DE1468178A1

DE1468178A1 - Verfahren zur Isolierung des Antibiotikums Fusidinsaeure aus Fermentationsbruehen durch Extraktion

Info

Publication number: DE1468178A1
Application number: DE19611468178
Authority: DE
Inventors: Lorck Henning Otto Bojsen; Sverre Jahnsen; Godtfredsen Wagn Ole
Original assignee: Leo Pharmaceutical Products Ltd AS
Current assignee: Leo Pharma AS
Priority date: 1960-09-21
Filing date: 1961-09-21
Publication date: 1969-02-13
Also published as: CH458624A; FR1651M; SE334436B; DK114682B; DK114542B; SE334435B; ES270607A1; DE1467986A1

Description

DB. ING.F.WTJESTHOFF 8 MÜNCHEN θ

ΒΙΡΙ» ING. G. PUI<S schwbiobkstbassb 2

DR. E. ν. PECHMANN m.*ro» as Οβ 51 FKOTBCTFATBJfT MßlfClIKlf

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B JB₁ aohreibung zu der Patentanmeldung

L0VEMS IEMISKB FABHIK, VED. A. KOHGSTiSD, 11, Ballerup Byvej, Ballerup, Dänemark

betreffend

Verfahren zur Isolierung dea Antibiotikums Puaidinsäure aua gernu>iitation8brüh«n.a_urch Extraktion.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren aur Isolierung dea neuen Antibiotikums Pusidinaäure,das auch ala Antibiotikum ZH-6 bezeichnet wird, aua, dieaea enthaltenden, KuIturflüaaigkeiten in guter Auebeute und in einem, für therapeutische Zwecke zufriedenatellenden, Reinheitagrad.

Daa Antibiotikum wird erzeugt, indem man einen Mikroorganiamua unter geregelten Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium wachsen läßt. Die bekannten Pilse Oephaloaporium lamellaeoola und Tuaidium ooccineum Fuck K. Tubaki erzeugen diese

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Substanz unter geeigneten KuItürbedingungen in, für die industrielle Produktion zufriedenstellenden, Mengen. Das Fermentationsverfahren selbst fällt jedoch nicht in den Umfang der Erfindung.

Das Antibiotikum Fusidinsäure ist eine schwache Säure, die mit verschiedenen anorganischen und organischen Basen Salze und außerdem Solvate, das sind Molekül» verbindungen mit gewissen Lösungsmitteln, bilden kann.

Me elektrometrische Titration des Antibiotikums in 80%-igem wässrigen Äthanol liefert einen pK-rfert, der einem pK -Y/ert von ungefähr 5 »3 in Wasser entspricht. Ferner zeigt die Titration ein Äquj.valenzgewicht der Substanz von 516 an.

Untersuchungen über die chemische Struktur und analytische Daten für diese Substanz deuten auf die formel CU-jH^gOg hin. Die Verbindung scheint ein Cyelopentenopolyhydrophenanthren-Hingsystein , das durch zwei Hydroxylgruppen, eine Aoetoxygruppe und vier Methylgruppen substituiert ist und in 17-Stellung über eine Doppelbindung mit dem c< Kohlenstoffatom von 5-Methyl-4,5-hepteneäure verbunden ist, zu enthalten.

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U68178 Die Struktur des Antibiotikums Fusidinsäure

wurde bisher nicht endgültig tufgeklärt, jedoch •vird cuijenoiomen, daß die Verbindung nachstehende Formel (I) besitzt, in welcher die wellenförmigen Linien Jizeigen, daß die Konfiguration an dem betreffenden Kohlenstoffatom un^ev/iss ist und die unterbrochenen Linien, daß sich der betreffende nest in <X -Stellung befindet»

J-CO₂H

CH₂-OH₂-GH β C:

CH, CH,

0OC.CH,

(D

Das Antibiotikum Fusidinsuure ist in Wasser und Hexan schwer löslich und löslich in Äthanol, Azeton , Methylbutylketon, Amylacetat, Chloroform und
ähnlichen Lösungsmitteln.

Wie erwähnt, kann das Antibiotikum Molekülverbindungen, sogenannte Solvate, mit einigen organischen Lösungsmitteln,insbesondere Benzol und Methanol,

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bilden und dieee Solvate sind gut kristallisierende Verbindungen. Deshalb kann man sich der Bildung von Solvaten bei der Extraktion und Reinigung der Verbindung bedienen· Die kristallinen Alkalisalze dee Antibiotikums Fusidinsäure sind in tfaeti er leicht löslich und können vorteilhafterweise als Bestandteile

en
pharmazeutischer Zubereitung/ verwendet werden. Die Salze des Antibiotikums Fusidinsäure mit organischen Aminen und insbesondere solche Salze, deren Amin-Komponente keine hydrophilen Gruppen, z.B. Hydroxylgruppen, enthält, sind in Wasser schwer löslich oder unlöslich, jedoch leicht löslich in gewiesen organischen Lösungsmitteln. Aus diesem Grunde kann das Antibiotikum Fuuidinsäure aus einer, kleine Mengen des Antibiotikums

enthaltenden, wässrigen Phase in Form eines der oben erwähnten Aminsalze durch Extraktion der wässrigen

Phase mit einem für das betreffende Salz geeigneten organischen Lösungsmittel isoliert werden.

Bei bakteriologischen Untersuchungen erwies sich das Antibiotikum Fusidinsäure gegen verschiedenartige pathogene Mikroorganismen wirksam, insbesondere gegen otaphylococcue aureus_t geisserla gonorrhoea»» einschließlich penioillinresistenter Stämme derselben,

in
Meisseria mengitidea» Myoobacterium tuberoulosle^ und die streptomycin-, ißonikotinsäurehydracid- und p-aiüino-salizyleäure-reaistenten Stämme dieser Organismen und gegen gorynebaoterium diphteriae.

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1468178 Das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren beruht

auf den sauren Eigenschaften des Antibiotikums und seinen« oben geschilderten, Löslichkeitseigenachaften und denen adner Salze. Durch Zusatz eineο Amins in freier Form odeipin Form eines seiner Salze oder einer Säure in solchen Mengen, daß wesentliche Mengen des in dem Kulturmedium anwesenden Antibiotikums Pusidinsuure mit diesen in Reaktion treten , wird das Antibiotikum in eine, in organischen Lösungsmitteln lösliche, Form gebracht· Hierauf wird das Antibiotikum mit einem, mit Wasser nicht mischbaren ader im weantlichen nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, z.B. einem JEster, einem Keton oder einem Chlorkohlenwasserstoff, extrahiert und hierauf aus dem Extraktionsmittel isoliert, gegebenenfalls in Form eines seiner üalze mit einer pharmazeutisch zulässigen Base oder in Form eines Solvats der Verbindung.

Bei der Extraktion in technischem Maßstab erwiesen sich Methyliaobutylketon, Am/laoet^t und ßutylacetat für die Extraktion besonders geeignet.

Vorzugsweise wird die Extraktion nach Entfernung der Feststoffe aus dem Kulturmedium, z.B. der verwendeten Mikroorganismen oder dur verwendeten Nährstoffbestandteile, durch Filtration oder Zentrifugieren, durchgeführt.

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iurde das Antibiotikum aus dem KuItürmediuia in Form der freien Säure extrtfiiert, dann kann die organische Phase auf ein Kleines Volumen eingeengt werden, aus weichein sich das Antibiotikum beim Kühlen oder durch Zusatz eines Bestandteiles, der die Löslichkeit des Antibiotikums herabgesetzt , ausscheidet. Auch kann der Extrikt zur Trockene verdampft und hierauf der .Rückstand aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, vorzugsweise aus einem Lösungsmittel, mit dem das Antibiotikum ein gut kristallisierendes Solvat bildet, z.B. Benzol oder Methanol, umkristallisiert v/erden.

Ferner kann durch Extraktion der organischen Phase mit einer wässrigen Lösung oder Suspension eines, das gewünschte Kation enthaltenden, alkalisdh wirkenden otoffes das Antibiotikum in Form eines seiner wasserlöslichen iialze isoliert werden.

Wird das Antibiotikum nach Ansäuren des Kulturmediums extrahiert, dann säurt man vorzugsweise auf einen pH-./ert von 3 bis 6, z.B. von 5 bis 6, an, da hierdurch günstige Bedingungen für eine erfolgreiche Extraktion der Fermentationsflüssigkeit, nach da? Entfernung des Myceliums, entstehen.

viird das Antibiotikum aus dem Kulturmedium in Form eines seiner Aminsalze extrahiert, dann stellt man den

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pH—»ifert vorzugsweise auf 7,0 oder darüber ein.

Far diese Auufuhrungsart dee erfindungugenäßen Verfahrens bevorzugt man stark bauiuche Amine, die eine hühere, uieht-substituierte, Kohlenwasaerstoffgruppe im Molekül enthalten und insbesondere quaternäre Amine, z.B. üetyl-pyridiniumchlorid.

Aua der, das .uninsalz des ioitibiotikums enthaltenden, organischen Phase kann die Verbindung vorteiln^rter»;eiae in Form eines seiner wasserlöslichen Salze iaoliert ./erden, indem man die organische Phase mit einer, das gewünschte Kation enthaltenden, wdssrigalkalischen Losung extrahiert.

Auch kann das Antibiotikum nach anderen bekannten Vorfahren isoliert werden, z.B. durch dopxjelte Umsetzung des Aminsalze8 im Extraktionemedium mit einem anderen, in diesem löslichen oder mäßig löslichen,Salz, das ein Kation euthält, mit welchem das Antibiotikum ein^ in diesem Uxtraktionamedium schwer lösliches, Sale oildet.

Ferner kann das, das Auinsalz des Antibiotikums enthaltende, iäxtraktionsiaedium mit einer wässrigen Losung einer starken »jaure behandelt werden, um die Aminkomponente aus dem iüxtraktlonsmedium zu entfernen, wodurch man eine organische Phase mit dem Antibiotikum in Form der freien diure erhält, aus dieserihaae kann

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BAOORtQlNAt

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das Antibiotikum, wie oben» isoliert werden.

In einer erfindungsgemäßen, geeigneten Ausführungsart kann die Extraktion als mehrstufiges Verfahren durchgeführt werden, indem man zunächst das Antibiotikum mit einem organischen Lösungsmittel im uegenstrom und hierauf das organische Lösungsmittel mit einer wässrigen Lösung oder Suspension einer alkalisch wirkenden Substanz extrahiert»worauf man schließlich die so gewonnene wässrig« Lösung ansäuert und das Antibiotikum mit einem, mit fässer nicht misohbaren, Lösungsmittel extrahiert·

Für die Gegenstromextraktion, die zweckmäßigerweise in einer Podbielniak-üxtraktionsrorrichtting durchgeführt werden.kann, können als Extraktionemittel z.B. Butylaaetat oder Methylisobuty!keton verwendet werden. Aus der auf diese weise erhaltenen organischen Lüsung kann das Antibiotikum mit einer wässrigen latriuahydroxydlösung oder einer wässrigen Suspension ron Xalsiumhydroxyd ausgeschüttelt werden und naoh der Abtrennung und dem Ansäuern der wässrigen Phase wird diese schließlich z.B. mit Methylisobutylketon oder Benzol extrahiert.

Das erfindungsgemäee Terfahren wird durch nachstehende Beispiele näher erläutertt

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Beispiel 1i

Sine PermentEfcionaflüsaigkeit mit einer AktiTität entsprechend einem Gehalt von 70 mg des Antibiotikums Tuaidlnsäure je Liter wurde vom Myoel durch Filtration befreit, in 700 1 des Piltrata der pH-Wert mittel· einer 25-#igen HgSO^-LÖsung auf 3,3 eingestellt und in einer Podbielniak-Extraktionsvorrlchtung im Gegenstrom mit 230 1 Butylasetat extrahiert· Die ao erhaltene Butylazetatphase wurde mit 77 1 Wasser, dem eine 10#-ige NaOH-Lösung bia au einem pH-Wert von 10,0 augegeben worden war»extrahiert und die Phasen getrennt. Der pH-tfert der wässrigen Phase wurde nun durch Zugabe einer 25 jt-igen HgSO,-Lösung auf 3,2 eingestellt und die Lösung mit 40 1 Methyliaobutylketon extrahiert. Die Phasen wurden getrennt ,die organische Phase mit 40 g Aktivkohle behandelt und im Vakuum bei einer Siedetemperatur von 25°C zur Trockene verdampft, Der Eindampfrückstand wurde in 500 ml Benzol gelöst und die Lösung über Haoht im Üiaachrank stehen gelassen· Hierbei kristallisierte das Benzolsolvat des Antibiotikums Pusidinaäure.Das Benzolsulvat wlirde abfiltriert und aus Benzol umkristallisiert^ wobei man 12,0 g der reinen Substanz, P 189,0 bis 189,5°^, erhielt.

Durch Trocknen des dolvata bei 50° C/0,01 mm Hg

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bia sur Gewiohtskonatan« wurde ein benzolfreies Produkt, P 191 bis 192⁰O, ΠΚ7Ζ2 « 9° (c » 1 Ji,

D Chloroform), erhalten·

Beispiel 2\

15 OOCjtL Fermentationsbrühe mit einem Gehalt von 3,75 kg des Antibiotikums Fusidinsäure wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt und in einer PodbielniaJc-Extraktionsvorrichtung mit 3000 1 Methylisobutylketon extrahiert. .Der Extrakt enthielt 3,4 kg des Antibiotikums Fusidinsäure. Eb wurde mit 600 1 wässrigen Natriumhydroxyds mit einem pH-Wert von 11,5 extrahiert. Sofort nach der Extraktion wurde die wässrige Phase auf einen pH-*/ert von 3,3 gebracht und Im Vakuum auf ein Volumen von 150 1 eingeengt. Diese enthielten 3,25 kg des Antibiotikums Pusidinsiiure.

Es wurden 40 1 Benzol hinaugef ligt und unter Rühren der pH-»/ert d^r wässrigen Phase durch Zusatz von Ohlorwaaserstoffsäure auf 5,0 eingestellt. Das Rühren wurde 4 Stunden fortgesetzt und hierauf der, aus dem Benzolsolvat des Antibiotikums Fuaidinsaure bestehende, niederschlag abfiltriert, mit ./asser und Benzol gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt betrug 2,8 kg. Us wurde in 12 1 Methylenchlorid gelöst, filtriert und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Jäindaittpfrüek3tand wurde in 3,2 1 v/armen Methanols

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gelöst und auf O⁰C abgekühlt, wobei ein Methanol-Solvat auskristallieierte, das abfiltriert, 3 mal mit je 300 ml eiskalten Methanole gewaschen und ge. trocknet wurde, wobei man 2,48 kg farbloses Methanol-Solvat erhielt.

Dieses Produkt wurde in einem Gemisch von 750 ml Methanol und 1750 ml Azeton suspendiert, einige Tropfen Phenolphthalein hinzugefügt und dann unter Rühren 33^-iges wässriges Natriumhydroxyd bis zum Auftreten einer schwach rötlichen Färbung zugesetzt· Die Lösung wurde durch Dicalite, ein aus Diatomeenerde bestehendes Filtriermittel,filtriert, mit 5 1 Methylbutylketon vermengt und im Vakuum auf ungefähr 3 1 eingeengt* Während des Sinengens kristallisiert· das Natriumsalz· Dieses wurde abfiltriert, mit Azeton und hierauf mit Äther gewaschen und getrocknet» wobei man 2,39 kg reines Natriumsalz des Antibiotikums Fusidinsäure erhielt.

Beispiel 3t

10 1 geklärter Fermentationsbrühe (mit einem Gehalt von ungefähr 700 mg des Antibiotikums Fueidinaäure je 1) wurde auf einen pH-Wert von 7«0 eingestellt.

I.

Ss wurden 90 mg Oetyl-Pyridiniumchlorid hinzu-

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gefügt and dl· Lüftung 2 aal alt j· 500 al Methylieobutylketon extrahiert.

laoh dtr Extraktion wurden in der wässrig*» Phase weniger al· 35 ag/1 Antibiotilnui raeldlneättre gefunden.

SI· Tereinlgten Methylieobutylketon-lxt»»kt· wurden alt Waeeer gtwaeohen und hierauf «la Ubereehul einer gesättigten wässrigen Kaliuaaietmt-Leenag un*er Rühren hinaugefügt.

I«oh einetundigea Eühren bei Haumteaperatur wurde da· rohe Kalluaeale de· Antibiotilcuaa fusltlaetmi¹· geeaamelt» alt Aieton gewaeehen und getrooknei.

Sa· erhaltene Seil war für dl· Hereiellvag SalsMi dee Antibiotikuae fu«ldlaeäure la pheraa-■eutlMA reiner QtulitKt gut geeignet.

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Claims

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1· Verfahren but Isolierung des Antibiotikums fusidinsäure ans eine« dieses enthaltenden Kultur-BMdIm₉ dadurch gekennseiohnet , daß man ein AmIa oder eines seiner SaUe oder eine Säure in aoloher «enge «uetst, dal wesentliche Mengen des in de» Kultunwdlum anwesenden Antibiotikums fusidinsäure in organischem LBsungenitteln löalioh werden und das Antibiotika« «it einem, «it Wasser nicht-mischbaren oder weitgehend nioht-misohbaren organischen Lösungsmittel, insbesondere eine« Seter» einem Keton oder eine« Chlorkohlemwaeseretoff, extrahiert, worauf «an das Antibiotikum aas des Bxtraktioneaittel isoliert, gegebenenfalls in For« eine· seiner Salse «it einer phareaneutiaoh sulässlge« Baee oder in form eines seiner Solrate·

2. Verfahren naoh Anspruoh 1, daduroh g e k e η η -seionnet, daJ «an das Kulturmedium, yorsugswelse auf einen pH-Wert τοη 3 - 6,+ansäuert und das Antibiotika« «it eine« mit Wasser nicht mischbaren oder weltgehend nioht mischbaren organiaohen Löaungsmittel,

Insbesondere einem Xster, einem Keton oder eine«

kohlen

Chloxraraaaerstoff, extrahiert, worauf man das Antibiotikum aus dem Extrakt isoliert, gegebenenfalls in Form einea seiner Salze oder Solvate mit einem organischen Lösungsmittel·

BAD

-H- U*6»3

3· Verfahren nach Anspruoh 1, dadurch g β -kennzeichnet , daß man das Kulturmedium auf einen pH-Wert ron 7,0 oder darüber eine teilt, ein starkes Amin in solchen Mengen hinaufilgt, dafi eine wesentliche Menge dea Aminsalze* des Antibiotikums entsteht und das SaIa mit eines mit Wasser nicht mischbaren oder weitgehend nicht mischbaren organischen lösungsmittel, insbesondere einem Bster, einem Keton oder einem Chlorkohlenwasaeratoff» extrahiert, worauf man das konsenlrlerte Antibiotikum aus dem Extrakt isoliert, gegebenenfalls in Form eines meiner Salze mit pharmazeutisch zulässigen Basen oder in Form eines seiner Solvate mit einem organischen Lösungsmittel·

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion als 4eg«nstromextraktion ausführt.

5· Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dafi man eine mit «fässer nicht mischbare, das Antibiotikum Pusidinsäure enthaltende, Phase mit wässrigem Alkali extrahiert und aus der so entstandenen wässrigen Lösung eines Salzes des Antibiotikums das Salz isoliert oder das Antibiotikum durch Ansäuarn der Lösung ausfällt.

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6. Verfahren naoh Anspruch 5« dadttreh g β k β α η -seiohnet, ^dafl >ba einer wässrigen Lösung •inea SalMS dta Antibiotikums fusldlnsäure Bensol In solohsB Mengen susetst, daB das in der Lösung Torhandent Antibiotikum in sein Beniol-SolTat übergeführt wird« vorauf man das Oemieeh ansäuert, üb das Benmol-SolYat des Antibiotikums au·sufallen, dieses abtrennt und gegebenenfalls in das Antibiotika« Fusidinsäar* oder ein SaIs desselben umwandelt.

7· Verfahren naoh AnsprUohen 5 oder 6» daduroh gekennseiohnet « dafl man das isolierte rohe Antibiotikum Yusidinsäure aus einem Lösungsmittel, das lur Bildung τοη Solraten alt dem Antibiotikum fähig 1st· umkristallieiert, worauf man das ausgesohiedene Solrat de· Antibiotikums isoliert und gegebenenfallsin das Antibiotikum «der ein SaIs dessslben überführt.

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