DE19506615A1

DE19506615A1 - Aufschluß von Bakterienzellen durch Phagenlysine

Info

Publication number: DE19506615A1
Application number: DE1995106615
Authority: DE
Inventors: Peter Dr Schubert; Siegfried Prof Dr Scherer; Martin J Dr Loessner
Original assignee: SCHERER SIEGFRIED UNIV PROF DR; Merck Patent GmbH
Current assignee: Scherer Siegfried Univ-Prof Dr 85354 Freisin
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1995-02-24
Publication date: 1996-08-29

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Phagenlysinen zum Aufschluß von Bakterienzellen, sowie Verfahren für den Aufschluß von Bakterien zellen durch Phagenlysine und Testzusammenstellungen für die Durch führung dieses Verfahrens.

Stand der Technik

Für den Nachweis und die Bestimmung von Bakterien dienen neben extrazellulären Bestandteilen oft zelluläre Bestandteile, z. B. Adenosin triphosphat (ATP) für den Nachweis von Bakterien oder chromosomale DNS oder ribosomale RNS als Zielanalyt für Nukleinsäure-Sonden oder für die Nukleinsäureamplifikation. Zur Untersuchung derartiger zellulären Bestandteile von Bakterien (z. B. chromosomale DNS, Plasmide, RNS, Proteine, Lipide, Metabolite) müssen die Zellen möglichst schnell und schonend aufgeschlossen werden, um die Integrität und Funktionalität der isolierten Bestandteile und Makromoleküle zu gewährleisten und um die Analyte zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit in hoher Ausbeute zu isolieren. Zu den bekannten Methoden gehört die Anwendung von Lyso zym oder Mutanolysin (lysierendes Enzym aus Streptomyces globisporus). Auch in Kombination mit Detergenzien erfordert diese Methode erhöhte Temperaturen und ein alkalisches Medium bei oft langen Inkubationszeiten. Unter diesen Bedingungen sind viele Analyte instabil.

Für den Nachweis von Bakterien wird in WO 94106 931 vorgeschlagen, die Bakterienzellen mit Phagen zu lysieren und anschließend beispielsweise das ATP mittels bekannter Methoden nachzuweisen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens muß mit vermehrungsfähigen Viren gearbeitet werden; eine Verfahrenweise, die für die Routineanalytik aus Sicherheitsgründen bedenklich ist. Im übrigen ist die Bakteriolyse bei der Phageninfektion ein äußerst komplexer Vorgang. In EP 0 168 933 werden rekombinante Phagen offenbart, die das lux-Gen insertiert enthalten.

Phagenlysine aus verschiedenen phageninfizierten Bakterien wurden beschrieben. In DE 43 26 617 wird beispielsweise die Verwendung von Lysinen aus Listeriaphagen als spezifisches Desinfektionsmittel gegen Listerien offenbart. Die durch Phagenlysine hervorgerufenen Bakteriolyse kann äußerst spezifisch sein: Einige Bakteriophagen lysieren nur bestimmte Serotypen von Bakterien. In J. Bact. 107 Seite 499-504 (1971) werden Phagenlysine beschrieben, die spezifisch Zellen der Bakteriengattung Staphylococcus lysieren. In Chemical Abstracts 84 1596 (1976) wird auf Phagenlysine hingewiesen, die nur bestimmte Clostridien arten lysieren. Es gibt aber auch Phagenlysine mit wesentlich breiterem Lysespektrum: So wird beispielsweise in JP 04/141 089 ein Phagolysin offenbart, das ein ähnlich breites Lysespektrum wie Lysozym aufweist.

Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren bereitzustellen, bei denen Zielanalyte in guter Ausbeute durch Lyse der Bakterienzellen unter Bedingungen freigesetzt werden, unter denen diese Zielanalyte weitgehend stabil sind. Dabei soll die Lyse beispielsweise aus Sicherheitsgründen ohne Verwendung von kompletten Bakteriophagen ermöglicht werden.

Es wurde gefunden, daß diese Aufgabe in hervorragender Weise dadurch gelöst wird, daß man die Bakterienzellen mit Phagenlysinen behandelt. Durch die Auswahl der Phagenlysine läßt sich die Spezifität der Lyse reaktion und damit der gesamten Nachweisreaktion beeinflussen.

Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zum Nachweis von Bakterien durch eine Nachweisreaktion auf zelluläre bakterielle Bestandteile in einem Bakterienlysat, wobei das Lysat durch Einwirkung eines gereinigten Phagenlysins auf die Bakterien gewonnen wird.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung von Phagen lysinen für Nachweisverfahren von Bakterien, wobei zelluläre bakterielle Bestandteile durch die Einwirkung des Phagenlysins freigesetzt und nach bekannten Methoden nachgewiesen werden.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Reagenzzusammenstellungen für den Nachweis von Bakterien enthaltend neben üblichen Nachweis mitteln ein gereinigtes Phagenlysin.

Beschreibung der Erfindung

Nachweisverfahren für Bakterien, bei denen zelluläre bakterielle Bestand teile zur Reaktion gebracht werden, sind in großer Zahl bekannt. Dazu gehören der Nachweis von Enzymen, die nur bei bestimmten Species oder Gruppen von Bakterien vorkommen, z. B. Glucosidase oder β-Galacto sidase. Weiterhin gehören dazu Nachweisreaktionen auf Nukleinsäuren mittels Nukleinsäuresonden oder Amplifikationsverfahren. Ein weiteres bekanntes Nachweisverfahren beruht auf dem Nachweis von ATP, beispielsweise durch die Messung der Lumineszenz, die bei der Luciferin- Luciferase-Reaktion auftritt. Derartige Verfahren, sowie die Optimierung von Verfahrensvarianten sind dem Fachmann geläufig und in der Literatur beschrieben. Erfindungsgemäß werden diese Reaktionen als übliche Nachweisverfahren zusammengefaßt. Die Reagenzien, die für diese Nachweisverfahren notwendig sind, werden als übliche Nachweismittel bezeichnet.

Beispiele für derartige Nachweismittel sind folgende Zusammenstellungen:

a) für den Nachweis von Enzymen umfassend einen Puffer und ein Enzymsubstrat;
b) für den Nachweis spezieller Nukleinsäureabschnitte umfassend eine Nukleinsäuresonde, die mittels einer Markierung nachweisbar ist;
c) für die Amplifikation spezieller Nukleinsäureabschnitte umfassend zwei Nukleinsäureprimer, ein Gemisch der Nukleotidtriphosphate und eine Nukleinsäurepolymerase;
d) für den Nachweis von ATP umfassend Luciferin und Luciferase beispielsweise aus Leuchtkäfern.

So werden in Infect. Immunity 58, 1943-1950 (1990) für den Nachweis von Listerien geeignet DNS-Sonden beschrieben. Für den Nachweis von Listerien geeignete Primer werden in EP 0 576 842 offenbart. Beide Dokumente offenbaren Einzelheiten über Verfahrensparameter für derartige Nachweisreaktionen, sowie weitere Literatur, die zugehörige Verfahrensvarianten offenbart.

Der ATP-Nachweis mit der Luciferin-Luciferase-Reaktion ist nicht spezifisch für bestimmte Organismen, da ATP in allen lebenden Zellen vorkommt. Wird dieser Nachweis jedoch mit einem Phagenlysin kombiniert, das spezifisch für eine bestimmte Bakteriengattung ist, so wird die Nachweisreaktion insgesamt spezifisch. Wird mittels eines Phagen lysins mit breitem Wirkungsspektrum DNA freigesetzt und erfolgt der Nachweis mittels einer spezifischen DNA-Sonde, so ist wiederum die Nachweisreaktion insgesamt spezifisch.

Phagenlysine sind Enzyme oder Enzymkomplexe, die Lysis von Bakterien bewirken, und die im Phagengenom codiert sind. Phagenlysine wurden aus zahlreichen mit Bakteriophagen infizierten Bakterienzellen gewonnen und aufgereinigt. Beispiele für solche dem Fachmann bekannten Phagen lysine sind in den bereits genannten Dokumenten offenbart. Zu diesen bekannten Phagenlysinen gehören solche, die aus Bakterien der Gattung Listeria isoliert werden können. Auch aus zahlreichen anderen Bakterien gruppen sind Bakteriophagen und Phagenlysine beschrieben. Diese Phagenlysine können aus kultivierten phageninfizierten Bakterien gewonnen werden. Bevorzugterweise werden die Phagenlysine jedoch aus Kulturen von Bakterien, z. B. Escherichia coli, gewonnen, wobei die Bakterien durch dem Fachmann bekannte Rekombinationstechniken in die Lage versetzt werden, die gewünschten Phagenlysine zu produzieren.

Beispielsweise kann aus Phagenlysaten der Listeriaphagen A 511, A 500 oder A 118 ein Phagenlysin (bezeichnet als PLY 511, PLY 500 beziehungsweise PLY 118) hergestellt werden, das eine schnelle (d. h. innerhalb von 2-6 Minuten) und vollständige (95-100%) Zellwand- Hydrolyse ermöglicht. Dabei werden neben Bestandteilen des Zellinnern (chromosomale DNS), Plasmide, RNS, Proteine, etc.) auch sämtliche Zellwand-assoziierten (nicht-kovalent gebundenen) Proteine freigesetzt. Alle Makromoleküle liegen anschließend nativ vor, sind aktiv und keiner chemischen Schädigung ausgesetzt. Erfindungsgemäß verwendbare Phagenlysine können auch durch Rekombinationstechniken, beispiels weise aus rekombinanten Stämmen von Escherichia coli, gewonnen werden, die die Phagolysin-Gene ply 511, ply 500 oder ply 118 (aus den Phagen A 511, A 500 beziehungsweise A 118) auf einem Expressions plasmid tragen. Hierbei können die Zellen in hoher Ausbeute (bis zu 20% des Gesamt-Proteins) Lysine produzieren. Diese rekombinanten Enzyme lassen sich leichter isolieren und reinigen, und weisen dieselbe Spezifität bei keiner nachweisbaren Fremdaktivität auf. Die gereinigten Phagenlysine werden in einem wäßrigen Puffer bei -30°C aufbewahrt.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen den Erfindungsgedanken näher erläutern; sie stellen keine Einschränkung des Erfindungsumfanges dar.

Beispiel 1 Lyse von Bakterienzellen

Zellen von Listeria monocytogenes (WSLC 1001; serovar 1/2c) werden in 10 ml Tryptose-Nährlösung bei 30°C bis in die spät-logarithmische Wachstumsphase kultiviert und in 2 ml Portionen durch Zentrifugation bei 15 000 × g (1 Minute) geerntet. Für den Lysetest wird der Zellniederschlag in 900 µl Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert, auf 30°C temperiert und mit 100 µl einer Lösung von 10 U PLY 118 versetzt. (Eine Einheit (U) Phagenlysin verringert in einem Volumen von 1 ml bei einer Temperatur von 30°C bei einem pH von 8,0 die Extinktion bei 600 nm einer Suspension von Zellen von Listeria monocytogenes WSLC 1001 um 0,01/min.) Die Lysereaktion wird durch Messung der Trübung bei 600 nm verfolgt. Nach 8-10 Minuten ist die Lösung klar.

Mit ähnlichem Ergebnis läßt sich der Versuch mit Zellen von Listeria ivanovii (WSLC 3009; serovar 5) und anderen Listeria-Arten wiederholen.

Beispiel 2 Isolierung von m-RNS

Zur Isolierung von m-RNS aus Kulturen von Listeria monocytogenes werden die Zellen in kleinen Volumina (ca. 1-5 ml) durch Zentrifugation konzentriert, kurz in einem Trockeneis-Ethanol Gemisch eingefroren (ca. 1-5 min.), und in 1/10 Volumen Puffer (Tris-HCl, 20 mM, pH 8,0) resuspendiert. Nach Zugabe einer geringen Menge des rekombinanten Lysine (Phagolysin aus Listeriaphage A118, in 20 mM Tris-HCl, pH 7,3, 20 mM NaCl, 0,1% Triton X100) wird etwa 2-5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bis die trübe Suspension fast völlig klar geworden ist. Nach Deproteinierung der Suspension (mit Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol, 125 : 24 : 1 (V/V), pH 4,2) kann die RNS durch ethanolische Fällung direkt gewonnen werden. Reste von DNS können gegebenenfalls durch hydrolytische Spaltung mit DNAse entfernt werden. Die nun völlig reine RNS steht für weitere Untersuchungen zur Verfügung.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Bakterien durch eine Nachweisreaktion auf zelluläre bakterielle Bestandteile in einem Bakterienlysat, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysat durch Einwirkung eines gereinigten Phagenlysins auf die Bakterien gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Gattung Listeria nachgewiesen werden, und daß ein Phagenlysin aus einem Listeriaphagen verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Species Staphylococcus aureus nachgewiesen werden, und daß ein Phagenlysin aus einem Staphylococcenphagen verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien der Species Bacillus cereus nachgewiesen werden, und daß ein Phagen lysin aus einem Bacillusphagen verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure durch eine Nukleinsäuresonde nachgewiesen wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleinsäure durch eine Amplifikationsreaktion nachgewiesen wird.

7. Verwendung von Phagenlysinen für Nachweisverfahren von Bakterien, wobei zelluläre bakterielle Bestandteile durch die Einwirkung des Phagenlysins freigesetzt und nach bekannten Methoden nachgewiesen werden.

8. Reagenzzusammenstellung für den Nachweis von Bakterien enthaltend neben üblichen Nachweismitteln ein gereinigtes Phagenlysin.