DE1767737A1

DE1767737A1 - Process for the production of cellulase

Info

Publication number: DE1767737A1
Application number: DE19681767737
Authority: DE
Inventors: Bruno Charles F
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1968-06-11
Filing date: 1968-06-11
Publication date: 1971-09-23

Description

Verfahren zur Herstellung von Collulaso Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur lierntellung und Isolierung von Cellulaae In hochgereinigter Form durch aubmerge Züchtung und Isolierung durch Absorption und Blution. Zur Zeit wird Cellulase nach dem Koji-(Tablett-)Verfahren gevonnen. Bei diesen, Ver.-l'ahren wird ein Subetrat aus Segemehl, Volzenkleie, Ammoniumsultat und anderen Zus.litzen bereitet, das durch Zugabe von Wasser zu einem Brei angerührt wird. Dieser Bretwird in ein Tablett oder eine rlache Schale &*-geben» mit einem Collulaso produzierenden Mikraorganismus lnckuli.err, und während eines Zeitraumes von fUnt bis sect)a Tagen dee Parmentatteti überlaasen. Blarhofe, Malaaufgut, Getreidemaische und ähnliches sind Beispiele andarer Substrate, die Im Koji-(Tablett-)Verfahren eingesetzt worden kAnen. Diese Substrate sind jedoch In ihrer Zusammensetzung sebc heterogen und enthalten eine Vielzahl von fermentlerbaren Bestandteilen, He zur Bildung von Enzymen, wie Amylasen und Pietinasen, führen. Diese langsam fermentlerbaren Bestandteile stören oft bti der laolierung des Enzyms Cellulase aus den rohen Parmentationsbrühen.Process for the production of Collulaso The invention relates to a new process for the formation and isolation of Cellulaae in a highly purified form by aubmerge cultivation and isolation by absorption and bleeding. Cellulase is currently produced using the koji (tray) method. In this process, a subetrate of sail flour, volzenk bran, ammonium result and other additives is prepared, which is mixed into a paste by adding water. This board is placed in a tray or a flat bowl with a collulaso-producing microorganism, and left over for a period of five to six days. Blarhofe, Malaaufgut, cereal mash and the like are examples of other substrates that can be used in the koji (tray) process. However, these substrates are sebc heterogeneous in their composition and contain a large number of fermentable constituents, which lead to the formation of enzymes such as amylases and pietinases. These slowly fermentable constituents often interfere with the laolation of the cellulase enzyme from the raw parmentation broths.

Zur Isolierung dieses Enzyms aue seiner Fermentatlonsbrühe sind mehrere Schritte nötig, zu denen auch Salz- und Lösungsmittal-Fällungsverfahren und ähnliches gshören, die teuer und zeitaufwendig sind und darüberhinaue zu einnm Enäprodukt führen können, das voh schmierigem Gefüge ist und nur begrenzte Enzymaktivität hat.There are several ways to isolate this enzyme from its fermentation broth Steps necessary, including salt and solvent precipitation processes and the like which are expensive and time-consuming and also lead to a product can lead, which is voh greasy structure and has only limited enzyme activity.

Erfindungegemäß ist gefunden worden, daß Cellulase durch aubmerse Fermentation gewonnen werden kann. Dabei wird ein Medium mit einem Cellulase bildenden Organismus Inokuliert, das inokulierte Medium wührend seiner Fermentationsperiode belüftet, das gebildete Enzym Cellulase an einem Absorptionamaterial absorbiert und die Callulaie vom Aboorptionematerial eluiert. Beinpiele für Cellulase produzierende Mikroorganismen, die ini Verfahren der Erfindung verwendet werden können, sind Stämme von Organiumen, die zu folgenden Arte a gehörenz Trichoderma, Myrotheeiup, renicillium, Aspergillus, Chaetomium, Xylaria, Polyporouo und Trametee. Organismen der Arten Teichoderma und Penicillium werden ztw Gewinnunj von Gellulase durch submerse Fermentation bevorzugt., Unter eubmerDer Fermentation bzw. Züchtung wird eine Fermentation verstanden, die in tiefen Gefäßen erfolgt, durch die Luft mit einer Geschwindigkeit %n 0,254 am/sec bis 1,778 cm/See strömt, vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit von 0,508 cm/sec bis 1,0!6 cmfeee. Die Geschwindigkeit des Luftstromes wird so reguliert, daß nicht mehr als 25 bis 50 Prozent der gebildeten Enzyme inaktiviert werden. Die Brühe in den Gefäßen wird auf bekannte Weise bewegt (umgewälzt).According to the invention it has been found that cellulase can be obtained by extreme fermentation. A medium is inoculated with a cellulase-producing organism, the inoculated medium is aerated during its fermentation period, the cellulase enzyme formed is absorbed on an absorption material and the callula is eluted from the absorption material. Beinpiele for cellulase producing microorganisms that ini method of the invention can be used, are strains of Organiumen that gehörenz following Arte a Trichoderma, Myrotheeiup, renicillium, Aspergillus, Chaetomium, Xylaria, Polyporouo and Trametee. Organisms of the species Teichoderma and Penicillium are sometimes preferred to obtain gellulase by submerged fermentation., Under eubmerDer fermentation or breeding is understood a fermentation that takes place in deep vessels, through the air at a speed of% n 0.254 am / sec to 1.778 cm / Lake flows, preferably at a speed of 0.508 cm / sec to 1.0! 6 cmfeee. The speed of the air flow is regulated so that no more than 25 to 50 percent of the enzymes formed are inactivated. The broth in the vessels is agitated (circulated) in a known manner.

01 Die beim Verfahren vepwendete Brühe enthält als Hauptbestandteil ein cellulosehaltiges Material, verwandt dem Material, das bei der praktischen Anwendung der gewonnenen Cellulase schließlich modifiziert werden soll, z.Be gemahlene Maiskolben, Jute, Linters, Brocken von Weizenkleie und undenatuvierte Cellulose, wie mikrokristalline Cellulose. Der für das Wachstum und die Enzymproduktion nötige Stickstot? wird hauptsächlich in Form anorganischer Salze angeboten, wie Ammoniumphosphat oder -sultat, mit einer wirksamen Menge an-einfachen organischen Stickstoffverbindungen, wie Harnstoff. Weiter werden angeboten bestimmte Mineralsalze, wie Caleium-, MEgnasium- und Kobaltsalze. Es hat sich gezeig',#, daß während 0.ter Fermentation und Züchtung der pH-Wart äas Mediums bis auf 3,8 oder darunter (3,2) fallen kann. Im erfIndungsgeinäßen VerZahren wird die Aufrechterhaltung eines sauren p,-1,-!e#eteE: bevorzugt, vorzugsweise eines p.-Wertes zwischen 4sO und 4,8., insbesondere zwischen 4,4 und 4,6. Die Temperatur wird zwischen 25 und 400 C gehalteni die bevorzugte Temperatur liegt zwischen 30 und 35 0 C. Die Zeitdauer der submeraen Fermentation hängt von der Größe der im Fermentationsprozeß verwendeten Gefäße ab. Vorzugsweise soll die Kultur etwa vier bis neun Tage fermentiert werden. Die besten Ergebnisse werden erhalten, wenn die Kultur fünf bis sieben Tage fermentiert wird.01 The broth used in the process contains a cellulose-containing material as its main component, related to the material that is ultimately to be modified in the practical application of the cellulase obtained, e.g. ground corn on the cob, jute, linters, chunks of wheat bran and undenatured cellulose such as microcrystalline cellulose . The nitrogen death necessary for growth and enzyme production? is mainly offered in the form of inorganic salts, such as ammonium phosphate or ammonium result, with an effective amount of simple organic nitrogen compounds such as urea. Certain mineral salts such as Caleium, MEgnasium and Cobalt salts are also offered. It has been shown that during the 0th fermentation and cultivation the pH of the medium can drop to 3.8 or below (3.2). In the method according to the invention, the maintenance of an acidic p, -1, -! E # eteE is preferred, preferably a p. Value between 40 and 4.8, in particular between 4.4 and 4.6. The temperature is situated between 25 and 400 C gehalteni the preferred temperature between 30 and 35 0 C. The duration of the fermentation submeraen depends on the size of the vessels used in the fermentation process. Preferably the culture should be fermented for about four to nine days. The best results are obtained when the culture is fermented for five to seven days.

Die Gewinnung und Reinigung des cellulolytischen Enzymen wird Im erfindungsgemäßen Verfahren wirksam und wirtschaftlich erreicht durch Absorption und Elution von unbehandeltem oder vorzugsweise alkalimodifiziertem cellulosehaYtigem Abeorptionnmaterial" wie Lintere oder aufbereitete Baumwolle. Das Abeorptionsmaterial, das von beliebiger Reinheit sein kann, wird In einer alkalischen Lösung eingeweicht, wie In Hatronlauge, Kalllauge oder Natriumbicarbonatlösung#mit Konzentrationen zwischen 1t0 bis 10 normal, vorzugsweise zwischen 4 und 6 normal. Nach dreißig bis sechzig minütigem Einweichen wird alkalltrei gewaschen, der p.-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 7,0 eingestellt und säu.-efrei gewaschen. Im Idealtall, aber nicht notwendigerweise, wird die Abeorption und Elution von Enzymen mit Hilfe der Säulenmethode durchgeführt. Die Absorption der Enzyme erfolgt vorzugsweiße'bei p. 1; bis .5.,5 und 20 bis»400 C. Die absorbierten Enzybie werden frei von organischen und anorganischen Fremdstoffen mit verdünntem Alkali bei 15 bis 25 0 C eluiert. Die Absorptions-Elutions-Lösung, die oben angegeben wurde, hat eine Konzentration von 0.,0001 bis 0,03 normal, vorzugsweise 0e001 N. Dieses Verfahren führt zu einer zehn-bis zwanzig-fachen Anreicherung (Enzymaktivität/Gesamtfeststoff) und zu einer etwa zehnfachen Verringerung des Volumens. Die Enzyme können durch Fällung mit Lösungsmitteln welter kont-#--n-tr5.ert werden, z.B.The extraction and purification of the cellulolytic enzymes is effectively and economically achieved in the process according to the invention by absorption and elution of untreated or preferably alkali-modified cellulose-containing absorption material such as linters or processed cotton. The absorption material, which can be of any purity, is soaked in an alkaline solution, In such Hatronlauge, Kalllauge or sodium bicarbonate at concentrations between # 1T0 to 10 normal, preferably between 4 and 6 normal. After thirty to sixty minute soaking alkalltrei washed, the p.-value with dilute hydrochloric acid is adjusted to 7.0 and säu.- p EFREI washed in Idealtall, but not necessarily, the Abeorption and elution of enzymes using the column method is performed vorzugsweiße'bei the absorption of the enzymes is carried out 1,... up to .5, 5, and 20 to "400 C. the absorbed. Enzybies become free of organic and inorganic foreign matter en eluted with dilute alkali at 15 to 25 0C. The absorption-elution solution given above has a concentration of 0. 0001 to 0.03 normal, preferably 0e001 N. This method results in a ten to twenty fold enrichment (enzyme activity / total solids) and one about ten fold reduction in volume. The enzymes can also be controlled by precipitation with solvents, e.g.

durch Eingießen des Eluates In fünf Volumteile Acoton bei 5 0C.9 Sammeln des Niederschlages und Trocknen im Vakuum. Als Alternative kann das Eluat durch konventionelle Verfahren vor oder nach Konzentration durch Verdampfen lyophiliziert werden.by pouring the eluate into five parts by volume of Acoton at 5 ° C..9 Collecting the precipitate and drying in vacuo. Alternatively, the eluate can be by conventional methods before or after concentration by evaporation lyophiliziert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. Beispiel 1 Eine lyophilisierte Kultur (durch Gefriertrocknung stabilisierte Sporen oder Mycel) von Trichoderma viride (ATCC 16325) wird zur Inokulation von 100 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung verwendet: Gemahlene Maiskolben 195 % Säurebehandelte Baumwolle Os05 % (mikrokristalline Cellulose) LactoGe 031 % Heenstoff 0203 % (NH4)2HPO4 0,3 % Mgs04.7H20 0903 % cac12 0303 % Fec12*4H20 Von % MnS04.7H20 09001 % C0C1206H20 030014 % (NH4)6M0 7 02V4H20 0e005 % ZnS04.7H20 02001 % CUSOV5H20 0e001 % Das so beschriebene Medlum wird mit Leitungswasser aufgefüllt, auf PH 4,0 gebracht, In 200 ml Portionen auf 500 ml Flaschen verteilt$ mit Watte zugestopft und durch dreißigminütigen Autoklavieren bei 1210C aterilialirt. Die inokulierte Kultur wird bei 30 0 C auf einer Drehschüttelmaschine Inkubiert, die mit 280 Umdrohungen1Minute auf einem Kreis von 5 cm Durchmeuaer oszilliert. Nach sieben Tagen wird ein 5% (vol/vol) Tranafer In mehrere Flaschen mit Medium gleicher Zusammensetzung und gleicher Zubereitung durchgeführt. Im zweiten Flaschen-Stadium wird unter identischen Bedingungen inkublert, wie im ersten. In einem dritten Flaschen-Stadium werden 1000 ml des Mediums In einnr 4-Liter Flasche, die mit einem Seitenarm und einer Inokulatlonsgloche Zkonventionelle'Ausrüstung) ausgestattet ist, mit dem gesamten Inhalt einer Flasche aus dem zweiten Stadium Inokuliert. Das Medlum ist im dritten Flaschen-Stadium das gleiche wie in den vorausgegangenon Stadien, mit der Ausnahme, daß 0,05 5 steriles Antischaummittel nach sechzigminütigem Autaklavieren hinzugefügt wird. Die Inkubation erfolgt im dritten Flaschen-Siadium bei 30 0 C während sieben Tagen auf einem mechanlochen Schüttler, der-bci einer Ausschwenkung von 3,8 cm Durchmesser mit 240 Umdrehungan/Minute rotiert. Der gesamte Inhall das dritten Flaschen-Stadiums wird verwendet zur Inokulation von 227 Liter Medium, das die für das dritte Flaschen-Stadium beschriebene Zusammensetzung besitzt, m it dem Unterschied, daß 0$1% KH 2 PO 4 zugcsetzt sind und daß die Maiskolben mit Hilfe eines Stokos Granulator Modell 43-4 durch ein 0,84 mm Sieb gesiebt sind. Sterilisation erfolgt durch sechzigminütiges Erhitzen auf 1210C mit Hilfe von Dampf, der über einen Verteiler eingeblasen wird, Die Maiskolben werden als letzte Komponente zum Ansatz gegeben, nachdem der p.-Wert auf 4,0 eingestellt ist. Nach der Sterilisation wird der PH -Wert auf 5,0 eingestellt. Nach 48 Stunden liegt der p.-Wert bei 3.4. Von diesem Zeitpunkt an wird der p.-Wert mit 50X NaOH stets auf 4,8 nachgestellt, sobald er auf 4,0 abgesunken Ist. Zur Belüftung wird während der eraten 48 Stunden bei einem Druck von 0,78 at eine Strömungsgeschwindigkeit von 1.016 eminee (mittlere Geschwindigkeit) aufrechterhalten, dann wird sie reduziert aut 0,1508 en./sec. Die Bewegung Ist minimal. Die Tompe.rti.ttir wird be:# 30 OC gehalten. Die Züchtung wird unter dieuar Bedingungen 114 Stunden fortgesetzt. Ein Teil (*.t'[ L:Iter) der Tieftankkultur,. die In der' oben be- achrienienen 1-Icine 114 Stunden gezüchtet wurde"wird verwendet zur InokulaIV"ion von 567 Liter Medlum, die in einem 750 Liter Edelotahl-Fermenter konventioneller Bauart enthalten sind. Das Medlum Ist dao gleiche wie beim vorausgegangenen Stadium" mit der Ausnahme, daß der Gehalt an (N1Y2P04 094% (statt 0.39) und der der mikrokrimtallinen Colluloue 1,0% (statt 0$05%) ist, und daß die Maiskolben nIeht gesiebt sind (die getrockneten Wei- kolben werden In einer Ball und Jewel Mühle Kow 4038 gemahlen). Sterilination und Durchführung de:# Fermentation erfolgt in gleicher Weise Nite Im ersten Tiettank-Stadim. W&Ohi140 st=do" Züchtung werden 500 ml Toluol zum Schutz gegen Nikroorguie»n zugesetzt. Der p.-Wert wird auf 4,0 bis 5,5 naohgestellt. Die gesamte Brühe (545 Liter) wird zunächst durch *in rOt:i*r*ZM*$ Vakuumfilter (Band-Typ) filtriertg und dann'duroh ein Feintilter filtriert (Sparkler-Typ). Das gekltj#tö,Piltrat bat einschließlich der Wasohwänner ein Volumen von 454,.L:Lter. Die geklärte Filtrat, das 6.8x10 Aktivitiltaeinheiten enthält (die Einheit der -%"dellulase ist die Menge Enzym, die bei pli 5,0 und 400C in einer stunde 10 pg Filterpapier löst), wird auf p. 530 gebracht und über eine 15.,2 x 1011 cm Säule filtriert, die 3,1 kg Baumwolle (Watte) enthält (verwendet wird unIgebleichte Carolina Pharmaoeutleal Absorptionn Baumwolle (Watte), die durch Einweichen In 72 Liter 20% Natronlauge während fünfmAvierzig Minuten modifiziert, mit Wasser gewaschen-und mit 16 ml 12 N HC1 neutralisiert wurde). Das Filtrat wird mit einer Geschwindigkeit von 2 Llter/Ninute durch die Säule geleitet. Die Elution der Enzymaktivitat erfolgt mit 09001 N NaOH (75 Liter). 53 Liter werden aufgefangen., In welchen 4,63 x 10 6 Einheiten enthalten sind. Der p.-Wert des Eluaten wird mit 1,2 n HCl auf 5,0 eingestellt, das Volumen wird durch EindaWten auf 116 reduziert, anachließend wird lyophilisiert.The examples illustrate the invention. Example 1 A lyophilized culture (freeze-drying stabilized spores or mycelium) of Trichoderma viride (ATCC 16325) is used to inoculate 100 ml of a medium of the following composition: Ground corn on the cob 195% Acid-treated cotton Os05% (microcrystalline cellulose) LactoGe 031% Heenstoff 0203% (NH4) 2HPO4 0.3% Mgs04.7H20 0903% cac12 0303% Fec12 * 4H20 From% MnS04.7H20 09001% C0C1206H20 030014 % (NH4) 6M0 7 02V4H20 0e005 % ZnS04.7H20 02001% CUSOV5H20 0e001 % The medlum described in this way is filled with tap water, brought to pH 4.0, divided into 200 ml portions in 500 ml bottles, stuffed with cotton wool and sterilized by autoclaving at 120 ° C. for 30 minutes. The inoculated culture is incubated at 30 ° C. on a rotary shaker which oscillates with 280 threats for 1 minute on a circle of 5 cm diameter. After seven days, a 5% (vol / vol) transfer is carried out in several bottles with medium of the same composition and the same preparation. In the second bottle stage, incubation takes place under identical conditions as in the first. In a third bottle stage, 1000 ml of the medium are inoculated with the entire contents of a bottle from the second stage in a 4 liter bottle, which is equipped with a side arm and an inoculation cap (conventional equipment). The medlum in the third bottle stage is the same as in the previous stages, except that 0.05 % sterile antifoam is added after sixty minutes of autoclaving. The incubation takes place in the third bottle stage at 30 ° C. for seven days on a mechanical shaker that rotates at 240 revolutions per minute with a swivel of 3.8 cm in diameter. The entire contents of the third bottle stage are used for the inoculation of 227 liters of medium which has the composition described for the third bottle stage, with the difference that 0 $ 1% KH 2 PO 4 are added and that the corn cobs are used of a Stokos granulator model 43-4 are sieved through a 0.84 mm sieve. Sterilization takes place by heating to 1210C for sixty minutes with the aid of steam that is blown in via a distributor. The corn cobs are added as the last component after the p. Value has been set to 4.0. After the sterilization, the pH value is adjusted to 5.0. After 48 hours the p. Value is 3.4. From this point on, the p. Value is always readjusted to 4.8 with 50X NaOH as soon as it has dropped to 4.0. For ventilation, a flow rate of 1,016 eminee is used for the estimated 48 hours at a pressure of 0.78 at (medium speed) then it will reduced to 0.1508 en./sec. The movement is minimal. the Tompe.rti.ttir is held at: # 30 OC . Breeding is under dieuar conditions continued for 114 hours. A part (* .t '[L: Iter) of the deep tank culture ,. in the 'above achrienienen 1-Icine was grown for 114 hours "is used for InokulaIV "ion of 567 liters of medlum, which in a 750 liters Edelotahl fermenters of conventional design are included. That Medlum is the same as in the previous stage "with the exception that the content of (N1Y2P04 094% (instead of 0.39) and that of the microcrimtalline Colluloue is 1.0% (instead of 0 $ 05%) , and that the corn on the cob are not sifted (the dried white pistons are ground in a ball and jewel mill Kow 4038). Sterilization and implementation de: # Fermentation takes place in same way Nite in the first Tiettank-Stadim. W & Ohi140 st = do " 500 ml of toluene are grown to protect against Nikroorguie »n added. The p. Value is adjusted to 4.0 to 5.5. the entire broth (545 liters) is initially indicated by * in red: i * r * ZM * $ Vacuum filter (belt type) filtered and then thru a Fine filter filtered (sparkler type). That kltj # tö, Piltrat asked including the Wasohwänner a volume of 454, .L: Lter. the Clarified filtrate containing 6.8x10 units of activity (the The unit of -% "dellulase is the amount of enzyme that pli 5.0 and 400C dissolves 10 pg of filter paper in one hour), is applied to p. 530 brought and filtered through a 15, 2 × 1011 cm column containing 3.1 kg of cotton (wadding) (unbleached Carolina Pharmaoeutleal Absorption cotton (wadding) is used, which is modified by soaking in 72 liters of 20% sodium hydroxide solution for forty minutes , washed with water and neutralized with 16 ml of 12 N HC1). The filtrate is passed through the column at a rate of 2 liters / minute. The enzyme activity is eluted with 09001 N NaOH (75 liters). 53 liters are collected, in which 4.63 x 10 6 units are contained. The p. Value of the eluate is adjusted to 5.0 with 1.2 N HCl, the volume is reduced to 116 by data storage, and it is then lyophilized.

Bis wird ein Pulver (78 g) erhalten. Das Pulver enthält 4,7 x 10 6 A"tvitlitoeinheiten, die Aktivitätsausbeute Filtrat zu Pulver betriRgt demniaeh 70%. gebe Uter #jMp Kulturbrühe werden wie In Beispiel I hergestellt» xi$,der AU4o»Jmov daß der verwendete Nikroorganismus Penleillium m ,vers»iie #AT00 16340) Ist. Diese Kultur wird auf pa 590 eitp- Koottlit -el#W eine 5 x 18 m Glansäule mit einer Ganchwin- dij»it vo# 100 al/min. geleitet. Die Glansäule Ist mit Ab- »orptionob*uwolle (Watte) gepackt, die dreißig Minuten In 20X NaOH eingeweicht, mit 12 n HCl neutralisiert und mit Wasser gewaschen wurde. Nach dem vollständigen Auftragen der enzynkreichen Kultur wird die Enzymaktivität mit 2 Liter 0.001 a Natronlauge eluiert. Das aufgefangene Volumen beträgt 1,3 Liter und enthält 94,% der' Enzymaktivität. Um eine Inaktivierung den Enzyms zu verhindern, wird der p.-Vert den Eluaten sofort mit verdünnter Salzsäure auf 5"0 eingestellt. Zusätzlich zur 20-fachen Anreicherung ist das Enzym 6-fach konzentriert.A powder (78 g) is obtained until. The powder contains 4.7 × 10 6 Å tvitlito units, and the activity yield from the filtrate to powder is approximately 70%. give uter #jMp culture broth are prepared as in example I » xi $, the AU4o »Jmov that the Nikroorganism Penleillium used m , vers »iie # AT00 16340) Is. This culture is on pa 590 eitp- Koottlit -el # W a 5 x 18 m Glans column with a Ganchwin- dij »it from # 100 al / min. directed. The Glansäule Includes waste »Orptionob * uwolle (cotton wool) packed, the thirty minutes in 20X Soaked in NaOH, neutralized with 12N HCl, and washed with water. After the enzyme-rich culture has been fully applied, the enzyme activity is eluted with 2 liters of 0.001 a sodium hydroxide solution. The collected volume is 1.3 liters and contains 94% of the enzyme activity. In order to prevent inactivation of the enzyme, the p.-Vert of the eluate is immediately adjusted to 5 "0 with dilute hydrochloric acid. In addition to the 20-fold enrichment, the enzyme is concentrated 6-fold.

Ein Test ergibt, daß In Filtrat 2 x 105 Ensymeinheiten enthalten sind, während das Eluat 1,88 x 105 Einheiten enthält. Nach einer 5-fachen Konzentration den Enzyms durch Eindampfen und nach Fällimg mit Lösungsmitteln wird eine endgültige Ausbeute von BOX erhalten. Das Gesamtgewicht den erhaltenen Enzyms beträgt 4 Z, (1,6 x 105 Einheiten).A test shows that in filtrate 2 x 105 Ensymeinheiten are included, while the eluate containing 1.88 x 105 units. After a 5-fold concentration of the enzyme by evaporation and after precipitation with solvents, a final yield of BOX is obtained. The total weight of the enzyme obtained is 4 Z, (1.6 x 105 units).

Beispiel 3 Die Verfahren von Beiapiel 1 und Beispiel 2 werden wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Konzentrationen der verwendeten gemahlenen Mainknlben von 1,0% bis 39 verliert werden. Dem Medlum, das die höhere Konzentration an Maiskolben erithUt» werden zusätzliche 0,3% anorganischer Stickstoff zugesetzt. Beim Test den Filtratee jeden gefäfte wffl *im be- trächtliche Enzymbildung beobachtet. Example 3 The procedures of Example 1 and Example 2 are repeated with the exception that the concentrations of the milled meatballs used are lost from 1.0% to 39 %. The Medlum that the higher concentration of corn cobs erithUt "are additional 0.3% of inorganic nitrogen was added. The Filtratee each gefäfte wffl * observed in the test in the loading trächtliche enzyme formation.

Beispiel 4 Die Verfahren der Beispiele 1 und 2 worden wiederholt, mit dov Ausnahme, daß das MediUm weniger als IX gemahlene Maiskolben, ferner 1,0% mikrokristalline Cellulose und 0,6% anorganischen Stickstoff enthält. Sowohl Trichoderma viride als auch Penleillium variabile haben ausgezeichnete Mengen an Cellulaso gebildet. Example 4 The procedures of Examples 1 and 2 were repeated with the exception that the MediUm contained less than IX ground corn on the cob, also 1.0% microcrystalline cellulose and 0.6% inorganic nitrogen. Both Trichoderma viride and Penleillium variabile produced excellent amounts of Cellulaso.

Claims

Claims 1. Process for the production of Collulane on a microblological basis Paths, characterized in that a collulase is formed end the microorganism in a medium under aubnersen Conditions and ventilation grows and the cellular abeorbiert lase at e4.Inem Aboorptionamaterial and from waste sorption material eluted. 2. Ver, your according to claim 1, characterized in that one OrsanIsms of the crude Trichoderma, Myrotheolum, Penleillium, Aspergillus, Chaetor.litni, Xylaria, Polyporous and Trametes used, 3. Process according to Anepruch 1 and 2 "characterized in that that one can cultivate in the acidic p. range above e ** » 3.29 preferably between p. 4.0 and 4.8 and at 25 to 40 or, runs for 4 to 9 days. 4. The method according to claim 1 to 3, characterized in " da £ the cellulase. untreated or pre-alkaline modified cellulosic absorption material aorbs and the cellulans with 030001 to 0903 normal alkali at 15 Wa 25 0 C eluted.