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DE1792019A1 - Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV

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DE1792019A1
DE1792019A1 DE19681792019 DE1792019A DE1792019A1 DE 1792019 A1 DE1792019 A1 DE 1792019A1 DE 19681792019 DE19681792019 DE 19681792019 DE 1792019 A DE1792019 A DE 1792019A DE 1792019 A1 DE1792019 A1 DE 1792019A1
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streptomyces
fermentation
agar
brown
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Giancarlo Lancini
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Lepetit SpA
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    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV durch Fermentation neuer Varianten von Streptomyces mediterranei, die die Eigenschaft haben, das erwähnte Antibiotikum direkt herzustellen.
In einer früheren Veröffentlichung (Antibiotics Annual 1959 - 60, 262) beschreiben Sensi et al. die Herstellung des Antibiotikums Rifamycin, das aus einem üemiuch vieler Substanzen mit ähnlicher Struktur beoteht, durch Fermentation eines Streptomyces mediterrane i~Stammes. Als Interessanteste unter diesen Substanzen erwies sich Rifamycin Bj deswegen verachte man, die Ausbeute zu verbessern. In "Appl.Microbiol. £, 325 (1961)" wird von Margalith et al, eines der lOrschungsergebnisse beschrieben; dort heisst ea, dass sich die Ausbeute und die Reinheit von Rifamycin B durch Zusatz von Hatriumdiäthylbarbiturat zu der Perraentationsbrühe verbessern lässt. Eine weitere Veröffentlichung (Sensi et al., Il Farmaco, Ed, Sei, 1j6, 165) betrifft die Herstellung von Rifamycin SV, das eine der Komponenten der Rifamycin-Gattung darstellt, eine höhere antibakterielle Wirksamkeit besitzt und
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ein wichtiges Zwischenglied zur Synthese anderer Rifamycin-Derivate darstellt. Allgemein ausgedrückt, besteht das Verfahren
darin, dass man Rifamycin B einer Reihe chemischer Prozesse
unterwirft,'während der es zuerst zu Rifamycin 0 oxydiert, dann zu Rifamycin S hydrolysiert und schliesBlich mit einem milden
Reduktionsmittel in Rifamycin SV verwandelt wird. Diese Synthese ist offensichtlich sehr mühsam und bringt in den verschiedenen Stufen ziemlich schwer zu lösende praktische Probleme mit sich, verbunden mit wahrscheinlich häufig vorkommenden Verlusten desselben Antibiotikums. Aus wirtschaftlichen Überlegungen heraus suchte man nach einem einfacheren Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SV.
Dieses Problem wurde nun durch das erfiraUngsgemässe Verfahren
gelöst, ^s wurde gefunden, dass, wenn man Streptomyces mediterrane! der Wirkung physikalischer (z.B. UV-Strahlen), chemischer (Senfgas, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, etc.) oder biologischer (z.B. Actinophage) Mutationsmittel aussetzt, Varianten des genannten Mikroorganismus erhalten wurden, die Rifamycin SV und unterschiedliche Mengen anderer Rifamycine bilden.
Die Rifamycin SV bildenden Varianten behalten die ursprüngliche Taxonomie des Streptomyces mediterrane! bei und die ihre Kultur betreffenden Eigenschaften sind praktisch die gleichen. Nur bei der Bildung dee Luft-Myzeliums und in der Farbe der löslichen
Pigmente wurden einige Unterschiede beobachtet, nachdem die
Varianten auf entsprechenden Nährboden gewa^gen waren. In der
folgenden Tabelle werden die Eigenschaften des Streptomyces mediterranei ATCO 13685 mit denen einer neuen Varianten verglichen, die sich ala besonders wirksam bei der Bildung hoher
Ausbeuten von Rifamycin SV erwies. Die Variante, welche die
interne Codenummer RS2O erhielt, wurde beim ATCC hinterlegt und
erhielt die Nummer 21.271.
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Vergleich der Eigenschaften der Kulturen von Streptomyces med.iterran.ei ATCC 13685 und vom Stamm RS2O auf mehreren Nährböden
Nährboden Vegetatives
Myzelium 		ATCC 13685 Lösliches
Pigment		 (ATCC 21271) Luft-
Myzelium		 Lösliches
Pigment
glasklar
bis hell
braun 		Luft-
Hyzelium 		grün-gelb
bis hell
braun		 Vegetatives
Ilyzelium		 fehlt helles grün
gelb bis
braun
grün-gelb
Stärke Agar glasklar
bis hell
braun 		rosa
■weiß		 hellgelb glasklar
bis orange
braun bis
dunkelbraun		 fehlt helles grün
gelb bis
braun '
grün-gelb ,
DB Ca-Halat-
Grlukose-Agar 		glasklar
bis hell
orange 		rosa
v/eiß 		wenig,
schwach
orange 		glasklar bis
orange gelb 		fehlt sehr helles
grün-gelb bis
braun grün
gelb
σ
ο
a
ζ		 Ca-Malat-
GIycerin—Agar 		glasklar
bis orange
gelb 		weiß
hell orange 		sehr helles
gelb-braun 		glasklar bis
orange-gelb
bis orange
braun		 fehlt braun-gelb
bis braun
rot
3ennet-Agar
CD
(O
OO		 rosa
weiß 		glasklar bis
orange gelb
bis dunkles
rot-braun
CO CD CO
Die in der vorstehenden Tabelle genannten Nährböden hatten folgende Zusammensetzung: .
Stärke-Agar: 10 g lösliche Stärke, 1 g KgHPO4, 1 g MgSO4.7HgOf
1 g NaCL, 2 g (NH4J2SO4, 2 g CaCO3, je 0,001 g FeSO^,7HgO1 MnCl2„4H20, ZnSO4.7H2O, 20 g Agar Difco, mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach 20 minütiger Sterilisation bei 1200C lag der pH-Wert bei 6,7 bis 6,8.
Ca-Malat-Glukoae.-Agar - 20 g Glukose, 10 g Ca-Malat, 0,5 g NH4Cl, 0,5 g K2HPO4, 15 g Agar Difco, mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach 15 minütiger Sterilisation bei 1150C lag der pH-Wert bei 6,5.
Ca-Malat-Glyzerin-Agar - 10 g Glyzerin, 10 g Ca-Malate, 0,5 g NH4Cl, 0,5 g K2HPO4, 15 g Agar Difco, mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach 15 minütiger Sterilisation bei 1150C lag der pH-Wert bei 6,5 bis 6,6, ■
Bennet-Agar - 10 g Glukose, 1 g Hefeextrakt, 1 g Fleischextrakt,
2 g N~Z-Amin A, 15 g Agar, mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt. Nach Sterilisation lag der pH-Wert bei 6,7 - 6,8.
Das Fermentations- und Extrakt!oneverfahren kommt im wesentlichen dem zur Herstellung von Rifamycin B beschriebenen Verfahren gleich und besteht in der Züchtung einer der genannten Varianten der Streptomyces medlterranei in einem eine assimilierbare Kohlenstoff und Stickstoff-Quelle und wichtige Mineralsalze enthaltenden Nährmedium, bis dieses Nährmedium eine beträchtliche antibiotische Wirksamkeit besitzt, und in der Ixtraktion von .Rifamycin SV aus dem Nährmedium. Insbesondere wird diese Variante unter Rühren und unter belüfteten submereen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25° - 37°C und vorzugsweise bei 280C gezüchtet. Als Kohlenstoffquelle können die folgenden Kohlenhydrate und Kohlenstoffderivate verwendet werden! Glukose, Galactose, Lactose, Saccharose, Maltose, Glyzerin, Mannit usw. Brauchbare Stickstoffquellen sind z.B. Aminosäuren und deren Gemische, Peptide, Proteine und deren Spaltprodukte wie ^epton, Hefeextrakt,
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Sojabohnenmehl, ^aiswasser, lösliche Fischrückstände, Fleischextrakte, wässrige Teile der Getreidesamen. Die Fermentation kann über 96 - 180 Std. hinweg durchgeführt werden» Der.Anfangs -pH-Wert, der im allgemeinen bei etwa pH 6,2 bis pH 6,4 lag, sank während der Fermentation auf pH 5,5 - 6,0, Im allgemeinen wurden die besten Ergebnisse bei 180 stündiger Fermentation beobachtet, lach dieser Zeit erhielt man eine ausgezeichnete Ausbeute des Antibiotikums.
Nach Ablauf der Fermentation konnte das Rifamycin SV durch folgendes Verfahren isoliert werden. Das Fermentationsmedium v/ird bei dem ind-pH-Wert von pH 6,4 bis pH 6,6 filtriert. Um die beste Stabilität der antibiotischen Substanz zu garantieren, wird das Filtrat auf einen pH-Wert, der vorzugsweise unter pH 5 liegt, atengesäuert. Die wirksame Substans wird mit sicii mit Wasser nicht-mischbaren Lösungsmitteln, wie Chloroform, Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylacetat extrahiert. Das Volumenverhältnis zwischen eiern Wedium und dem Lösungsmittel ändert sich je nach dem gewählten Lösungsmittel; im allgemeinen wird ein Verhältnis von 2 : 1 bis zu 10 : 1 verwendet«,
Das Myzelium behält weiterhin eine mikrobiologische Wirksamkeit, die bemerkenswert hoher ist als die bei der Fermentation von Rifamycin B beobachtete. Mit einem mit Wasser nicht-mischbaren Lösungsmittel wird die wirksame Substanz aus de:?: My i: el ium extrahiert und dann mit der organis hen Phase vereinigt, die bereits das meiste Rifamycin enthält. Die wirksame Substanz kanu aus dem
Myzelium auch mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel wie Aceton extrahiert werden. In diesem Falle wird die Flüssigkeit filtriert, da3 Aceton im Vakuum abgedampft, das .'.UfaiTiycin mit einem mit Wasser nioht-mischbaren Lösungsmittel extrahiert und das Verfahren, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt*
Wenn die Hauptmenge der antibiotisch wirksamen Substanz in das Lösungsmittel überführt worden ist, wird vorzu^aw·: ioe bei einer Temperatur von unter 3O0O im Vakuum bl3 zur 'Trockene destilliert.
Die Reinigung dos Rifamycin SV wird chromatographisc/i an einer
109820/20U BADOR,G,NAL
mit einem geeigneten Adsorptionsmaterial, wie Silikagel, präparierten Säule durchgeführt. Die Rifamycine werden in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Aceton gelöst, auf die
Säule gebracht und mit einem geeigneten Löeungsmittelgemisch wie Aceton und Benzol eluiert. Im allgemeinen ist die Abtrennung von Rifamycin SV aus anderen Rifamycinen ziemlich scharf, da es eine wesentlich höhere Beweglichkeit besitzt und auf Grund des charakteristischen orange-gelben Farbrlnges innerhalb der Säule leicht verfolgt werden kann. Das das Rifamycin SV enthaltende Eluat
wird dann im Vakuum zur Trockne konzentriert und ein kristalliner, orange-gelber Rückstand erhalten.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Eine Suspension des Myzelium der Streptomyces mediterranei
ATCC 13685 wurde mit N-methyl-Nf-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt und auf Bennet-Agar okuliert. Die Kolonien, die die mutagene Behandlung überlebten, wurden isoliert und auf ihre Fähigkeit,
das Wachstum von Pseudomonas reptilivora NRRL-B6, die auf Penassay-Samenagar bei einem pli-V/ert von pH 7,2 gezüchtet wurden, zu
hemmen, geprüft. Rifamycin B ist unter diesen Bedingungen mikrobiologisch inaktiv, und rtifamycin SV bildende Stämme konnten
ausgewählt werden«
Der eine dieser Stamme, hier RS2O abgekürzt, wurde 6 bis 8 Tage,
lang auf dem Bennet-Agar vermehrt und bei 28 C inkubiert. Mit der Kultur, die aus der schräg ime Reagensglas angelegten Agarkultur erhalten wurde, wurden zwei 5OÜ ml Erlenmeyerkolben unter sterilen Bedingungen okuliert. Die Kolben enthielten 100 ml des vegetativen Mediums der folgenden Zusammensetzung:
Fleischextrakt 5 g
Hefeextrakt 5 ß
Pepton 5 g
Caseinhydrolysat 3 g
Glukose 20 g NaCl 1,5 g
mit H2O auf 1 Liter aufgefüllt.
ί; 109820/2 044
BAD
Der pH-./ert wurde mit NaOH auf pH 7,3 eingestellt.
Die auf diese Weise okulierten Kolben wurden 72 Std, bei 280C auf irgendeinen Schüttelapparat untergebracht. Der Inhalt der beiden Erlenmeyerkolben wurde als Impfstoff benutzt, indem man ihn in einen 10 1 fassenden Vorfermenter, der 4 1 des vorstehend erwähnten vegetativen Mediums enthielt, eingoß.
Die Inkubation wurde bei 280C unter Rühren mit 750 U/min, und unter Belüftung mit 1 V/V/min. durchgeführt. Nach dreissigstündigem Wachstum wurde ein 7 bis 10biges Volumen gepackter Zellen erhalten«, Im nächsten Stadium wurde ein 10 liter fassender, aus Gl-"ς bestehender Ferraenter verwendet, der 4 Liter des nao:;~teneiid erwähnten Feraientationsmediums enthielt:
Erduu:r.ne:u
So ήabchnenmehl
Glukose
Glyzerin
KH2PC4
Propylenglykol
CaCO3
Ka-Diathylbarbiturat
CuSO4.5H2O PeSO^,7H2O ZnSO4.7H2O HnSO4.4H2O CaCl2.6H2O (NH4)6Mo70 .4H2O mit H2O auf
Der pH-Wert wurde mit UaOH auf pH 7,8 eingestellt. Die Sterilisation wurde 60 Min. bei 1200C durchgeführt. Nach der Sterilisation lag der pH-Wert bei 6,4· (Ein Teil des Inhaltes des Vorfermenters gleich 5"/* des Inhaltes des Fermenters wurde als Impfstoff verwende det).
BAD ORIGINAL. 109820/20U B
25 g g g
5 g 0,85 g g
9,5 95 g mg
40 g mg
1 g mg
5 g mg
8,5 mg
1,7 5 mg
2,8 1 Liter aufgefüllt.
8,5
42,5
3,4
1,7
0,8S
Die Fermentation wurde bei 280O unter Rühren mit 750 U/min, . und unter Belüftung mit 1 V/V/mtn. durchgeführt. Silikon A wurde als Antischaummittel verwendet. Während der Fermentation erhielt die Kulturbrühe eine charakterlachö rotbraune Farbe, Nach 120 stündigem Wachstum wurde ein 20 - 25#iges Volumen gepackter Zellen erhalten. Der pH-Wert der Brühe war pH 6,0, Fach 180 Std. wurde die höchste antibiotische Wirksamkeit (2000 Γ/ml Rifamycin SV) erzielt. Die Brühe wurde zu diesem Zeitpunkt isoliert.
Beispiel 2 ;
Eine gemäss Beispiel 1 erhaltene Kultur von Streptomyces mediterrane i RS20 wurde unter Rühren gemäss Beispiel 1 in einem BLolben präpariert. Zur Vorzüchtung wurde sie in einen 10 Liter fassenden, aus Glas bestehenden Fermente* gegossen, der 4 1 dee
folgenden Mediums enthielt ι
Glukose 5g
Erdnußmehl 7,5 g
CaGO3 1,65 S
MgSO4.7 H2O , 0,33 g
KH2PO4 0,33 g
FeSO+.7H2O 3,3 mg
a ZnSO4.7H2O 16,5 mg
MnSO4.4H2O 1,3 mg
mit H2O auf 1 Liter aufgefüllt.
Der pH-Wert wurde auf pH 7,5 eingestellt. Die Sterilisation wurde 50 Min. bei 1200O durchgeführt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,4. Nach 38 stündigem Wachstum betrug das Volumen der gepackten Zellen 6 - 8 $> des QesamtTOlumens. Ein Impfstoff gleich 10 # wurde für einen 20 Liter fassenden, aus Glas bestehenden Fermenter, der 10 1 des folgenden Fermentationsmediums enthielt, verwendet: «■■■
109820/20A4
Maiswasser 20 g
Sojabohnenmehl 15 g
(NH4)2SO4 6 g
MgSO4.7H2O 0,85 g
Glukose 100 g
KH2PO4 1 g
CaGO3 6 g
FeSO.·7H2O 8,5 mg
ZnSO4.7H2O 42,5 mg
MnSO4.4H2O 3,4 mg
OuSO4. 5H2O 2,8 mg
COCl2.6H2O 1,7 mg
mit H2O auf 1 Liter aufgefüllt.
Der pH-Wert wurde mit Natrium auf pH 7,8 eingestellt. Die Sterilisation wurde 50 Minuten bei 1200C durchgeführt. Nach der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,4, Die fermentation wurde 150 Std. bei 28°C durchgeführt. Bei der Isolierung (harvest) betrug der pH-Wert der Fermentationsbrühe pH 6,0. Die antibiotische Endaktivität betrug 160OjVmI Rifamycin SV,
Das -Produkt wurde extrahiert, auf chromatographischem Wege gereinigt und dan kristallisiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Insbesondere wurde die Chromatographie mit Silikagel (Mejdc 0,05 - 0,20 mm) durchgeführt» Das rohe Rifamycin wurde in Aceton gelöst und dann mit einem Benzol-Aceton-Gemisch im Verhältnis 1:1 eluiert. D.ms auf diese Weise gereinigte Produkt zeigte die ohemisch-physikalischen Eigenschaften von Rifamycin SV. Schmelzpunktί Zersetzungsbeginn bei 1400C, ^ÜTp β -3,9° (c = 1 1» in Methanol).
Das I.R.-Spektrum zeigte folgende Absorptionsbanden: 3440, 2920 (Nujol), 2850 (Nujol), 1700, 1658, 1605, 1545, 1464 (Nujol), 45 1415, 1375 (ilujol), 1325, 1290, 1260, 1218, 1197, 1164, 1125, 1115, 1102, 1083, 1050, 1020, 976, 962, 950, 930, 915, 898, 871, 845, 830, 801, 785, 772, 760, 750, 717, 703 cm""1·
Das sichtbare und das U.V.Spektrum wurden mit Phosphabpuffer pH = 7, 3, durchgeführt und zeigte Absorptionsmaxima bei L'23 mu, 314 rau und 445 pu. 1 0 9 8 2 0 / 2 0 A A

Claims (1)

PATENTANSPRÜCHE*
1. Verfahren zur Herstellung von Rifamycin SY, dadurch gekennzeichnet, dass man eine zur Bildung von Rifamycin SV fähige Variante von Streptomvces mediterrane! in einem wässrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und wichtige Mineralsalze enthält, unter aeroben Bubmersen Bedingungen züchtet und die Fermentationslösung aufarbeitet,
2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Variante Streptomyces mediterranel ATCC 21271 verwendet.
3· Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces mediterrane! ATCC 21271 96 bis 180 Stunden bei einer Temperatur von 25 - 37°C und einem Ausgangs-pH-Wert von pH 6t2 - 6,4 züchtet.
Für Lepetit S.p.A.
(Jruppo per la Ricerca Scientifica e la Produzione Chimica Farmaceutioa Mailand / Italien
Rechtsanwalt
109820/2044
DE19681792019 1967-07-13 1968-07-12 Verfahren zur Herstellung von Rifamycin-SV Expired DE1792019C (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1834367 1967-07-13
IT1834367 1967-07-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE1792019A1 true DE1792019A1 (de) 1971-05-13
DE1792019C DE1792019C (de) 1973-03-01

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BR6800615D0 (pt) 1973-02-22
IL30248A (en) 1972-12-29
CH477551A (fr) 1969-08-31
BE717542A (de) 1968-12-16
FI45344C (fi) 1972-05-10
FR1584343A (de) 1969-12-19
AT279044B (de) 1970-02-25
IL30248A0 (en) 1968-08-22
GB1185434A (en) 1970-03-25
NL146877B (nl) 1975-08-15
NO124729B (de) 1972-05-29
DK117627B (da) 1970-05-19
US3597324A (en) 1971-08-03
FI45344B (de) 1972-01-31
ES356123A1 (es) 1970-04-01
NL6809640A (de) 1969-01-15
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