DE1518057A1

DE1518057A1 - Verfahren zur Herstellung injizierbarer Zubereitungen mit prolongierter ACTH-Aktivitaet

Info

Publication number: DE1518057A1
Application number: DE19641518057
Authority: DE
Inventors: Homan Dr Jan Daniel Herman; Evert De Jager
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1963-02-15
Filing date: 1964-02-14
Publication date: 1970-06-18
Also published as: CH467073A; FI42743B; BE643835A; BR6456859D0; AT246925B; FR3597M; US3678027A; DK107248C; NL289055A; SE327504B; ES295953A1; GB1046523A; DE1518057B2; DE1518057C3

Description

betreffend

"Verfahren zur Herstellung injizierbarer Zubereitungen mit prolongierter AGTH-Aktivität".

Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer, schwerlöslicher Komplexverbindungen, bestehend aus einer therapeutisch zulässigen Verbindung eines Metalls, das die Resorption von Proteinhormonen verlangsamt und einem Peptid mit der Aktivität von adrenocorticotropem Hormon und injizierbarer Zubereitungen, die eine oder mehrere dieser Komplexverbindungen enthalten und eine erhöhte und prolongierte Aktivität von adrenocorticotropem Hormon aufweisen.

Adrenocorticotropes Hormon (ACTH) wurde während vieler Jahre aus den Vorderlappen von Säugern für die Herstellung von Arzneimitteln isoliert. Seine günstige Wirkung bei gewissen Erkrankungen ist allgemein bekannt« In den letzten Jahren erfolg-

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te eine rascfee Entwicklung von Verfahren zur Synthese von Proteinen und verschiedenen Forschern gelang die Synthese von Peptiden mit ACTH-Aktivität. Da festgestellt wurde, daß nur ein Teil des ACTH-Moleküls für die charakteristische V/irkung auf die Nebenniere wesentlich ist, kann man allgemein erwarten, daß diese synthetischen Peptide mit ACTH-Aktivität als Arzneimittel verwendet werden und im Laufe der Zeit das ACTH aus tierischen Organen ersetzen werden. Letztere sind ein kostspieliges Ausgangsmaterial, das noch immer nur in verhältnismäßig kleinen Mengen gewonnen werden kann. Der Bedarf an Präparaten mit erhöhter und prolongierter Wirkung wird dementsprechend zunehmen.

Aus der US-Patentschrift Nr. 2 807 569 sind für Injektionsaecke geeignete ACTH-Zubereitungen bekannt, in welchen das Hormon mit einem oder mehreren Salzen oder einem oder mehreren Hydroxyden oder Oxyden von Metallen, die die Resorption von Proteinhormonen verzögern, kombiniert ist und diese Verbindungen können einen unlöslichen oder schwerlöslichen Komplex mit dem ACTH bei pH-Werten von etwa 6 bis etwa 8 bilden. In der US-Patentanmeldung Nr. 212 454· werden zinkh^altige Suspensionen von ACTH beschrieben, die entsprechend den Verfahren der US-Patentschrift Hr. 2 807 569 hergestellt werden und durch Zusatz einer, von einem Oxyd des Phosphors abgeleiteten, Säure oder einem Derivat einer solchen Säure gekennzeichnet sind.

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Die neuen schwerlöslichen Komplexverbindungen nach der Erfindung bestehen aus einer pharmazeutisch zulässigen Metallyerbindung, die ein Salz, ein Hydroxyd oder ein Oxyd eines Metalls sein kann, das die Resorption von Proteinhormonen verzögert und einem der Peptide mit der Aktivität von adrenocorti- · ootropem Hormon mit einer Aminosäuresequenz aus zumindest den ersten 19 und nicht mehr als den ersten 31 Aminosäureresten des ACTH· Unter AGTH ist hier der Hauptbestandteil eines Gemisches von "Verbindungen mit der Aktivität von adrenocorticotropem Hormon zu verstehen, wie es in der Hypophyse von z. B. Menschen, Schweinen, Rindern oder Schafen auftritt. Die Aminosäuresequens dieses Hauptbestandteils ist für die genannten Arten von Säugern bekannt. Dieser Hauptbestandteil besteiit in allen Fällen aus 39 Aminosäureresten. Von Serin, der N-terminalen Aminosäure an, ist die Sequenz 1-24 bei den verschiedenen Säugern identisch. In der Sequenz 25 - 32 findet man jedoch Unterschiede bezüglich der Zusammensetzung und Aminosäuresequenz, jedoch erwiesen sich diese Unterschiede nicht von wesentlicher Bedeutung für-die biologische Aktivität des ACTH. In dieser.: Zusammenhang wird auf die Literatur über die Strukturaufklärung der verschiedenen AGTH-Moleküle aus.verschiedenen Tierarten hingewiesen. Siehe z. B. T. H. Lee und Mitarbeiter, Γ. 'fiol. Chem. £36, 2970 (1961) und R. G. Sheperd und Mitarbeiter, J. Am. Chem. Soc. TO, 5069 (1956).

Aus einer Suspension der erwähnten schwerlöslicher, xlom-

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plexverbindungen in einem wässrigen injizierbaren Vehikel . und mit einem pH-Wert der Suspensionen von etwa 6,0 bis etwa 8,0 können injizierbare Zubereitungen hergestellt werden. Diese v/eisen eine prolongierte und erhöhte AGTH-Aktivität auf. Sowohl die schwerlöslichen Komplexverbindungen nach der Erfindung, als auch die injizierbaren Zubereitungen sind neu.

Unter Peptiden mit ACTH-Aktivität, die als Bestandteil der .uomplexverWindungen nach der Erfindung auftreten, sind die freien Peptide und deren funktionelle Derivate zu verstehen· Letztere sind z. Be Amide und Hydrazide, die substituiert oder unsubstituiert und von der Carboxylgruppe des 5. und des C-terminalen Aminosäurerestes abgeleitet sein können, ferner Ester mit aliphatischen, aromatischen oder araliphatischen Alkoholen, z. B. Methanol, Äthanol und Benzylalkohol, Alkaliealze und Säureadditionssalze der Peptide, die sich von Garbonsäuren, ζ. Β. Z itronen-, Esrnstein-, Äpfel-, Halon-, ".'ein-, Glutamin-, Gerb-, Essig-, Propiolsäure oder anorganischen Säuren, z. B. Chlorwassersto:fsäure oder Phosphorsäure ableiten. Diese funktioneilen Lerivate kennen v/ hrend oder nach der Herstellung der betreffenden Peptide entstanden sein.

Als Beispiele für die erfiridungsgemäß verwendeten Peptide können Peptide mit ACTH-Aktivität erwähnt werden, die eine Sequenz der ersten 19, 20, 24, 26, 28 und 31 Aminosäurereste enthalten unä in nachstehenden Beispielen zur Herstellung inji-

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zierbarer Arzneimittel verwendet wurden. Alle basischen Aminosäuren in dem ACTH-Molekül befinden sich in der Sequenz 6 _ 21, zum Unterschied von den sauren Aminosäuren. Die Mehrzahl der letzteren tritt in der Sequenz 25 - 39 auf. Infolgedessen zeigen Peptide mit Sequenzen von 1-18 bis 1 - 31 einen höheren isoelektrischen Punkt, als das ACTH-Molekül mit 39 Aminosäurerestene Außerdem zeigen diese Peptide mit ACTH-Aktivität eine erhöhte löslichkeit bei pH-Werten von etwa 6 bis etwa 8. Da sie Eigenschaften besitzen, die physikalisch und chemisch von denen des ACTH-Moleküls verschieden sind, ist es überraschend, daß die basischen Peptide mit ACTH-Aktivität mit den erwähnten Metallverbindungen Komplexe bilden, die bei pH-Werten von etv/a 6 bis etwa 8 schwer löslich oder unlöslich sind und daß die erhaltenen Komplexe im Vergleiche zu ATCH eine verstärkte und prolongierte Aktivität aufweisen. Anscheinend spielen die basischen Aminosäurereste eine wichtige Rolle bei der Bildung der schwer löslichen Metallkomplexverbindungen. Die prolongierte Aktivität der Metallkomplexverbindungen dieser Peptide erschien ausgeprägter bei Verwendung von Komplexen mit kleineren Peptiden. Deshalb wird die Verwendung von Peptiden mit ACTH-Aktivität, die Aminosäuresequenzen von 1-19 bis 1 - 24 besitzen, bevorzugt. Dies wird anhand der in den nachstehenden Beispielen angeführten pharmakologischen Ergeonisse näher erläutert, überdies wird durch Verabreichung von Zubereitungen aus diesen kleineren Peptiden in der Humanmedizin verhütet, daß frende Peptide injiziert werden, die nach längerer Verabreichung schädlich wirken können.

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Die verwendeten Peptide mit ACTH-Aktivität können durch enzymatisehen Abbau von ACTH hergestellt werden (siehe Shejfcard und Mitarbeiter, J. Am. Chem. Soc. 78__f 5051 (1956)). Sie können auch auf synthetischem Wege hergestellt werden, z. B. nach den von H. Kappeier und R. Schwyzer in HeIv. Chim. Acta 44, 1136 (1961) beschriebenen Verfahren. Eine Synthese des 20-Peptids wurde von K. Hoffman und Mitarbeitern in dem J. Am. Chem. Soc. 84, 4481 (1962) beschrieben. Dieses Peptid wurde in Form seines Amids hergestellt und als solches in Beispiel 7 verwendet· Die Synthese des 19-Peptids wurde von C. H. Li in dem J. Am. Chem. Soc. 82_, 5760 (1960) beschrieben. Folgende Peptide mit ACTH-Aktivität wurden hergestellt:

a) Sequenz 1-31 durch Abbau mit Pepsin,

b) Sequenz 1 - 28 durch Abbau mit Pepsin und Carboxypeptidase A

c) Sequenz 1-26 durch Abbau von verestertem ACTH mit Pepsin und hierauffolgende Einwirkung von Carboxypeptidase A und Verseifung

d) Sequenz 1-24 durch Abbau des 26-Peptids mit Carboxypeptidase B,

e) Sequenz 1-24 durch Synthese,

f) Sequenz 1-20 durch Synthese,

g) Sequenz 1-19 durch Synthese.

In dv.;.i Ascorbinsäuretest (ascorbic acid depletion test) nach der Q.S.P. XVI (US-Pharmakopöe XVI) wurden die folgenden

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biologischen Potenzen mit den angeführten Vertrauensgrenzen für P β Of05 nach subcutaner Injektion gefunden»

31-Peptid 148^27-1727u.S.P.E/mg

28-Peptid 1OO/~78-129_7 " "

26-Peptid 99<f" 69-1427 " "

24-Peptid 61^"51~ 727 " »
19-Peptid

20-Peptid 73<f*59- 9θ7
24-Peptid 101^*85-1

Die Komplexverbindungen nach der Erfindung bestehen aus einem Träger auo einem schwerlöslichen Salz, Hydroxyd oder Oxyd eines oder mehrerer der angegebenen Metalle und dem Peptid mit ACTH-Aktivität, das an diesem Träger als aktiver Bestandteil adsorbiert ist. Ein solcher Komplex kann als "Adsorptionskonplex" bezeichnet werden.

Die für-das erfindungsgemäße Verfahren am meisten geeigneten Metalle sind Zink, Nickel, Kobalt, Kupfer und Eisen. Auch Gemische derselben können verwendet .werden. Vorzugsweise wird das physiologische Metall Zink verwendet und zwar in Form seines Hydroxyds, Oxyds, Phosphats oder eines Gemisches derselben. Die Reihenfolge, in welcher das Peptid, die Ketallverbindung und das Medium zusammengebracht werden, ist nicht vcn wesentlicher Bedeutung. Die Komplexverbindunf; kann aus den Reaktiensgexisch isoliert und zu gegebener Zeit in einem pharmazeutisch geei^ne-

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BAD GriiGt.MAL

- 8 ten wässrigen Medium wieder suspendiert oder direkt in einem

solchen Medium hergestellt werden, wodurch das Reaktionsgemisch selbst als Injektionszubereitung verwendet werden kann. Gewöhnlich wird aus dem Peptid mit ACTH-Aktivität eine wässrige Lösung hergestellt, welcher man eine wässrige Lösung eines Metallsalzes hinzufügt, worauf man den pH-Y/ert z. B. mittels einer Natriumphosphat- und/oder einer Natriumhydroxydlösung auf den gewünschten Wert einstellt. Bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 8 entsteht die Suspension eines bei diesem pH-V/ert gebildeten Komplexes, der aus dem Peptid mit ACTH-Aktivität, das an die Metellverbindung, z. B. Zinkphosphat oder Zinkhydroxyd, adsorbiert ist, besteht. Schließlich wird die erhaltene Suspension auf ein Volumen verdünnt, das die gewünschte Anzahl von Einheiten, z. B. 30 U.S.P.-Einheiten/ml enthält. Soll die Zubereitung die Form einer Lösung haben, dann verwendet man eine lösliche Metallverbindung als Ausgangsmaterial, deren pH-Y/ert auf einen Wert eingestellt wird, bei welchem das Metall in Lösung bleibt. Nach der Injektion einer solchen Zubereitung entsteht durch die Pufferwirkung der Körperflüssigkeiten an der Injektionsstelle ein schwerlöslicher oder unlöslicher Komplex. Diese Zubereitungen sind ebenfalls neu und ein Gegenstand der Erfindung.

Es wurde gefunden, daß die Verwendung von 1 - 20 mg Metall je 100 Uo3oP.-Einheiten einen sehr günstigen Einfluß auf die Aktivität der Peptide mit AGTH-Aktivitat ausüben. Vorzugsweise verwendet man 2 bis 8 mg Metall je 100 U.S.P.-Einheiten.

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Auch wird vorzugsweise ein wässriges Medium mit einem Konservierungsmittel, z. B. einem Phenol, Benzylalkohol oder einem Ester von p-Hydroxybenzoesäure, einer Verbindung, die die Zubereitung isotonisch maoht, z. B. Natriumchlorid und einem Puffer, um den pH-Wert auf dem gewünschten Wert zu halten, z. B. einem Acetat- oder Phosphatpuffer, verwendet.

Ferner wurde gefunden, daß die Stabilität und lagerbeständigkeit der Zubereitungen nach der Erfindung durch Zusatz einer von einem Phosphoroxyd abgeleiteten Säure oder eines Derivats dieser Säure in einer Menge von etwa 0,05 bis etwa 0,70 mg-Äquivalent PO* je mg-Ä'quivalent Zink verbessert werden. Beispiele für solche Oxysäuren von Phosphor sind Metaphosphor-, Phosphor-, Orthophosphor-, Pyrophosphor- und Tripolyphosphorsäure. Unter "Derivate dieser Säuren" sind pharmazeutisch zulässige anorganische Salze dieser Säuren, Ester dieser Säuren mit organischen Hydroxyverbindungen, z.B. Nucleoside. , Kohlenhydrate. , Polylakohole. und Hydroxyaminosäuren und geeignete anorganische Salze dieser Ester zu verstehen. Als Beispiele von Salzen und Estern von Oxysäuren von Phosphor können primäre, sekundäre und tertiäre Natrium-, Kalium- und Ammoniumsalze, G-lycerophosphate, Fructose-, Ribose- und G-lucosephosphate und Nucleosidphosphate, z. B. Adenosin-mono-, di- und triphosphat, Gytidinphosphat und Phosphoserin, ferner Phosphamide, z. B. e< tinpho:;phat, erwähnt werden»

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- ίο -

Die prolongierte Aktivität der Zubereitungen nach der Erfindung wurde mittels einea pharmakologischen Tests bestimmt, der auf dem ursprünglich in Endocrinology 4£, 379 (1948) beschriebenen Ascorbinsäuretest beruht· Anstelle einer intravenösen Injektion wurde einer Gruppe von 8 Ratten eine subcutane Injektion von 3 U.S.P.-Einheiten in Form eines Adsorptionskomplexes mit z. B. Zinkhydroxyd verabreicht. Einer anderen Gruppe von 8 Ratten wurden, ebenfalls subcutan, 3 U.S.P.-Sinheiten eines ACTH-Standardpräparats ohne Zinkhydroxyd verabreicht. Nach 24 Stunden wurde bei jeder Ratte der beiden Gruppen der Ascorbinsäuregehalt der linken und rechten Nebenniere zusammen bestimmt. Die Differenz zwischen dem durchschnittlichen Ascorbinsäuregehalt der Nebennieren der beiden Gruppen diente als Kriterium für die prolongierte Aktivität. (Siehe hiezu British Pharmacopoea 1958, Addendum 1960, Seite 21). Bei diesem Test wurde z. B. die sehr bedeutende Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 331 /Ug/100 mg Nebennieren mit einer Zubereitung beobachtet, die aus einem synthetischen Peptid mit ACTH-Aktivität, mit der Sequenz 1-24 und Zinkhydroxyd als Metallverbindung hergestellt wurde.

Die Zubereitungen nach der Erfindung wurden klinisch geprüft, wie in den Seispielen 7 und 9 beschrieben. Die Ergebnisse dieser Prüfungen bestätigen das günstige Ergebnis der pharmakologischen Prüfungen«

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In den nachfolgenden Beispielen wird die Herstellung und ZusammenSetzung einiger Zubereitungen, die Peptide mit ACTH-Aktivität enthalten, beschrieben und ihre prolongierte Aktivität gezeigt.

Beispiel 1

22,7 mg des 31-Peptids mit einer Potenz von 148 U.S.P.Einheit en/mg wurden in 2 ml Wasser gelöst. Hierauf wurden 3,4 ml einer Zinkchloridlösung mit einem·Gehalt von 43,9 mg/ml Zink und 2 ml einer Lösung von sek.-Natriumphosphat mit einem Gehalt von 63»2 mg/ml Na₂HPO^.12 aq. hinzugefügt. Das Gesamtvolumen der Lösung wurde mit destilliertem Wasser auf 10 ml aufgefüllt und diese lösung hierauf tropfenweise unter Rühren 25 ml einer Lösung der folgenden Zusammensetzung zugegeben» 2 ^c' (Gewicht/Volumen) Benzylalkohol und 1,2 Gew,-< Natriumchlorid. Gleichzeitig wurde eine 0,5 n-Natriumhydroxydlösung tropfenweise hinzugefügt, ua so den pH-Wert auf 8,0 zu halten. Die erforderliche Jesastraenge an Alkali betrug 5,3 ml.

Schließlich wurde das Volumen mit destilliertem ",'asser auf 50 ml gebracht.

Die Zusammensetzung der so erhaltenen Suspension war folgende ι

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31-Peptid 60 U.S.P.-E/ml

Zink 3 mg/ml

Na₂HPO₄ 1.0 mg/ml

Benzylalkohol 10 * mg/ml

Natriumchlorid 9.0 mg/ml

pH-Wert 8.0

Eei i.er Prüfung auf prolongierte Aktivität wurde eine

durchschnittliche Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 202 /^ug/ mg Nebennieren gefunden, was eine sehr gute prolongierte

Aktivität anzeigt.

- Auf gleiche Weise wurden entsprechende Zubereitungen unter Verwenden.;; von Kotalt und Eisen, anstelle von Zink, hergestellt. Auch diese zeigten in dem erwähnten Test eine prolongierte Aktivität.

Beispiel 2

:,^Tach '.en Verfahren von Beispiel 1 wurde mit dem 28-Peptid ir.it A3TH-Ai-:tivität eine Suspension der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

25-Peptid (100 U.S.P.-3/mg) 30 U.3.P.-E/ml Zink (als Zinkchlorid zugegeben) 1.75 mg/ml

Ha₂HPO/. 0.58 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml

!Tat ri urne hl ο rid 8.5 mg/ml

pH-V:ert QC9825/1857 ⁸*° BAD ORIGiMAL

Bei der Prüfung auf prolongierte Aktivität wurde eine Wirkung von 240 /Ug/100 mg Nebennieren gefunden«,

Beispiel 3

Nach dem Verfahren von Beispiel 1 wurde aus dem 24-Peptid mit ACTH-Aktivität eine Suspension der folgenden Zusammensetzung hergestellt:

24-Peptid (61 U.S.P.-E/mg) 30 U.S.P.-E/ml Zink (als Zinkchlorid zugegeben) 1,75 mg/ml Na₂HPO₄ 0,58 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml Natriumchlorid 8,8 mg/ml

pH-Wert 8,0

Bei dem Ascorbinsäuretest wurde die sehr hohe Wirkung, von 347 /Ug/100 mg Nebennieren gefunden·

Beispiel 4

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurde eine Suspension der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt«

31-Peptid (106 U.S.P.-E/mg) 60 U.S.P.-E/ml Zink (als Zinkchlorid zugegeben) 3 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml 009825/185 7

Natriumchlorid 9.1 mg/ml

pH-Wert 8.0

Eei dem Ascorbinsäuretest wurde eine Wirkung von 192 Mg/ mg Nebennieren gefunden.

Beispiel 5

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurde eine Suspension der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt»

26-Peptid (99 U.S.P.-E/mg) 60 U.S.P.-E/ml

Zink (als Zinkchlorid zugegeben) 2,5 mg/ml

benzylalkohol 10 mg/ml

Natriumchlorid 9,3 mg/ml

pH-7/ert 7,5

Bei der Prüfung auf prolongierte Aktivität zeigte diese Zubereitung eine Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 182 /Ug/ mg Nebennieren,

Beispiel 6

Nach dem Verfahren von Beispiel 1 wurde eine Suspension der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt»

19-Peptid (45 U.S.P.-E/mg) 40 U.S.P.-E/ml

Zink (als Zinkacetat zugegeben) 2 mg/ml 009825/1857

₂₄ 0,66 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml

Natriumchlorid 9,2 mg/ml

pH-Wert -8,0

Diese Zubereitung ergab bei der Prüfung auf prolongierte Aktivität eine Wirkung (response) von 293 /ug/100 mg Nebennieren. ,

Beispiel 7

In der oben beschriebenen Weise wurde eine Suspension der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt:

20-Peptid (73 U.S.P.-E/mg) 60 U.S.P.-E/ml

Zink (als Zinksulfat zugegecen) 3 mg/ml

Na₂HPO₄ 1,0 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml

Natriumchlorid 9,3 mg/ml

pH-Wert' 7,8

Bei der Prüfung auf prolongierte Aktivität betrug die Senkung des Ascorbinsäuregehaltes 312 /ug/100 mg Nebennieren.

Diese Zubereitung wurde an 7 Patienten in einer Dosierung von 60 U.S.P.-Einheiten klinisch getestet. Alle 4 Stunden vrarien in dem Blut Eosinophilzählungen av-rchgefTnrt. Der Prozentsatz

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BAD

der Eosinophilen wurde für jeden Patienten berechnet und die Mittelwer/te berechnet. Das Abfallen der Eosinophilwerte und die Wiederherstellung des Blutbildes entsprechend dem zu Beginn des Versuches gefundenen gestatten ee, die prolongierte Aktivität der Zubereitung zu bestimmen. Folgende Eosinophil-Mittelwerte wurden gefunden»

Zeit (h)	Werte	Injektion	4	8	12	16	20	-	24
•	0	91	43	38	36	84	102
100

Eine Zubereitung ähnlicher Zusammensetzung, Jedooh mit derselben Kenge handelsüblichem ACTH, lieferte folgende Eoeinophilwertei

Zeit (h)	Injektion	4	8	12	16	20	24
	0	50	25	50	87	102	,101
Werte	100

Aus diesen Zahlen ist klar zu erkennen, d«8 die Aktivität der ersten Zubereitung langer anhielt,

Beispiel 8

14,-1 it.- eir.es synthetischen 24-peptids mit AOTH-Akti-009825/1857

BAD Or^i'-iAL

vität, mit einer Potenz von 101 U.S.P.-Einheiten/mg wurden in 5 ml angesäuertem Wasser (pH-Wert 3,0) gelöst.

4,7 ml einer Zinkchloridlösung mit einem Gehalt von 21,4 mg/ml Zink wurden hinzugefügt und das Gesamtvolumen mit Wasser auf 20 ml gebracht. Dieser Lösung wurden 20 ml einer Lösung, die 12,5 mg/ml Phenol und 15 mg/ml Natriumchlorid enthielt, hinzugefügt. Unter Rühren wurde der pH-Wert durch tropfenweise Zugabe von 4,8 ml einer carbonatfreien, 0,5 n-Natriumhydroxydlösung auf 7,6 eingestellt und das Volumen mit Y/asser auf 50 ml gebracht.

Die auf diese Weise hergestellte Suspension besaß nachfolgende Zusammensetzung:

24-Peptid 40 U.S.P.-E/ml

Zink 2 mg Zn/ml

Phenol 5 mg/ml

Natriumchlorid 8,8 mg/ml

pH-Wert 7,6

In dieser Zubereitung war das Zink hauptsächlich als basisches Salz der Formel ZnGl₂. x Zn(OH)₂ anwesend.

Diese Zubereitung gab eine Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 267 /ug/iOO mg Nebennieren in der Prüfung auf pro-

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longierte Wirkung.
Beispiel 9

Nach Beispiel 1 wurde eine Suspension der nachstehen den Zusammensetzung hergestellt:

24-Peptid (101 U.S.P.-E/mg) 30 U.S.P.-E/ml Zink 1,75 mg/ml

Na₂HPO₄ 0,58 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml pH-Wert 8,0

Im Ascorbinsäuretest wurde eine Wirkung von 287 /U 100 mg Nebennieren gefunden.

Diese Zubereitung wurde an 7 Patienten in einer Dosierung von 60 U.3.P.- Einheiten klinisch geprüft. Die 17-0H-Gorticoidexkretion im Urin in 24 Stunden wurde nach CC, Porter und R. H. Silber, J. Biol. Chem. JI85_, 201.(1950) an 4 aufeinanderfolgenden Tagen bestimmt. In der nachstehenden Tabelle geben die Zahlen die 17-Hydroxycorticoidexkretion in mg/24 h an.

Tabelle 009825/1857

Patient^.	1	Injektion von 60 U.S.P.-E 2	3	4
1	6,5	22,2	5,8	4,7
cvi	8,1	29,6	15,1	8,3
3	6,4	26,7	9,7	5,0
4	10,9	33,3	13,3	8,0
5	9,4	39,2	9,2	9,6
6	8,0	43,9 •	17,5	6,4
7	7,2	24,9	9,4	2,8

All· 7 Patienten reagierten am Injektionstag. Bei 4 der 7 Patienten wurde sogar am 2. Tag nach der Injektion eine deutliche Wirkung festgestellt.

Beispiel 10

Haoh dem oben beschriebenen Verfahren wurde eine Suspension der nachstehenden Zusammensetzung hergestellt:

31-Peptid (148 U.	0098	S	.P.	-E/mg) ·	30 U.S.P.-E/ml	mg Ni/ml	BAD OF.iüiMAL
HiSO₄				2	,3 mg/ml
Na₅PO₄				2,	,5 mg/ml
Phenol				O₁	,9 mg/ml
NaCl				8,	pH 7,0
NaOH
2	5/	1857

Der Test auf prolongierte Aktivität ergab eine bedeutend verlängerte Wirkung.

Beispiel 11

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurde eine Suspension nachstehender ZuBammenBetzung hergestellt»

26-Peptid (99 U.S.P.-E/mg) 40 U.S.P.-E/ml CuSO₄ 2 mg CU/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml NaCl 9,3 mg/ml

' NaOH pH 8,0

Bei dem Test auf prolongierte Wirkung wurde eine Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 147 /ug/100 ml Nebennieren festge stellt.

Beispiel 12

Ί.Β wurde eine Suspension nachstehender Zusammensetzung hergestellt»

20-Peptid 30 U.S.P.-E/ml

CoSO₄ 1,5 mg Co/ml

Na₃PO₄ 2,8 mg/ml

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Glycerin 2,4 mg/ml

Phenol 0,5 mg/ml

pH-Wert 6,4

Der Teat auf prolongierte Wirkung ergab eine Senkung des AsoorbinBäuregehaltes von 155 mg/100 mg Nebennieren.

Beispiel 13

Es wurde eine Suspension der nachfolgenden Zusammensetzung hergestellt»

24-Peptid 60 U.S.P.-B/ml

Ferriacetat 3,5 mg Pe/ml

NaCl 9,0 mg/ml

Methylparaben (p-Hydroxybenzoe-

säuremethylester) 0,85 mg/ml Propylparaben (p-Hydroxybenzoe-

säurepropylester) 0,15 mg/ml NaOH pH 6,5

Die Senkung des Ascorbinsäuregehaltes betrug 173 /Ug/iOO mg Nebennieren.

Beispiel 14

Es wurde eine Suspension der nachstehenden Zusammensetzung

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hergestellt}

19-Peptid (45 tJ.S.P.-E/mg) 40 Ü.S.P.-E/ml ZnCIp 2 mg Zn/ml

Na₃PO₄ 3,3 mg/ml

Phenol 0,5 mg/ml

Glycerin 2,4 mg/ml

pH-Wert 6,0

Die in der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren vorhandene ACTH-Aktivität betrug 0,36 U.S.P.-Einheiten/ml, wodurch die Entstehung eines schwerlöslichen Komplexes bewiesen wurde.

Beispiel 15

-Nach Beispiel 8 wurde eine Suspension der nachstehen den Zusammensetzung hergestellt. Hiebei wurde anstelle von Phenol Benzylalkohol als Konservierungsmittel verwendet»

24-Peptid (101 E/mg) 40 U.S.P.-E/ml

Zink (als ZnCIp zugegeben) 1 mg/ml

Benzylalkohol 10 mg/ml

Natriumchlorid 9,1 mg/ml

pH-Wert 7,8

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Unter diesen Bedingungen entstand ein schwerlöslicher Koaplex. Die AÖTH-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde EU O_t25 tJ.B.Pe-Einheiten/el bestimmt. Das bedeutet, daß mehr ale 99 ffi der Aktivität in der schwerlöslichen Komplexverbindung Yorhanden war. Ferner zeigte die Zubereitung eine bedeutend verlängerte Aktivität, da man eine Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 321 /Ug/100 «g Hebennieren fand.

Beispiel 16

Es wurde eine Zubereitung "der nachstehenden Zusammenset-Bung hergestellt ι

1-24 Peptid 40 U.S.P.-E/ml

Zink (als ZnGl₂ xugegeben) 4 mg/ml Benzylalkohol 10 mg/ml

Natriumchlorid 9»1 mg/ml

pH-Wert 4,0

Diese Zubereitung gab in dem Test auf verlängerte Aktivität eine Senkung des Ascorbinsäuregehaltes von 137 /Ug/100 mg. Nebennieren*

BAD ORIGINAL

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Patentansprüche

Claims

Pat entansprüohe

1. Verfahren zur Herstellung injizierbarer Zubereitungen mit prolongierter ACTH-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem wässrigen, für Injektionszwecke geeigneten, Träger ein Peptid, das ACTH-Aktivität und eine Sequenz von zumindest den ersten 19 und höchstens den ersten 31 Aminosäureresten des ACTH-Moleküls besitzt, Kit einem oder mehreren Salzen, Hydroxyden oder Oxyden eines Metall·, das die Resorption von Proteinhormonen verzögert und sohwerlösliohe Komplexverbindungen mit diesem Peptid bei einem pH-Wert gleich dem der Gewebeflussigkeiten bilden kann, zur Reaktion bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeioh net, daß man den pH-Wert der Zubereitung auf einen Wert zwischen etwa 6 und etwa 8 einstellt·

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeioh net, daß man ein Peptid mit ACTH-Aktivität und mit einer Sequenz von zumindest der der ersten 19 und höchstens der der ersten 24 Aminosäurereste des ACTH-Moleküls verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeioh net, daß man 1 - 20 mg Metall je 100 U.S.P.-Einheiten de· Beptids verwendet.

BAD ORIGINAL

009825/1857

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

«eichnet , daß man als Metall Zink, gickel, Kobalt, Kupfer oder Eisen rerwendet.

6, Verfahren nach Anspruch 5_f dadurch gekennzeichnet, daß man als Metall Zink verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß man eine von einem Oxyd von Phosphor abgeleitete Säure oder einen Ester oder ein pharmazeutisch geeignetes Salz dieser Säure oder des Esters in einer Menge von etwa 0,05 bis etwa 0,70 mg-Äquivalent PO^ je mg-Äquivalent Zink verwendet.

BAD

009825/18B7