DE1617566B1 - Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven PolypeptidsInfo
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Description
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Her- . bei der Anwendung des erfindungsgemäß hergestellten
stellung eines physiologisch aktiven Polypeptide. * Polypeptide zur Cholesterinspiegelsenkung besteht
Es sind nur wenige Polypeptide bekannt, die bio- dabei darin, daß es sich bei dem Polypeptid um eine
logisch wirksam sind, beispielsweise solche der Hirn- wenig toxische, eine große therapeutische Breite beanhangdrüse.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu- 5 sitzende Substanz handelt, während die bekannten,
gründe, ein Verfahren zur Herstellung eines physio- zur Senkung des Cholesterinspiegels verwendeten
logisch aktiven Polypeptide zu schaffen, welches zur Medikamente häufig zu unerwünschten Nebenwirkun-
Cholesterinspiegelsenkung sowie zur Steigerung der gen im Organismus führen können.
17-Keto-Steroid-Ausscheidung geeignet ist. Weiterhin hat es sich überraschenderweise gezeigt,
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei einem io daß die 17-Keto-Steroid-Ausscheidung durch Ver-
Verfahren der eingangs genannten Gattung dadurch abreichung des erfindungsgemäß hergestellten Polygelöst,
daß reticulo-endothelialreiche Organe von ■ peptids in signifikanter Weise gesteigert werden kann.
Säugetieren bei einer. Temperatur von nicht mehr als Es wurde gefunden, daß durch orale Verabreichung
45° C einer vollständigen enzymatischen Proteolyse von täglich 100 mg des erfindungsgemäß hergestellten
unterworfen werden, dann das Reaktionsgemisch von 15 Polypeptide die 17-Keto-Steroid-Ausscheidung erheb-
den unlöslichen Bestandteilen getrennt und daraufhin lieh gesteigert werden kann, während sie durch Testo-
das Polypeptid durch eine Polypeptidabtrennungs- steronverabreichung verringert wird. Damit steht ein
methode abgetrennt wird. Mittel zur Verfugung, mit dem die 17-Keto-Steroid-
AIs reticulo-endothelialreiche Organe kommen da- Ausscheidung älterer Menschen in physiologisch
bei Milz, Lymphdrüsen oder Knochenmark in Frage. 20 unbedenklicher Weise über eine lange Zeit gesteigert
Die Abtrennung des Polypeptids kann durch eine der werden kann.
üblichen Polypeptidabtrennungsmethoden, beispiels- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Mt
weise durch Salzfällung oder durch Phenolextraktion, erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die enzyma- ™
erfolgen. Das so gewonnene Konzentrat kann gege- tische Proteolyse durch Pepsin, Trypsin oder Papain,
benenfalls noch in üblicher Weise gereinigt werden, 25 Ee hat sich überraschenderweise gezeigt, daß die
beispielsweise durch isoelektrische Ausfällung von Proteolyse auch bei Verwendung von Trypsin oder
Verunreinigungen, präparative Elektrophorese oder Papain nicht limitiert zu werden braucht. Die Pro-Säulenchromatographie.
·teolyse geht auch bei Verwendung dieser Substanzen
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren her- nicht bis zur Aminoeäure, sondern bleibt bei dem
gestellte physiologisch aktive Polypeptid besteht aus 30 erfindungsgemäßenPolypeptid stehen.Das erfindungs-
17 Aminosäuren und ist für parenterale, orale und gemäße Polypeptid ist oral anwendbar,
örtliche Anwendung geeignet. Das Polypeptid kann Es wurde gefunden, daß dier Proteolyse auch durch
außerdem noch eine braune prosthetische Gruppe. tierische Proteinasen, beispielsweise Kathepsine,
enthalten. Chymotrypsine oder Lab; pflanzliche Proteinasen,
Wenn man das nach dem erfindungsgemäßen Ver- 35 beispielsweise Bromelin oder Pomiferin; oder Bak-
fahren hergestellte Polypeptid hydrolieiert, werden terienproteinasen, z. B. Qostridiumarten oder bazillus
folgende Aminosäuren frei, wobei in Klammern subtilis, durchgeführt werden kann.
Mikromol Aminosäure pro 10 mg angegeben sind: Das Aussalzen" des physiologisch aktiven PoIy-
Lysin (5,18) Histidin (3,28), Arginin (4,35), Asparagin- peptids kann durch Alkalimetall-, Erdalkalimetall-,
säure (4,15), Threonin (5,15), Serin (3,29), Glutamin- 40 Ammonium- oder Aluminiumsalze erfolgen. Auch
säure (6,10), Prolin (6,54), Glycin (6,69), Alanin andere übliche Trennungsgänge, beispielsweise durch
(5,85), Cystein (0,92), VaHn (5,56), Methionin (0,70), '. wasserlösliche organische Lösungemittel oder durch
Ieoleucin (2,87), Leucin (6,02), Tyroein (2,46), Phenyl- Lösen in einer teilweiee wasserlöslichen Substanz, ^
alanin (4,27). beispielsweise Phenol, können angewandt werden. Die fj
Das Molekulargewicht des Polypeptids beträgt 45 durch Aussalzen gewonnenen Konzentrate eignen sich
weniger als 5000. Das physiologisch wirksame Poly- vornehmlich zur oralen Anwendung,
peptid verhält sich wie ein reines Polypeptid sowohl Wenn das physiologisch aktive Polypeptid zur
bei Chromatographie als auch bei Papierelektro- parenteralen Anwendung kommen soll, ist ein weite-
phorese. Der isoelektrische Punkt liegt bei pH 5,5. r . rer Reinigungsvorgang wünschenswert. Eine Reini-
Der Rf-Wert dee Polypeptids liegt in Partridge- 50 giing kann in einfacher Weise durch isoelektrische
Lösung zwischen 0,5 und 0,6. Die spezielle Stoff- Ausfällung, durch Säulenchromatographie mit An-
wechselwirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids ionen- oder Kationenaustauscherharzen, Dextrangel-
besteht in einer Senkung des Cholesterinspiegels im Anionen- oder- K-ationenaustauscher-Hj-Cellulose, SiIi-
Blut sowie in einer Steigerung der 17-Keto-Steroid- , kagel, Aluminiumoxyd oder andere Absorbentien,
Ausscheidung. ~ 55 oder durch Elektrophorese erfolgen. Die Reihenfolge
Das erfindungsgemäße Polypeptid ist durch seine der Reinigungsvorgänge ist beliebig und in das Ervorgenannten
physikochemischen Daten und pharma- messen des Fächmannes gestellt,
kologischen Eigenschaften definiert. Zum besseren Verständnie der Erfindung sind im
kologischen Eigenschaften definiert. Zum besseren Verständnie der Erfindung sind im
Dae nach dem erfindungegemäßen Verfahren her- folgenden mehrere Aueführungebeispiele angegeben,
gestellte Polypeptid eignet sich vorzüglich dazu, den 60 τι · · 1 1
Choleeterinepiegel im menechlichen Blut zu eenken, Beispiel 1 ;
der insbesondere bei älteren Menschen häufig über- 5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei
höht ist und hierdurch zur Arteriosklerose führen 40° C 24 Stunden mit 5 g Pepsin 1:1000 der Proteo-
kann. Es wurde gefunden, daß durch orale Anwen- lyse unterworfen, wobei 5 1 destilliertes Wasser zu-
dung von täglich 100 mg des erfindungsgemäß her- 65 gefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit
gestellten Polypeptids der Cholesterinspiegel bei einer Salzsäure auf 1,7 bis 1,9 eingestellt wurde. Daraufhin
großen Anzahl von Personen im Mittel um etwa 10 wurde das Reaktionsgemisch durch ein Papierfilter
bis 15% gesenkt werden konnte. Der große Vorteil gefiltert. Zu der klargefilterten Lösung wurden
32 Gewichtsprozent Natriumchlorid gegeben. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde abgetrennt
und getrocknet und war für orale Anwendung geeignet, vorzugsweise in Form von Tabletten oder
Dragees.
5 kg Lymphdrüsen von Rindern wurden bei 40° C 72 Stunden mit 10 g Pepsin 1:1000 der Proteolyse
unterworfen, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Salzäure
auf 1,7 eingestellt wurde. Daraufhin wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert. Zu der klaren Lösung
wurden dann 20 bis 25 Gewichtsprozent Phenol gegeben. Die Phenolphase wurde von der Wasserphase
im Scheidetrichter getrennt und das Phenol aus der Phenolphase durch Äther extrahiert. Das zurückbleibende
Konzentrat, das das physiologisch aktive Polypeptid enthält, war an sich bereits in dieser Form
für parenterale Verwendung geeignet. Zur weiteren Reinigung wurde jedoch das gesamte Konzentrat, das
aus der Phenolphase durch Entfernen des Phenols gewonnen wurde, mit Wasser auf ein Trockengewicht
von 10% verdünnt. Durch Zugabe von 7,472 g NaH2PO4 und 0,784 g Na2HPO4-2 H2O wurde der
pH-Wert dieser Mischung eingestellt, worauf der erhaltene Niederschlag durch Filtration oder Zentrifugieren
entfernt wurde. Nach isotonischer Einstellung war das gereinigte Konzentrat zur parenteralen Anwendung
geeignet.
5 kg frisch zerkleinerte Schweinemilz wurden bei 45° C und einem pH-Wert von 8,0 6 Stunden lang
durch 125 g Trypsin (Ig = 40 000 Fuld-Gross-Einheiten)
abgebaut, wobei 5 1 destilliertes Wasser zugefügt wurden und die Einstellung des pH-Wertes
durch Natronlauge erfolgte. Die weitere Konzentrierung erfolgte wie im Beispiel 1.
5 kg frisch zerkleinerte Rindermilz wurden bei 45° C 10 Stunden mit 40 g rohem Papain behandelt,
wobei 51 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Natronlauge auf einen
Wert von 7,0 eingestellt wurde. Die weitere Konzentrierung und Reinigung der Mischung erfolgte wie im
Beispiel 2.
5 kg Knochenmark von Rindern wurden bei 40° C 72 Stunden lang mit 10 g Pepsin der Proteolyse unterworfen,
wobei 51 destilliertes Wasser zugefügt wurden und der pH-Wert der Lösung mit Salzsäure auf
1,7 eingestellt wurde. Nach der Konzentrierung durch Phenolextraktion wie im Beispiel 2 wurde das Konzentrat
durch Säulenchromatographie gereinigt.
Die Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptids wurde wie folgt geprüft:
I. die Glykose roter Blutkörperchen von 1 Milliliter Blut wurde während einer Stunde vor und
nach Verabreichung des Polypeptids anaerob geprüft. Nach der Zugabe des Polypeptids war
die Glykose vermindert. Dieses Ergebnis wurde auch 24 Stunden nach Verabreichung des Polypeptids
gefunden.
Π. Die Glykose zweier Gruppen von Mäuse- oder Ratten-Acites-Tumorzellen wurde 6 bis 7 Tage
nach Transplantation verglichen, die eine Gruppe nach Injektion einer isotonischen Salzlösung, die
andere Gruppe nach Injektion einer Lösung des erfindungsgemäßen Polypeptids. Nach Behandlung
mit dem Polypeptid war die Glykose vermindert.
Der Nachweis der Erythrozytenglykose kann beispielsweise nach einem Verfahren erfolgen, wie es in
dem Artikel von W. Kuhlmey in »Das medizinische Laboratorium«, 19, Heft 1 (1966), angegeben ist.
Weitere therapeutische Eigenschaften des erfindungsgemäßen Polypeptids können sich aus der oben
beschriebenen metabolischen Aktivität ergeben.
Das erfindungsgemäße, physiologisch aktive Polypeptid kann vorteilhaft mit einem oder mehreren
pharmazeutischen Träger bzw. Trägern verwendet werden.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids, dadurch gekennzeichnet,
daß reticulo-endothelialreiche Organe von Säugetieren bei einer Temperatur von nicht mehr als 45° C einer vollständigen enzymatischen
Proteolyse unterworfen werden, dann das Reaktionsgemisch von den unlöslichen Bestandteilen
getrennt und daraufhin das Polypeptid durch eine Polypeptidabtrennungsmethode abgetrennt
wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteolyse mit Pepsin,
Trypsin oder Papain erfolgt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB775366A GB1142571A (en) | 1966-02-22 | 1966-02-22 | A new polypeptide, and a method of preparing it |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1617566B1 true DE1617566B1 (de) | 1971-06-09 |
Family
ID=9839062
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1967K0061478 Pending DE1617566B1 (de) | 1966-02-22 | 1967-02-21 | Verfahren zur Herstellung eines physiologisch aktiven Polypeptids |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE1617566B1 (de) |
| GB (1) | GB1142571A (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2848051A1 (de) * | 1977-11-08 | 1979-05-10 | Genentech Inc | Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3151979A1 (de) * | 1981-12-31 | 1983-07-14 | Karl Dr.med. 2900 Oldenburg Kuhlmey | Verfahren zur herstellung eines cholesterinspiegelsenkenden polypeptids aus reticulo-endothelreichen organen von saeugetieren und dessen verwendung |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020031563A1 (en) | 1992-09-30 | 2002-03-14 | Hodge Thomas W. | Method of inhibiting tumor necrosis factor |
| CN1223602C (zh) | 2001-07-13 | 2005-10-19 | 一泰医药研究（深圳）有限公司 | 序列号11的生物活性肽 |
-
1966
- 1966-02-22 GB GB775366A patent/GB1142571A/en not_active Expired
-
1967
- 1967-02-21 DE DE1967K0061478 patent/DE1617566B1/de active Pending
Non-Patent Citations (1)
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| None * |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| DE2848051A1 (de) * | 1977-11-08 | 1979-05-10 | Genentech Inc | Synthetische dna und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3151979A1 (de) * | 1981-12-31 | 1983-07-14 | Karl Dr.med. 2900 Oldenburg Kuhlmey | Verfahren zur herstellung eines cholesterinspiegelsenkenden polypeptids aus reticulo-endothelreichen organen von saeugetieren und dessen verwendung |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB1142571A (en) | 1969-02-12 |
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