DE1617284C3

DE1617284C3 - Vorrichtung und Verfahren zum Züchten von Gewebekulturzellen

Info

Publication number: DE1617284C3
Application number: DE1617284A
Authority: DE
Inventors: Joseph Bernard Waukegan Schleicher; Ronald Eugene Grayslake Weiss
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1965-12-23
Filing date: 1966-12-02
Publication date: 1974-07-11
Also published as: US3407120A; BR6685644D0; NL6617693A; GB1097669A; SE357574B; SE357387B; DE1617284A1

Description

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An den durch die Endplatten 17 hindurchgeführten eine mechanische Pumpe verwendet werden. F i g. 2

Enden 16 sind die Trägerstäbe 13 mit Gewinde ver- zeigt eine Abänderung der Vorrichtung, bei der zum

sehen. Das ganze Aggregat von Platten 12, Träger- Umwälzen der Flüssigkeit eine außerhalb des Gefäßes

stäben 13 und Endplatten 17 wird von den Muttern 18 angeordnete Pumpe dient. Das Nährmedium 14 wird

zusammengehalten. 5 durch die Einlaßleitung 31 vom Boden des Gefäßes 11

Das Gefäß 11 steht auf der elastischen Schutzunter- durch die sterile Pumpe 32 angesaugt und durch die

lage 19 und ist zwischen der Grundplatte 20 und der Auslaßleitung 33 zum Flüssigkeitsspiegel gepumpt, wo

Deckplatte 21 eingeklemmt. Die Befestigungsstäbe 22 es austritt. Auf diese Weise wird das Medium umge-

sind an der Grundplatte 20 befestigt und durch Öff- wälzt und belüftet, so saß in dem ganzen Gefäß 11

nungen in der Deckplatte 21 hindurchgeführt, und das io gleichmäßige Wachstumsbedingungen herrschen.

Ganze wird durch die auf die Enden der Befestigungs- Das Gefäß 11 mit dem darin befindlichen Medium

stäbe 20 aufgeschraubten Muttern 23 zusammengehal- 14, den Platten und der Umlaufpumpe kann sich in

ten. Zwischen dem Gefäß 11 und der Deckplatte 21 einem Ofen mit konstanter Temperatur oder in einem

befindet sich der elastische Dichtungsring 24, so daß thermostatisch gesteuerten Bad befinden, um die

das Gefäß 11, wenn es in dieser Weise eingespannt ist, 15 Wachstumstemperatur zu steuern. Das Gefäß kann

sich zwischen dem Dichtungsring 24 und dem elasti- aber auch mit einem Mantel ausgestattet sein, durch

sehen Kissen 19 befindet. den eine Temperatursteuerungsflüssigkeit umläuft. Die

Die bisher üblichen Verfahren, bei denen die Probenahme aus dem Gefäß zwecks Steuerung des Gewebekulturen in mit Stopfen verschlossenen pH-Wertes kann von Zeit zu Zeit oder kontinuierlich Flaschen gezüchtet werden, haben den Nachteil, daß 20 erfolgen. Gegebenenfalls kann das Nährmedium durch die in dem Gewebekulturmedium zur Verfügung ein pH-Registriergerät überwacht werden, das seinerstehende Sauerstoffmenge das Wachstum der Zellen seits mit einem Steuergerät in Verbindung steht, um die infolge von Erschöpfung an Sauerstoff oder unkon- Zufuhr von Kohlendioxyd und damit den pH-Wert des trollierbaren Konzentrationsgefällen und pH-Schwan- Nährmediums zu steuern.

kungen, die durch Ansammlung von Kohlendioxyd 25 F i g. 3 erläutert schematisch ein vollständig selbstzustande kommen, beschränken kann. Die Vorrichtung tätiges System, bei dem das Nährmedium durch einen und das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglichen Wärmeaustauscher, eine Belüftungssäule und eine eine konstante Sauerstoffzufuhr und Vermischung des Gewebezellenzüchtungssäule umläuft, welch letztere Nährmediums 14, so daß an allen aufeinandergestapel- die aufgestapelten, in Abständen voneinander stehenten und voneinander auf Abstand stehenden Platten 12 30 den Platten enthält. Zur Steuerung und Innehaltung gleichmäßige Wachstumsbedingungen herrschen. Bei der richtigen Wachstumsbedingungen dienen verden bekannten Verfahren war ein großes Volumen an schiedene Meß- und Steuergeräte. In der dargestellten Gasphase erforderlich, um genügend Sauerstoff zur Ausführungsform strömt das Nährmedium 14 aus der Verfügung zu stellen und das erzeugte Kohlendioxyd Gewebekultursäule 10 durch eine Leitung in den aufzufangen. Bei der in F i g. 1 dargestellten Ausfüh- 35 Wärmeaustauscher 35, der zum Erhitzen oder Kühlen rungsform der Erfindung wird ein steriles Gemisch aus des Nährmediums verwendet werden kann. Durch das Luft und Kohlendioxyd durch den Einlaß 25 in das von dem Temperaturregistrier- und -steuergerät 37 Verteilerrohr 26 eingeleitet, wobei die Luft den nötigen selbsttätig betätigte Ventil 36 und eine Warmwasser-Sauerstoff zur Verfügung stellt und das Kohlendioxyd zuführung wird die richtige Züchtungstemperatur zur Steuerung des pH-Wertes dient. An Stelle von 40 innegehalten. Aus dem Wärmeaustauscher 35 strömt Kohlendioxyd können auch andere Mittel zum Steuern das Nährmedium 14 weiter über die Pumpe 38 in die des pH-Wertes verwendet werden. Wenn das Gas- Belüftungssäule 39. Auf diesem Strömungsweg passiert gemisch aus dem unteren Ende des Verteilerrohres 26 das Medium 14 die pH-Elektroden 40, die den pH-austritt, erzeugen die frei aufsteigenden Gasblasen eine Wert des Nährmediums bestimmen und auf dem Wege Turbulenz in der Flüssigkeit, die das Zellenwachstum 45 über den pH-Verstärker 41 und das pH-Registrier- und auf einem Teil der Fläche der Platten 12 stören kann. -steuergerät 42 das Ventil 43 betätigen, durch das Um diese Wirkung nach Möglichkeit einzuschränken steriles Kohlendioxyd zwecks Einstellung des pH- und gleichzeitig einen Umlauf des Nährmediums 14 Wertes in das Nährmedium eingeleitet wird. Abgezu erzeugen, ist die Luftheberpumpe 27 vorgesehen. messene Mengen steriler Luft werden in das Nähr-Wenn das Gasgemisch in die Luftheberpumpe 27 ein- 50 medium eingeleitet, wenn es in die Belüftungssäule 39 tritt, nehmen die aufsteigenden Gasblasen flüssiges eintritt, die mit Porzellansätteln oder anderen Füll-Nährmedium 14 durch das untere Ende 28 der Pumpe körpern zur Erzielung eines guten Kontaktes zwischen 27 mit und führen es aufwärts, so daß es aus dem Gas und Flüssigkeit beschickt ist.
oberen Ende der Luftheberpumpe ausfließt. Auf diese Mit der oben beschriebenen Vorrichtung kann das Weise wird eine gleichzeitige Belüftung und schwache 55 folgende Verfahren zum Züchten von Gewebezellen Zirkulation des Nährmediums 14 erzielt. Durch die durchgeführt werden: Zu Anfang wird die Vorrichtung Öffnung 29 können die Abgase und die gasförmigen gereinigt zusammengesetzt und sterilisiert. Dann stellt Produkte entweichen. Das Probenahmerohr 30, das man das flüssige Nährmedium und die zum Beimpfen sich nach unten in das flüssige Nährmedium erstreckt, erforderlichen Zellen her. Es wird eine Menge Nährdient zur zeitweiligen Entnahme von Proben des Nähr- 60 medium hergestellt die ausreicht, um die Platten in dem mediums zwecks Analyse und Verfahrenssteuerung. Gefäß zu bedecken. Das Nährmedium enthält die

Das Vermischen und der Umlauf des Nährmediums erforderlichen Salzlösungen, Puffer, Seren, pH-Indika-

14 sind erforderlich, um gleichmäßige Umweltbedin- toren und Antibiotica. Für die meisten Zellen wird der

gungen für das Zellenwachstum an sämtlichen Platten pH-Wert zweckmäßig zwischen 6,6 und 7,6 gehalten.

12 zu schaffen. Zum Mischen und Umlaufenlassen des 65 Die zum Beimpfen erforderlichen Zellen werden nach

Nährmediums kann die oben beschriebene Luftheber- einem Zellenabtrennungsverfahren gewonnen, bei dem

pumpe, eine Rührvorrichtung, z. B. ein Magnetrührer, einzelne Zellen von zerkleinerten Gewebestücken losein Vibrationsrührer oder ein Scheibenrührer, oder gelöst werden. Dies kann durch Einwirkung von

Trypsin oder anderen Enzymen oder aber nach anderen gelöstem Sauerstoff zu sättigen und den pH-Wert einmechanischen oder chemischen Verfahren erfolgen. zustellen

Die einzelnen Zellen werden in Nährmedium ge- Die Zellensuspension wird mittels einer Pumpe durch

waschen, um die proteolytischen Enzyme zu entfernen das in F i g. 1 dargestellte Rohr 30 in die sterilisierte oder zu neutralisieren. Dann werden die Zellen in der 5 Vorrichtung gefördert. Diese Vorrichtung besteht aus zum Beimpfen erforderlichen Konzentration wieder in einem 7V₂1 fassenden Gefäß aus schwer schmelzbarem dem Medium suspendiert. Die Suspension wird unter Glas, in dem 28 quadratische Glasplatten (10 ■ 10 cm) aseptischen Bedingungen unter der Wirkung einer in Abständen von 6,35 mm voneinander übereinander. Pumpe, eines Vakuums oder der Schwerkraft m die gestapelt sind. Eine Luftheberpumpe wird verwendet, Massen - Gewebekulturzuch ungsvorrichtung emge- io um etwa 4V₂I Nährmedium umlaufen zu lassen. Die fuhrt. Dann laßt man die Zellen so lange absitzen, bis Vorrichtung wird, wie oben beschrieben, gemäß sie sich auf den Oberflachen der Platten festgesetzt Fig. 1 zusammengesetzt. Man läßt die Zellensuspenhaben Zu diesem Zeitpunkt wird die Beluftungs- und sion 10 bis 15 Minuten mit Hilfe der Luftheberpumpe Umlaufvorrichtung in Tätigkeit gesetzt. Bei einigen 27 umlaufen, um eine gute Verteilung der ZeUen zu Zellen ist ein Festsetzen auf den Plattenoberflächen 15 gewährleisten. Dann wird die Luftheberpumpe abgemcht erforderlich, bevor man mit dem Umlauf des schaltet. Man läßt die Zellen sich auf den Oberflächen Nahrmedmms beginnt. Die Steuerung des pH-Wertes der Platten 12 4 Stunden absetzen. Sodann wird die und des gelosten Sauerstoffs und Koh endioxyds wird Gasheberpumpe 27 wieder in Tätigkeit gesetzt. Die durch Steuerung der Geschwindigkeit der Begasung Pumpe fördert das Gasgemisch mit einer Geschwindig- und des Flüssigkeitsumlaufs sowie durch Steuerung der ao keit von 300 ml/Min, und bewirkt gleichzeitig die Zusammensetzung der Gasphase erreicht. Die Tempe- Begasung und den Umlauf des Nährmediums Zu ratursteuerung erfolgt mitte s eines ummantelten diesem Zeitpunkt ergibt die Analyse einer Probe auf ( Gefäßes und eines äußeren Wärmeaustauschers oder gelösten Sauerstoff eine 50°/₀ige Sättigung, bezogen auf ^l dadurch, daß man das Gefäß meinem Wasserbad oder bei der gleichen Temperatur mit Luft gesättigtes Wasser. ~₍ ^{Raum v}™ konstanter Temperatur hält. Das 25 Die Begasung und der Umlauf des Nährmediums wer-Wachstum der Zellen auf den Platten wird an der Auf- den während der gesamten Wachstumsperiode mit nähme von Chemikalien aus xiem Nahrmedium sowie einer Geschwindigkeit von 300 ml/Min, fortgesetzt, so durch mikroskopische Beobachtung von Kontroll- daß die Menge an gelöstem Sauerstoff einem Sättigen und bzw. oder mittels einer oder mehrerer gungsgrad von 70 bis 90% entspricht. Mit Hilfe eines Beobachtungsplattenim dem System verfolgt undÜber- 30 Wasserbades von konstanter Temperatur, in dem sich wacht. Nach einer bestimmten Zeit bildet sich eine die gesamte Anlage befindet, wird die Temperatur im .einzige, zusammengeflossene Zellenschicht auf den Verlaufe von 6 bis 7 Tagen bei 36 bis 37°C konstant Oberflachen der Platten aus. Zu diesem Zeitpunkt gehalten

werden die Nährflüssigkeiten unter der Einwirkung Durch mikroskopische Untersuchung der Glasober-

von Druck, Vakuum oder Schwerkraft abgezogen, 35 flächen wird festgestellt, daß die Rindernierenzellen auf und das Gewebe kann gewaschen werden, um Spuren jeder Platte zu einer Schicht von normalen Zellen von Nahrmedium oder Serum daraus zu entfernen, zusammengeflossen sind, ebenso, wie sie in Gewebeworauf die Vorrichtung mit neuem Nahrmedium ge- kulturflaschen erhalten werden
füllt wird. Sämtliche Vorgänge werden unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Nunmehr können 40

die Zellen untersucht oder zur Herstellung von Impf- Beispiel 2

stoffen, für biochemische oder sonstige Zwecke ver-

wendet werden. Man arbeitet nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, ι

daß das Nährmedium, nachdem die Zellen 6 bis 7 Tage ^s

Beispiel 1 ⁴⁵ g^ezüchtet worden sind, aseptisch durch das »Me

dium 199« (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, S. 1, 1950)

„ . , , _T. . _. , ^zur Erhaltung der Zellen während der Viruserzeugung

Frisch gewonnene Nieren von jungen Rindern wer- ersetzt wird. Zusammen mit dem »Medium 199« wird

iil_of^{uf 2} i^{ls 5}^ verkleinert und mittels einer ein Stamm von an die Nierengewebekultur von jungen

0,25"/₀igen Trypsinlosung trypsimert. Die einzelnen ₅o Rindern angepaßtem Influenza-B/M-Virus eingeführt.

Zellen werden m einem Nahrmedium der folgenden Unmittelbar nach dem Zusatz des neuen Nähr-

Zusammensetzung suspendiert: mediums wird die Luftheberpumpe 27 angestellt. Von

_ , ... ..„ ~ . Zeit zu Zeit werden während der Viruserzeugung

SazlosunggemaßEarl Flüssigkeitsproben zur Analvse abgezogen. Nach

if^To^r⁰' ' ' 0*0/ 55 6tägiger Viruserzeugung werden die Flüssigkeiten

i>. lö/, W\5) yö /₀ aseptisch abgezogen und auf gelösten Sauerstoff und

Lactalbumin-Hydrolysat 0,5 % Virusgehalt analysiert. Die Analysen haben die folgen-

Kälberserum 4,0"/₀ den Ergebnisse:

Phenolrot 0,01 % ⁶<> Hämagglutinationstiter 16 je ml

pH-Wert mit CO₂ eingestellt auf .. 6,6 Hühnerzellenagglutination 6,7 je ml

Die Zellen werden in der zum Beimpfen erforder- Beispiel 3

liehen Konzentration (1,8 · 10⁵ Zellen je Milliliter) 65

wieder in dem obigen Medium suspendiert. Nunmehr Man arbeitet nach Beispiel 1 mit dem Unterschied,

wird das Medium mehrere Minuten mit einem sterilen daß die Nierenzellen von junaen Rindern durch den Gemisch aus 5 % CO₂ und 95 % Luft begast, um es mit Wistar-Zellenstamm WI-38 erlern werden Das Nähr-

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medium für diese Zellen ist folgendermaßen zusammen- Die Zellensuspension wird aus einzelnen Schichten gesetzt: von Zellen erhalten, die in mehreren Gewebekultur-Grundmedium flaschen gezüchtet werden. Die Zellensuspension wird, (E a gle, H., Science, 122, wie oben beschrieben, in die Züchtungsvorrichtung

S. 501,1955) 90 °/o 5 eingeführt. Nach 4 Tagen zeigt die mikroskopische

Kälberserum 10 % Beobachtung der Plattenoberflächen, daß die Zellen

Glutamin 0,29 g/l zu einer normalen Zellenkultur zusammengeflossen

Phenolrot 0,01% sind.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

den die auf Abstand gehaltenen Platten jeweils einzeln Patentansprüche: unterteilte Abteilungen. Eine Zirkulation des Nähr mediums ist nicht vorgesehen.

1. Vorrichtung zum Züchten von Gewebekultur- Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zum zellen, mit einem Gefäß (10) für flüssiges Kultur- 5 Züchten von Gewebekulturzellen, mit einem Gefäß (10) medium (14) und einer Anzahl von in dem Gefäß für flüssiges Kulturmedium (14) und einer Anzahl von auf Abstand voneinander stehenden Platten (12), in dem Gefäß auf Abstand voneinander stehenden gekennzeichnet durch eine Anordnung Platten (12), die gekennzeichnet ist durch eine An-(27; 31 bis 33) zum Umlaufenlassen des flüssigen Ordnung (27; 31 bis 33) zum Umlaufenlassen des flüssi-Kulturmediums und eine Leitung (26) zum Ein- io gen Kulturmediums und eine Leitung (26) zum Einleiten eines sauerstoffhaltigen Gases in das flüssige leiten eines sauerstoffhakigen Gases in das flüssige Kulturmedium. Kulturmedium.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet Die Platten (12) können aus Glas, Kunststoff oder durch eine Temperatursteuerungsanordnung (35 sonstigem geeigneten Werkstoff sein, auf dem sich die bis 37) in der Anordnung zum Umlaufenlassen des 15 Zellen festsetzen und vermehren können. In der Vorflüssigen. Kulturmediums zum Konstanthalten der richtung ist zweckmäßigerweise eine Temperatur-Temperatur des flüssigen Kulturmediums inner- Steuerungsanordnung (35 bis 37) in der Anordnung halb eines bestimmten Bereiches. zum Umlaufenlassen des flüssigen Kulturmediums

3. Verfahren zum Züchten von Gewebekultur- vorgesehen, um die Temperatur des flüssigen Kulturzellen, bei dem man in einem Gefäß, welches außer 20 mediums innerhalb eines bestimmten Bereiches kon-

■ dem flüssigen Kulturmedium eine Anzahl von in stant zu halten.

Abständen voneinander angeordneten Platten für Das erfindungsgemäße Verfahren zum Züchten von das Zellenwachstum enthält, das Kulturmedium Gewebekulturzellen, bei dem man in einem Gefäß, mit den zu züchtenden Zellen beimpft und das welches außer dem flüssigen Kulturmedium eine Anflüssige Medium belüftet, bis sich auf den Ober- 25 zahl von in Abständen voneinander angeordneten flächen der Platten zusammengeflossene Einzel- Platten für das Zellenwachstum enthält, das Kulturschichten von Zellen gebildet haben, dadurch ge- medium mit den zu züchtenden Zellen beimpft und das kennzeichnet, daß man das flüssige Medium in dem flüssige Medium belüftet, bis sich auf den Oberflächen Gefäß umlaufen läßt. der Platten zusammengeflossene Einzelschichten von

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- 3° Zellen ausgebildet haben ist dadurch gekennzeichnet, zeichnet, daß man das flüssige Medium abzieht, die daß man das flüssige Medium in dem Gefäß umlaufen gezüchteten Zellen durch Zusatz eines Virus mit läßt. Das flüssige Medium wird dann abgezogen, die einem frischen Nährmedium infiziert, das neue gezüchteten Zellen werden durch Zusatz eines Virus Nährmedium belüftet, die Belüftung des Nähr- mit einem frischen Nährmedium infiziert, das neue mediums fortsetzt, bis die gewünschte Viruskonzen- 35 Nährmedium wird belüftet, und die Belüftung wird tration erreicht ist, und das letztgenannte Nähr- fortgesetzt, bis die gewünschte Viruskonzentration ermedium zwecks Isolierung und Reinigung des Virus reicht ist. Dann wird das Nährmedium zum Isolieren entfernt. und Reinigen .des Virus entfernt. Das virushaltige Nähr-

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekenn- medium läßt man vorzugsweise umlaufen, zeichnet, daß man das virushaltige Nährmedium 40 Tn den Zeichnungen zeigt

umlaufen läßt. F i g. 1 einen Querschnitt durch eine Vorrichtung

ι·'--·' gemäß einer Ausführungsform der Erfindung,

F i g. 2 einen Querschnitt durch eine Vorrichtung

gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung

45 und

F i g. 3 eine schematische Darstellung eines selbsttätig gesteuerten Züchtungssystems.

Gewebekulturzellen zur Viruserzeugung für Impf- Die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 ist in F i g. 1

stoffe wurden schon auf dem Boden von rechteckigen und 2 dargestellt. Bei der Ausführungsform gemäß Flaschen gezüchtet. Die Flaschen werden mit sterili- 50 F i g. 1 sind in dem zylinderförmigen Gefäß 11 die siertem Gewebenährmedium beschickt, das eine Zellen- übereinandergestapelten, in Abständen voneinander suspension enthält. Dann werden die Zellen bebrütet, angeordneten Platten 12 untergebracht, auf denen die bis sich durch Zellenwachstum auf der unter der Zellen gezüchtet werden. Die Platten 12 werden durch Flüssigkeit befindlichen Glasoberfläche eine Schicht die gekerbten Trägerstäbe 13 auf Abstand voneinander bildet, worauf das Zellennährmedium durch ein 55 gehalten. Gegebenenfalls können die Platten auch auf frisches, virushaltiges Medium ersetzt wird. Wenn das andere Weise getragen und auf Abstand voneinander Virus in die Zellen eingedrungen ist und die Virus- gehalten werden; z. B. können auf jede Platte mehrere konzentration in dem Medium die erforderliche Höhe Abstandhalter von gleicher Dicke aufgesetzt werden, erreicht hat, wird das virushaltige Medium auf Impf- die die nächsthöhere Platte tragen und den Abstand stoffe verarbeitet. Um nach dieser Methode nennens- ⁶° zwischen den Platten bestimmen. Die Anordnung, werte Mengen an Gewebekulturen zu erhalten, müssen mittels derer die Platten 12 auf Abstand voneinander die Zellen auf den Böden einer großen Anzahl von gehalten werden, soll, den freien Zutritt und den UmFlaschen gezüchtet werden. lauf des Nährmediums 14 zwischen den auf Abstand Aus der deutschen Patentschrift 659 150 ist ein Bak- stehenden Platten 12 ermöglichen. Die in der Zeichterienbrut- und -sterilisierschrank bekannt, bei dem "5 nung dargestellten Stäbe 13 haben Kerben 15, in die sich ein Nährmedium auf Platten befindet, die auf die Platten 12 eingesetzt sind. Die Kerben 15 sind in Abstand voneinander stehen und die in dem Schrank den Trägerstäben 13 so angeordnet, daß sie die Platten angeordnet sind. Bei dieser bekannten Apparatur bil- 12 in den gewünschten Abständen voneinander halten.