DE1213641C2 - Substrat zur bestimmung der konzentration des enzyms glutaminsaeure-oxylessigtransaminase in koerperfluessigkeiten - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Int. Cl.:

GOl η-33/16

DEUTSCHES

PATENT

PATENTAMT

■ CHRIFT

Deutsche Kl.: 421-3/54

Nummer:

Aktenzeichen:

Anmeldetag:

P 12 13 641.3-52 (W 30099)

3. Juni 1961
31. März 1966

4. Januar 1973

Auslegetag:

Ausgabetag:

Patentschrift weicht von der Auslegeschrift ab

Die Erfindung betrifft ein Substrat zur Bestimmung der Konzentration des Enzyms Glutaminsäure-Oxalessig-Transaminase in Körperflüssigkeiten, bestehend aus L-Asparaginsäure, a-Ketoglutarsäure, einem Diazoniumsalz, welches mit Oxalessigsäure unter Bildung eines gefärbten Kupplungsprodukts zu kuppeln vermag, sowie einem Puffernder den pH-Wert in der Körperflüssigkeit während der Messung im Bereich von 6,5 bis 8,0 zu halten vermag.

Dieses Enzym trägt seinen Namen, weil es die *° Geschwindigkeit der reversiblen Umsetzung von L-Glutaminsäure mit Oxalessigsäure zu a-Ketoglutarsäure und L-Asparaginsäure, bei der gemäß nächstehendem Formelbild eine Aminogruppe von einem Molekül zum anderen verlagert wird, zu katalysieren vermag.

NH2	O	O	ί— —>	CH2	20
	Il	Il
CH-COOH	h c—cooH :	C-COOH
		CH2-COOH
CH2	CH2-COOH	«-Ketoglu
		tarsäure	25
CH2-COOH	Oxalessig	NH2
L-Glutamin	säure
säure			30
		+ CH-COOH
		CH2COOH
		L-Asparagin-	Q C
			00
		saure

Die ' Geschwindigkeit dieser Reaktion ist der Enzymkonzentration im Reaktionsmedium direkt proportional. Bekanntlich wird dieses Transaminase-Enzym bei gewissen Zellzerstörungsformen im Körper freigesetzt, und deshalb stellt die Messung der Enzymkonzentration ein wertvolles Mittel bei der Diagnose von Krankheiten, wie Myocardinf arkt, intrahepatärem Lymphom oder Karzinom, Hepatitis, Zirrhose u. dgl., dar, bei denen eine solche Zellzerstörung stattfindet. Dieses Enzym wird in Körperflüssigkeiten, wie Blut, Liquor u. dgl., hinein freigesetzt und wird meistens im Blutserum, also der beim Zentrifugieren geronnenen, intakten Blutes erhaltenen flüssigen Fraktion, gemessen.

Alle zur Zeit bekannten Methoden zur Bestimmung der Transaminase-Enzym-Konzentration in Körper-Substrat zur Bestimmung der Konzentration des Enzyms Glutaminsäure-Oxalessig-Transaminase
in Körperflüssigkeiten

Patentiert für:

Warner-Lambert Pharmaceutical Company,
Morris Plains, N. J. (V. St. A.)

Vertreter:

Dr. phil. G. Henkel

und Dr. rer. nat. W.-D. Henkel, Patentanwälte,

8000 München 9, Eduard-Schmid-Str. 2

Als Erfinder benannt:
Arthur Lawrence Babson,
Morris Plains, N. J. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

V. St. v. Amerika vom 30. August 1960 (52 793)

flüssigkeiten, beispielsweise Blutserum, hängen von der Messung der Geschwindigkeit der vorstehend angegebenen Reaktion ab, indem die Geschwindigkeit der Bildung oder des Verschwindens einer der an der Reaktion teilnehmenden Verbindungen gemessen wird. Aus »Clinical Chemistry«, Bd. 6, Nr. 4, S. 394 (1960), ist es bekannt, daß sich das Enzym Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase durch Kuppeln der bei der genannten Umsetzung in Freiheit gesetzten Oxalessigsäure mit 4-Amino-2,5-diäthoxybenz-, aniliddiazoniumchlorid und kolorimetrische Auswertung der Intensität des erhaltenen Farbkomplexes bei 630 πΐμ bestimmen läßt. Nachteilig an den bekannten Maßnahmen ist jedoch, daß der pH-Wert der zu bestimmenden Lösung des Farbkomplexes unmittelbar vor der kolorimetrischen Auswertung durch Zugabe eines geeigneten Puffers auf 9 erhöht werden muß, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Dieses Erfordernis kompliziert jedoch das Bestimmungsverfahren wieder ganz beträchtlich. Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein Substrat zur Bestimmung der Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase in Körperflüssigkeiten zu entwickeln, das ein im pH-Bereich von 6,5 bis 8,0, d. h. im Bereich des für die Enzymreaktion optimalen wertbaren Farbkomplex kuppelndes Diazoniumsalz wertbaren Farbkomplex kuppelndes Diazonimumsalz enthält. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Substrat zur Bestimmung der Konzentration des Enzyms Glutaminsäure-Oxalessig-Transaminase in

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Körperflüssigkeiten, bestehend aus l- Asparagin säure, 37° C bevorzugt wird. Niedrigere Temperaturen ver-

a-Ketoglutarsäure, einem Diazoniumsalz, welches mit langen längere Zeiten, während bei höheren Tempe-

Oxalessigsäure unter Bildung eines gefärbten Kupp- raturen eine schnellere Umsetzung erzielt wird,

lungsprodukts zu kuppeln vermag, sowie einem Zwecks Erzielung wiederholbarer Ergebnisse müssen

Puffer, der den pH-Wert in der Körperflüssigkeit 5 natürlich bei allen Bestimmungen dieselben Inku-

während der Messung im Bereich von 6,5 bis 8,0 zu bationsbedingungen innegehalten werden,

halten vermag, welches dadurch gekennzeichnet ist, Bei Abschluß der Inkubation wird die inkubierte

daß das Diazoniumsalz aus 6-Benzamido-4-methoxy- Mischung vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen

m-toluidindiazoniumchlorid besteht. etwa 10 und etwa 20° C abgekühlt. Dieses Abkühlen

Das erfindungsgemäße Substrat eignet sich zur io ist zwar nicht von Bedeutung, aber erwünscht, da

Bestimmung des Enzyms Glutaminsäure-Oxalessig- es dazu dient, die enzymatische Reaktion im Substrat

Transaminase in jeder beliebigen Körperflüssigkeit beträchtlich zu verlangsamen und dadurch eine merk-

einschließlich Rückenmarksflüssigkeit, Blutserum liehe Bildung von zusätzlicher Oxalessigsäure wäh-

u. dgl. Da das Enzym am häufigsten im Blutserum rend des Kupplungsschrittes zu verhindern. Das

bestimmt wird, ist dieses die normalerweise für die 15 Herunterkühlen auf eine niedrigere Temperatur ist

Bestimmung verwendete Flüssigkeit. Das Blutserum auch deshalb wünschenswert, weil das zugesetzte

wird nach üblichen Verfahren durch Zentrifugieren Diazoniumsalz gegen Zersetzung gesichert wird,

aus geronnenem, inktaktem Blut abgetrennt. Der Mischung wird nunmehr das .6-Benzamido-

Da bei Verwendung eines Substrats gemäß der 4-methoxy-m-toluidindiazomumchlorid zugesetzt, das

Erfindung eine sichtbare Färbung hervorgerufen wird, 20 mit der während der Inkubationszeit im Substrat

ist kein kompliziert aufgebautes Ultraviolett-Spektro- entstandenen Oxalessigsäure zu einem ausgeprägt

photometer erforderlich; da 6-Benzamido-4-methoxy- roten Kupplungsprodukt kuppelt. Auch hier kommt

m-toluidindiazoniumchlorid nur mit der Oxalessig- es nicht auf die absolute Diazoniumsalzmenge an,

säure kuppelt, wird ferner eine hochgradige Meß- es muß vielmehr ebenfalls nur in beträchtlichem

genauigkeit erzielt. Die Bestimmung läßt sich bereits 25 Überschuß zugesetzt werden,

in 0,1 ml Körperflüssigkeit durchführen. Zweckmäßigerweise wird das Diazoniumsalz mit

Bei der Bestimmung des genannten Enzyms kann einem geeigneten, alkalischen Puffer ähnlich den in zunächst ein kleines Volumen der zu untersuchenden dem genannten Gemisch verwendeten Puffern ge-Körperflüssigkeit mit einem gepufferten L-Asparagin- mischt, um einen günstigen pH-Wert für die Kuppsäure und α-Ketoglutarsäure enthaltenden Gemisch 3° lungsreaktion sicherzustellen. Beim 6-Benzamidoinkubiert und danach 6-Benzamido-4-methoxy-m- 4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid hat sich ein toluidindiazoniumchlorid zugesetzt werden, um eine pH-Wert von etwa 7,4 als besonders wirksam ersichtbare Färbung zu erzeugen, deren Dichte der wiesen. Erfahrungsgemäß verdient Natriumbarbital Enzymkonzentration in der Körperflüssigkeit propor- den Vorzug, jedoch sind auch andere alkalische tional ist. Das gepufferte Gemisch braucht hierbei 35 Puffer, wie z. B. Trinatriumphosphat, Trishydroxynur α-Ketoglutarsäure und L-Asparaginsäure als methylaminomethan u. dgl., verwendbar,
aktive Bestandteile zu enthalten, wobei letztere Säure Das Diazoniumsalz nebst alkalischem Puffer kann entweder in reiner L-Form oder als razemisches Ge- zusammen mit üblichen, neutralen, pharmazeutischen misch, also als D,L-Asparaginsäure zugesetzt sein Verdünnungsmitteln, wie sie auch bei den L-Aspakann. Auf die vorhandene Menge kommt es nicht 40 raginsäure und α-Ketoglutarsäure enthaltenden Taentscheidend an, nur müssen beide Säuren in be- bletten verwendet werden, zu. Tabletten formuliert trächtlichem Überschuß vorliegen. werden. Im allgemeinen werden Tabletten von 20 bis

Das gepufferte Gemisch enthält auch alkalische 40 mg Gewicht bevorzugt. Diese physikalische Form

Puffermaterialien, um die Eigenazidität des Substrats von Diazoniumsalz und Puffer stellt eine sehr be-

zu überwinden und den pH-Wert während der Inku- 45 queme Gebrauchsform dar.

bation, in der die Oxalessigsäure freigesetzt wird, Nach dem Zusatz des Diazoniumsalzes läßt man

zwischen 6,5 und 8,0 und vorzugsweise bei 7 bis 7,5 die Mischung einige Minuten stehen, damit die Kupp-

zu halten. Zu den brauchbaren Puffern gehören lungsreaktion vor sich gehen kann, und dann wird

Trinatriumphosphat, Natriumbarbital, Trishydroxy- sie entweder mit einer Standard-Farbkarte verglichen

methylaminomethan u. dgl. 50 oder zwecks Messung der optischen Dichte mittels

Bei einer wegen ihrer bequemen Anwendbarkeit normalem Spektrophotometer in eine Küvette einbevorzugten Art des gepufferten Gemisches sind seine gebracht. Die Konzentration der Glutaminsäure-Bestandteile zu einer Tablette formuliert, die auch Oxalessigsäure-Transaminase in der unbekannten noch neutrale, pharmazeutische Verdünnungsmittel, Körperflüssigkeit wird durch einen Vergleich der wie Lactose, Leucin, Stearinsäure, Polyvinylpyrroli- 55 entstandenen und visuell oder mittels Spektrophotodon u. dgl., enthält. Tabletten im Gewicht von etwa meter bestimmten Färbung mit Farbnormen ,be-20 bis etwa 40 mg werden bevorzugt. Bei Verwen- stimmt, die nach der Testmethode an Hand von dung des Gemisches in Tablettenform wird die Flüssigkeiten mit bekannten Enzymgehalten erzielt Tablette vor der Zugabe der Körperflüssigkeit in werden.
etwas Wasser gelöst. 60 Diese beschriebene Bestimmungsmethode stellt

Bei der Durchführung der Bestimmung wird die zwar ein genaues und '.wirksames Verfahren zur Mischung aus Gemisch und Körperflüssigkeit eine Bestimmung der Konzentration der Glutaminsäurefestgelegte Zeit lang bei konstanter Temperatur zwi- Oxalessigsäure-Transaminase in Körperflüssigkeiten sehen etwa 25 und etwa 40° C inkubiert, um die dar, kann aber erfahrungsgemäß im Sinne einer zweigewünschte Umsetzung vor sich gehen zu lassen, bei 65 ten und bevorzugten Ausführungsform ohne wesentder die Oxalessigsäure freigesetzt wird. Temperatur liehe Beeinträchtigung der Meßgenauigkeit noch und Dauer der Inkubation ^können variiert werden, weiter vereinfacht werden. Vorzugsweise wird hierbei wobei eine Dauer von 15 bis 30 Minuten bei etwa ein kleines Volumen ^Körperflüssigkeit;direkt mit dem

gepufferten Substrat inkubiert, das L-Asparaginsäure (auch in Form des racemischen D,L-Gemisches), α-Ketoglutarsäure und 6-Benzamido-4-methoxy-intoluidindiazoniumchlorid enthält, wobei Oxalessigsäurebildung und Färbungsentwicklung gleichzeitig vor sich gehen.

Der Zusatz der Puffersubstanzen dient auch hier dazu, die Azidität des Substrats zu überwinden und den pH-Wert während der Inkubation zwischen etwa 6,5 und 8,0 und vorzugsweise zwischen 7 und 7,5 zu halten, wo der günstigste pH-Wert für die durch Glutamin-Oxalessig-Transaminase katalysierte, enzymatische Reaktion zwischen L-Asparaginsäure und «-Ketoglutarsäure liegt. Brauchbare Puffer sind beispielsweise Trinatriumphosphat, Natriumbarbital, ιέ TrishydiOxymethylaminornethan u. dgl.

Auf die im Substrat enthaltene Menge der aktiven Bestandteile kommt es wiederum nicht an; sie müssen lediglich in beträchtlichem Überschuß vorhanden sein.

Bei einer besonders wirksamen und sehr leicht verwendbaren Form des gepufferten Substrats werden die Bestandteile zusammen mit pharmazeutischen Verdünnungsmitteln, wie Lactose, Stearinsäure, Polyvinylpyrrolidon u. dgl., zu Tabletten formuliert, die vorzugsweise je etwa 20 bis 40 mg wiegen.

Bei der Bestimmungsdurchführung wird ein kleines Volumen der zu unterbrechenden Körperflüssigkeit, beispielsweise Blutserum, mit dem Substrat vermischt und eine festgelegte Zeit lang bei konstanter Temperatur im Bereich zwischen etwa 25 und etwa 40° C inkubiert. Im allgemeinen wird eine Inkubationsperiode von etwa 15 bis 30 Minuten bei etwa 37° C bevorzugt. Während der Inkubation wird Oxalessigsäure in der Geschwindigkeit und dem Ausmaß freigesetzt, wie dies der Konzentration der Glutaminsäure-Oxalessigsäure-Transaminase in der Körperflüssigkeit entspricht. Gleichzeitig kuppelt die freigesetzte Oxalessigsäure mit dem im Substrat vorhandenen 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidindiazoniumchlorid zu einem rotgefärbten Kupplungsprodukt. Nach Abschluß der Inkubation wird die in der inkubierten Mischung entwickelte Färbung mit einer Standard-Farbtafel verglichen oder iri einem Spektrophotometer gemessen.

Bei Benutzung des eine Einheit bildenden Substrats gemäß der Erfindung werden mit einer bemerkenswert einfachen Untersuchungsweise genaue Ergebnisse erzielt.

Das nachstehende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern.

Beispiel

Es werden Substrattabletten von je 25 mg und folgender Zusammensetzung hergestellt:

Gewicht in mg

Trinatriumphosphat 2,9

D,L-Asparaginsäure ..: 2,7

α-Ketoglutarsäure 0,4

ö-Benzamido^-methoxy-m-toluidin- ;

diazoniumchlorid ...,:■ 2,0

Polyvinylpyrrolidon 0,5

Lactose 15,1

L-Leucin 1,4

25,0

Eine Substrattablette wird in 0,5 ecm Wasser aufgelöst und mit 0,2 ecm Blutserum versetzt. Die Mischung wird 20 Minuten lang bei 37° C iükubiert. Die inkubierte Mischung wird auf 10 ecm verdünnt, in eine Küvette eingebracht und auf optische Dichte bei 530 ηΐμ untersucht.

Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Substrats ist eine schnelle, genaue und einfache Messung der Konzentration von Glutamin-Oxalessig-Transaminase im Blutserum oder anderen Körperflüssigkeiten möglich. Eine solche Genauigkeit und Einfachheit war mit den bisher bekannten Verfahren nicht erreichbar. Das Azoniumsalz gibt nur mit Oxalessigsäure und mit sonst keinem anderen in der inkubierten Mischung vorhandenen Bestandteil ein gefärbtes Kupplungsprodükt. Dieses Kupplungsprodukt besitzt obendrein eine sichtbare Färbung, so daß nicht mit einem kompliziert aufgebauten Ultraviolett-Spektrophotometer gearbeitet zu werden braucht. Die Substratzusammensetzung gemäß zweiter Ausführungsform der Erfindung stellt ein ungewöhnlich einfaches Substrat für diesen Test dar, da er durch bloßes Inkubieren des Substrats mit einem kleinen Volumen Körperflüssigkeit und anschließendes Vergleichen der entwickelten Färbung mit einer Farbnorm durchgeführt werden kann.

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Substrat zur Bestimmung der Konzentration des Enzyms Glutaminsäure-Oxalessig-Transaminase in Körperflüssigkeiten, bestehend aus L-Asparaginsäure, α-Ketoglutarsäure, einem Diazoniumsalz, welches mit Oxalessigsäure unter Bildung eines gefärbten Kupplungsprodukts zu kuppeln vermag, sowie einem Puffer, der den pH-Wert in der Körperflüssigkeit während der Messung im Bereich von 6,5 bis 8,0 zu halten vermag, dadurch gekennzeichnet, daß das Diazoniumsalz aus 6-Benzamido-4-methoxym-toluidindiazoniumchlorid besteht.

2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit einem Verdünnungsmittel kombiniert ist, um eine Tablette mit einem Gewicht im Bereich von 20 bis 40 mg zu bilden.

In Betracht gezogene Druckschriften:

Biochemical Journal, Vol. 70, 1958, S. 28 bis 34;

J. Biol. Chem., Vol. 179, 1949, S. 1235 bis 1244;

Organic Reactions, Bd. 10, 1959, S. 1, 11, 31;

Bull. Soc. chim. France, Bd. 31, 1904, S. 76 bis 91;

Chemische Berichte, Bd. 25, 1892, S. 3448 bis 3455; Clinical Chemistry, Vol. 6, 8. August 1960, Nr. 4, S. 394.

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