DE1617910A1 - Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Steffisburgensimycin - Google Patents

Description

Alfred Keeppener
Dr. Hans Ji)SiLiHi WoIS
Dr, Hans Chr, Beil

Rechtsanwälte

Frankfurt a. M.-Höchst

Adeionstraße 58 - TeL 3126 49

Unsere Hr. 13 312

The Upjohn Company Kalamazoo (Michigan, YStA)

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Steffisburgens imycin

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Stoffes, nämlich Steffisburgensimycin (U-20661),

Steffisburgensimycin ist eine chemische Verbindung, die durch Kultivieren eines Steffisburgensimycin erzeugenden Actinomyzes in einem wässrigen Uährmedium erhalten wird,, Sie ist eine neutrale chemische Verbindung, die das Wachstum von grampositiven Bakterien, z.B. B_acillus subtilis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Sarcina lutea und Mycobacterium avium hemmen und alleine oder in Kombination mit anderen antibakteriellen Mitteln verwendet werden können, um das Wachstum solcher in verschiedenen Umgebungen anwesenden Mikroorganismen zu verhindern oder deren Zahl zu reduzieren. Beispielsweise kann es als Desinfektionsmittel für verschiedene dentalmedizinische und* medizinische Geräte, die mit Staphylococcus aureus verunreinigt sind, verwendet werden, Bs kann auch als Futterzusatz zur För-i derung des Wachstums von Tieren, wie z.B. Säugetieren, Vögein, Fiaohen und Reptilien verwendet werden.

tOSfiU/2130

Der Mikroorganismus

Der erfindungsgemäss zur Herstellung von SteffisTpurgensimycin verwendete Aetinomyces wurde als Streptomyees steffisbursensis var* steffistrargensis nov. sp. bezeichnet. Eine Eigenschaft seiner Stämme ist die Produktion von Stef f isbü'gensimyeino Eine Subkultur des lebenden Organismus kann von der ständigen Sammlung des Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture Peoria, Illienois, USA bezogen werden» Die Bezugsnummer ist NRRL 3193·

Die Eigenschaften von Streptomyees steffisburgensis var» steffisburgensis nov« spec», ERRL 3193 sind in den nachfolgenden Tabellen beschrieben:

Tabelle I Aussehen auf Ektachrom

Tabelle II Assimilation von Kohlenstoffverbindungen in

- synthe Medium (J.Baet. Bd₀ 56, S. 107-114,1948)

T_abelle ΙΪΙ Kultureigenschaften

Tabelle IY Farbe nach Color Harmony Manual, 3.Ausgabe, 1948

und der ISCC-NBS Methode zur ParbbeStimmung und dem Dictionary of Color Names, NBS-Rundsehreiben 553.

Tabelle V Mikroskopische Eigenschaften

Tabelle I

Aussehen von S, steffisburgensis v· steffisburgensis

auf Ektachrom

Agarmedium Aussehen

Bennett's kein Luftwachstum

hellbraun—braune Rückseite

Saccharose n» Czapek kein Luftwachstum

gelb-hellbraune Rückseite

Maltose-Trypton kein Luftwachstum

braune Rückseite

Pepton-Eisen kein Luftwachstum

braune Rückseite

0,1 i» Tyrosin kein Luftwachstum

rot-braune Rückseite

Käseinstärke kein Luftwachstum

hellbraun-braune Rückseite

Dietz, A "Ektachrora Transparencies as Aids in Actinomycets Claeilfioation", Annal of the New York Academy of Scieno··, Βά, 60, S. 152-154, 1954 1098U/2130

Tabelle II

Assimilation von Kohlenstoffverbindungen in synthetischem Medium durch. S. steffisburgensis v. steffisfrurgensis

Kontrolle

1. D-Xylose +

2. L-Arabinose . + 3« Ehamnose +

4. DrlPruktose +

5. D-G-alaktose +

6. 'B-Glukose +

7. D-Mannose +

8. Maltose +

9. Saccharose " +

10. Laktose +

11. Cellobiose +

12. Raffinose +

13. Dextrin +

14. Inulin +

15. lösliche Stärke +

16. Glyzerin +

17. Duleit {-)

18. D-Mannit +

19. D-Sorbit (+)

20. Inosit ' . +

21. Salizin . M

22. Phenol . 23* Cresol .24.

26« Fa-iärtrat (-)

27. lia-^Salieylat -

28. Na-Acetat .■-■■»-·.

29. Ka-ßitrat {*■) 30.'Ka^uccinat . - (♦}

pösitiTe Assimilation
positive Assimilation - schwaches Wachstum schwaches Wachstum - keine Assimilation kein Wachstum

- ORfGINAt

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1617310

	Tabelle	III	Rückseite .	dunkelgeIb	Andere Kennzeichen
	Kultureigens chaften	braun	rosa-dunkel- gelb ■	Braunes Pigment. Melanin positiv
		farblos	braun	Kein Pigment. Malat löslich ge macht ( + )
Agar-Medium		Sehr schwache Spuren von grauweissem Luftwachstum gelb	blassgeln- duneklgelb	kein Pigment
Pepton-Eisen	S.steffisburgensis ve steffisburgensis	Sehr schwache Spuren von grauem Luftwachstum	dunkelgelb	hellbraunes Pigment. Kasein nicht gelöst.
Kalziummalat	Oberfläche	Spuren von grau weissem Luft- Wachstum	rosa-hellbraunes Pigment. Tyrosin nicht gelöst.
Grlukose- Asparagin	Kein Luftwachs tum	Spuren von grau weissem Luft wachstum	braunes Pigment. Xanthin gelöst .
Agar von ent rahmter Milch	Spuren von weis- sem Luftwachstum	Spuren von grau weissem Luft wachstum	kein Pigment.
Tyrosin	Massiges grau weis ses Luft- Wachstum	rot-hellbraunes Pig ment.
Xanthin	Kein Wachstum Kein Luftwachstum Spuren v.grauem Luftwachstum Spuren v#grau- rosa Luftwachst. Kein Luftwachst.	gelb-dunkelgelb kein Pigment rosa-dunkel- rosa-hellbraunes gelb Pigment · rosa-dunkel- rosa-hellbraunes gelb Pigment Spuren v.farb- kein Pigment
Nährstärke
Hefeextrakt- Malzextrakt
Bennett's _ 180C 24°C 280C 37°C '550C

Czapek¹

24 C

-. · 28⁰C

'37⁰C
.. 55⁰C

losem vegetativ,Wachstum nach 24 Std.

Kein Wachstum Kein bis Spuren v_#grauem Luft-Wachstum
Kein bis Spuren ν»grauem Luft-Wachstum
Rosa-dunkelgelbes Luftwachet· Kein Luftwa_chet.

gelb

gelb
gelb-rosa

kein Pigment

kein Pigment kein Pigment

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Spuren v.farblosem vegetativem W_achst, kein Pigment nach 24 Std.

Tabelle III (Fortsetzg·)

Agar-Medium

Maltose-Trypton

18⁰C 24°C

28⁰C 37⁰C 55°C

Reines G-elatine-Medium

Nährmedium

Oberfläche

Kein Wachstum Spuren Vograu-rosa Luftwachstum G-rau-rosa Luft-■Wachstum G-rau-rosa Luft-Wachstum Kein Luftwachstum Rückseite

gelb

rosa-dunkelgelb

rosa-dune|i:l- ·
gelb

Spuren v.farb
losem vegetativem Wachste
nach 24 Stdo

Brühenmedium
Hährnitrat

Svnthetisch.es Nitrat

Lackmus-Iiilch Andere Kennzeichen

gelb-hellbraunes

Pigment

rosa-hellbraunes

Pigment

rosa-hellbraunes

Pigment

kein Pigment

Braunes Pigment im oberen 1/4 d_eMediums Terflfcüssigung im Pigmentbereich

hellbraunes Pigment im oberen 1/4 d.Mediums βVerflüssigung im Pigmentbereicho

Farbloses Oberfläche n^achstum*Farbloses flockiges Wachstum unten₀Kein Pigment„ Nitrat nicht zu Nitrit reduzierte

Farbloses Oberflächenwachs turn« Farbloses flockiges Wachstum unten.Kein Pigment bis Spuren von dunkelgelbem Pigment. Nitrat nicht zu Nitrit reduziert.

Farbloser Oberflächenring. Teilweise Reduktion,
pH-Wert: 6,3-6,6.

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Tabelle I?

- ffarboharakteristika S, steffisburgensis ν«, steffisburegensis

Medium

Bennett' s-Agar
Oberfläche

Rückseite

Pigment

Czapek¹s
Saociiarnae-Agar

Oberfläche

Rückseite

Pigment

Maltose-

Trypton-Agax·

Oberfläche

Rückseite

Pigment

Color Harmony Manual 5»Ausgabe» 1948

3 ig beige-braun,trübbraun

31 g Iiehmbraun, zimtbraun, hellbraun

keins

2 ie hell senfgelb

2 ie hell senfbraun

keins

a weiss 3 ge kamelbeige

3 ng ahorngelb

3 ie kamelfarben, Ahornzucker hellbraun ISCC-MBS !"arb-Hamen Bundschreiben 553t 1955

80 m grau-gelblich bra_Un 95 g massig olivbraun

77 gm massig gelblichbraun

91 gm dunkelgräulich—gelb 94 g hell-olivbraun g hell-olrv

91 gm dunkelgräulich gelb 94 g hellolrvbraun g helloliv

gm weiss 79 m hellgräulich,gelblich-braun 94 m hellolivbraun

77 m massig gelblichbraun

76 m liellgelblichbraun

77 g massig gelblich

braun

Tabelle V

Mikroskopische Charakteristika von S.steffisburgensis v,steffisburgensis

Liohtmikro skop
Elektronenmikroskop

Sporenträger kurz, gerade bis offen spiral- bis spiralförmig

Sporen mife kurzen Stacheln

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is?

Die neue erfindungsgemässe Verbindung wird erhalten, wenn man den die Verbindung erzeugenden Organismus in einem wässrigen Hährmedium unter submersen aeroben Bedingungen züchtet· Zur Herstellung von begrenzten Mengen können auch Oberflächenkul— türen in Flaschen verwendet werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium ge zueiltet, das eine Kohlenstoff quelle, z.B. ein assimilierbares Kohlehydrat und eine Stickstoff quelle, z.B. eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder proteinhaltiges Material enthält· Bevorzugte Kohlenstoffquellmsind Glukose, brauner Zucker, Saccharose, Glycerin, Stärke, Maisstärke, Laktose, Dextrin, Melassen usw*· Bevorzugte Stickstoff quellen sind Maisweichwasser, Hefe, autolysierte Brauereihefe mit Milchfeststoffen, Sojabohnenmehl j Baumwollsamenmehl, Maismehl, g Milchfeststoffe, Pankreasdigest von Kasein, lösliche Rückstände &_us der ilkoholher-stellung, tierische P^onflilssigkeiten, Fleisch- und Knochenabfälle und dergleichen« Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoff quellen können mit Vorteil verwendet werden· Spurenmetalle, wie z.B. Zink, Magnesium, Mangan, Kobalt, Eisen und dergleichen brauchen zu den Fermentationsmech an nicht zugegeben zu werden, da Leitungswasser und nicht gereinigte Bestandteile verwendet werden·

Die Herstellung der erfindungsgemässen Verbindung kann bei einer beliebigen Temperatur vorgenommen werden, die zu ©inem zufriedenstellenden Wachstum des Mikroorganismus führt, z.B. etwa 18 bis 4O°C und vorzugsweise etwa 20 bis 30⁰G. normalerweise | wird die optimale Produktion der Verbindung in etwa 2 bis 10 Tagen erzielt. Das Medium hat während der Fermentation einen ziemlieh neutralen oder einen alkalischen pH-Wert, Der endgültige pH-Wert hängt teilweise von den anwesenden Puffern, - falls ,vorhanden, und teilweise von dem anfänglichen pH-Wert des Kulturmediums ab, der vorteilhafterweise vor der Sterilisation auf etwa 7»2 eingestellt wird·

Wird das Wachstum in grossen Gefässen und Sänke erzielt, dann wird der Mikroorganismus vorzugsweise in vegetativer Form statt « in Sporrenfom zur Inokulation verwendet, am einen deutlichen ί .Zeitverlust bei der Entstehung der neuen Verbindung und die damit verbundene Nicht ausnutzung der Anlage zu vermeiden· Bs ist

ι *■ '

!■***«,*' ^ßAD 109814/2130

daher erwünscht, ein vegetatives Inokulum in einer Nährbrühenkultur dadurch herzustellen, dass man die Brühenkultur mit einem Bruchteil einer Bodenkultur oder einer Schrägkultur inokuliert. Fachdem auf dieae Weise ein junges aktives vegetatives Inokulum erhalten wurde, wird es aseptisch in grosse Grefässe oder Tanks übergeführt. Das Medium, in dem das vegetiative Inokulum hergestellt wird, kann identisch mit dem für die Herstellung der neuen Verbindung verwendeten Medium oder verschieden davon sein, so lange nur ein gutes Wachstum des Mikroorganismus erzielt wird.

Die neue erfindungsgemässe Verbindung ist eine neutrale chemische Verbindung mit der Formel CoqH-qO^. Sie ist in niederen Alkanolen, wie z.B. Methanol, Äthanol, Isopropanol, den Butanolen und dergleichen; chlorierten niederen Alkanen z.B. Methylenchlorid, Chloroform, Ä'thylendi chlor id etc., niederen Alkanonen, z.B. Aceton, Methyläthylketon und dergleichen löslich und in Konzentrationen von weniger als 5 mg/ccm in Wasser, Diäthyläther und Cyclohexan.

Eine Vielzahl von Verfahren kann bei der Gewinnung und Reinigung von Steffisburgensimycin angewendet werden, wie z.B₀ Lösungsmittelextraktion, Flüssigkeits-Flüssigkeits-Verteilung in einer Vorrichtung nach Craig und Kristallisation aus Lösungsmitteln. Lösungsmittelextraktionsverfahren werden für die industrielle Produktion bevorzugt, da sie weniger zeitraubend und kostspielig sind.

In einem bevorzugten Verfahren wird Steffisburgensimycin aus seinem Kulturmedium durch Trennung der Mycele und der nicht gelösten Feststoffe mit herkömmlichen Mitteln, wie z.B. Filtration oder Zentrifugieren gewonnen. Das Antibiotikum wird dann .aus der filtrierten oder zentrifugierten Brühe extrahiert. Für ".die Extraktion von Steffisburgensimycin aus der filtrierten •Brühe können die vorstehenden Lösungsmittel, in denen es löslich ist, verwendet werden. Methylenchlorid ist das bevorzugte Bxtraktionslösungsmittel. Der durch Methylenchloridextraktion erhaltene Extrakt kann zur Trockne eingedampft werden, um unmittelbar das rohe Antibiotikum zufergeben. Dieses Präparat kann

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dort verwendet werden, wo ein reineres Antibiotikum nicht erforderlich isto

Steffisburgensimycin kann auch aus der filtrierten Fermentationsbrühe unter Verwendung eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels, wie z_eB_e Äthylacetat, Amylacetat, Methyläthylketon, 1-Butanol_f 2-Butanol oder Chloroform bei pH-Werten von etwa 3,0 bis 7,0 erhalten werden. Bei einem pH-Wert von 10,0 wird Steffisburgensimycin unter Verwendung von Methylenchlorid, Äthylacetat oder Methyläthylketon nicht in wesentlichen Mengen aus der filtrierten Brühe extrahierte Ein ande_ • res G-ewinnungsverfahren kann daher aus einer Extraktion durch ein Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, bei einem pH-Wert von 3,0 bis 7,0, einer erneuten Extraktion der aktiven Bestand- f teile durch Wasser bei einem pH-Wert von 10 und einer anschliessenden weiteren Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel der vorstehend beschriebenen Art bei einem pH-Wert von 3^0 bis 7,0 und der _an_achliessenden Verdampfung zur Trockne oder Kristallisation des Antibiotikums, bestehen«

Hochreines Steffisburgensimycin kann dadurch erhalten werden, dass man das vorstehende unreine trockene Steffisburgensimycinpräparat aus verschiedenen Lösungsmitteln kristallisiert. Z.B. kann man ein unreines Steffisburgen-simycinpräparat in äiee siedendem Isopropanol lösen. Die Lösung kann man durch Filtrieren klären, im Vakuum konzentrieren und dann auf 40 bis 6O⁰C erhitzen, bei welcher Temperatur die Kristallisation des Antibio— -tikums beginnt. Man kann das kristalline Gemisch über Sacht bei etwa -10 bis -30⁰C halten und dann die Steffisburgensimycinkristalle abfiltrieren. Man kann die Steffisburgensimycinkristalle mit kaltem Isopropanol waschen und im Vakuum trocknen, um ein hochreines kristallines Steffisburgensimycinpräparat zu erhalten. Hochreines Steffisburgensimycin kann auch aus Lösungsmitteln, wie z.B. Wasser, niederen Alkoholen, z.B. Methanol "und Äthanol, Estern, z.B. Äthylaoetat, Ketonen z.B. Acetones und Methyläthylketon, kristallisiert werden.

Die neue erfindunsgegmässe Verbindung Steffisburgensimyein hemmt das Wachstum von verschiedenen grampositiven Bakterien.

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Z₀B, ist es aktiv gegenüber Bacillus subtilis, Bacillus oereug, Staphylococcus au^eus, Sarcina lutea und Mycobaeterium avium. Steffisburgensimycin kann man daher als Desinfektionsmittel für gewaschenes und gestapeltes Essgeschirr verwenden, das mit Staphylococcus aureus verunreinigt ist. Es kann ferner bei Vögeln und Kaninchen zur Bekämpfung des Organismus Mycobacterium avium verwendet werden, der, wie bekannt ist, die allgemeine !Tuberkulose bei diesen Tieren verursacht. Steffisburgens imyc in kann auch bei der Papierherstellung zur Bekämpfung des Befalls von Wolle durch den Organismus Bacillus cereus verwendet werden. Es kann ferner bei der Lagerung von Petroleumprodukten zur Bekämpfung des Mikroorganismus Bacillus subtilis verwendet werden, von dem bekannt ist, dass er bei der Lagerung von Petroleumprodukten zur Bildung von Schlamm und zur Korrosion führt. Es kann auch als pH-Wert-Indikator verwendet werden, d.h.« es verleiht eine gelbe Farbe saurer Lösung und eine röt-violette-Farbe basischer Lösung.

In den nachfolgenden Beispielen sind alle Prozentsätze auf das Gewicht und alle Lösungsmittelgemischanteile auf das Volumen bezogen, sofern es nicht anders angeg^eben ist.

Beispiel 1 *
A Fermentation

Eine Bodenkultur von Streptomyces steffisburgensis var. steffisburgensis, URRL 3193» wurde zum Inokulieren einer Reihe von 500 ecm fassenden Erlenmeyer—Kolben verwendet, von denen jeder 100 ecm eines sterilen vorgeimpften Mediums enthielt, das die folgende Zusammensetzung hatte:

Glucosemonohydrat 25 g/l

Pharmamedia ⁺' 25 g/l

Leitungswasser Restmenge

+ ) Pharmamedia ist ein handelsübliches Baumwollsamenmehl, das von Trader's Oil Mill Company, Fort Worth, Texas hergestellt wird»

Der Kolbeninhalt wurde drei Tage bei 28 C auf einer rotierenden

_u , ₂,_{3 0}

Schüttelvorrichtung nach Gump bei 250 TJ/Min kultiviert·

Ein Schüttelkolben (100 ecm) mit dem vorstehenden Inokulum wurde zum Inokulieren eines 20 Liter fassenden Impftanks verwendet, der 13 Liter steriles Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthielt:

Glucosemonohydrat 10 g/l

Maisweichwasser 10 g/l

Pharmamedia 2 g/l

Wilsons Peptonflüssigkeit%

Hr. 159 ^} 10 g/l

Leitungswasser Restmenge

+) Wilson's Peptonflüssigkeit Mr. 159 ist ein Präparat aus hydrolysiert en Proteinen tierischen Ursprungs*

Der Inhalt des Impftanks wurde zwei ΐage lang bei 28°ö unter Belüftung mit 10 Liter p? Luft pro Minute und £ühr.en. bei 400 U/Min, behandelt«,

Der Inhalt des vorstehend beschriebenen Impftanks wurde sum Inokulieren eines 400 Liter fassenden IPermentatora verwendet, der 250 Liter des folgenden sterilen Mediums enthielts

Maisweichwasser 20 g/l

Glycerin 20 g/l

Uatriumohlorid 5 g/l

Leitungswasser Eestmenge

Vor der Sterilisation des Mediums wurde der pH-Wert des Mediums mit einer 50-prozentigen wässrigen Hatriumhydroxydlösung auf 7»2 eingestellt und dann wurden 10 g Calciumearbonat pro Liter zugegeben. Der Fermentationazyklus dauerte sechs iage, während welches? Zeit die Temperatur bei 28⁰O gehalten wurde» filtrierte Luft mit einer Geschwindigkeit von 80 l/Min, zugeführt wurde und bei. ESO U/Min gerührt wurde. Steriles Speeköl wurde zur Verhinderung der Schaumbildung zugegeben« Eine repräsentative Fermentation zu Steffisburgensimycin ergab 8,8 Bioeiniieiten/ccm bei 130 Std· gegenüber dem Mikroorganismus S* lutea» Die Probe \ gegenüber Sarcina lutta nird auf einem Agarnährboden Torgenomj mtn» der mit einem Phosphatpsiffer mit «inem pH-¥ert von 6_r0 auf el&en pH-Wert |<^q^ ^|bra(ib±-worden var. Sine Völismenein-

ORlQINAUtHSfECTED

heit (0,08 ecm) der das zu untersuchende Material enthaltenden Lösung wird auf eine Schale (12,7 mm) gebraucht, die dann auf eine Agarplatte gelegt wird, die mit dem Versuchs-Mikroorganismus geimpft worden war. Eine Bioeinheit (BE) ist die Konzentration des Antibiotikums, die unter den herkömmlichen Versuchsbedingungen eine Inhibierungszone von 20 mm ergibt„ Palls Z₀B₀ eine Fermentationsbrühe auf 1:100 zu verdünnen ist, um die Inhibierungszone von 20 mm zu erzielen, dann beträgt die Aktivität dieser Brühe 100 BE pro ecm«,

B. Extraktion

Die gesamte B^ühe einer Steffisburgensimycinfermentation wie W beschrieben, wurde mit 5,0 η Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. Die gesamte angesäuerte Brühe wurde dann mittels Diatomeenerde als Filterhilfe filtrierte Der Filterkuchen wurde mit 1/10 seines Volumens Wasser gewaschen (bezogen auf das Brühenvolumen)* Die klare Brühe und das beim Waschen des Kuchens erhaltene Waschwasser wurden vereinigt mit 1/10 des Volumens Cyclohexan gewaschen und die Cyclohexanphase verworfen» Die wässrige Phase Wurde bei einem pH-Wert von 6,0 mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert und die wässrige Phase verworfen. Der Methylenchloridextrakt wurde im Vakuum bei weniger als 40 C konzentriert, um ein trockenes, unreines Steffisburgensimycinpräparat zu ergeben.

C. Reinigung

Ein nach dem in dem vorstehenden Teil B beschriebenen Verfahren erhaltenes Methylenchloridkonzentrat von Steffisburgensimycin wurde in 250 ecm siedendem Isopropanol gelöst. Die Lösung wurde durch Filtrieren geklärt und dann im Vakuum bei weniger als 40 C auf ein Volumen von 65 ecm konzentriert. Das Konzentrat wurde auf etwa 50 0 erhitzt, wo die Kristallisation von Steffisburgensimycin einsetzte, I₈Ch Abstellen des G-emischs über Macht bei -18 C wurden die Steffisburgensimycinkristalle abfiltriert, mit 2 ecm kaltem Isopropanol gewaschen und im Vakuum auf ein konstantes Gewicht von 450 mg getrocknet» Diese Steffisburgensimycinkristalle hatten eine Aktivität von 73,0 Bioeinheiten/mg

1098U/2130 BAD

~ 13 -

gegenüber der "beschriebenen S» lutea-Probe, Die Stoffbilanz für die vorstehend beschriebenen Gewinnungs- und Reinigungsverfahren lautet "wie folgt/

Verfahrensstufe Menge Probe

gesamte Brühe 4.000 ecm 12,6 Bioeinheiten/ccm

klare Brühe 3«600 ecm 10 " ·"

Methylenchloridextrakte 3»400 ecm 7,2 " "

kristallines Steffisburgens imyc in 450 mg 73 " /mg

Eigenschaften des Steffisburgensimycin

Kristalle: gelbe-hellorange Kristalle. In wässriger Lösung ist

die Farbe gelb und in starker Base rot-violett« Elementaranalyseϊ gefunden? G 58,31} H 5,52; 0 35,89 Optische Drehung: /«/ρ⁵ +85° (c, 0,054$ in Methanol), Löslichkeit j Es ist löslich in niederen Alkanolen, ζ.Β»Methanol, Äthanol, Isopropanol, den Butanolen und dergleichen? chlorierten niederen Alkanen» z.B» Methylenchlorid, Chloroform, A'thylendichlorid und dergleichen; niederen Alkanonen, z«B» Aceton_p Methyläthylketon und dergleichen! es ist ferner löslich in Konzentrationen von weniger als 5 mg/cm in Wasser, Diäthyläther und Cyclohexane UV-Spektrum:

O₉OI η HGl in Methanol Max« bei 214 f&t a ~ 43^42 Schulter bei 255 mu_s a » 38_s70 Schulter bei 300 mu₉ a « 22,24 Max. bei 236 mu, & ^ 5O_?37 Max. bei 278 eu_s a = 34?91 Mas β "bei 439 mu* a - 26,71.

Holekulargewiehts 574 (Massenspektrometer)₀

~* ■ Methanol
to

M&iic	bei	214	s rau9	a s	45 ρ	23
Max«	bei	256	/	a ss	51»	04
Schulter	bei	255	WX,	S a	3Βΰ	92
- Mas.	bei	278	/ mu,	a *		14
Schultsr	bei	298		a ss	25,	61
Max.	bei	439	a as	25*	94

0,01 η KOH in Methanol

Max. bei 227 mu, a = 51,93

Max. ' bei 263 mu, a = 42,86

Max» bei 353 mu, a = 7,20

'Max, bei 528 mu, a = 19,44

InfrarotSpektrum: Das Infrarotabsorptionsspektrum von in

Mineralölmull suspendiertem Steffisburgensimycin wird in Fig» 1 gezeigt. Steffisburgensimycin zeigt Maxima bei den folgenden in reziproken cm ausgedrückten Wellenlängen:

3470	(M)	1463	(S)	1193	(S)	925	(W)
2940	(S) (Öl)	1445	(S)	1163	(S)	913	(M)
2920	(S) (Öl)	1410	(M)	1143	(M)	893	(W)
2850	(S) (Öl)	1395	(S)	1123	(M)	870	(W)
2720	(W)	1376	(S) (Öl)	1105	(S)	858	(W)
1710	(S)	1310	(S)	1070	(S)	832	(W)
1672	(M)	1293	(S)	1053	(M)	812	(W)
1620	(S)	1268	(M)	1037	(S)	800	(W)
1610	(S)	1260	(S)	1020	(M)	793	(M)
1605	(S)	1245	(S)	1005	(M)	769	(M)
1560	(M)	1228	(M)	970	(M)	745	(W)
1510	(W)	1212	(M)	962	(M)	725	(W)
						698	(W)
						690	(W)

Die Bandenintensitäten sind als "S", "M" bzw. "W" angegeben und sind Näherungswerte in Bezug auf die Hintergründe in der Nähe der Bande« Eine ^HS^M-Bande ist ?on der gleichen Intensität wie die stärkste Bande im Spektrum· "M"-Banden haben eine Indensität, die zwischen 1/5 und 2/3 der stärksten Bande liegt und "W^?s==Banäen haben eine Intensität, die geringer ist als 1/3 der stärksten Bande« Diese Sciiütawerte wurden auf Grundlage einer prozentualen Durohlasaigkeitstabelle festgelegt.

Papierchromatogranaas B_ag iapiei'chroaiatogi'anim von Steffisbur-

gensimycin In den folgenden Lösungsmittel· systemen wird in ffig» 2 der Zeichnung gezeigtt

lU/2130

1-Butanol, Wasser (84:16), 16 Std,

II. 1-Butanol, Wasser (84:16) plus 0,25$ p-Toluolsulfonsäure, 16 Std„

III. 1-Butanol, Essigsäure, Wasser (2:1:1), 16 Std_e

IV. Zfo Piperidin (V/V) in 1-Butanol, Wasser (84:16), Std.

1-Butanol, Wasser (4:96), 5 Std.

YI. 1-Butanol, Wasser (4:96), plus 0,25$ p-Toluolsulfonsäure, 5 Std.

Antitumoraktivität:

Steffisburgensimyoin verhindert das Wachstum von KB-Zellen (epidermoide Carcinomzellen beim Menschen) in G-ewebekulturen» Bas Testverfahren -wird in Cancer Research, Bd. 19, ITr. 8 S. 843-46, Sept_e 1959 beschriebene

Antifungusaktivität ι Steffishurgensimycin hemmt dag Wachstum von

Hocardia as^eroides und Bl_astomyces dermatidis auf einer verdünnten A-garprobe bei einer Konzentration von 10 meg Steffisburgensimycin pro ecm Agarmedium₀ (Die Testver— bindung wird Agar in ^etrisohalan in Konsentrationen von 1, 10, 100 und 1000 meg/ ecm einverleiht. Suspensionen der Testfungi werden auf die Agaroberfläche aufgestricheno H_Pch Inkubation während 72 Std. bei 28 G werden die ietr.ischalen untersucht und der G-rad der Wachstumshemmung wird festgestellta)

Antivirusaktivität: Steffisburgensimycin zeigt eine antivirale . ' Aktivität gegenüber Herpes simplex bei Mäu

sen» Das folgende Testverfahren wurde angewendet s Die Testverbindung wird virus infizierten .Mäusen intraperitoneal verabreicht (entwöhnte weisse Swiss-Mäuse_s Stamms October HiIIs)₀ Tor der Infektion wurden vier Dosen der Testverbindung prophylaktisch gegeben: .44, 26, 19 und 3

109814/2130

Stunden vor Infektion« Fünf weitere Dosen wurden 4, 21, 28, 45 und 52 Stunden nach der Infektion als Therapie verabreicht. In jeder Gruppe befanden sich 20 Mäuse. Die Testdauer betrug 12 Tage. Die toten Mäuse werden zweimal täglich gezählt.

Herpes

12 g

intraperitoneal 30 ED₁

Mausgrösse Infektionsweg Erregervirus

Gewebetropismus Hirn

Pur den Herpesvirus wurden die Delta (/^)-Werte (behandelte Tiere minus infizierte Kontrolltiere) für die 50$ige Überlebenszeit (STj-Q) von Mäusen berechnet, die sterben« Der minimale STcQ-Wert für eine bedeutende Aktivität beträgt 20 Std. Folgende Ergebnisse wurden bei diesen Tests mit Steffisburgensimycin erhalten:

Anzahl d.Mäuse	Überleben de, <?o	Delta $> Überle bende	ST50	Delta	ST-Ent w*.
18 19 19	77,7 78,9 68,4	72,6 63,9 53,4	105,6 76,9 100,1	-28,9 -67,4 -44,3	32,8 63,6 55,6

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Claims (1)

1. A-

   PAIEIIASSPEÜCEE

   1, "Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Steffisburgensimycin, dadurch gekennzeichnet, dass man Organismen des Stammes Streptomyces steffisburgensis var» steffisburgensis ποτ. sp« in einem wässrigen Nahrmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert, wobei das Hahrmedium eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und assimilierbaren Stickstoff enthält,

   2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet^ dass man die kultivierte Hährbrüiie filtriert, .das ^iXtrat miteinem mit Wasser nicht 'mischbare» Ijäsungöm|;^$i|. ^ Steff isburgeitisimyGin aus .dem

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet\ dass man das ifährmedium 2 bis 10 'S age bei etwa 18 bis" etwa 40⁰G hält,

   Für The üpjohn Company Kalamazoo (Michigan,

   OBlGiNAt INSPECTSD

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