmol) wurde analog der Titelverbindung gemäß Beispiel 4 zur Titelverbindung gemäß Beispiel 5 umgesetzt.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,2.
MS (ESI) = 459 (M+H).

Beispiel 6 2-(1-(4-((1-(8-Aminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)-L-β-(2- thienyl)alaninyl)-aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthal-in-2-yl- propionsäureethylester · Trifluoracetat a) 4-Phenylpiperidin-4-carbonsäuremethylester

4-Phenylpiperidin-4-carbonsäure Tosylat (200 g, 0,53 mol wurden in Methanol (1000 ml) unter Zugabe von Thionylchlorid (150 ml) gekocht. Nach Beendigung der HCl Entwicklung wurde eingeengt. Nun wurde mit gesättigter Na₂CO₃ Lösung ein pH ∼11 eingestellt und 3 mal mit Ethylacetat (3×300 ml) extrahiert. Nach Trocknen der organischen Phasen über MgSO₄ wurde im Vakuum eingeengt, wobei das Produkt als Öl anfällt.
R_f (EE/MeOH 10/1) = 0,4.
MS (DCI) = 220 (M+H).

b) 1-(8-tert.Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenylpiperidin-⁴- carbonsäure-methylester

Zu 8-Boc-aminooctylamin Hydrochlorid (10 g, 35 mmol) und Diisopropylethylamin (4,6 g, 35 mmol) in DMF (100 ml) wurden bei RT N,N′-Carbonyldiimidazol (5,8 g, 35 mmol) zugegeben. Nach 4h wurde die Verbindung gemäß Beispiel 1a (7,8 g, 35 mmol) zugegeben und weitere 18 h bei RT gerührt. Anschließend wurde Ethylacetat (500 ml) zugegeben und je 1 mal (100 ml) mit 5% NaHSO₄, gesättigter Na₂CO₃ und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt.
Ausbeute Verbindung 1b) 15 g.
R_f (EE) = 0,6.
MS (FAB) = 490 (M + H).

c) 1-(8-tert.Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenylpiperidin-4- carbonsäure

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 1b (15 g, 31 mmol) wurde in MeOH/H₂O 2/1 (300 ml) und Natriumhydroxid (4,8 g, 120 mmol) 18 h bei RT gerührt. Anschließend wurde im Vakuum eingeengt und mit 1 n HCl ein pH = 3 eingestellt. Nun wurde 3× mit je 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinten organischen Extrakte wurden über MgSO₄ getrocknet. Die Titelverbindung wurde durch Einengen im Vakuum erhalten.
MS (DCI) = 476 (M+H).

d) 1-(8-tert.Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenylpiperidin-4- carbonyl-β(2-thienyl)alanin-methylester

Zu der Verbindung gemäß Beispiel 1c (14 g, 29 mmol) in DMF (100 ml) wurde bei RT HOBt (6 g, 44 mmol) und DCC (7,2 g, 35 mmol) zugegeben. Nach 30 min. wurde β(2-Thienyl)alanin-methylester Hydrochlorid (6,1g, 29 mmol) und Triethylamin (3 g, 29 mmol) hinzugefügt. Nach 18 h wurde filtriert und das Filtrat mit Ethylacetat (500 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde je 1 mal (100 ml) mit 5% NaHSO₄, gesättigter Na₂CO₃ und gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum eingeengt. Die Titelverbindung wurde nach Chromatographie an SiO₂ mit MTB als Laufmittel erhalten.
R_f (MTB) = 0,4.
MS (FAB) = 643 (M+H).

e) 1-(8-tert.Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenylpiperidin-4- carbonyl-β-(2-thienyl)alanin

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 1d (12,8g, 27 mmol) in MeOH/H₂O 2/1 (300 ml) und Natriumhydroxid (4,4 g, 110 mmol) wurden analog Beispiel 1c umgesetzt, um die Titelverbindung zu erhalten.
MS (FAB) = 629 (M+H).

f) 2-(1-(4-((1-(8-Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperid-in-4- carbonyl)-L-β-(2-thienyl)alaninyl)-aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3- naphthalin-2-yl-propionsäureethylester

Zur Titelverbindung gemäß Beispiel 6e (200 mg, 0,32 mmol) in DMF (5 ml) wurde bei RT HOBt (65 mg, 0,48 mmol) und DCC (72 mg, 0,35 mmol) gegeben. Nach 1 h wurde die Titelverbindung gemäß Beispiel 2 (170 mg, 0,31 mmol) und Triethylamin (43 ml, 0,31 mmol) zugegeben. Nach 18 h wurde im Vakuum eingeengt. Zum Rückstand wurde Acetonnitril gegeben und filtriert. Das Filtrat wurde abermals eingeengt. Nach Zugabe von Ethylacetat (50 ml) wurde je 1× mit gesättigter Na₂CO₃- und NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt. Chromatographie an SiO₂ lieferte die Titelverbindung (Eluens EE).
R_f (EE) = 0,45.
MS (ESI) = 1026 (M+H).

g) 2-(1-(4-((1-(8-Aminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)-L-β-(2- thienyl)alaninyl)-aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthal-in-2-yl- propionsäureethylester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 6f (150 mg, 0,15 mmol) wurde analog Beispiel 2 umgesetzt, wobei die Titelverbindung gemäß Beispiel 6 als Öl anfiel.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,35.
MS (ESI) = 925 (M+H).

Beispiel 7 2-(1-(4-((1-(8-Aminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)-L-β-(2- thienyl)alaninyl)-aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthalin-2--yl- propionsäureethylester

Die Titelverbindung wurde durch Umsetzung der Titelverbindung gemäß Beispiel 6 (120 mg, 0, 13 mmol) analog zu Beispiel 1e erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,3.
MS (FAB) = 927 (M+H).

Beispiel 8 2-(1-(4-(1-(8-t-Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperi-din-4- carbonyl)-aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthalin-2-yl- propionsäureethylester

Die Titelverbindung wurde analog Beispiel 6d aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 2 (170 mg, 0,32 mmol) und der Titelverbindung gemäß Beispiel 6c (150 mg, 0,32 mmol) erhalten.

R_f (EE) = 0,3 MS (ESI) = 872 (M + H).

Beispiel 9 2-(1-(4-(1-(8-t-Butyloxycarbonylaminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperi-din-4- carbonyl)-aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthalin-2-yl- propionsäureethylester

Die Titelverbindung wurde aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 8 (285 mg, 0,33 mmol) analog der Umsetzung gemäß Beispiel 1e erhalten.
R_f (EE/MeOH 1/1) = 0,3
MS (FAB) = 874 (M+H).

Beispiel 10 2-(1-(4-(1-(8-Aminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthyl-2-yl-prnpionsäure-ethylester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 2 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 8 (120 mg, 0,14 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/20/5/5) = 0,5.
MS (FAB) = 772 (M+H).

Beispiel 11 2-(1-(4-(1-(8-Aminooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthyl-2-yl-propionsäureethy-lester ·Di trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 2 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 9 (120 mg, 0,14 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,3.
MS(FAB) = 774(M+H).

Beispiel 12 2-(1-(4-(1-(8-Guanidinooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl-)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthyl-2-yl-propionsäure-ethylester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 4 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 10 (120 mg, 0,14 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/20/5/5) = 0,5.
MS(FAB) = 814(M+H).

Beispiel 13 2-(1-(4-(1-(8-Guanidinooctylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl-)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthyl-2-yl-propionsäureethy-lester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 4 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 11(120 mg, 0,14 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/20/5/5) = 0,25.
MS (FAB) = 816 (M+H).

Beispiel 14 2-(1-(4-(1-(6-Aminohexylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yliden)-3-naphthyl-2-yl-prnpionsäure-ethylester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß der Beispiele 6d und 2 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 2 (350 mg, 0,67 mmol) und 1-(6-t- Butyloxycarbonylaminohexylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonsäur-e (300 mg, 0,67 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,5.
MS (FAB) = 744 (M + H).

Beispiel 15 2-(1-(4-(1-(6-Aminohexylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthyl-2-yl-propionsäureethy-lester

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 1e aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 14 (120 mg, 0,14 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/20/5/5) = 0,25.
MS (FAB) = 776 (M+H).

Beispiel 16 2-(1-(4-(1-(6-Guanidinohexylcarbamoyl)-4-phenyl-piperidin-4-carbonyl-)- aminomethylbenzyl)-pyrrolidin-2-yl)-3-naphthyl-2-yl-propionsäureethy-lester

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 4 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 15 (250 mg, 0,29 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,1,
MS (ESI) = 788 (M+H).

Beispiel 17 1-(4-Aminomethylbenzyl)-2,3,3a,4,5,6-Hexahydroindol-7-carbonsäure-et-hylester · Trifluoracetat a) 2,2-Dimethyl-5-(3-allyl-pyrrolidin-2-yiiiden)-[1,3]-dioxan-4,6-dion

Zu 2,2-Dimethyl-5-pyrolidin-2-yliden-(1,3]-dioxan-4,6-dion (3g, 13,5 mmol) in trockenem THF (120 ml) wurde unter einer Argonatmosphäre bei -65°C n- Butyllithium (24 ml einer 15% Lösung in Hexan) zugegeben. Nun wurde die Kühlung entfernt und nach 45 min. dann wieder auf -65°C abgekühlt. Zu dieser Suspension wurde Allylbromid (1,2 ml, 13,9 mmol) zugespritzt. Nach 30 min. wurde 30 ml 10% HCl-Lösung zugegeben und 3 mal mit Ethylacetat (3×100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden 1 mal mit gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, wobei die Titelverbindung als farblose amorphe Kristalle anfiel.
R_f (EE/n-H 2/1) = 0,5. MS (Cl) = 251 (M⁺)

b) 3-Allyl-pyrrolidin-2-yliden-essigsäureethylester

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 17a (3,2 g , 12,7 mmol) in Ethanol (60 ml; absolut) und Natriumethylat (16,5 ml einer 1 M Lösung in absolutem Ethanol) wurde 18 h unter Rückfluß gekocht. Danach wurde eingeengt, H₂O (30 ml) zugegeben und mit 2 N HCl auf pH = 5-6 eingestellt. Nun wurde 2 mal mit Ethylacetat (100 ml) extrahiert, die organischen Extrakte getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt. Die Titelverbindung fiel dabei als Öl an.
R_f (EE/n-H 2/1) = 0,6
MS (Cl) = 195 (M⁺),

c) 5-Jodo-2,3,3a,4,5,6-Hexahydro-1H-indol-7-carbonsäureethylester

Zur Titelverbindung gemäß Beispiel 17b (5, 1g, 23 mmol) in Dichlormethan (100 ml) wurde unter Argon bei -5°C eine Lösung aus N-Jodsuccinimid (6,9g, 30 mmol) in Dichlormethan (100 ml) zugetropft. Nach 3 h (während dieser Zeit bildete sich. (3-Allyl-pyrrolidin-2-yliden)-2-Jodessigsäure-ethylester) wurde die Kühlung entfernt. Nach 18 h bei RT wurde 1 mal mit halbgesättigter Na₂SO₃- Lösung (100 ml) und 1 mal mit H₂O (100 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (CaCl₂) und im Vakuum eingeengt. Der kristalline Rückstand wurde aus Ethanol kristallisiert.
R_f(EE/nH 1/2) = 0,25
MS (ESI) = 322 (M+H)

d) 2,3,3a,4,5,6-Hexahydro-1H-indol-7-carbonsäureethylester

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 17c (500 mg, 1,56 mmol) und Raney Nickel (100 mg) wurden in einem Gemisch aus Methanol (5 ml), THF (10 ml) und Diisopropylethylamin (2 ml) in einer Wasserstoffatmosphäre (1 atm) 1 h lang gerührt. Danach wurde über Kieselgur vom Katalysator abfiltriert, gesättigte NaCl- Lösung (50 ml) zugegeben und 2 mal mit Ethylacetat extrahiert. Die organischen Extrakte werden getrocknet (MgSO₄) und im Vakuum eingeengt, wobei die Titelverbindung kristallin anfiel.
R_f (DIP) = 0,6 MS(El) = 196 (M+H),
Smp.: 74°C (aus DIP kristallisiert).

e) 1-(4-t-Butyloxycarbonylaminomethylbenzyl)-2,3,3a,4,5,6-hexahydro-ind-ol- 7-carbonsäure-ethylester

Die Titelverbindung wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 1d aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 1c (1,05 g, 3,3 mmol) und der Titelverbindung gemäß Beispiel 17d (640 mg, 3,3 mmol) erhalten.
R_f (E/n-H 1/4) = 0,1.
MS (ESI) = 415 (M+H).

f) 1-(4-Aminomethylbenzyl)-2,3,3a,4,5,6-Hexahydroindol-7-carbonsäure ethylester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung gemäß Beispiel 17 wurde analog der Umsetzung gemäß Beispiel 2 aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 17e (200 mg, 0,48 mmol) erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,3.
MS (ESI) = 315 (M+H).

Beispiel 18 1(4-Aminomethylbenzyl)-octahydro-indol-7-carbonsäureethylester · Trifluoracetat

Die Titelverbindung wurde aus der Titelverbindung gemäß Beispiel 17e (414 mg, 1 mmol) analog der Umsetzung gemäß den Beispielen 1e und 2 erhalten.
R_f (CH₂Cl₂/MeOH/CH₃CO₂H/H₂O 130/30/5/5) = 0,4,
MS (ESI) = 317 (M+H).

Claims

1. Verbindungen der Formel (1) in welcher die Symbole folgende Bedeutung haben:

a) R¹
1. -OH,
2. -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl,
3. -O-(C₃-C₆)-Alkenyl,
4. -O-(C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. -NR⁶R⁷ bedeutet;
b) R²
1. (C₁-C₁₀)-Alkyl,
2. (C₂-C₁₀)-Alkenyl,
3. (C₃-C₁₀)-Alkinyl,
4. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
6. (C₄-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₁-C₄)-Alkyl,
7. (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkenyl,
8. (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkinyl,
9. -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵,
10. (C₆-C₁₀)-Aryl,
11. einem wie unter b) 1., 2., 3. oder 9. definierten Rest, der mit COR¹ monosubstituiert ist,
12. einem wie unter b) 1., 2., 3. oder 9. definierten Rest, worin 1 bis alle H-Atome durch Halogen substituiert sind, oder
13. den unter b) 4. und 10. definierten Rest, der am Aryl mit 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Resten aus der Reihe Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxy und Nitro, Cyano substituiert ist;
c) R³
1. Wasserstoff,
2. (C₁-C₈)-Alkyl,
3. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
4. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. (C₂-C₆)-Alkenyl,
6. (C₃-C₆)-Alkinyl,
7. R² und R³ zusammen (C₂-C₄)-Alkyl,
8. einen wie unter c) 7. definierten Rest der mit Halogen substituiert ist;
d) R⁴
1. Wasserstoff,
2. (C₁-C₆)-Alkyl,
3. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
4. (C₃-C₁₀)-Alkenyl,
e) R⁵
1. Wasserstoff,
2. ein Rest der Formel (II)
f) R⁶ und R⁷ gleich oder verschieden
1. Wasserstoff,
2. (C₁-C₁₀)-Alkyl,
3. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
4. (C₁-C₁₀)-Alkylamino,
5. (C₁-C₁₀)-Alkylguanidino bedeutet;
g) R⁸
1. (C₆-C₁₀)-Aryl,
2. (C₁-C₆)-Alkyl,
3. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
4. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
5. (C₂-C₆)-Alkenyl,
6. ein unter g) 1. und 4. definierter Rest, der mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe COR¹, Halogen, Nitro, Cyano, (C₁-C₄)-Alkoxy oder Amino substituiert ist;
h) R⁹
1. -NH-(CH₂)_o-NHR⁴
2. -O-(CH₂)_o-NH₂
i) A eine Einfach- oder Doppelbindung bedeutet;
j) B O, NR³ oder S ist;
k) Y eine direkte Bindung oder eine Aminosäure, bevorzugt Phenylalanin, 2-Chlorphenylalanin, 3-Chlorphenylalanin, 4-Chlorphenylalanin, 2- Fluorphenylalanin, 3-Fluorphenylalanin, 4-Fluorphenylalanin, Tyrosin, O-Methyltyrosin, ß-(2-Thienyl)alanin, Glycin, Cyclohexylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Norleucin oder Phenylglycin, Serin oder Cystein bedeutet;
l) m eine Zahl 1-5,
m) n eine Zahl 1-5,
n) o eine Zahl 1-10 bedeutet,
sowie deren physiologisch verträgliche Salze.

2. Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch 1, worin

a) R²
1. (C₁-C₆)-Alkyl,
2. (C₂-C₆)-Alkenyl,
3. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
4. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
5. (C₃-C₆)-Cycloalkyl-(C₁-C₃)-Alkyl bedeutet,
6. ein unter a) 3. und 5. definierter Rest, der mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe Halogen, Nitro, Cyano, (C₁- C₄)-Alkoxy, COR¹ oder Amino substituiert ist; und
c) R⁸
1. (C₆-C₁₀)-Aryl,
2. (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl,
3. ein unter c) 1. und 2. definierter Rest, der mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe Halogen, Nitro, Cyano, (C₁- C₄)-Alkoxy, Amino oder COR¹ substituiert ist.

3. Verbindungen der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, worin

a) R¹-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl;
b) R²
1. (C₆-C₁₀)-Aryl-CH₂-,
2. (C₃-C₈)-Cycloalkyl,
3. (C₃-C₈)-Cycloalkyl-CH₂-;
c) R³
1. (C₃-C₅)-Alkenyl,
2. Phenyl-(C₁-C₃)-Alkyl,
3. R² und R³ zusammen (C₂-C₃)-Alkyl;
d) R⁴
1. Wasserstoff,
e) R⁵
1. Wasserstoff,
2. ein Rest der Formel (II) bedeutet
f) R⁸
1. Phenyl,
2. Benzyl bedeutet;
g) R⁹
1. -NH-(CH₂)_o-NHR⁴,
2. -O-(CH₂)_o-NH_2, bedeutet;
h) A eine Einfach- oder Doppelbindung ist;
i) Y
1. eine Einfachbindung,
2. eine Aminosäure aus der Reihe Phenylalanin, β-(2- Thienyl)alanin, O-Methyltyrosin, Glycin, Cyclchexylalanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylglycin, Serin oder Cystein bedeutet;
j) o eine Zahl von 1-10 ist.

4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Verbindung der Formel (III) mit einer Verbindung R³-X, worin
R³ Wasserstoff, (C₁-C₈)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl oder (C₃-C₆)-Alkinyl bedeutet und
X für eine Abgangsgruppe, wie Halogen, Mesylat oder Tosylat steht, mit einer metallorganischen Base, wie n-Butyllithium, s-Butyllithium, Methyllithium oder Phenyllithium, Natriumamid sowie Alkalimetallsalzen von organischen Stickstoffbasen, wie Lithiumdiisopropylamid, in einem inerten Lösungsmittel wie THF, Ether, Toluol oder Dimethoxyethan, bevorzugt bei -78 °C zu einer Verbindung der Formel IV worin R³ wie oben definiert ist, umsetzt;
b) die Verbindung der Formel IV mit einem Alkoholat der Formel R¹Na oder R¹K, worin
R¹-OH, -O-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -O-(C₃-C₆)-Alkenyl oder -O-(C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)- Alkyl bedeutet,
und dem entsprechenden Alkohol unter Rückfluß kocht, wobei man eine Verbindung der Formel V erhält, worin R¹ und R³ wie oben definiert sind;
c₁) falls in Formel I R² und R³ zusammen für (C₂-C₄)-Alkyl, das gegebenenfalls mit Halogen substituiert sein kann, stehen und in Formel V R³ (C₂-C₆)- Alkenyl bedeutet,
die Verbindung der Formel V mit J₂ oder radikalerzeugenden Reagenzien in Methylenchlorid oder THF bei Raumtemperatur zu einer Verbindung der Formel VI worin R Wasserstoff oder (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet und
R¹ wie unter b) definiert ist, umsetzt, und
c₂) die erhaltene Verbindung der Formel VI mit Raney-Nickel bei 1atm H₂ und Diisopropylethylamin als Base 1 h bei Raumtemperatur zu einer Verbindung der Formel VII worin R Wasserstoff oder (C₁-C₃)-Alkyl bedeutet und
R¹ wie unter b) definiert ist, umsetzt;
d) falls in Formel I R² und R³ zusammen nicht (C₂-C₄)-Alkyl, das gegebenenfalls mit Halogen substituiert sein kann, bedeutet,
eine Verbindung der Formel V worin
R¹-O-(C₁-C₁₀)-Alkyl, -O-(C₃-C₆)-Alkenyl oder -O-(C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl bedeutet und
R³ Wasserstoff, (C₁-C₈)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl oder (C₃-C₆)-Alkinyl bedeutet,
mit einer Base, z. B. Natriumhydrid, deprotoniert und anschließend mit einer Verbindung R²-X, worin
R²(C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₄-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₁-C₄)-Alkyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl- (C₂-C₄)-Alkenyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkinyl, -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, (C₆- C₁₀)-Aryl; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder -(CH₂)_m-B- (CH₂)_n-R⁵, die mit COR¹ monosubstituiert sind; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)- Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, worin 1 bis alle H-Atome durch Halogen substituiert sind; oder (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl oder (C₆- C₁₀)-Aryl, die am Aryl mit 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Resten aus der Reihe Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxy und Nitro, Cyano substituiert sind bedeutet,
B O, NR³ oder S ist,
m eine Zahl 1-5,
n eine Zahl 1-5,
R⁵ Wasserstoff oder einen Rest der Formel II bedeutet, und
X eine geeignete Abgangsgruppe, z. B. Halogen, Mesylat oder Tosylat,
bedeutet,
zu einer Verbindung der Formel VIII umsetzt, worin R¹, R² und R³ wie unter d) definiert sind;
e) die Verbindung der Formel VIII mit einer Verbindung der Formel worin
Prot. für eine Aminoschutzgruppe, wie z. B. tert. Butoxycarbonyl, steht,
R⁴ Wasserstoff, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₁₀)-Alkenyl, -C(O)-O-(C₁-C₆)-Alkyl,-C(O)-O-(C₁-C₆)-Alkyl-(C₆-C₁₀)Aryl, oder X eine geeignete Abgangsgruppe, z. B. Halogen, Mesylat oder Tosylat, bedeutet,
mit einer Base, z. B. Natriumhydrid, deprotoniert, und anschließend mit einer Verbindung der Formel VII oder VIII worin
R¹ wie unter d) definiert ist,
R²(C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₄-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₁-C₄)-Alkyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl- (C₂-C₄)-Alkenyl, (C₅-C₁₀)-Cycloalkyl-(C₂-C₄)-Alkinyl, -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, (C₆- C₁₀)-Aryl; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)-Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder -(CH₂)_m-B- (CH₂)_n-R⁵, die mit COR¹ monosubstituiert sind; (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₂-C₁₀)- Alkenyl, (C₃-C₁₀)-Alkinyl oder -(CH₂)_m-B-(CH₂)_n-R⁵, worin 1 bis alle H-Atome durch Halogen substituiert sind; oder (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl oder (C₆- C₁₀)-Aryl, die am Aryl mit 1 oder 2 gleichen oder verschiedenen Resten aus der Reihe Halogen, (C₁-C₄)-Alkoxy und Nitro, Cyano substituiert sind bedeutet,
B O, NR³ oder S ist,
m eine Zahl 1-5,
n eine Zahl 1-5,
R⁵ Wasserstoff oder einen Rest der Formel II bedeutet, und
R³ Wasserstoff, (C₁-C₈)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl oder (C₃-C₆)-Alkinyl bedeutet,
zu einer Verbindung der Formel IX umsetzt, worin R¹, R², R³, R⁴ und Prot wie unter e) definiert sind und
R² und R³ zusammen für (C₂-C₄)-Alkyl, das gegebenenfalls mit Halogen substituiert ist, stehen;
f) die Aminoschutzgruppe Prot nach bekannten Methoden, z. B. mit tert. Butoxycarbonyl (Boc) unter sauren Bedingungen, bevorzugt in Trifluoressigsäure (TFA) oder mit HCl in Dimethoxyethan, oder mit TFA in Dimethoxyethan oder Dichlormethan als bevorzugtem Lösungsmittel, abspaltet;
g) gegebenenfalls die erhaltene Verbindung der Formel X mit freier Aminogruppe worin R¹, R², R³ und R⁴ wie unter e) (Formel IX) definiert sind, mit einer Verbindung der Formel II′ worin
R⁸ (C₆-C₁₀)-Aryl, (C₁-C₆)-Alkyl, (C₃-C₈)-Cycloalkyl, (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₂-C₆)-Alkenyl; (C₆-C₁₀)-Aryl oder (C₆-C₁₀)-Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, die mit einem oder mehreren Resten aus der Reihe COR¹, Halogen, Nitro, Cyano, (C₁-C₄)- Alkoxy oder Amino substituiert sind, bedeutet,
R⁹ -NH-(CH₂)_o-NHR⁴, -O-(CH₂)_o-NH₂ oder bedeutet,
o eine Zahl 1-10 ist, und
Y eine direkte Bindung oder eine Aminosäure bedeutet,
nach den allgemeinen Methoden der Peptidchemie kuppelt, so daß man eine Verbindung der Formel X′ erhält, worin R¹, R², R³ und R⁴ wie unter g) definiert sind und R⁵ worin R⁸, R⁹ und Y wie unter g) definiert sind, bedeutet;
h) gegebenenfalls die Doppelbindung der Formeln X oder X′ mit Natriumcyanoborhydrid in niederen Alkoholen, wie Methanol, bei Raumtemperatur und pH ∼5 zu einer Verbindung der Formel XI hydriert, worin R¹, R², R³, R⁴, R⁵ wie unter g) definiert sind und
A eine Einfachbindung bedeutet;
i) gegebenenfalls die Verbindungen der Formeln X, X′ oder XI unter sauren oder basischen Bedingungen verseift oder
mit HNR⁶R⁷, worin
R⁶ und R⁷ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (C₁-C₁₀)-Alkyl, (C₆-C₁₀)- Aryl-(C₁-C₃)-Alkyl, (C₁-C₁₀)-Alkylamino oder (C₁-C₁₀)-Alkylguanidino bedeuten,
in hochsiedenden Lösungsmitteln, z. B. Xylol oder DMF, erhitzt, wobei man die Verbindungen der Formel I erhält; und
k) die Verbindungen der Formel I gegebenenfalls nach bekannten Methoden in ihre physiologisch verträglichen Salze überführt.

5. Verwendung der Verbindungen der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 als Heilmittel.

6. Heilmittel enthaltend eine Verbindung der Formel I gemäß den Ansprüchen 1 bis 3.