DE1598296B2 - Einrichtung zur Beschleunigung chromatographischer Analysen von Aminosäuregemischen und ähnlichen Gemischen - Google Patents

Description

Die Erfindung wird an Hand einiger Ausführungsbeispiele im folgenden näher beschrieben. Es zeigt

F i g. 1 eine schematische Anordnung,

F i g. 2 eine Alternative nach F i g. 1,

F i g. 3 eine weitere Alternative, F i g. 4 eine andere Ausgestaltung nach F i g. 1 und

F i g. 5 ein Schema der Anordnung einer Einrichtung für die Durchführung des klassischen Verfahrens der bisher gebräuchlichen Chromatographie in einer Dreierkolonne.

Umfangsstutzen 1 bis 6 eines Vielwegehahnes, mit Vorteil eines automatischen Sechswegehahnes 7, können an einen zentralen Stutzen 8', der durch eine Leitung 9 mit einer Pumpe 10 verbunden ist, angeschlossen sein, welche die Eluenten in eine große Kolonne 11 drückt. Die Umfangsstutzen 1 bis 6 des Hahnes 7 sind an Behälter 12,13,14,15 für die EIutionslösungen angeschlossen, wobei die Stutzen 1 und 3 miteinander verbunden und direkt an den Behälter für den ersten Elutionspuffer angeschlossen sind, während der zwischen ihnen befindliche Stutzen 2 an den gleichen Behälter 12 über ein druckloses Dosiersystem 16 angeschlossen ist.

In ähnlicher Weise wird das Eluat in eine einzige kleine Kolonne 17 durch eine Pumpe 18 gedrückt, wobei der Eluent aus einem Behälter 19 entweder direkt oder gegebenenfalls unter Verwendung einer drucklosen Dosiereinrichtung 20 über einen automatischen Dreiweghahn 21 angesaugt wird, der in der einen Stellung die Pumpe 18 direkt mit dem Gefäß 19 und in der anderen Stellung das Gefäß 19 über das drucklose Dosiersystem 20 verbindet. Das drucklose Dosiersystem 16 für die große Kolonne 11 und das drucklose Dosiersystem 20 für die kleine Kolonne 17 können durch gestrichelt eingezeichnete Druckdosiersysteme 22 und 23 ersetzt werden, die dicht vor der Kolone 11 und 17 angeschlossen sind. In diesem Fall kann der Stutzen 2 des Mehrweghahnes? an einen nicht eingezeichneten Behälter für eine weitere Elutionslösung angeschlossen sein, oder es kann die Zahl der Stutzen um zwei verringert werden. Bei Verwendung von beispielsweise nur zwei Elutionslösungen kann der dargestellte, automatische, standardmäßig hergestellte Sechswegehahn 7 so verwendet werden, daß immer zwei gegenüberliegende Stutzen miteinander verbunden sind, wodurch für einen analytischen Zyklus lediglich drei, d. h. die Hälfte der Umdrehung des Kerns des Sechswegehahnes 7 notwendig sind. Im Falle der Anwendung eines Druckdosiersystems 23 an Stelle des drucklosen Dosiersystems 20 kann der Zweiwegehahn 21 entfallen. Das gleiche gilt auch für den Fall, daß eine manuelle Dosierung in die Kolonne in der klassischen Art angewendet werden soll, wobei die Dosiersysteme überhaupt entfallen. Die drucklosen Dosiersysteme haben gegenüber den Drucksystemen den Vorteil, daß bei ihnen minimale Forderungen an die Dichtheit gestellt werden. -

Bei den klassischen Systemen für die Durchführung der Analysen auf einer kleinen und zwei großen Kolonnen werden für die Elution der großen Kolonne Zitratpuffer mit einer Azidität von pH 3,25 bis 4,25 verwendet mit einer Lösungsnormalität von 0,2 und für die Regenerierung 0,2 N NaOH. Für die kleine Kolonne wird nur ein Zitratpuffer mit einer Azidität von pH 5,28 bei einer Normalität von 0,35 angewendet. Bei der Einrichtung gemäß der Erfindung können mit Vorteil diese Puffer und auch die Regenerierlösung verwendet werden, die beim klassischen Verfahren verwendet werden, wobei das Wesen des Effektes hinsichtlich der Elutionsdauer auf einer einzigen Kolonne, wie auch hinsichtlich einer besseren Trennung der verhältnismäßig schwer trennbaren Aminosäuren, Thyrosin, Phenylalanin dadurch erreicht wird, daß für nur eine große Kolonne ein dritter Elutionspuffer mit einer größeren Azidität und auch Normalität im Vergleich zu den beiden ersten Puffern verwendet wird. Mit Vorteil kann auch dieser dritte Puffer für eine einzige große Kolonne identisch sein mit einem Elutionspuffer für die kleine Kolonne. Wenn die zugehörigen Leitungen miteinander verbunden sind, wie dies in der Abb. 1 durch eine gestrichelte Verbindung 24 angedeutet ist, kann einer von den zwei Behältern 14 oder 19 entfallen.

Dies aus den Kolonnen 11 und 17 ablaufenden Eluate werden durch kapillare Leitungen 25 und 26 zum hydraulischen Schalter 27 geführt, der in seinem Drehkern mit Vorteil zwei dünne Kanäle 28, 29 besitzt, welche die angeführten Leitungen 25 und 26 so miteinander verbinden, daß wenn eine von ihnen an eine Zuleitung 30 zur Auswerteeinrichtung angeschlossen ist, die andere an einen Abfall 31 oder umgekehrt angeschlossen ist. Der hydraulische Schalter 27 kann gleich wie die hydraulischen Schalter 7 und 21 mit der Hand bedient werden, wenn eine Automatisierung nicht gewünscht wird. Ein wichtiger Vorteil besteht darin, daß alle drei hydraulischen Schalter leicht automatisch auf Befehle einer zentralen Programmiereinrichtung, die nicht in der F i g. 1 eingezeichnet ist, bewegt werden können. Auch im Falle einer vollkommenen Automatisierung, einschließlich einer automatischen Eintragung der Proben aus dem Dosiersystem auf die Kolonne kann eine vollständige Automatisierung durch außerordentlich einfache Mittel erreicht werden, wie es aus der vereinfachten Gesamtanordnung gegenüber der klassischen Anordnung hervorgeht, die später bei der Erläuterung zur F i g. 4 beschrieben ist. Die Vorteile einer auch manuellen Bedienung des ganzen analytischen Systems gemäß F i g. 1 auch im Falle einer Automatisierung liegen vor allem darin, daß sie eine Sicherung im Falle einer Störung des automatischen Systems oder in solchen Fällen bedeuten, bei denen aus irgendwelchen Gründen der Prozeß individuell geführt werden soll, abweichend von einem automatischen, programmierten Prozeß. Für diesen Zweck können die automatischen Schalter 7, 21 und 27 so ausgebildet sein, daß ihre manuelle Verschiebung auch im Falle eines Anschlusses an eine automatische Beherrschung möglich ist.

Der hydraulische Schalter 27 schaltet das aus den Kolonnen 11 und 17 fließende Eluat durch die Leitung 30 an die Auswerteeinrichtung in solchen Momenten, in denen sie die separierten Komponenten, deren Separierung auf der zugehörigen Kolonne erzielt wurde, wegführen. Hierdurch wird erreicht, daß die ganze Auswerteeinrichtung dauernd zur Auswertung des Eluats, sei es von der ersten, sei es von der zweiten Kolonne 11 oder 17 benützt wird. Hierbei drückt das Eluat aus der einen Kolonne nach dem Umschalten das Eluat vor sich, das sich für die Dauer von etwa 15 Minuten im Reaktor befindet, wohin es vor dem Umschalten aus der vorherigen Kolonne gedrückt wurde. Die ganze Funktion der großen Kolonne 11 ist so eingerichtet, daß in der Zeit, in der das Eluat in die Auswerteeinrichtung aus

der kleinen Kolonne 17 weggeführt wird, auf der großen Kolonne 11 die Beendigung der Elution, insbesondere durch einen dritten Elutionspuffer, weiter eine kurze Regenerierung und wiederum eine Stabilisierung mit dem Puffer verläuft, der vorzugsweise identisch mit dem ersten Elutionspuffer sein kann. Mit diesem wird in der Zeit des Wegführens des EIuats aus der kleinen Kolonne 17 in die Auswerteeinrichtung die Elution der vorhergehenden Analyse auf der großen Kolonne 11 und weiter deren Regenerierung und Restabilisierung beendigt. Auf der kleinen ' Kolonne 17 verläuft vor dem Umschalten ihres EIuats auf die Auswerteeinrichtung die Elution der sauren und basischen Aminosäuren in einem im Wesen nichtseparierten Zustand in den Abfall 31 vor dem Augenblick des Umschaltens. Nach dem Umschalten auf die große Kolonne 11 sichert das Eluat aus dieser Kolonne dagegen den Transport der auf der kleinen Kolonne 17 separierten Aminosäuren. In manchen Fällen ist es zweckmäßig, daß auch die kleine Kolonne 17 nach jedem analytischen Zyklus regeneriert wird, damit die Elution auf ihr mit mehr als einer Elutionslösung durchgeführt werden kann.

Die F i g. 2 zeigt schematisch eine Alternative eines Details der Anordnung für diesen Zweck, wobei der Dreiweghahn 23 durch einen Mehrweghahn 32 ersetzt ist, dessen Umfangsstutzen in einer nicht weiter dargestellten Weise an Behälter mit den zugehörigen Lösungen angeschlossen sind, analog wie in der F i g. 1 beim hydraulischen Umschalter 7. Eine solche kompliziertere Elution auf der kleinen Kolonne 17 und eine eventuelle Regenerierung ist zweckmäßig, beziehungsweise notwendig im Falle komplizierterer Gemische, die neben den Grund-Aminosäuren noch weitere Stoffe enthalten.

Es ist vorteilhaft, daß für verschiedene Typen von Analysen, insbesondere von komplizierteren Gemischen als Aminosäuregemischen, wie sie sich bei Hydrolysaten von Eiweißstoffen und Peptiden ergeben, alternativ andere kleine Kolonnen verwendet werden als die, welche im Prinzip bei der Separierung von einfachen Gemischen basischer Aminosäuren, die lediglich aus den Grund-Aminosäuren bestehen, verwendet werden.

Die F i g. 3 zeigt schematisch die Möglichkeit des Ersatzes des hydraulischen Mehrwegschalters 7 durch zwei oder mehrere Zweiwegschalter 33, 34 usw., durch deren Serienschaltung ähnliche Funktionen erreicht werden können wie durch die Schaltung gemäß Fig. 1. So z.B. kann eine Leitung 35 entweder an ein druckloses Dosiersystem, wie das System 16 in der Fig. 1, oder direkt an einige Behälter 12 bis 15 für die Elutionslösung geschaltet werden. In ähnlicher Weise kann durch eine Leitung 36 ein Zweiweghahn 34 an einen weiteren Umschalter oder direkt an weitere Behälter der zugehörigen Lösungen angeschlossen werden. In ähnlicher Weise kann auch eine gleiche Funktion gemäß der F i g. 2 für eine kleine Kolonne durch einen hydraulischen Mehrwegschalter 32 erreicht werden.

Die F i g. 4 zeigt schematisch eine alternative Detailausführung von zwei Zweiweghähnen 37, 38, die beim Umschalten die Funktion des hydraulischen Schalters 27 gemäß der F i g. 1 ersetzen können.

Die Fig.5 stellt schematisch denjenigen Teil der üblichen, nichtautomatischen Standardeinrichtungen für die Analyse von Aminosäuregemischen und ähnlichen Stoffen dar, die eine ähnliche Grundfunktion wie die Einrichtung gemäß der F i g. 1 haben. Beim Vergleich beider Schemata gehen deutlich die Unterschiede und Vorteile der Einrichtung gemäß der Erfindung hervor. Die Standardeinrichtung gemäß der Fig.5 enthält die kleine basische Kolonne 40 und zwei große Kolonnen 41, 42, die sich in der Funktion des Separierens, Regenerierens und Stabilisierens abwechseln. Um möglichst gleiche Separierungen auf den beiden Kolonnen 41 und 42 zu erreichen, wird

ίο die wichtige Forderung gestellt, daß diese beiden Kolonnen, sowohl was die Geometrie, als auch die Füllungen anbelangt, identisch sind, was nicht immer leicht erreicht werden kann. Alle drei Kolonnen 40, 41, 42 und eventuell auch weitere Kolonnen in der vorhandenen Einrichtung sind abwechselnd mit Hilfe von mit der Hand bedienbaren Zweiweghähnen 43, 44, 45 gegebenenfalls mit weiteren Hähnen versehen, die entweder an die zur Auswerteeinrichtung führenden Leitungen 46 oder an den Abfall 47 geschaltet sind.

Auf allen Kolonnen 40, 41, 42 werden die Proben mit der Hand mit Hilfe einer Pipette nach der Einstellung des Betriebes der einzelnen Kolonnen und nach der Beseitigung des Gehaltes der Flüssigkeit durch die Ionen-Austauschersäule aufgetragen. Nach weiteren heiklen Prozeduren des Eindrückens der Proben und ihre Reste abspülender Flüssigkeit, die ebenfalls mit einer Pipette auf den Scheitel der Säule aufgetragen wird, werden die einzelnen Kolonnen wieder mit Flüssigkeit ergänzt und mit einem Kugelverschluß 48, 49, 50 verschlossen. Eine Pumpe 51 drückt während der Funktion der kleinen Kolonne den Puffer aus einem Behälter 52 über den Verschluß 48 in die kleine Kolonne 40. Eine zweite Pumpe 53 drückt verschiedene Puffer aus Behältern 54, 55, über einen Zweiweghahn 56 in eine der beiden großen Kolonnen 41, 42 über den Verschluß 49, der entweder an die Kolonne 41 oder die Kolonne 42 angeschaltet wird, wie durch den Doppelpfeil 57 angedeutet ist. Während durch eine Kolonne, z. B. die Kolonne 41, der Elutionspuffer in dieser Weise durchgedrückt wird, wird mit der zweiten Kolonne, z. B. die Kolonne 42, in der gleichen Zeit im längeren Verlauf die Regenerierlösung und nach ihr der Stabilisierungspuffer aus den Behältern 58 und 59 über einen Zweiweghahn 60 eingedrückt mit Hilfe einer besonderen Pumpe 61 oder einer anderen, den notwendigen Überdruck erzeugenden Einrichtung, wodurch die angeführten Lösungen über den Verschluß 50, gegebenenfalls den Verschluß 49, in die zugehörige Kolonne (42 bzw. 41) und dann in den Abfall 47 gedrückt werden. Bei manchen bekannten Einrichtungen werden an Stelle der Pumpe 61 und des Hahns 60 zwei Pumpen oder andere, einen Überdruck in den geschlossenen Behältern 58, 59 hervorrufende Einrichtungen benützt, wodurch ein Durchfluß dieser Lösung allmählich durch eine der großen Kolonnen 41, 42 sichergestellt wird, während die andere die Separationsfunktion ausführt.

Wie aus dem Vergleich der F i g. 5 und deren Beschreibung mit der F i g. 1 und ihrer Beschreibung hervorgeht, ist zu ersehen, daß auch bei nichtautomatischer Funktion der Einrichtung gemäß der F i g. 5 diese Einrichtung und ihre Funktion komplizierter ist als das Verfahren und die Einrichtung gemäß der Fig. 1, welche die Funktion der Separation von Aminosäuregemischen und ähnlichen Stoffen mit wesentlich höherer Effektivität und mit einer Auto-

matisierung in verschiedenen Stufen bis zur totalen Automatisierung durchführen kann.

Es ist ersichtlich, daß bei der Einrichtung gemäß der Erfindung nicht nur die Zahl der Kolonnen um eine große Kolonne, sondern auch die Zahl der Pumpen und eventuell der Schaltelemente verkleinert werden kann. Wenn die" Funktion einer Einrichtung gemäß der standardisierten Schaltung entsprechend der F i g. 5 automatisiert werden sollte, dann wäre

eine unverhältnismäßig kompliziertere Automatisierungseinrichtung als bei einer Einrichtung nach Fi g. 1 nötig.

In keinem der Schemata, die in den F i g. 1 bis 5 dargestellt sind, sind Elemente eingezeichnet, die der Auswertung des Eluats dienen, mit Ausnahme des ReaKtors, der Schreibeinrichtung und anderer Teile, die insbesondere eine weitere Pumpe für das Fördern der Auswertereaeentien enthalten.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

409 584/307

Claims (2)

1 2 vorgenommen wird, also auf einer kleinen und ledig- Patentansprüche: lieh auf einer großen Kolonne. Es entfällt also die Notwendigkeit, eine zweite große Kolonne zu ver-

1. Einrichtung zur Beschleunigung chromato- wenden, wodurch die Gesamtzahl der Kolonnen für graphischer Analysen von Aminosäuregemischen 5 die komplette Analyse von drei auf zwei reduziert und ähnlichen Gemischen, bestehend aus Kolon- wird und noch weitere Vorteile erreicht werden.

nen, deren Eintritte über Pumpen, Mehrweg- Ausgehend von dieser Erkenntnis besteht die Aufhähne und Dosiereinrichtungen mit Behältern für gäbe der Erfindung darin, eine Einrichtung zu schaf-Elutionslösungen verbunden sind und deren Aus- fen, mit der eine Beschleunigung chromatographitritte über einen Mehrweghahn mit einem Abfall io scher Analysen von Aminosäuregemischen und ähn- und mit einer Auswertungseinrichtung verbunden liehen Gemischen zu erzielen ist und die in ihren Insind, dadurch gekennzeichnet, daß so- vestitionskosten niedriger als die bisher bekannten wohl die einzige große Kolonne (11) als auch die Einrichtungen liegt.

kleine Kolonne (17) je eine selbständige Pumpe Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch ge-

(10, 18) besitzt, welche die Eintritte der Kolon- 15 löst, daß sowohl die einzige große Kolonne als auch

nen (11, 17) über je einen selbständigen Mehr- die kleine Kolonne je eine selbständige Pumpe be-

weghahn (7, 21) mit den betreffenden Behältern sitzt, welche die Eintritte der Kolonnen über je einen

(12, 13, 14, 15, 19) verbindet, wobei jeder Mehr- selbständigen Mehrweghahn mit den betreffenden

weghahn (7, 21) für wenigstens einen Behälter Behältern verbindet und wobei jeder Mehrweghahn

eine Umleitung über ein selbständiges Dosie- 20 für wenigstens einen Behälter eine Umleitung über

rungssystem (16, 20) aufweist. ein selbständiges Dosierungssystem aufweist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge- Nach einer Ausgestaltung der Erfindung sind die kennzeichnet, daß die Mehrweghähne (7, 21) vor Mehrweghähne vor dem Eintritt in beide Kolonnen dem Eintritt in beide Kolonnen (11, 17) und nach und nach dem Austritt aus beiden Kolonnen mit dem Austritt aus beiden Kolonnen (11, 17) mit 25 einer Programmiereinrichtung verbunden.

einer Programmiereinrichtung verbunden sind. Durch die Erfindung entsteht der Vorteil des Wegfalls einer zweiten großen Kolonne, wodurch die Gesamtzahl der Kolonnen für die komplette Analyse von drei auf zwei reduziert wird. Weitere Vorteile

30 bestehen insbesondere in einer niedrigen Anzahl von

Pumpen und insbesondere in einer vollkommen automatischen Durchführung der Analyse und einem vollautomatischen Eintragen der für die Analyse be-

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Be- stimmten Proben aus dem Dosiersystem, in das die schleunigung chromatographischer Analysen von 35 Proben vorher in einer für die Bedienung geeigneten Aminosäuregemischen und ähnlichen Gemischen, die Zeit eingebracht werden. Durch den Wegfall mehreaus Kolonnen besteht, deren Eintritte über Pumpen, rer Pumpen wird die gesamte Zeit gespart, die bisher Mehrweghähne und Dosiereinrichtungen mit Behäl- für die Durchführung der üblichen Regenerierung tern für Elutionslösungen verbunden sind und deren und Restabilisierung auf der dritten Kolonne not-Austritte über einen Mehrweghahn mit einem Abfall 40 wuidig war. Dadurch wird eine wesentliche Verein- und mit einer Auswertungseinrichtung verbunden fachung auch bei einer nichtautomatischen Funktion sind. erreicht. In noch größerem Maße machen sich jedoch Die bekannten klassischen Formen der Analysato- die Vorteile der Erfindung bei einer vollautomatiren für Aminosäuren verwenden auch in einer nicht sehen Funktion geltend, besonders in dem Sinne, daß automatischen Ausführung mindestens drei Kolon- 45 ganze Serien von Analysen völlig automatisch, einnen, bei denen für die Analyse des Aminosäuregemi- schließlich des Eintragens der Proben auf die Kolonsches eine kurze, sogenannte »kleine« oder »basi- nen, durchgeführt werden, wobei die Proben automasche« Kolonne für die Separierung der einzelnen ba- tisch auf die Kolonnen in geeigneten Zeiten aus den sischen Aminosäuren bestimmt ist, während die bei- Dosiereinrichtungen gefördert werden, in die sie in den anderen sogenannten »großen« Kolonnen ab- 50 einer für die Bedienung geeigneten Zeit eingebracht wechselnd so arbeiten, daß immer eine von ihnen die wurden. Eine solche totale Automatisierung kann erübrigen Aminosäuren, d. h. saure und neutrale, findungsgemäß durch wesentlich einfachere Mittel trennt, während die andere regeniert und restabili- und mit erhöhter Sicherheit erreicht werden, als dies siert wird. Im nachfolgenden Zyklus werden die der Fall wäre, wenn eine Vollautomatisierung auf Funktionen der beiden großen Kolonnen gewechselt, 55 der bekannten Dreierkolonne durchgeführt würde, so daß die zweite von ihnen für die Separation be- Diese Vorteile machen sich nicht nur bei Analysatonützt wird, während die erste regeneriert und restabi- ren geltend, bei denen auf die Einfachkeit und Gelisiert wird. . schwindigkeit der Funktion besonderer Wert gelegt Dabei ist es bekannt, die Separation des Amino- wird, sondern auch bei anderen Typen, z. B. bei säurengemisches in einerseits basische und anderer- 60 Analysatoren, bei denen insbesondere Wert entweder seits neutrale und saure Komponenten vorzunehmen auf die Geschwindigkeit oder eine erhöhte Genauig- und die Elution mittels dreier Puffer mit sprunghaft keit wie auch auf die Separationswirkung gelegt wird, steigender Azidität durchzuführen (Anal. Chemistry, Gleich vorteilhaft machen sich die Vorzüge der Er-VoI. 30, 1958, S. 1190 bis 1206). findung auch bei universalen Analysatoren geltend, Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß 65 die für die Durchführung sowohl beschleunigter als die Analysen der obenerwähnten Gemische praktisch eventuell auch langsamer Analysen, die jedoch mit gleichgut und in manchen Fällen sogar besser durch- erhöhter Genauigkeit, Empfindlichkeit und Selektivigeführt werden können, wenn sie auf zwei Kolonnen tat arbeiten, ausgestattet sind.