DE1617457A1

DE1617457A1 - Verfahren zur Stabilisierung von Zubereitungen interferierender Virusprodukte

Info

Publication number: DE1617457A1
Application number: DE19671617457
Authority: DE
Inventors: Romano Dr Angelucci
Original assignee: Carlo Erba SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1966-12-16
Filing date: 1967-12-09
Publication date: 1972-04-20
Also published as: SE350069B; GB1170679A; US3674864A; NL6717142A; FR1573000A

Description

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Die vorliegende Erfindung Wfcariif-t aligemein gesagt Terfaihren zur StalDilisierang äex EinWirkung^lciafi von Zu-- ' bereitungen von inaktivierten Tirem^ insbesondere·· G-rippeviren, welelie bei der Prophylaxe gegen Tirenericranlcungen verwendbar sind* derartige Zubereitungen sind dädiurch erhältlieh, daB/Suspensionen von Viren mit nV-Strählen oder mittels Hitze nach der Methode yon W. Henle und K. Pauker (Virology 1958» ,6» 181) oder entsprechend der in der US-Paten-feschrift 3 259 547 von'1966 oder der in dem Österreichischen Patent 33 598/63 von Qlin Mathieson Ghem. Corp. mit der amerikanischen Priorität vom 25·9·1962 beschriebenen Methode behandelt.

Verfährt man wie in den oben angegebenen Patentschriften beschrieben und wendet man z.B. Influenza-Virus APE 8 oder Ml 1 oder B Lee, so wurde gefunden, daß die nach den vorstehenden Erläuterungen hergestellte, schließlich erhaltene Suspension bestrahlter Viren in gepufferten physio-. logischen Kochsalzlösungen (gepufferter Kochsalzlösung nach

" Sörensenj physiologische ITatriumchlori dlö sung von 0,9 ^) BAD OR/Qi_NAL 2Θ98 1 7/137 7

ihre haemagglutinierende Wirkung und Einwirkungskraft in den folgenden Stuf en des Einfrierens oder der Lypphilisation, welche angewandt werden, um, das Produkt über längere Zeit intakt zu !halten, in bemerkenswertem Umfang verliert. Werden z.B. Suspensionen von Influenza—Virus A-FB. 8, B. Lee oder J¹M 1 nach, der Methode von Mizutani H* (iTature 1965, 198 , 109) und mittels Bifferentialzentrifugierung gereinigt und untersuch.t, so ist zu beobeciiten, daß der Haemagglutinationstiter nach Einfrie-ren und Iiyöphylisieren in bemerkenswertem Umfang abnimmt, wenn das Supensionsmittel physiologische Kochsalzlösung (0,9 1> S-ehalt), gepufferte Kochsalzlösung nach H. Dulbeccö und M. Vogt (j.Exp.Med. 1954, 99 -, 1967) oder gepufferte Kochsalzlösung nach Sörensen (Biοehem. Ztsehr. 1909, 2V, =131) war. Dies ergibt sich aus dem folgendem .Diagramm.

Figur 1: Abwandlung des Häemagglutinationstiters von gereinigtem, bestrahltem, in Kochsalzlösung suspendiertem und bei —25° C gehaltenem Influenza-Virus APR 8.

BAD ORIGINAL

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Haemagglutinationsausgangstiter (HA-Titei? 50 ^): 1/10240

1/10240-1/5120-

1/2560-1A28O-

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£ = in pkysiologisciier Lösung (0,9 ^ KaCl) hergestellte Suspension^ y / =.-■ _ ^! ;

ο = in gepufferter KoGhsalzlÖsung naeli DUltecco und Vogt hergestellte Suspension

χ■-. in gepufferter Koehsaizlösuiig nach SÖrensen hergestellte Susrpension. : i :

Die Änderung des Haemagglutinationstiters von gereinigtem, "bestrahltem und in Kochsalzlösung suspendiertem und Iyoßhylisiertem Influenza-Virus APR 8 ergibt sich aus föl-' gendemt - _-. : ^v -.-.-. , y' f.\-_ ^; ^: Der Haemagglutinationsausgangstiter; (HA 50 $) betrug t/10240. Der Haemagglutinationstiter einer in physiologischer Kochsalzlösung CG, 9 $> NaCl) hergestellt en Suspension betrug nach der Lyophyiisatiön 1/1280^ |HA-Titer 50 io) \ der^ HaemaggLutinatiönstiter^ einer in gepufferter

ORfGINAL

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Lösung nach Dulbecco und Vogt hergestellten Suspension betrug nach LyophylisatiLon i/t£80 (M-Ti t er 50 "$'■)·

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilisierung von Zubereitungen von interferierenden Viren ist dadurch, gekennzeichnet, daß eine Virussuspensiön zuerst (nach der Methode von Mizutani) gereinigt, sodann mittels ÜV-Bestrahlung inaktiviert und hiernach mittels Differentialultrazentrifugierung weiter gereinigt wird, sodann in einer Lösung eines Mono»- und/oder Disaccharide suspendiert und schließlich lyophylisiert wird. Unter Überwindung der vorstehend erwähnten Nachteile wird also zuerst eine Reinigung der Virussuspension durchgeführt, die mittels verschiedener Metnoden erhalten wurden, bei denen allantoische oder amniotische Flüssigkeiten von bebrüteten Eiern oder Flüssigkeiten von diploiden menschlichen Zellen verwendet wurden, die mit verschiedenen Viren infiziert und ¹¹ in vitro" kultiviert wurden. Diese Reinigung kann nach verschiedenen Methoden durchgeführt werden. In den nachfolgenden Beispielen wurde die Suspension gemäß H. Mizutani gereinigt.* mittels einer ersten Zentrifugierung bei 6500 I|/min« für 10 Minuten und Vermischen der überstehenden Flüssigkeit mit -einer 12,5 %-igen Suspension von BaSO^ in doppelt destilliertem Wasser· Das so erhaltene Gemisch wird 10 Minuten bei +4° G gerührt, wonach es 12 Stunden im Kühlschrank stehengelassen wird und sodann langsam zentrifugiert wird« Die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und der Niederschlag wird in einer Lösung von Natriumzitrat (0,25 M-, pH 8,0) wieder suspendiert.

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Das Gemisch wird sodann 5 Minuten gerührt, undüber Eacht bei 4° C gehalten. Durch Zentrifugierung wurde die virushaltige ITatriumzitratiösung gewönnen und bei +4° G unter kontinuierlichem fiühren gegen doppelt destilliertes Wasser dialysiert.- ;

Das so gewonnene Produkt wurde in geeigneter Weise verdünnt und durch Bestrahlung mit UV-Licht nach einem der vorerwähnten Methoden inaktiviert und sodann 90 Minuten bei 43 500 U/min, zentrifugiert» Der niederschlag wurde in Lösungen verschiedener Konzentrationen von Mono- und/oder Disacchariden suspendiert und diese Lösungen wurden lyophylisiert. Besonders geeignet erwies sich eine Konzentration entsprechend einer Schmelzpunktserniedrigungvon Ä = -0,53° C.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

Wie vorstehend erwähnt gereinigte Suspensionen von Influenza-Yirus APE 8 wurden in Lösungen von Mono™ und Disacchariden mit einer Konzentration entsprechend einer Gefrierpunkts exniedrigung von Δ * -0,53° C hergestellt und sodann lyophylisiert. Als Kontrolle dient eine in Salzlö-* sung (0,9 $> NaCl) und eine in gepufferter Kochs al zlösung nach Dulbecco und Vogt hergestellte gleiche Suspension. Das Ergebnis war wie folgt:

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Haemagglutinationstiter vor Lyophylisierung

Saccharose	1/5120
Maltose	1/5120
Lactose	1/5120
Glucose	1/5120
NaCl 0,9 $>	1/5120
Kochsalzlösung nach Dulbecco und Vogt	1/5120
Beispiel 2

Haemagglut inati ons · titer nach Lyophylisierung

1/5120 1/5120 1/5120 1/5120 1/1280 1/1280

In einer anderen Versuchsreihe wurde die Wirkkraft von Suspensionen von Influenza-Virus APB 8 B Lee und PM 1 in bebrüteten Eiern untersucht, welche gereinigt und mit UV-Licht bestrahlt und in physiologischer Kochsalzlösung (0,9 $ NaCl), gepufferter Kochsalzlösung nach Sörensen, gepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco und Vogt und in Lösungen von Mono- und Disacchariden hergestellt wurden. Die Zubereitungen wurden lyophylisiert und vor Gebrauch durch Zugabe eines geeigneten Volumens an destilliertem Wasser gelöst.

Die Wirkkraft wurde bestimmt, indem 200 Eaemagglutinationsdosen eines inaktiven Virus verwendet wurden, welche vor der Lyophylislerung des Materials verifiziert wurden. Die zur Herstellung der einzelnen Suspensionen angewandte Methode war wie folgt (nach Henle und Pauker)? 18 elf Tage bebrütete Leghorneier wurden über das Allantoin mit 200 HA 50 $-Dosen von mit W-Strahlen inaktiviertem Virus

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JiER 8 teimpft. Dieser ifeiiaiag^ü1iiti^tiöiasi;d^Bi· wurdte vor . der liyöphylisier^üng beistimmt«, Ϊ6 Stünden näijh ^impfung warten diese bei fer ^eternit üng bei +;35^Q C gehaltenen Eier in G-ruppen von Je 6 Eimern aufgeteilt und jede Svwgpe wttrile mit 0,2 ml aktivem Virus ÄER ® in Basen eiatspreohend Ί χ tO⁴, 1 χ 1Ό⁵ und 1 χ JW⁶ Eiinfelcti ons dösen 50 i> (ElB 50 ψ) infiiisiert. Zur gleichen Zeit wurdfen 16 weitere, je*- doch "niöht behandelte Eier in drei Gruppen ^von $e 6 Eiern auigeteilt uOd aof allantöisce&em ^eg mit alctiv^em AER 8 Virus entsprechend den vörferwähnten Dos^n und Bedingungen beimpft (Kontrollen). Die Eier wurden in ^inen.Brutöfen bei +55° C gesetzt und 24 Stunden nöiCh Beinipfung mit dem aktiven Virus herausgenommen. Öl ei ehe Meiig5en allantöischer Plüssigkeit von 3 Eiern wurden für jede ÖrupJpe zusammengegeben. Sie allantoischen PlüSisigkeiten der verbleibenden 5 Eier jeder Gruppe wurden nach einer Bebriiteng von 48 Stunden gesammelt. Die Ergebnisse waren wie folgt:

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Die aus den beschri ebenen Untersuchungen erhaltenenDaten ."".r zeigen eine Verminderung der Wirlcfcraft eler> in Eochsalzlö-^ sungen hergestellten Zubereitungen von Virus im Vergieich ; zu solchen, die unter Zusatz von Mono- und Ms$.cchäriden hergestellt wurden. ' "--v .- ": ^ ..:; r; ."

Patentansprüche;

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Claims

Patentansprüche;

1. Verfahren zur Stabilisierung von Zubereitungen von interferierenden Viren, dadurch gekenn- -_: zeichnet, daß eine Virussuspension zuerst gereinigt, sodann mittels UV-Bestrahlung inaktiviert und dann durch Differentialultrazentrifugierung weitergereinigt wird, sodann in einer Lösung eines Mono- und/oder Disaccharids suspendiert und schließlich lyophylisiert wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Mono- und/oder Disaccharid Grlucose, Mannose, Galactose, Laevulose, Saccharose, Lactose oder Maltose verwendet wird.

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