DE1804022C3 - Polypeptide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

'J

Die interessanteste Wirkung der erfindungsgemäßen produkt umgesetzt werden, das dann mit einer dritten

'olypeppde ist die antithromboplastische Wirkung, Aminosäure oder mit einem ähnlichen aus zwei oder

veil sie eine Beeinflussung des Koagulalionsverlaufes mehreren anderen Aminosäuren erhaltenen Zwischen-

:u einem früheren Zeitpunkt erlaubt. Wie bereits produkt zu einem neuen Pepüd verkettet wird, das

;rwähnt, sind jedoch auch eine Antithrombinwirkung 5 dann gegebenenfalls auf ähnliche Weise weiter umge-

jnd eine fibrinolytische Wirkung, ebenso wie in ge- setzt wird, bis die gewünschte Kette aufgebaut ist.

wissen Fällen eine Gefäßwirkung, festgestellt worden. Die Reihenfolge im Zusammenbau der Aminosäuren

Die letztgenannte Wirkung steht nicht mit der Konfi- ist somit in weitem Ausmaß wahlfrei, so lange man

guration des natürlichen Peptides A in klarem Zu- bloß beachtet, daß die Aminosäuren in solcher Folge

sammenhang. In seiner Art kann die Gefäßwirkung 10 aneinandergekoppelt werden, daß die gewünschte

als eine bradychininähnliche Aktivität angesehen Folge von Aminosäuren im Endprodukt erhalten wird,

werden. Bei den Umsetzungen ist darauf zu achten, daß freie

Die obenerwähnten Wirkungen sind an großen Aminogruppen und Carboxylgruppen, die nicht rea-

Versuchstieren in vivo und im menschlichen Blut gieren sollen, auf geeignete Weise geschützt werden,

geprüft worden, wie nachstehend näher erläutert wird. 15 damit die Kopplung in gewünschter Weise erfolgt.

Die infragestehenden Verbindungen enthalten op- Eine geeignete Weise, die Aminogruppen zu schützen,

tisch aktive Aminosäuren von L-Konfiguratiun, wel- besteht darin, die Aminosäure in das Carbo benzyl oxy-

che durch Amidbindung miteinander vereinigt sind. derivat umzuwandeln.

Im folgenden sollen sowohl in der allgemeinen Bei der Umsetzung von Produkten, die Guanidin-

Beschreibung als auch in den Beispielen die erwähnten 20 gruppen (wie Arginin) enthalten, wird die Guanidinin-

Aminosäuren überall L-Konfiguration haben, obwohl gruppe durch Umwandlung in das ω-Nitroderivat ge-

dies nicht besonders hervorgehoben wird. schützt. Im erhaltenen Endprodukt können restliche

In der nachstehenden Tabelle ist die Bedeutung der Schutzgruppen auf geeignete Weise entfernt werden,

verwendeten Abkürzungen erläutert. z. B. durch Hydrierung, wie untenstehend näher be-

25 schrieben wird.

Tabelle 1 Somit bedeutet das Verfahren nach der Erfindung

,.,.. TJ '. " ". '. '. ~~Z eine Serie von Umsetzungen des Typs

Abkürzung Name der Aminosäure in L-Form ^{e Jr}

A — COZ -f NH₂B -> ACONHB,

30 wobei ACOZ eine einfache Aminosäure bedeutet oder ein durch eine ähnliche Reaktion aufgebautes niedriges Peptid, worin Aminogruppen und Carboxylgruppen, die nicht reagieren sollen, auf geeignete Weise geschützt sind, oder ein zur Reaktion neigendes Derivat 35 einer solchen Aminosäure oder eines Peptides, und NH₂B bedeutet eine Aminosäure oder ein Peptid, in denen Carboxylgruppen geschützt sein können, und Aminogruppen, die nicht reagieren sollen, auf geeig-

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach nete Weise geschützt sind, wobei die angewendeten

an sich bekannten Methoden zur Synthese von Poly- 40 Aminosäuren und die Realuionsfolge so gewählt

peptiden hergestellt werden. werden, daß ein Polypeptid nach der obenstehenden

Allgemein bedeutet es, daß man die infragestehenden Formel entsteht, worauf die nicht erwünschten Schutz-

Polypeptide, ausgehend von den einfachen Amino- gruppen entfernt werden.

säuren, stufenweise durch Kopplung derselben in ge- Die Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptide

wünschter Form unter Ausbildung von Amidbindun- 45 wird durch die nachstehenden Beispiele veranschaugen aufbaut. licht. Die Beispiele 1 bis 11 erläutern zusammen-

So können zwei Aminosäuren zu einem Zwischen- genommen die vollständige Synthese von

Phe — Leu — AIa — GIu (y-OMe) — GIy — GIy — GIy — VaI — Arg — OMe.

Die übrigen Beispiele erläutern die Synthesen von Nach Abkühlen wird 5,6 ml Triäthylamin (0,04 Mol)

Zwischenprodukten für andere im Rahmen der Er- zugesetzt und das gebildete Triäthylaminhydrochlorid

findung liegender Verbindungen, wobei die Zwischen- abfiltriert. Die filtrierte Lösung wird auf —1O⁰C

produkte in Form von Schutzgruppen enthaltenden 55 gekühlt, und unter Rühren werden 14,92 g Carbo-

Derivaten erhalten werden. Die Entfernung der Schutz- benzyloxy-Valin-p-Nitrophenylester (0,04 Mol) zuge-

gruppen wird in zusammenfassender Form anschlie- geben. Nach 2 Stunden bei — 10⁰C darf die Tempera-

ßend an die Beispiele beschrieben, und für einige der tür in dei Reaktionsmischung auf Raumtemperatur

hergestellten Derivate werden experimentelle Einzel- steigen und b'i dieserTemperatur 24Stunden reagieren,

heilen in Tabellenform angegeben. 6» Das Dimetuvlformamid wird im Vakuum bei 30 bis

40 C abpedunstet und der Rückstand in einer Mi-

Be is pi el 1 schung von \thylacttat, n-Butylalkohol (2 : I) gelöst.

Carbobcnzyloxy-Valyl-o-Nitroarginin-Mcthvlcsicr, P^{ie lisu}^ *^ird'⁵™! ^mit 5?'.,igcr Natrium-bicarbonat-

hergestellt nach Methoden A und Ii' ^loslln^ ²ⁿ?^al T„^u T' ,^3m.^al T*,,^{1 N}'^Sal"f^ure"

6₅ lösung und schließlich 3mal mit destilliertem Wasser

A. 10,8 g feinpulverisiertes und getrocknetes oNitro- extrahiert.

arginin-Methylesterhydrochlorid (0,04 Mol) werden in Die Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet,

1SOmI neudestilliertem Dimethylformamid gelöst. zur Trockne eingedampft und der Rückstand in

VaI	Valin
Arg	Arginin
Phe	Phenylalanin
GIy	Glycin
Leu	Leucin
AIa	Alanin
GIu	Glutaminsäure

18

trocknem Methanol gelöst. Aus der Methanollösung kristallisiert die Substanz durch Zusatz von absolutem Äther aus. Ausbeute 14,1 g mit einem Schmelzpunkt von 163 bis 164° C.

Durch Zusatz von Petroläther zur Mutterlauge erhält man 1,1 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 155 bis 156° C.

Summe der Ausbeute 81,4%;

Analyse C_i0H_MN_eO₇ (Molgewicht 466,5), (Trocknung 10 Stunden bei 70"C über Ρ,Ο₅);

berechnet C 51,49, H 6,48, N 18,02%;

erhalten C 52,02, H 6,61, N 17,99%,.

B. 5,4 g f'j-Nitroarginin-Methylesterhydrochlorid »5 (0,02 Mol) werden in 75 ml Dimethylformamid gelöst, und nach dem Abkühlen werden 4,84 ml Tributylamin (0,02 MoI) zugesetzt. Sobald die Temperatur der Lösung — 10⁰C beträgt, werden 7,0 g Carbobenzyloxy-VaIin (0,028 Mo!), das sich leicht löst, und darauf « 5,77 g Dicyclohexylcarbodiirnid (0,028 Mol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird 2 Stunden bei -1O⁰C, dann etwa 10 Stunden bei 0"C und schließlich 8 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird zugesetzt 1 ml Essigsäure, und nach ¹I₂ Stunde wird *5 das gebildete Dicyclohexylcarbamid abfiltriert (Gewicht 5,9 g). Das Filtrat wird eingedampft und der Rückstand in Äthylacetat-Butylalkohol (2: 1) gelöst. Spuren von ungelösten Dicyclohexylcarbamid werden abfiltriert. Sonst verfährt man wie unter A.

Ausbeute: 7,35 g mit einem Schmelzpunkt von 160 bis 161°C, was 78,9% der Theorie entspricht. Aus der Mutterlauge erhält man eine Substanz, die bei etwa 131⁰C schmilzt und wahrscheinlich N-Carbobenzyloxy-Valin-N.N'-Dicyclohexylharnstoff darstellt.

Beispiel 2

Herstellung von Carbobenzyloxy-Glycyl-Glycyl-Valyl-

(')-Nitroarginin-Methylester

40

9,33 g Carbobenzyloxy-Valylco-Nitroarginin-Methylester (0,020 Mol) werden in 120 ml trockener Essigsäure gelöst und 10 g trockener, bromfreier Bromwasserstoff in die Lösung bei 20^cC 45 Minuten lang eingeleitet. 80 ml Essigsäure und der Überschuß an Bromwasserstoff werden im Vakuum bei 20''C abdestilliert und der Rückstand in 1 1 trockenem Äther kräftig digeriert. Die Ätherphase wird abdekantiert und der Rückstand noch 3mal mit trockenem Äther digeriert. Die körnig gewordene Substanz wird über Phosphorpentoxyd im Vakuumexsiccator getrocknet. Sie erweist sich als sehr hygroskopisch. Die Analyse auf Bromwasserstoff ergab etwa 1,5 Äquivalente Bromwasserstoff pro Mol gegenüber dem berechneten einen Äquivalent Bromwasserstoff.

Ausbeute 9,2 g Valyl-o-Nitroarginin-Methylester-1,5 HBr. Das Hydrobromid wird in 80 ml neudestilliertem Dimethylformamid gelöst und auf 0⁰C gekühlt. 4,30 ml (0,031 Mol) Triethylamin werden zugesetzt, und nach 10 Minuten Rühren wird das gebildete Tri- 6* äthylamin-Hydrobromid (etwa 3,55 g) abfiltriert. Dem Filtrat, das auf —10⁰C abgekühlt wurde, werden 7,75 g Carbobenzyloxy-Glycyl-Glycin-p-Nitrophenylcsler mit mit einem Schmelzpunk' von 163 bis 164 C zugesetzt (0,020 Mol). Die Mischung wird 1 Stunde lang bei -10'C gerührt, worauf man auf Raumtemperatur ansteigen läßt. Nach 4 Tagen Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung im Vakuum hei 40 C einge-

022

dampft und der RückEiand mit Äthylacetat behandelt, worauf er kristallisiert.

Ausbeute 12,45 g mit einem Schmelzpunkt von 152 bis 154'C. Die Substanz wird in Dimethylformamid Relöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung ausgefällt. Die Fällung wird mit destilliertem Wasser und Äthanol gewaschen. Die Substanz wird wiederum im Dimethylformamid gelöst und mit 5%iger Zitronensäurelösung ausgefällt, mit destilliertem Wasser und gekühltem Äthanol gewaschen und im Vakuumexsiccator über P₂O; getrocknet.

Ausbeute 7,6 g mit einem Schmelzpunkt von 176 bis 181⁰C;

Analyse C₂₄H_:1,N_SO₉ (Molgewicht 579,6),
(Trocknung 10 Stunden bei 70'C über P₂O- unter 0,2 Torr);

berechnet C49,73, H 6,09, N 19,34",,:

erhalten C 49,20, H 6,34, N 19,35".,.

Beispiel 3

Herstellung von Carbobenzyloxy-Alanyl-y-Mcthyiglutaminsäure

5.92 g Glutaminsäure-y-Methylesterhydrochlorici (0,03 Mol) werden in einer Mischung von Pyridin Wasser (1:1) gelöst und auf 5^:'C abgekühlt. Der Mischung werden 10,32 g (0.03 Mol) Carbobenzyloxy-Alanin-p-Nitrophcnylester portionsweise zugesetzt und der pH-Wert mit Hilfe von 4 N-NaOH konstant auf 8,7 gehalten. Nach 24stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird die Lösung mit Wasser verdünnt und mit Natriumbicarbonat gesättigt. Die gesättigte Lösung wird 7mal mit Äthylacetat extrahiert und mit halbkonzentrierter Salzsäure auf pH 2,9 bei etwa 0 C angesäuert, dann mit Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetat-Phase mit kochsalzgesättigtem Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in absolutem Äther gelöst, und bei Zusatz von Petroläther kristallisiert die Substanz als Nadeln aus.

Ausbeute 6,3 g mit einem Schmelzpunkt von 99.5 bis 100,5'C, was 57,3% der Theorie entspricht; Analyse C₁₇H₂₂O₇N₂ (Molgewicht 366,4);

berechnet C 55,75. H 6,05, N 7.65%;

erhalten C 55,60, H 5,98, N 7.54 %.

Äquivalentgewicht:

Berechnet 366,4;

erhalten 367,3, 368,1.

Beispiel 4

Herstellung von Carbobenzyloxy-Glycin-Carbotert.-Butyloxyhydrazid

20,9 g Carbobenzyloxy-Glycin (0,1 Mol) und 13,2 g Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid (0,1 Mol) werden in 150 ml Acetonitril gelöst. Nach Abkühlung auf OC werden 20,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,1 Mol), gelöst in 50 ml Acetonitril, zugesetzt, worauf man die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur über Nacht stehenläßt. Gebildetes Dicyclohexylcarbamid wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und mit 5"„igcr Zitronensäure, Wasser, 5"„igern Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Äthylacctat-Phasc wird über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert.

wobei die Substanz auskrislallisicrl. Oie Substan/. wird in Äther gelöst und bei Zusatz von Petrolälher kristallisieren 29,1 g (90,1 "„) Caiboncnzylo.xy-C ilyein-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid aus. Schmelzpunkt 76 bis 83'C. Umk'ristallisiening aus Ath>lacctal-Pctroläther ergibt 23.1 g (71,5"„) mit einem Schmelzpunkt von 81 bis 84' C. Weitere Umkristallisierung erhöht den Schmelzpunkt auf 82 bis 84 C.

Analyse (Γ,,Η,,Κ,Ο- (Molgewicht 323.36):

berechnet C 55.72, 116.54. N 13,00",,:

erhalten C 55,39. 11 6.66. N 13,35",,.

Beispiel 5

Herstellung von Glycin-Carho-tcrt.-ButyUmhydrazid

9,7 g Carbobenzyloxy-Glycin-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid (0,03 Mol) werden in 100 ml Methanol gelöst, 0,5 g 10°,',iges Pd/C zugegeben und Wasserstoff eingeleitet. Nach 12 Stunden sind 660 ml Wasserstoff verbraucht, und die Hydrierung wird abgebrochen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Methanol unter Vakuum angetrieben. Der Rückstand wird mit absolutem Äther digeriert, wobei eine Substanz mit einem Schmelzpunkt von 141 bis 143 C auskristallisiert. Ausbeute 5,3 (93"„ der Theorie).

Der Schmelzpunkt der Substanz steigt nach einer L'mkristallisation aus Methanol -- Athcr auf 145 bis 146^aC.

Analyse C-H_nN₁O₁ (Molgewicht 189.22):

berechnet ' '. . . C 44.43, H 7,99, N 22.21 'V₁;

erhalten C 43,94. 117.97. N 22,35"/,.

E-Gewicht 189,2: 191.0.

Beispiel 6

Herstellung von Carbobcnzyloxy-Phcnvlalanyl-Leucin-Äthyleslcr

9,8 g Lcuein-Äthylestcrhydrochlorid (0.05 Mol) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und 5.06 g Triäthylamin (0,05 Mol) zugegeben. Das gebildete Triäthylaminhydrochlorid wird abfihriert und mit etwas gekühltem Dimethylformamid gewaschen.

15.0 g Carbohenzyloxy-Phenyiaianin (0.05 Mol) werden in 30 ml Dimethylformamid/Azeioniiril (1 : 1) gelöst und auf — 10^cC abgekühlt, worauf 10.4 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,05 Mol) und das obige FiI-trat, das Leucin-Äthylester enthält, zugesetzt werden. Die Temperatur in der Reaktionsmischung kann über Nacht auf Raumtemperatur ansteigen, und dann wird ImI 50%ige Essigsäure zugesetzt. Nach 30 Minuten wird gebildetes Dicyclohexylcarbamid abfiltrierl und das Filtrat im Vakuum unter 40 C zu Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und etwas ungelöstes Dicyclohexylcarbamid abfiltriert. Die Äthylacetat-Lösung wird mit 1 N-SaIzsäure, Wasser, 50°„iger Nalriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen konzentriert. Nach Zusatz von Petroläther kristallisiert Carbobenzyloxy-Phcnylalanyl-Lcucin-Äthylcstcr als Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 116 bis 117 C aus. Ausheule 19.45 gJKS.3ⁿ„ der Theorie). Durch t'mkristaHisicrunp aus Allylacetat' Petrolälher erhol
117.5 CV

sich der Schmelzpunkt auf 117 bis

Analyse (V, 11..N.(V (Molgewicht 440.55): berechnet *.'. .'.". .". . '. C 6SJ6. Il 7.32. N <>.}(<".,: erhalten C 67.74. Il 7.1S. N (öS" ,.

Beispiel 7

Herstellung von Caibnhcnzylo\y-Phenvl.ilan\l-Lcucinhydrazid

X.4 g Carboben/vJoxy-Phcnvlalanyl-Lciiciii-Athvlcstcr (0.02 Mol) werden in 150 ml Methanol gelost und 4.0 g Hydrazinhydrat (0.08 Mol) zugcei/i. Die Mischung wird über Nacht gerührt, und gebildetes Carbohcnzyloxy-Phenylalaiiyl-Lcueiiihydrazid w ird ab- filtriert und mit etwas Methanol gewaschen. Dann wird aus McthanolAVasscr umkristallisiert, wodurch man 6,6 g mit einem Schmelzpunkt von 192.5 bis 193.5 C erhält, was 81,5",, der Theorie entspricht.

Analyse C ..,R_1nN₄O₄ (Molgewicht 426.53):

berechnet C 64.77, H 7.09. N 13.14",,:

erhalten C 64.85, H 7,12. N 13.16",,.

Beispiel 8

Herstellung von Carbobenzyloxy-y-Melhylghiiamyl-Glyein-Caibo-icrt.-Butyloxyhydnizid

7.4 g Carbobcnzyloxy-y-Mcthylglutaminsäiirc (0.025 Mol) werden in 50 ml Methylcnchlorid gelöst und auf --10 C gekühlt, worauf 5,4 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,0265 Mol), gelöst in 25 ml gekühltem Methylcnchlorid. unter Rühren zugesetzt werden.

Dann werden 4,73 g Glycin-Carbo-tcrt.-Bulvloxyhydrazid (0.025 Mol), gelöst in 25 ml gekühltem Äthylacetat, zugegeben. Die Temperatur der Mischung kann über Nacht auf Raumtemperatur ansteigen, und 30 Minuten vor der Abhltrierung von Dicyclohexylcarbamid werden 2 Tropfen 50",,ige Tssigsäurc zugesetzt. Das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Allylacetat gelöst, worauf mit 5",,IgCm Nalriumbicarbon.it. Wasser, 5",,iger Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet wird Die Äthylacctatlösung wird auf ein kleines Volumen konzentriert, und nach Zusatz von Petrolälher kristallisieren S.2 g Substanz mit einem Schmelzpunkt vor 104 bis 105,5 C aus. IJmkristallisierimg aus Äthyl acetat/Petroläthcr erhöht den Schmelzpunkt auf 10* bis 108 C.

Beispiel 9 Herstellung von Carbobcnzyloxy-Alanyl-y-Mcthylglut

amyl-Glycin-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazid

nach Methoden A und B

A. 1,83 g Carbobenzyloxy-Alanyl-y-Methylglutamin säure (SmMoI) werden >n 10 ml Methylcnchlorid gc löst, und nach Abkühlung auf -10 C werden 1.08 Dicyclohexylcarbodiimid (5,2mMol), gelöst in 5 n' gekühltem Methylcnchlorid, zugesetzt, und schließlic werden 0.95 g Glyciri-Carbo-tert.-Butyloxyhydrazi (5mMol), gelöst in HImI gekühltem Äthylaccta' zugegeben. Die Mischung wird gerührt und übe Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen, worat 2 Tropfen 50"„ige Essigsäure zugesetzt werden. Nac 30 Minuten wird das gebildete Dicyclohcxylearhami (1.1 p) abfiltrierl und mil etwas Äthylacetat gewaschci

Das FiItnit wird im Vakuum zur Trockne eingedampft Und der Rest in Äthylacetat gelöst, worauf mit 5"„iger Natriumbicarbonatlösimg. Wasser. 5",,iger /Kronentäurclösung und Wasser gewaschen wird. Die Athyl- icetat-Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet Und auf ein kleines Volumen konzentriert, wobei 2.3 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 140 bis 150 C ■^kristallisieren. Nach zwei l^;mkrisiallisaiionen aus Allylacetat steigt der Schmelzpunkt auf 154 bis 150 C an, und es ergibt sich eine Ausbeute von 1,9 g (70.4",, der Theorie).

Analyse C₄I l_TlN-,O₉ (Molgewicht 537.58):

berechnet C 53,63, H 6.56, N 13,O3^c\,:

erhalten C 53.4S, H 6,52. N 12,79",,.

B. 4,0g Carbobenzyloxy-y-Mcthylglutamyl-Cilycm-Carbo-terl.-Butyloxyhydrazid (0,06 Mol) werden in 60 ml Methanol gelöst und 0,5 g l()"„iges Pd C (mit Wasser angefeuchtet) zugesetzt. Die Carbobenzvloxy-Schutzgruppe wird mit Wasserstoff bei Raumtemperatur und Atmosphiirendruck im Laufe von 2 bis 3 Stunden weghydnert. Der Verbrauch an Wasserstoff betragt 200 ml gegenüber den berechneten 195 ml. Der Katalysator wird abfiltriert und das Killrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in absolutem Äther gelöst und zur Trockne cingedunstet. wobei ein Öl erhalten wird. Das Öl wird im Vakuumexsiccator über Phosphorpentaoxyd getrocknet, wobei das Öl in eine feste hygroskopische Substanz übergeht, die 2,76g wiegt, was 96,5",, der Theorie entspricht.

Das Produkt (2,76 g) wird in 40 ml Dimethylformamid gelöst und auf —10 C abgekühlt, und es werden 3,0 g Carbobenzyloxy-Alanin-p-Nitrophenylester (8,C niMol) zugesetzt. Die Lösung kann sodann langsam Raumtemperatur annehmen, und nach 24 Stunden wird sie im Vakuum zur Trockne eingedunstet. Der Rückstand wird wie unter A behandelt.

Ausbeute 3,35 g mit einem Schmelzpunkt von 151 bis 153 C, was 75,5°_u der Theorie entspricht. Nach drei Umkristallisierungen aus Äthylacetat erhöht sich der Schmelzpunkt auf 160,5 bis 161^:C (wurde bei 153^;C umgelagert).

Be

10

ι s ρ i e 1

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phcnylalanyl-Leucyl-Alanyl-7-Methylglutamyl-GIycin-Carbo-

tert .-Butyloxyhydrazid

1,8 g des nach Beispiel 9 erhaltenen Produktes (2 mMol) werden in 50 ml Methanol gelöst, 0,2 g 10°„iges Pd/C zugesetzt und Wasserstoff eingeleitet. Mach 3 Stunden ist die Hydrierung beendet, wobei $5 ml (theoretisch 45 ml) verbraucht wurden. Der Katalysator wird entfernt und die Lösung im Vakuum tür Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst.

0,86 g des Produktes nach Beispiel 7 (2 mMol) werden in 3 ml 6 N-Salzsäure -f 2 ml 50%iger Essigsäure gelöst und mit 40 ml Äthylacetat überschichtet. Die Mischung wird auf —10'C abgekühlt und 2,0 ml !molares Natriumnitrit unter Umrühren tropfenweise tugegeben. Nach 15 Minuten bei —10^cC wird die Äthylacetat-Phase von der Wasserphase getrennt und mit gekühlter, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Eiswasser gewaschen. Die Äthylacetatlösung wird über Magnesiumsulfat 1 Stunde lang bei —10" C getrocknet. Die Äihylacetatlösung, welche Carbobenzyl- oxy-Phcnylalanyl-Leucinazid eiilhak. wird langsam in die das freie AminopeptiJ enthaltende Dimethylformamidlösung unter Umrühren und bei - 10 C eingetropft. Nach 24 Stunden bei 0 C und 4S Stunden bei Raumtemperatur wird die gebildete Ausfallung ablillriert. Ausbeute 0.35 g mit einem Schmelzpunkt \on 207 bis 208 C. Die Mutterlauge wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Athylacetat gelöst, mit 5"_niüem Natriumbicarbonat, Wasser, 5"„iger Ziironensäurelösimg und Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Athylacetat gelöst und bei Zusatz von Petrolällier kristallisieren 0.70 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 180 bis 200 C aus.

Zusammen gibt dies 0.80 g Ausbeute, was 50,1 "„ der Theorie entspricht, hin kleiner Teil wird nochmals aus Athylacetat umkrisiallisiert.

Analyse C₁I₁II₀₁N₇O₁, (Moluewicht 797,9):

berechnet C 58,7?, 116,95, N12,29"_u:

erhalten C 5S,4S, H 6,77, N 12,35",,.

Beispiel 11

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Leucyl-Alanyl-v-Methyl-Glutamyl-Glycyl-Glycyl- ülycyl-Valyl-ci-Nitroarginin-Melhylester

334 mg des Produktes nach Beispiel 10 werden in 1.8 ml Trifluoressigsäurc gelöst, und nach 45 Minuten bei 22 C wird die Trifluoressigsäurelösung unter Rühren in 100 ml absolutem Äther eingetropft.

Nach 2 Stunden im Kühlschrank wird die Ausfällung abfiltrierl und mehrmals mit absolutem Äther gewaschen, worauf sie in 4 ml Dimethylformamid und 1 ml 4 N-Salzsäurc gelöst wird. Die Lösung wird auf

— 10 C abgekühlt, und 0.42 ml 1 M-Natriumnitritlösung werden im Laufe von 5 Minuten unter Rühren zugetropft, »vorauf die Lösung samt der gebildeten Ausfällung in 30 ml eiskalte. 2"_uige Natriumbicarbo-

natlösung getropft wird, wodurch die Ausfällung des gebildeten Säurcazids vollständig wird. Das Azid wird auf dem Filter mit Eiswasser und eiskalter 5°_uiger Zitronensäurelösung gewaschen, anschließend mit Eiswasser von der Zitronensäure freigewaschen und dann

schnell über Phosphorpentoxyd im Vakuum bei 5 "C getrocknet und unmittelbar zur Kopplung angewendet. Die Ausbeute an trockenem Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Alanyl-y-Methylglutamyl-Glycinazid beträgt 291 mg, was 98 "_o der Theorie entspricht.

243 mg des Produktes nach Beispiel 2 (0,42 mMol) werden in 2 ml absoluter Essigsäure gelöst und 1 ml

4 N-Bromwasserstoff in Essigsäure zugesetzt, worauf die Mischung 45 Minuten gegen Luftfeuchtigkeit geschützt bei Raumtemperatur stehenbleibt. Dann wird

die Mischung in 100 ml absolutem Äther unter kräftigem Rühren eingetropft. Die Ausfällung wird gewaschen und mit absolutem Äther digeriert, bis sie körnig (hygroskopisch) wird. Das Tetra-Peptidmethylesterhydrobromid wird in 4 rnl Dimethylformamid

gelöst und der Lösung werden 0,09 ml Triäthylamin (0,64 mMol) zugesetzt, die auf -1OX gekühlt wird, und das obenerwähnte Azid wird, gelöst in 10 ml aui

— 10^cC vorgekühltem Dimethylformamid, unter Rühren bei -1OX zugetropft. Nach 24 Stunden bei OC

kann die Lösung 48 Stunden bei Raumtemperatur stehenbleiben, worauf sie auf 5 ml bei 20°C untei Vakuum konzentrier, wird. Darauf wird nochmals ir

5 ml Dimethylformamid gelöst und unter Umrührer

j, _v

7u 40 ml 5"„igcr Zitronensäurelösung zugesetzt. Die Ausfällung wird mit Wasser von Zitronensäure freigewaschen und im Vakuum über Phosphorpenloxyd getrocknet. Ausbeute 265 mg mit einem Schmelzpunkt von 203 bis 213 C, was 66,7 "_u der Theorie entspricht. Zwei Unifällungen aus Dimeihylformamid/Wasser erhöhen den Schmelzpunkt auf 211 bis 215 C.

Analyse C-₀H-,N₁₃O₁₁₁ (Molgewicht 11
berechnet'....'.... C 53,99, H 6,62,
erhalten C 53,51, H 6,56,

12.2);

N 16,37",,;

N 16.72','_u.

Beispiel 12

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyloj-Nitro-arginin-Methylester

10,8 g ffj-Nitroarginin-Methylesterhydrochlorid |40 mMol) werden in Dimethylformamid gelöst und •nter Kühlung 4,05 g Triäthylamin (40 mMol) zugesetzt. Gebildetes Triäthylamin-HCl wird abfiltriert lind dem Filtrat eine abgekühlte Lösung ( — 10 C) von 12,0 g Carbobenzyloxy-Phenylalamin (4OmMoI) in Acetonitril zugegeben, der bei — 10^cC 9,1 g Dieyclohexylcarbodiimid (40 mMol) zugesetzt waren. Es wird 2 Stunden bei —10^cC gerührt und über Nacht »uf Raumtemperatur gebracht.

Das gebildete Dicyclohexylcarbamid wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und wie gewöhnlich gewaschen. Aus der Äthylacetatlösung werden bei Zusatz von absolutem Äther Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 87 bis 89;C erhalten. Nach Umkristallisation aus 60%igem Äthanol werden Kristalle von anderer Modifikation mit einem Schmelzpunkt von 153,5 bis 155°C erhalten. Ausbeute 17,9 g (87,1 % der Theorie).

Analyse Cj₄H₃₀N₆O₇ (Molgewicht 514.55):

berechnet C 56,02, H 5,88, N 16,33 %:

erhalten C 55,94, H 6,09, N 16,42%.

Beispiel 13

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenyialanylvalyl-(i)-Nitroarginin-Methylester

9,33 g des Produktes nach Beispiel 1 (20 mMol) werden wie nach Beispiel 2 behandelt. Die Ausbeute an hygroskopischem Valyl-ro-Nitroargininmethylester-1,5 HBr beträgt nach Trocknung im Vakuum über KOH und P₂O₅ 9,15 g, was quantitativ ist.

Der Hydrobromiddipeptidester wird in 50 ml Dimethylformamid gelöst und auf -5⁰C abgekühlt, «vorauf 4,2 ml Triäthylamin (3OmMoI) zugesetzt herden. Gebildetes Triäthylamin-HBr wird abfiltriert und dem Filtrat 8,4 g Carbobenzyloxy-Phenylalaminp-Nitrophenylester (20 mMol) zugesetzt. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung auf -1O⁰C abgekühlt und weitere 1,4 ml Triäthylamin zugesetzt. .Die Mischung kann dann 24 Stunden stehen. Nach Zusatz von 1 ml Essigsäure wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in einer Mischung von Äthylacetat/Butylalkohol (3:1) gelöst und wie gewöhnlich mit Wasser, 5?_oiger Zitronensäure und Wasser gewaschen. Die Lösung wird liiber MgSO₄ getrocknet und auf ein kleines Volumen «ingedunstet, das nach Zusatz von absolutem Äther 10,1 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 108 bis 111⁰C ergibt, was 82,3% der Theorie entspricht.

Umkristallisation aus Äthylacetat/Methanol nach Zusatz von absolutem Äther erhöht den Schmelzpunkt auf 112 bis 114¹C.

Analyse C₂₈H₁₉N₇O₈ (Molgewicht 613,69);

berechnet C 56,76, H 6,41, N 15,98%;

erhalten C 56,32, H 6,48, N 16,12%'.

Beispiel 14

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Glycyl-Valyl-cy-Nitroarginin-Methylester

2,33 g des Produktes nach Beispiel 1 (5 mMol) werden wie nach Beispiel 2 behandelt, und der erhaltene Hydrobromid-Dipeptidmethylester wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst, auf —5 C gekühlt und 1,05 ml Triäthylamin (7,5 mMol) zugesetzt. Triäthylamin-HBr wird abfiltriert, und das Filtrat wird wie folgt angewendet:

»ο 1,85 g Carbobenzyloxy-Phcnylalamyl-Glycinhydrazid (5 mMol) werden in 7 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1,5 ml 6 N-Salzsäure versetzt, auf —10°C abgekühlt, und es werden unter Rühren 5,1 ml 1 M-Natriumnitritlösung (5,1 mMol) eingetropft. Nach 10 Minuten bei -1O⁰C wird 50 ml 5%ige Natriumbicarbonatlösung zugesetzt, und bei 0^cC beginnt das Azid auszufallen. Die Ausfällung ist vollständig nach Zusatz von 30 ml eisgekühltem Wasser, 10 Minuten Rühren, Filtrierung und sorgfältiger Waschung mit Eiswasser. Das Ausgefällte wird im F.iswasser unter Umrühren abgeschlämmt, filtriert und mit 0°C-Wasser gewaschen. Der Prozeß wird 3mal wiederholt und die Substanz bei 5⁰C über P₂O₅ im Vakuum getrocknet, worauf sie unmittelbar angewendet wird. Ausbeute 1,77 g (93% der Theorie).

In die auf —10° C gekühlte Dimethylformamidlösung des Aminodipeptids wird das in 8 ml auf —10⁰C vorgekühltem Dimethylformamid gelöste Azid unter Rühren zugetropft. Nach 10 Minuten bei —10"C kann die Mischung 48 Stunden bei Raumtemperatur stehen und wird dann im Vakuum auf 7 ml konzentriert und wie nach Beispiel 11 behandelt. Ausbeute 2,44 g (78,2% der Theorie). Umkristallisation aus 60%igem Äthanol ergibt 1,95 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 147 bis 149^DC.

Analyse C₁₁H₄₀N₈O, (Molgewicht 670,74);

berechnet C 55,51, H 6,31, N 16,71 %;

erhalten C 55,38, H 6,58, N 16,90%.

Beispiel 15

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Glycyl-Glycyl-Valyl-w-Nitroargininmeihylester

1,77 g des nach Beispiel 1 gewonnenen Produktes (3,8 mMol) werden wie unter Beispiel 2 behandelt und der erhaltene Hydrobromid-Dipeptidmethylestei wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst, auf —5°C abgekühlt, und es werden 0,79 ml Triäthylamii (5,7 mMol) zugesetzt. Das Triäthylamin-HBr win abfiltriert und das Filtrat wie unten angewendet 1,62 g Carbobenzyloxy Phenylalanyl-Glycyl- Glycin hydrazid (3,8 mMol) werden in 10 ml Dimethylform amid gelöst, 1 ml 6 N-Salzsäure zugesetzt und au —10⁰C gekühlt. Unter Rühren werden 3,85 m 1 M-Natriumnitritlösung (3,85 mMol) zugetropft unc im übrigen wie im Beispiel 14 behandelt. Ausbeut 1,55 g (0,5% der Theorie).

In die auf —10°C gekühlte Dimethylformamidlösung des Aminodipeptidcsters wird das in 9 ml auf — 10⁰C vorgekühltem Dimethylformamid gelöste Car- bobenzyloxy-Tripeptidazid unter Rühren zugetropft. Im übrigen wird wie nach Beispiel 11 gearbeitet. Ausbeute: 1,93 g mit einem Schmelzpunkt von 185 bis 190⁰C, was 73,1 % der Theorie entspricht. Um- kristallisation aus 90 %igem Äthanol erhöht den Schmelzpunkt auf 188 bis 191⁰C.

Analyse C_MH₄₅N_eO,„ (Molgewicht 727,8):

berechnet C 54,45, H 6,23, H 17,32%:

erhalten C 55.01, H 6,18. N 17,52%.

Beispiel 16 Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl- Glycyl-Glycyl-Glycyl-Valyl-

w-Nitroargininmethylester

1,74 g des nach Beispiel 2 gewonnenen Produktes (3 mMol) werden in 7 ml trockener Essigsäure gelöst, und unter wasserfreien Bedingungen werden 7 ml 4 N-HBr in Essigsäure zugesetzt. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur ist die Kohlendioxydentwicklung beendet und die Reaktion vollständig. Im Vakuum wird der Überschuß an Bromwasserstoff und 7 ml Essigsäure abdetsilliert und der Rückstand unter kräftigem Rühren in 150 ml absolutem trockenen Äther eingetropft. Der Äther wird abdekantiert, und aufgearbeitet. Die Ausbeute von 2,26 g Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Phcnylalaninazid, entsprechend 96% der Theorie, wird in 8 ml Dimethylformamid gelöst, auf —10 C gekühlt und unter Rühren in eine vorgekühlte Lösung des Aminodipeptidesters eingetropft Die weitere Verfahrensweise entspricht den Beispielen 11 und 14. Ausbeute 2.14 g mit einem Schmelzpunkt von 218 bis 220 ¹C. entsprechend 58,7",; der Theorie.

ίο Analyse Γ_1ΚΗ^Ν_ΛΟ₈ (Moleewidit 760,87);

berechnet C 59,99, H 6,36, N 14.73%:

erhalten C 59,49, H 6,33, N 14.81 "„.

Beispiel 18

Herstellung von Carbobcnzyloxy-Phenylalanyl-Leucyl-Valyl-o-Nitroarginin-Methylester

2,35 g des Produktes aus Beispiel 1 (5 mMol) werden behandelt, wie es in den Beispielen 2 und 14 bc-

»o schrieben ist. Die erhaltene Dimethylformamidlösung von Valyl-f)-Nitroarginin-Methylester wird wie folgt angewendet:

2.13 g des Produktes nach Beispiel 7 (5 mMol) werden in einer Mischung von 5 m! 6 N-Salzsäure

a5 und 5 ml 50%igcr Essigsäure gelöst, mit 80 ml Äthylacetat überschichtet und das Verfahren wie im Beispiel 10 beschrieben fortgesetzt. Die Äthylacetatlösung mit dem Carbobenzyloxy-Dipcptidazid wird auf — 10"C abgekühlt und unter Rühren in die oben-

Rückstand wird über P₂O-, und KOH im Vakuum

gp

der Rückstand, der eine körnige Konsistenz annahm, 3° erwähnte D^;methylformamidlösung eingetropft, die wird weitere 3mal mit trockenem Äther digeriert. Der auf —10^rC vorgekühlt war. Die weitere Aiisführimr

entspricht dem Beispiel 10. und die erhaltene Äthylacetatlösung wird zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 7 ml Dimethylformamid gelösl und nach Beispiel 11 gereinigt. Ausbeute 2.65 g mil einem Schmelzpunkt vor. 171 bis 181 C, entsprechend

₂,

getrocknet. Die Ausbeute an Tetrapcptidestcrhydro- bromid beträgt l,62_g, was 95 % der Theorie entspricht. berechnet auf 1,5 Äquivalente HBr pro Mol Peptid. Das Hydrobromid wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst und auf —10⁰C abgekühlt, worauf 0.60 ml Triäthylamin(4,28 mMol) zugesetzt werden und das gebildete Triäthylamin-HBr abfiltriert wird. Unter Rühren bei —10⁰C wird dem Filtrat 1,44 g Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-GIycin-p-Nilrophenylester (3 mMol) zugesetzt, und nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung wieder auf — 1O⁰C abgekühlt, und es werden weitere 0,20 ml Triäthylamin zugegeben, worauf man 24 Stunden stehenläßt. Die Aufarbeitung erfolgt wie nach Beispiel 2. Ausbeute 1,59 g mit einem Schmelzpunkt von 164 bis 167"'C, was 71,2% der Theorie entspricht. Umkristaiüsation aus 60%igem Methanol erhöht den Schmelzpunkt auf 169 bis 172°C.

72.9% der Theorie. Das Produkt wird weitere 2ma aus 60%igem Äthanol umkristalüsiert. wobei mcI der Schmelzpunkt auf 179 bis 182^! C erhöht.

Analyse Q₂H₅₀N_KO„ (Molgewicht 726.851:

berechnet C 57,84, H 6,94. N 15.42°,,

erhalten C 58,05. H 7,01. N 15.35 %

Beispiel 19

Herstellung von Carbobenzyloxy-Valyl-('(-Nitroargininamid

45.8 ■. Carbobenzyloxy - o> - Nitroargininamu 50 (0,13MoI) mit einem Schmelzpunkt von 217 bi 218"C werden in 300 ml wasserfreier Essigsäure ge löst, und unter wasserfreien Bedingungen werdei 300 ml 2 N-HBr in trockener Essigsäure unter Ruh ren zugesetzt. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatu 55 ist die Kohlendioxydentwicklung beendet, worauf di Reaktionsmischung im Vakuum bei 2O⁰C unte wasserfreien Bedingungen eingedampft wird, bis de Rückstand ein Volumen von 250 ml hat. Der Rück stand wird unter kräftigem Rühren in 2,5 1 trockener 2,35 g des Produktes nach Beispiel 1 (5 mMol) 60 Äther eingetropft, wobei eine plastische Masse aus werden wie in den Beispielen 2 und 14 behandelt, fällt. Die Ätherphase wird abdekantiert und der Rück Und die erhaltene Lösung von Valyl-w-Nitroarginin- stand weitere 3mal mit trockenem Äther digerieri methylester wird wie folgt angewendet: wobei die Substanz körnig und fest wird. Die Substan

2,3 g Carbobenzyloxy-Phcnylalanyl-Phenyl-alanin- wird im Vakuum über P₁O₅ und KOH getrocknet, i hydrazid (5 mMol) werden in 7 ml Dimethylformamid 65 350 ml Dimethylformamid gelöst, und es werde gelöst und 3 ml 4 N-Salzsäure zugesetzt, gekühlt auf 18,5 ml 1 riäthylamin (0,134MoI) zugesetzt. Nac -10'C und 5,1 ml 1 M-NaNO₂-Lösung unter Ruh- Abkühlung aui -10'C wird das gebildete Triäthy rcn eingetropft und die Mischung wie nach Beispiel 14 amin-HBr abfiltricrt, und unter Rühren wird dan

Analyse C₃SH₄₈N₁₀O_n (Molgewicht 784,85);

berechnet C 53,56, H 6,17, N 17,85%;

erhalten C 54,01, H 6,08, N 17,99 %.

Beispiel 17

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenyialanyl-Phenylalanyl-Valyl-w-Nitroargininmethylester

is

dem Fütrat 48,4 g Carbobenzyloxy-Valin-p-Nitrophenylester (0,13 Mol) zugesetzt. Die Reaktionsmischung läßt man 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, konzentriert sii auf 100 ml und schüttelt sie unter Rühren in 1 1 5°,,ige Natriumbicarbonjtlösung. Die ausfallende Substanz wird abfikrieri. mit Wasser gewaschen und wieder in 75 ml Dimethylformamid gelöst und dann in 1 1 1 N-Salzsäure geschüttet, filtriert und mit Wasser gewaschen. Ausbeute 47,1g mit einem Schmelzpunkt von dl.5 bis 63 C, entsprechend 80,2°,, der Theorie. Umkristallisation aus 60°„igem Methanol erhöhl den Schmelzpunkt des Produktes a_uf 66 bis 67 C, jedoch nach Umkristallisation aus Äthanol mit Zusatz von Wasser wird der Schmelzpunkt auf 218 bis 219 C heraufgesetzt.

Analyse C,,,H₂₁₁NjO₆ (Molgewicht 451,5, Substanz mit Schmelzpunkt 218 bis 219'C):

berechnet C 50.55, If 6,47, N 21,72 ",;.-

erhalten C 50,57. H 6.62, N 21.89 V

Beispiel 20

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Valyl-f)-Nitroarginin-Amid

1,0 g des Produktes nach Beispiel 19 (2.22 mMol) wird in 5 ml trockener Essigsäure gelöst, und unter wasserfreien Bedingungen werden 5 ml 2N-HBr in trockener Essigsäure zugesetzt. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 19. Die erhaltene Dimethylformamidlösung (10 ml) des Valyl-f-Nitroarginin-Amids wird auf — 10^r C gekühlt, und es werden 0,93 g Carbobenzyloxy-Phenylalanin-p-Nitrophen\!ester (2.22 mMol) unter Rühren zugesetzt. Die Reinigung des geschützten Trir-eptidamids erfolgt nach den Richtlinien des Beispiels 19. Ausbeute 1,15 g mit einem Schmelzpunkt von 213 bis 220 C, entsprechend 86.5",'. der Theorie. Zwei Umkristallisationcn aus 80"„igem Äthanol erhöhen den Schmelzpunkt des Produktes auf 218 bis 220° C.

Analyse C_KH._)fiN_KO₇ (Molgewicht 598.68):

berechnet C 56.18, H 6,40, N 18,72°,,;

erhalten C 56.29, H 6,52, N 18,87°,,.

Beispiel 21

Herstellung von Carbobenzyloxy-f)-Nitroarginylfj-Nitroargininmethylester

35,3 g Carbobenzyloxy-r'j-Nitroarginin (0,1 Mol) mit einem Schmelzpunkt von 134,5 bis 136"'C werden in 200 ml Dimeihylformamid/Tetrahydrofuran (1 : 1) gelöst, und unter Rühren werden 13,9 ml Trimelhylamin (0,1 Mol) zugetropft. Nach Abkühlung auf -10"C werden 13,66 g Chlorameisensäureisobutylester (0,1 Mol) in der Zeit von 20 Minuten zugesetzt, wobei die Temperatur in der Lösung sich zwischen —10'C und -5⁰C hält. Der Lösung wird ω-Nitroargininmethylester, in Dimethylformamid gelöst und aus 27,0 g ω-Nitroargininmethylester-HCI (0,1 Mol) mittels 13,9 ml Triäthylamin (0,1 Mol) freigemacht und auf

— 10^cC vorgekühlt, zugesetzt, wobei die Temperatur in der Reaktionsmischung während des lintropfcns

— 8^CC beträgt. Man läßt die Reaktionsmischung langsam Raumtemperatur annehmen, und nach einigen Stunden ist die Reaktion beendet. Triäthylamin-HCI, das während der Reaktion gebildet wurde, wird abfiltriert und das I iliral 7ur Trockne eingedampft.

Der Rückstand wird in 900 ml Butylalkohol/Äthylacetat (2:1) gelöst, mit 1 N-Salzsäure, 5"„iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser geschüttelt, und die Lösungsmittelphase wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Verdunsten des Lösungsmittels wird eine Substanz mit einem Schmelzpunkt von 136 bis 14K C erhalten. Ausbeute 34,6 g (60,8°., der Theorie). Das Produkt wird einige Male aus S0",,igcm Methanol umkristallisiert. wobei sich der Schmelzpunkt auf 147 ίο bis 150 C erhöht.

Analyse CiH₁₁N₁₀O₉ (Molccwiehl 568.57);
berechnet "....".... C 44.36. H 5.67. N 24.64".; erhalten C 44,38. H 5.64, N 24,72",,.

Beispiel 22

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Valin-Methylesier

so 29.9 g Carboben?\loxy-Phen\lalanin (0,1 Mol) werden in 75 ml Dimethylformamid gelöst, auf —10 C gekühlt und darauf 20.6 g Dicyclohexylcarbodiimid. gelöst in 25 ;nl Dimethylformamid, dazugetropft. Valin-Methylester, in 30 ml Dimethylformamid gelöst und durch Zusatz, von 13,85 ml Triäthylamin zu 16,8 g Valin-Methylcster-HCl (0.1 Mol) inDimethylformamid aus seinem Hydrochlorid freigemacht, wird tropfenweise so zugesetzt, daß sich die Temperatur der Reaktionslösung bei - 10 C hält. Die Reaktion ist nach 24 Stunden bei Raumtemperatur vollständig, und nach Abkühlung wird das gebildete Dicyclohcxylcarbamid abfiltriert. Das Filtrat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Atlnlacclat gelöst und wie gewöhnlich geschüttelt. Nach Verdunsten des

Äthylacetats wird der Rückstand in 80",JgCm Methanol gelöst, wobei 33.5 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 113 bis 115 C auskrislallisieren. Ausbeute 33,5 g (81,2",, der Theorie).

Analyse C„H.._VN₂O_S (Molgewicht 412.49);

berechnet C 66.97, H 6.S4. \ 6,79°,,:

erhalten C 67.09. H 6.85. N 6,91",,.

Beispiel 23

Herstellung von Carbobcnzyloxy-Phcnylalanyl-Valinhydrazid

8.25 g des nach Beispiel 23 gewonnenen Produktes (2OmMoI) werden in 150 ml Methanol gelöst und 3.94g Hydrazinlndral (8OmMoI) zugesetzt. Is wird 48 Stunden lang unter Rühren am Rückfluß gekocht. konzentriert, und nach Zusatz von etwas Wasser kristallisiert ein Produkt aus, das aus Methanol/ Wasser umkristallisiert wird. Ausbeute 7,35 g mit einem Schmelzpunkt von 210 bis 211.5'C, entsprechend 89 "„ der Theorie

Analyse C₂,H₂.N₄O₄ (Molccwicht 412.5):

berechnet ." C 64.06. 1! 6.84. N 13.58 "^

erhalten C 64,64, 116.5S, N 13.63",;

Beispie

Herstellung von Ca 1 ho)

PhcriN lalanin-M

24

m-Phenyl.ihn vlv lcster

16.2 g Pheinlalanin-Methylestcr-IICI (75 mMol) mi einem Schmelzpunkt \on 15S.5 bis 1 59 C werden ii Dimcilnlfnrniamid gelost, auf 0 C abgekühlt um

04

10,5 ml Triäthylamin (75 mMol) zugesetzt. Gebildetes Triäthylamin-HCl wird übfiltriert, und das Filtrat auf — 10 C gekühlt, worauf 31,5 g Carbobenzyloxy-Phenylilanin-p-Nitrophenylester (75 mMol) zugegeben werden. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung wieder auf —10 C abgekühlt, und es werden 3,5 ml Triäthylamin (25 mMol) zugesetzt, worauf man die Lösung nochmals 24 Stunden stehenläßt. Darauf wird im Vakuum zur Trockne eingedunstet, der Rückstand in Äthylacetat gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösurig, Wasser, 3°_oiger Salzsäure und Wasser gewaschen. Die Äihylacelatlösung wird über Magensiumsulfat getrocknet, auf kleineres Volumen konzentriert. Nach Zusatz von Petroläther kristallisiert das Produkt als Nadeln aus, das 2mal aus Äthylacetat/Petroläther umkristallisiert wird. Ausbeute 27,85 g mit Schmelzpunkt von 148,5 bis 149" C, entsprechend 80,7% der Theorie.

Analyse C,₇H,_SN.,O, (Molgewicht 460,54);

berechnet C 70^42, H 6,13, N 6,08%;

erhalten C 70,69, H 6,15, N 6,12%.

Beispiel 25

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Phenylalaninhj drazid

23,0 g des nach Beispiel 25 gewonnenen Produktes (50 niMol) werden in 500 ml trockenem Methanol gelöst. 7,5 g Hydrazinhydrat (0,15 Mol) zugesetzt, und iie Mischung wird 4 Stunden am Rückfluß gekocht, H'orauf man sie bei Raumtemperatur über Nacht ttehenläßt. Die gebildete Ausfällung von 18,1 g mit *inem Schmelzpunkt von 198 bis 2OO,5^CC wird abgetaugt und das Fillrat auf etwa 100 ml eingedunstet. Nach Zusatz von etwas Wasser kristallisieren 4,15 g Substanz mit einem Schmelzpunkt von 196,5 bis J97,5^; C aus. Beide Fraktionen werden aus Methanol limkristallisiert, wobei sich der Schmelzpunkt auf 201 bis 203,5 C erhöht. Ausbeule 19,5 g (84,8% der Theorie).

Analyse C₆H.,_SN₄O₄ (Molgewicht 460,54);

berechnet C 67,81, H 6,13, N 12,17°_O;

erhalten C 67,57, H 6,08, N 12,37%.

Beispiel 26

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phcnylalanyl-Glycin-Äthyläther

2,8 g Glycin-Äthylester-HCl (20 mMol) werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst und 2,05 g Triäthylamin zugegeben. Die Mischung wird auf OC gekühlt und gebildetes Triäthylamin-HCl abfiltriert. Dem Filtrat wird eine Mischung aus 6,0 g Carbobenzyioxy-Phcnylalanin (20 mMol) und 4,2 g Dicyclohexylcarbodiimid (20 mMol) in 20 ml Dimethylformamid bei - 10 C zugesetzt. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wird die Mischung auf OC abgekühlt und gekildetes Dicyclohexylcarbaniid abliltricrt. Das t iltrai *>ird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Athylacclul gelöst und wie üblich mit 4%iger SaIztäure, 5"_uigcr Natriumbicarbonatlösung untl Wasser geschüttelt. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat Und Konzentrierung kristallisiert das Produkt bei Zusatz von Petroläther aus. Ausbeute 6,45 g mit einem Schmelzpunkt von 109 bis 111,5'C, entsprechend t!3,9% der Theorie. Der Schmelzpunkt wird durch Umkristallisation aus Äthylacetai-Petroiiither auf H2 bis 112,5 ⁼ C erhöht.

Analyse C₁H₄₁N-O₃ (Molgewicht 384,44):

berechnet "...". C 65,64, H 6,29, N 7,29%;

emahen C 65,35, H 6,35, N 7,40- .

Beispiel 27

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Glycyl-Glycin-Äthylester

1,97 2 Glycyl-Glycin-Äthyiester-HCl (10 mMol) mit einem Schmelzpunkt von 182 bis 184 C werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst, 1,4 ml Triäthylamin (10 mMol) zugesetzt und gebildetes Triäthylamin-KCI abfiltriert. Dem Filtrat werden 4,2 g (10 mMol) Carbobenzyloxy-Phenylalanin-p-Nitrophenylesier zugegeben. Es wird wie in früheren Beispielen (13) beschrieben aufeearbeitet. Das Produkt wird aus Dimethylformamrd/Wasser umkristallisiert. Ausbeute 3,85 g mit Schmelzpunkt 93 bis 95C, was 87,2 % der Theorie entspricht.

Analyse C₃H_nN₁O₆ (Molgewicht 441,49); berechnet" C 62,57, H 6,16, N 9,52"..;

erhalten C 62,20, H 6,05, N 9,72 V

Beispiel 28

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Glycinhydrazid

6,35 g des nach Beispiel 27 gewonnenen Produktes (16,5 mMol) werden in 50 ml Methanol gelöst und 3,2 g Hydrazinhydrat (64 mMol) zugesetzt. Nach

24stündi2em Rühren bei Raumtemperatur wird die Lösung zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in etwas warmem Methanol gelöst, worauf das Produkt auskristallisiert. Ausbeute 4,95 g mit einem Schmelzpunkt von 151,5 bis 152,5⁰C, entsprechend 81,0% der Theorie.

Analyse C₁₈Hj₂N₄O₁ (Molgewicht 370,42):

berechnet C 61,61, H 5,99, N 15,13^C _O;

erhalten C 61,80, H 5,87, N 15,22";.

45

Beispiel 29

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanylglycyl-Glycinhydrazid

2,1 g des nach Beispiel 28 gewonnenen Produktes (4.75 mMol) werden in 25 ml Methanol gelöst und 0,9 g Hydrazinhydrat (18 mMol) zugesetzt. Nach 48 stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird die gebildete Ausfällung abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Das Produkt wird aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute 1,75 g mit einem Schmelzpunkt von 190 bis 191C, entsprechend 86,6% der Theorie.

Analyse C₂₁H₀₅N₅O₅ (Molgewicht 427,47);

berechnet C 59,01. H 5,90, N 16.38%;

erhalten C 59,49, H 5,95, N J6,50%.

Beispiel 30

Herstellung von Carbobcnzyloxy-Valylc)-Nitroarginin-lsopropylester

2,5 g n-Nitroarginin-Isopropylester-Hydrochlorid (8,4 mMol) werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst.

Nach Kühlung werden 1,2 ml Triäthylamin zugegeben, und das ausfallende Triäthylaminhydrochlorid wird' durch Abnltrierung entfernt. Das Filtrat wird auf -1O⁰C gekühlt und 3,2 g Carbobenzyloxy-Valinp-Nitrophenylester (8,4 mMol) werden unter Rühren tugesetzt. Nach 2stündigem Rühren bei —10^JC läßt man die Substanz Raumtemperatur annehmen und bei dieser Temperatur einen Tag lang reagieren. Die Reaktionsmischung wird wieder auf —10° C abgekühlt, worauf weitere 1,2 ml Triäthylamin zugesetzt werden. Nach einigen Stunden ist die Reaktion praktisch beendet. Dimethylformamid wird im Vakuum bei 30 bis 40" C abgedampft und der Rückstand in etwa 500 ml mit Wasser gesättigtem Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird wie üblich mit 5 % iger, wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1 N-wäßriger Chlorwasserstoffsäure und Wasser extrahiert. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Jieißem Äthylacetat gelöst, und nach Zusatz von trock- ao »em Isopropyläther kristallisiert die Substanz aus, wenn sie in einer Kühlkammer stehengelassen wird. pie 3,65 g Ausbeute haben einen Schmelzpunkt von 162 bis 166^ C, das sind 88% der Theorie. Nach einer weiteren Umkristallisation aus Äthylacetat/Isopropyl- as Ither erhöht sich der Schmelzpunkt auf 165 bis 168°C. Beim Umkristallisieren aus Methanol/Äthylacetat weist die Substanz einen Schmelzpunkt von 115 bis 116° C auf. Die Substanz ist einheitlich bei Dünnschichtchromatographie auf Silikagel in drei verschiedenen Lösungssystemen und hat eine optische Drehung von [λ]? = -24,6^C (C = 1. Methanol).

Analyse C₂₂H₃₄N₈O₇ (Molgewicht 494,56);

berechnet C 53,43, H 6,93, N 16,99%;

erhalten C 53,20, H 6,99, N 17,11 %.

Beispiel 31

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-

Valyl-w-Nitroarginin-Isopropylester

2,0 g Carbobenzyloxy-Valyl-w-Nitroarginin-lsopropylester (4,05 mMol) werden in 10 ml trocknem Eisessig gelöst, dann 5 ml 4 N-Bromwasserstoff in Eisessig zugesetzt und die Mischung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt, wobei die Reaktion vor Feuchtigkeit aus der Luft geschützt wird. Während der Reaktionszeit kristallisiert eine Menge von Tripeptidfster-Hydrobromid aus, und _zwar vollständig nach Zusatz von 2,50 ml trocknem Äther. Die Ätherphase wird dekantiert und der Niederschlag 3- bis 4mal weiterhin mit trocknem Äther behandelt. Der Niederschlag wird im Vakuum über Kaliumhydroxyd und P₂O₅ getrocknet und ist stark hygroskopisch. Das gewonnene Tripeptidester-Hydrobromid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst und auf 0^cC gekühlt und mit 1 ml Triäthylamin (7,3 mMol) versetzt. Das angefallene Triäthylaminhydrobromid wird abfiltriert und dem Filtrat 1,7 g Carbobenzyloxy-Phenyl-Alaninp-Nitrophenylester (4 mMol) zugesetzt. Nachdem ßo einige Stunden bei — 10^cC stehengelassen wurde, läßt man die Temperatur in der Reakticnslösung auf 20 C ansteigen. Die Reaktiosnlösung wird dann auf 10 C abgekühlt, worauf ein weiteres Mal 1 ml Triäthylamin zugesetzt wird und man die Reaktionsmischung über Nacht stehenläßt. Die Lösung wird im Vakjum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in einer Mischung von Äthylacetat/n-Butanol (2: 1) gelöst.

Die organische Phase wird wie gewöhnlich mit 5 %iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, lnormaler wäßriger Chlorwasserstoffsäure und Wasser extrahiert und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand in heißer Methanol-Äthylacetat-Mischung (1:1) gelöst, worauf die Lösung einen Tag lang in der Kühlkammer verbleibt. Es werden 1,93 g einer auskristallisierten Substanz mit einem Schmelzpunkt von 175 bis 177°C gewonnen. Eine Umkristallisierung erhöht den Schmelzpunkt auf 178 bis 179⁰C. Die Ausbeute beträgt 1,7 g, was 68% der Theorie entspricht. Die Substanz ist einheitlich in der Dünnschichtchromatographie auf Silikagel und hat eine optische Drehung von [χ}Ζ = 25,7° (C = 1, Methanol).

Analyse C₃₁H₁-N₇O₈ (Molgewicht 641,74);
berechnet ....*.... C 58,01, H 6,75, N 15,28%; erhalten C 58,32, H 6,92, N 15,19%.

Beispiel 32

Herstellung von Carbobenzyloxy-Valylw-Nitroarginyl-w-Nitroarginin-Methylester

5,7 g Carbobenzyloxy-cu-Nitroarginyl-io-Nitroarginin-Methylester (10 mMol) und 30 ml trockner Eisessig werden in einen vor Luftfeuchtigkeit geschützten Kolben eingebracht, worauf 10 ml 4 N-Bromwasserstoff in trocknem Eisessig schnell zugesetzt werden. Nach Istündigem Rühren bei Raumtemperatur ist die Carbobenzyloxylierung vollständig, und es hat sich eine plastische Substanz gebildet. Die Reaktionsmischung wird unter kräftigem Rühren in 700 ml trocknem Äther eingegossen, wodurch sich eine plastische harte Masse bildet, die auf der Oberfläche teilweise kristallin ist. Die Ätherphase wird abdekantiert und der Rückstand mit trocknem Äther digeriert, der dann wieder abdekantiert wird. Das Verfahren wird solange wiederholt, bis das Produkt kristallin geworden ist, worauf das Produkt über P₂O₅ und Kaliurahydroxyd im Vakuum getrocknet wird. Die Ausbeute an Dipeptidester-Hydrobromid beträgt 6,5 g, und die Bestimmung des Bromgehaltes zeigt, daß die Substanz 2,3 Äquivalente Bromwasserstoff enthält. Die Substanz wird in 40 ml Dimethylformamid gelöst, auf O⁰C abgekühlt und mit 3,5 ml Triäthylamin (25 mMol) versetzt. Das resultierende Triäthylaminhydrobromid wird abnitriert, und 3,75 g Carbobcnzyloxy-Valinp-Nitrophenylester werden dem Filtrat zugesetzt, worauf man die Reaktionsmischung langsam übei Nacht Raumtemperatur annehmen läßt. Weitere 1,4 m Triäthylamin (10 mMol) werden der Mischung nach Abkühlung auf —10⁰C zugesetzt, worauf man siel· die Reaktion über Nacht fortsetzen läßt. Die Lösunj wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand mi Äther, einer kleinen Menge Äthylacetat, einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, einer 10%igei wäßrigen Zitronensäurelösung und Wasser behandel und in heißem Methanol gelöst. Auf anschließendei Zusatz von Äthylacetat werden 5,1 g eines gelbei kristallinen Produktes gewonnen. Zwei Umkristalli sa'.ionen aus Methanul/Äthylacetat (1:1) ergeben end lieh ein Produkt mit einem Schmelzpunkt von 119 bi 122 C und einer optischen Drehung von [α]" = -12,3° (C --= 1, Dimethylformamid).

Die Dünnschichtchromatographie auf Silikagel de Produktes ergab in drei verschiedenen Lösungs systemen nur eine gefärbte Zone, was anzeigt, dai

die Substanz einheitlich ist. Ausbeute 4,35 g (65,2 % der Theorie).

Analyse CmH₄₁N₁₁O₁₀ (Molgewicht 643,68);

berechnet C 44,78 H 6,42, N 23,94%:

erhalten C 44,52, H 6,38, N 24,11%.

Beispiel 33

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phecylalanyl-Valyl-w-Nitroarginyl-tu-Nitroarginin-Methylester

1,30 g Carbobenzyloxy-Valyl-oj-Nitroarginyl-i'j-Nitroarginin-Methylester werden wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben deearbobenzyloxyliert. Beim anschließenden Aufarbeiten werden 1,55 g eines stark hygroskopischen Tripeptidester-Hydrobromids gewonnen, das auf Grund einer Bestimmung des Bromgehalts 2,4 Äquivalente an Bromwasserstoff enthält. Das Tripeptidester-Hydrobromid wird in 15 ml Dimethylformamid gelöst, auf —10"C gekühlt und 0,67 ml Triäthylamin (4,8 mMol) zugesetzt. Das entstandene Triäthylaminhydrobromid wird durch Filtern entfernt, und 0,84 g Carbobenzyloxy-Phenylalaninp-Nitrophenylester (2 mMol) werden dem Filtrat zugesetzt, worauf man die Reaktionslösung über Nacht Raumtemperatur annehmen läßt. 0,28 ml Triäthylamin werden der Lösung zugesetzt, die mehrere Stunden lang weitergerührt wird. Die Reaktionsmischung wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äther behandelt, der eine kleine Menge Äthylacetat enthält, und darauf mit wäßriger, 5%iger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung und Wasser.

Der Rückstand wird getrocknet und dann in MethanoI/Dimethylformamid (4: 1) gelöst, mit Aktivkohle behandelt und die klarfiltrierte Lösung über Nacht in die Kühlkar jner eingesetzt, wodurch 1,48 g eines Produktes gewonnen werden, das einen Schmelzpunkt von 234 bis 240°C aufweist. Durch weitere Umkristaliisation der Substanz erhöht sich der Schmelzpunkt auf 239 bis 241°C. Die Ausbeute von chromätographisch einheitlicher Substanz beträgt 1,15 g mit einer optischen Drehung von [α]? = —9,6° (C = 0,5 Dimethylformamid), was 70,6 % der Theorie entspricht.

Analyse CjJHs₀N₁₁O_n (Molgewicht 814,88);

beredinet C 51,59, H 6,19. N 20,62%;

erhalten C 51,81, H 6,09, N 20,95%.

Beispiel 34

Herstellung von Carbobenzyloxy-Phenylalanyl-Valyl-w-Nitroarginyl-w-Nitroarginin-Methylester

408 mg Carbobenzyloxy-PhenylalanyJ-Valyl-w-Nitroarginyl-cü-Nitroarginin-Methylester (0,5 mMol) werden decarbobenzyloxyliert, wie es in den vorherigen Beispielen beschrieben ist. 538 mg des anfallenden Tetrapeptidester-Hydrobromids, das 2,4 chemische Äquivalente des Bromwasserstoffs enthält, werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, auf —10°C gekühlt und mit 0,17 ml Triäthylamin versetzt, worauf das anfallende Triäthylaminhydrobromid durch Filtrierung entfernt wird. 0,21 g Carbobenzyloxy-Phenylalaninp-Nitrophenylester (0,5 mMol) werden dem Filtrat zugesetzt. Die Reaktionsfolge ist die gleiche, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Äther, einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, Wasser, einer 10%igen wäßrigen Zitronensäurelösung und Wasser digeriert. Das so behandelte Produkt wird in heißem Methanol gelöst, und die Lösung ergibt, nachdem sie einen Tag in der Kühlkammer stehengelassen wurde, 4,18 mg eines Produktes mit einem Schmelzpunkt von 230 bis 238'C Anschließend wird die Substanz zusätzlich zweimal aus Methanol umkristallisiert, was eine chromatographischeinheitlicheSubstanzmit einem Schmelzpunkt von 236 bis 240⁰C und einer optischen Drehung

ίο von [*]% = -20,0° (C = 3,8, Dimethylformamid) ergibt. Die Ausbeute beträgi 338 mg, was 703% der Theorie entspricht.

Analyse C₄₄H₅₁₁N₁₃O₁₂ (Molgewicht 962,06);
berechnet C 54,93, H 6,18, N 18,93%:

>5 erhalten C 54,62, H 6,25, N 19,10%.

Die endständigen «-Aminogruppen sowie die übrigen durchCarbobenzyloxygruppen geschützten Aminogruppen der Peptide werden von diesen Schutzgruppen

ίο durch Weghydrierung der Carbobenzyloxygruppe in Form von Toluol und Kohlensäure freigemacht. Die Nitrogruppe im Arginin wird gleichzeitig als Ammoniak wegreduziert, und zwar mit Hilfe von Wasserstoff als Reduktionsmittel und Palladium auf Kohlenstoff

as als Katalysator. Nachdem sämtliche Reduktionen auf gleiche Weise ausgeführt werden, mit Ausnahme \on kleineren Variationen, die in einer Tabelle angeführt sind, folgt hier nur eine allgemeine Beschreibung der Versuche (experimentelle Einzelheiten siehe Tabelle 2) Der geschützte Peptidester wird in einem Alkohol — Methanol oder Äthanol — gelöst und die erforderliche Anzahl an Äquivalenten der salzbildenden Säure in Form einer Wasser- oder Alkohollösung zugesetzt. Der mit Wasser angefeuchtete Katalysator (10% PaI-ladium auf Kohlenstoff) wird in einer Menge zugesetzt, die 100 mg pro Millimol Peptid entspricht. Die Katalysatormenge wird etwas erhöht, sobald die Länge des Peptids zunimmt. Sobald der Katalysator von den Wandungen des Reaktionsgefäßes abgespült ist. wird alle Luft mit Stickstoff aus dem Reaktionsapparat verdrängt. Der Stickstoff wird seinerseits mit Wasserstoff ausgetrieben. Das Reduktionssystem wird geschlossen, und über ein Meßgefäß als Wasserstoffreservoir wird der Wasserstoff für die Reduktion eingeleitet. Die Reaktion beginnt unter starkem Umrühren im Reduktionsgeiäß, und das gebildete Kohlendioxyd wird unter Rühren in einem an das Reaktionsgefäß angeschlossenen Kolben absorbiert, der 50%ige Kalilau·*- enthält. Mit Hilfe einer an das Wasserstoff-

so reservoir angeschlossenen Niveauflasche, die Wasser als Sperrflüssigkeit enthält, wird der Wasserstoffverbrauch für die vollständige Reaktion abgelesen (korrigiert auf Normaldruck und Normaltemperatur sowie reduziert mit dem Partialdruck des Wassers bei der betreffenden Temperatur). Die Reaktionszeit variiert in Abhängigkeit von der Länge der Peptide und Anwesenheit von Nitrogruppen im Arginin zwischen 2 und 12 Stunden. Sobald die Reaktion beendet ist, wird Stickstoff durch das Reaktionsgefäß geleitet, um den Wasserstoff zu verdrängen. Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingedampft, und der Rückstand einige Male mit irocknem Äther digeriert, worauf das Produkt fest und körnig wird. Sämtliche Peptidester sind als Hydrochloride sehr hygroskopisch und müssen daher in einer Trockenkammer verarbeitet und isoliert werden sowie kühl und unter wasserfreien Bedingungen aufbewahrt werden.

23

Tabelle 2

Peptiddetivat
zur Reduktion
des Beispiels

Menge l'eptidderivat Gewicht in M öl

HCL ■

H — Art-(NO₂) — OMc

1
11
12
13
14
15
16
17
18
20

5.39 g

4,66 g 253 mg 515,6 mg

5.0 g 826 mg 773 mg 450 mg 352 mg 1 374 mg 675 mg

20

10

0.227 1

8,15 1,23 1.06 0,57 0,46 1.89 1.13

Meniie

10",.'

PO₁C

75 mg 100mg

150 mg 125 mg 100mg

50 mg 200 mg 100 mg

24

WassersloffeiMiieniic in ml Berechn. Veihi.

1793

1120

25.5
112
913
138
119

64

52
212
126

1 5S0

1025

22.5 112 8S0 135 112

200 141

Rcdiiktionszeit in Stunden

Pcptiddcrivat Ausbeute an reduziertem Chloridgehalt des Aminosaurcanalyse

zur Reduktion Peptidester - NH₁CI Produktes

des Beispiels _C;_ewii:hl Prozent Bcrcchn. F.rlialten

HCL- H — Are (NO2)- OMe	5,3 g	87,6	31.15	33.90	Va! : Arg : NH, 0.99 : 1.0~l : 0.92	Arg : NH3 0,96 : 0,72 :
1	3.25 g	78.6	25.02	24,12	Phe : Leu : AIa : GIu : GIy : Va! : Are 0.95 : 1.03 : 1.09 : 1.04 : 3.00 : 1.03 : 0.9(	NH1 0,73
11	195 mg	80,9	10.04	9.76	Phe : Arg : NH, 1.00 : 1,00 : 0,85	Arg : NH1 0,97 : 0,76
12	375 mg	81.2	23.03	21.92	Phe : VaI : Arg : NH, 1.01 : 1.02 : 0.97 : 0.83	NH1 1,94
13	4,45 g	97.4	18.96	17.90	Phe : GIv : VaI : Arg : NH3 1.02 : 1.00 : 1.02 : 0.96 : 0.97
14	695 mg	91.3	17.21	17.05	Phe : GIy : VaI : Arg : NH, 1,02 : 2.03 : 0.98 : 0.97 : 0.84
15	650 mg	90.7	15.76	14.98	Phe : Uly : VaI 1,00 : 2,98 : 0.98
16	390 mg	92,9	14,53	14.13	Phe : VaI : Arg 2,01 : 1,02 : 0.97
17	283 mg	86,4	15,02	14,27	Phe : Leu : VaI 1,01 : 0,99 : 1.02
18	1050 mg	82,4	15,78	14,54	Phe : VaI : Arg 1,00 : 1,02 : 0,97
20	515 mg	83.7	19,49	18,64

Die Antithromboplastinwirkung für einige der In Tabelle 3 geben die Werte in Kolonne 3

interessantesten Verbindungen ist in Tabelle 3 angc- 35 50 "„ige Hemmung der Thromboplnstinakmitäi

geben, und zwar berechnet als eine Wirkung, die einer Millimol Peptid an. und /war ausgedrückt in

bestimmten Menge von Trypsinhcmmcr von der sprechender Menge Trypsinhcmmcr (mg). O>>

Lunge in standardisierter Form entspricht. den Tabcllcnformeln bedeutet eine Methylesterci

/H

Tabelle 3

Peptide

Anzahl Relative Amino- Weinsäure mung

Phe --VaI -Arg -OMe 3 0.18

Phe GIy - Val — Arg OMe 4 0,10

Phe —Phe —Val —Arg -OMe 4 0.19

Phe — Leu — Val — Arg — OMe 4 0,11

Phe —(GIy),-Val —Arg—OMe 5 0,076

Phe—(Clv);,—Val —Arg —OMe 6 0,15 Phe—Leu—Ala —GIu-(GIy)₃

Val —Arg—OMe 9 0,39

Die gefäßaktive bradychininähnliche Wirkung von zwei der wirksamsten Peptide nach der Erfindung wurde als prozentuale Steigerung der Durchblutung in der a. femoralia bei intraarterieller Injektion bei Hunden mit einer Lösung in einer Konzentration von 1 mg Peptid/ml und einer Injektionsgeschwindigkeit zwischen 1 bis 3 ml/min gemessen

Tabelle 4

Peptid

entsprechenden Aktivität von Heparin, eines handelsüblichen Amikoapulationsmittels. verglichen.

Verschiedene Mengen des Heparins bzw. des Peptides wurden mit Thrombin 30 Sekunden lang inkubierl. Danach wurde die zurückgebliebene Thrombin-Aktivität auf Fibrinogen als Substrat getestet. Die Zeit bis zur Polymerisation des Fibrins — die letzten Stufen der blutgerinnung bestehen aus der Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin und einer nachfolgenden Polymerisation des Fibrins — wurde gemessen und mit einer Blindprobe verglichen.

Puffer:
Destilliertes
Wasser:
Heparin:

Reagenzien
Tris-Puffer, 0,15 M, pH 7,35

Menge Peptid per ml Blut

Durchflußsteigerung in %

Phe - VaI — Arg — OMe	0.017	130
	0,031	270
	0,033	260
	0,05	480
	0,1	520
Phe —Leu —Ala —GIu
(GIy)3- Val — Arg—OMe	0,033	140
	0.05	360
	0.1	310

35

Die An'ikoagulationsaktivität des Polypeptides H — Phe — Vaf— Arg — OMe · HCI wurde mit der Vitrum-Heparin 5000 1UmI, verdünnt mit Wasser

Peptid: H — Phe — VaI — Arg — OMe ■ HCl Thrombin: Rinder-Thrombin 340 IU;mg, gelöst
auf 100 IU/ml physiologischer Kochsalzlösung, weiterverdünnt in Tris-Puffer 1/15
Fibrinogen: 0,4^, in Tris-Puffer, pH 7.2

Versuchsdurchführung

0,5 ml Thrombinlösung (Verdünnung 1/15; 37"C] wurden 30 Sekunden lang mit 0,5 ml HeparinlösunE (verschiedene Verdünnungsgrade: 37⁰C) oder mit 0,5 ml Peptidlösung (verschiedene Verdünnungsgrade: 37^:C) oder mit 0,5 ml destilliertem Wasser (37⁰C; inkubiert.

0,2 ml jeder Inkubationszubereitung wurden zi 0.2 ml auf 37°C erwärmten Fibrinogens gegeben. Dit Zeit bis zur Polymerisation des Fibrins wurde bestimmt. Der Anstieg der Koagulationszeit (.1/) wurd< gegen die Peptid-Konzentrationen (mg/m!) bzw. di( Heparin-Konzentration (IU/ml) aufgetragen. Die Er gebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 wiedergegeben

Tabelle 5	Phe — VaI	— Arg —	OMe ·	HCl	1,0 46,5	2,0 69	3,0 72	10,0 12,5
	0,028 5,5	0.125 16	0,25 19,5	0.5 34
mg/ml Anstieg der Koagulations zeit (see)	Heparin				0,5 17,5	1,0 17,5	5,0 17,5
	0,02 5,0	0,1 10,0	0,2 15,0	0,3 16,5
IU/ml Anstieg der Koagulations zeit (see)

Wie aus der Tabelle 5 ersichtlich, zeigt Heparin in kleinen Konzentrationen eine gute Wirkung in bezug euf die Koagulationszeit. Bei höheren Konzentrationen wird die Koagulationszeit jedoch nicht mit Steigenden Konzentrationen verlängert, sondern man erhält einen konstanten Wert, welcher bei noch höhe ren Konzentrationen sogar wieder abfällt. Dies wir durch die Tatsache erklärt, daß für Heparin die An Wesenheit seines Coftktors erforderlich ist, wenn ein Antikoagulationswirkung erzielt werden soll. Diese

λίν

8 04 022

Cofaktor ist somit für den bei einer Heparin-Behandlung erzielbaren maximalen Kffekt entscheidend.

Patienten, die infolge einer längeren Heparin-Therapie oder aus anderen Gründen einen zu niedrigen Spiegel des Heparin-Cofaktors aufweisen, sprechen daher auf die Heparin-Behandlung schlecht an.

Andererseits wird bei dem getesteten Peptid eine günstige therapeutische Reaktion bei vorgegebener Dosis über den gesamten gemessenen Bereich erzielt. Die Behandlung mit dem getesteten Peptid ist daher vorzuziehen, insbesondere beim Vorliegen eines Cofaktor-Mangels.

Claims (1)

1 2 lare Schwefelbrücken in unlösbare Koagulate verPatentansprüche: wandelt werden. Die einleitende Bildung von Thromboplastin wird

1. Phenylalanin und Arginin in termialen Posi- in den Blutgefäßen an Stellen aktiviert, an denen eine tionen aufweisende Polypeptide der Formeln 5 Verletzung vorliegt.

Dieses Thromboplastin, welches »intrinsic« Throm-

Phe — VaI — Arg—OMe boplastin oder Plasmathromboplastin genannt wird,

Phe — GIy — VaI — Arg — OMe kann jedoch durch ein aktives Produkt ersetzt werden,

pj,_e Qiy QJy y_ai A_rg OMe welches »extrinsic« Thromboplastin genannt wird und

p_he_GIy_GIy_GIy_VaI-Arg-OMe ^{10 das u} _K ^nter ?°^wirkunf ^{dneS FaktOrS in den Gefäß}-

. _v , geweben gebildet wird.

""^e ™"^e ^aI ^rg OMe Q_er g_an2e Koagulationsvorgang ist eine Serie von

Phe — Leu — VaI — Arg — OMe enzymatischen Reaktionen, bei denen verschiedene

Phe — VaI — Arg — NH₂ oder Faktoren einander sukzessiv aktivieren.

Phe — Leu — AIa — Glu"(y-OMe) — GIy — ¹S ^{Es sind} mehrere Substanzgruppen mit einer ver-

zögernden Wirkung auf die Blutkoagulation bekannt.

— GIy — GIy — VaI — Arg — OMe. D^₆ Substanzen können ihre Wirkung auf verschiedene Vorgänge in dem komplizierten Koagulations-

2. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide prozeß ausüben, und zwar von einer Beeinflussung der nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ₂₀ Blutgefäße bis zu starker Fibrinolyse. Die Beeinflusman sie in an sich bekannter Weise aus den _{sung des} Koagulationsmechanismus kann somit eine Am.nosäuren VaI, Arg, Phe, GIy, Leu, AIa und Gefäßwirkung, eine Antithrombinwirkung, eine fibri-GIu aufbaut. nolytische Wirkung oder eine Antithromboplastin-

wirkung sein. Bei der Antikoagulationstherapie, z. B.

25 im Zusammenhang mit chirurgischen Eingriffen, gilt

es, in einem so früh wie möglichen Stadium Mittel einzusetzen, die den Koagulationsprozeß verhindern,

Die Ernndung betrifft Phenylalanin und Arginin in _wenn pathologische Veränderungen zur Vermutung termialen Positionen aufweisende Polypeptide der eines hohen Gefahrenmomentes für Thrombosebildung Formeln ₃₀ ^_nj_aß gegeben haben. Ein solches Gefahrenmoment

p, _yi δ OM liegt oft auch bei jüngeren Patienten nach einem chirur-

_n,^C" " .*^S. . ^e _.. glichen Eingriff vor.

Phe — GIy — VaI — Arg — OMe Substanzen, die das Koagulationssystem beein-

Phe — GIy — GIy — VaI — Arg -- OMe flüssen, sind z. B. Heparin, Cumarinderivate, Strepto-

Phe — GIy — GIy — GIy — VaI — Arg — OMe 35 chinase, Proteinaseinhibitoren usw., und diese Sub-

Ph_e phe VaI Arg OMe stanzen wurden bisher bei der Antikoagulations-

p, _T via n\yf therapie benutzt. Bei der Anwendung dieser Substan-

1 ne ueu vai arg uMe _{zen lfeten abej}. _gewjsse Schwierigkeiten auf, insbeson-

Phe VaI Arg NH₂ oder ^_£Γε j_{st es e}j_{n mc}h_t unwesentliches Problem, die

Phe — Leu — AIa — GIu (y-OMe) — GIy ₄₀ individuell geeignete Dosis festzustellen. Verbesserte

GIy — GIv —VaI — Are OMe Medikamente wurden die Therapiesituation verbessern.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun neue Sub-

sowie Verfahren zu ihrer Herstellung. stanzen, die in erster Linie eine antithromboplastische

Die Polypeptide der Erfindung weisen interessante Wirkung zeigen und damit die Thrombinbildung sowie pharmakologische Eigenschaften, insbesondere blut- 45 die Antithrombinwirkung beeinflussen, so daß sie die koagulationshemmendc Wirkungen, auf. Überführung des Fibrinogens in Fibrin hemmen.

D e Koagulation des Blutes ist bekanntlich ein Außerdem haben gewisse erfindungsgemäß hergestellte komplizierter Vorgang. Schematisch kann gemäß all- Polypeptide andere interessante Wirkungen gezeigt, gemein anerkannten Hypothesen der normale Koagu- z. B. beeinflussen einige von ihnen stark die Blutlationsvorgang in drei Phasen unterteilt werden, näm- 50 gefäße, was bei der Behandlung von verschiedenen lieh eine erste Phase, bei der durch Zusammenwirkung Kreislaufstörungen von großem Interesse ist.
zwischen gewissen Faktoren im Blut Thromboplastin Die Polypeptide gemäß der Erfindung weisen eine

gebildet wird, eine zweite Phase, während der das Kette von Aminosäuren auf, die mit dem Peptid A Prothrombin des Blutes unter enzymatischer Mit- des Menschen in naher Übereinstimmung steht. Die wirkung eines Faktors, der vom Thromboplastin 55 betreffenden natürlichen Fibnnopeplide bestehen aus aktiviert worden ist, in Thrombin umgewandelt wird, 14 bis 16 Aminosäuren, doch hat es sich erfindungsgesowie eine dritte Phase, bei der das Thrombin, welches maß gezeigt, daß gute Wirkungen bereits bei Anwen- ein protheolytisclies F.nzym ist, das Fibrinogen in dung von Polypeptiden erzielt werden können, die au: Fibrin umwandelt, welches ein festes Koa»ulat bildet. 3 bis 9 Aminosäuren aufgebaut sind, obwohl Polypepti Diese umwandlung von Fibrinogen in Fibrin dürfte 60 de mit längeren Ketten im Rahmender Erfindung liegen to vor sieh gehen, daß das Fibrinogen durch Beein- Eine maximale anlithromboplastische Wirkung wire fliissung des Thrombins ein Paar Polypeptide mit bei gleicher Helix in den Polypeptidkettcn erhalten kurzen Ketten abspaltet, welche Peptid Λ und Pep- d. Iv. wenn die Anzahl Aminosäuren ein Vielfaches vor tid B genannt werden. 3 ist. Speziell zwei Aminosäuren, nämlich Phenyl

Durch Aggregation über die aktiven Abspalumgs- 65 alanin und Arginin, haben sich für die Erhallung eine enden weiden die i ibi inmoleküic in lange faser- guten anüihromboplastischen Wirkung als wesentlicl ähnliche Komplexe in Form \on weichen Aggregaten erwiesen, wenn siel", diese Aminosäuren in Endposi welche darauf durch zwischenmoleku- tionci" befinden.