DE1284391B

DE1284391B - Adsorption von Amylase an Staerke

Info

Publication number: DE1284391B
Application number: DEN23733A
Authority: DE
Inventors: Kusai Kiyoshi; Tsukamoto Makoto; Matsuda Osaharu; Komaki Toshiaki
Original assignee: Nagase and Co Ltd
Current assignee: Nagase and Co Ltd
Priority date: 1962-09-11
Filing date: 1963-09-10
Publication date: 1968-12-05
Also published as: US3297480A

Description

Bei der bekannten Gewinnung von α-Amylase ist es üblich, die durch Züchtung eines Mikroorganismus gewonnene Flüssigkeit mit Stärke zu behandeln, und die Stärke mit der daran adsorbierten aç-Amylase abzutrennen. Auf diese Weise kann oc-Amylase von anderen Enzymen abgetrennt und auch gereinigt werden. Die Amylase wird dann von der Stärke abgetrennt, beispielsweise durch Herauslösung mit einem geeigneten Lösungsmittel.
Dazu wird üblicherweise gewöhnliche Getreidestärke verwendet, die nicht besonders behandelt ist.
Die handelsübliche Getreidestärke besitzt aber nur verhältnismäßig geringe Adsorptionsfähigkeit für Amylase. Weiter ist bekannt, daß-gewöhnliche KartoffelstärkeüberhauptkeinemerklicheAdsorptionsfähigkeit für Amylase besitzt.
Es wäre daher erwiilzsßht, : eine Stärkesorte zu verwenden, deren Adsorptionsfähigkeit für Amylase im Vergleich zu derjenigen normaler Stärke größer ist.
Außerdem wäre es vorteilhaft, wenn man auch Kartoffelstärke und nicht nur Getreidestärke verwenden könnte.
Das technische Enzymgewinnungsverfahren selbst sollte jedoch dadurch möglichst nicht verändert oder gar kompliziert werden.
Die Erfindung besteht nun in der Verwendung von mit Wasserdampf bei 100 bis 135°C behandelter Stärke für die Adsorption von Amylase.
Hierbei kann nun jede Stärke verwendet werden, z. B. Mais-, Weizen-, Reis- und andere Getreidestärke oder Stärke aus weißen oder süßen Kartoffeln.
Für den hier beabsichtigten Verwendungszweck sollte die der Dampfbehandlung unterzogene Stärke bei der Dampfbehandlung selbst zweckmäßig weniger als 250/0, vorzugsweise weniger als 20°/o Wasser enthalten, da die behandelte Stärke sonst zu viel durch Amylase abbaufähige Produkte enthält. Die behandelte Stärke sollte auch bei der Dampfbehandlung selbst nicht mit kondensiertem Wasser in Berührung gekommen sein, damit keine Quellung oder Anfälligkeit für Abbau durch Amylase zur Folge hätte. Beides würde die Adsorptionsfähigkeit der Stärke für Amylase: vermindern.
Es kann zwar Stärke verwendet werden, die mit überhitztem Wasserdampf behandelt ist, zweckmäßigerweise sollte sie jedoch mit gesättigtem Wasserdampf behandelt worden sein.
Bei Verwendung von weißer Kartoffelstärke oder Weizenstärke sollte die Dampfbehandlung vorzugs-. weise zwischen 115 und 1300 C erfolgt sein, während die Behandlungstemperatur für Süßkartoffelstärke und Maisstärke zwischen 125 und 135°C betragen haben soll.
Die für die Adsorption verwendete Stärke sollte vorzugsweise etwa 10 bis 60 Minuten mit Dampf behandelt sein, was zweckmäßig in einem Autoklav an der in dünner Schicht ausgebreiteten Stärke erfolgen kann, wobei zweckmäßig die Stärke selbst bedeckt ist, um das Darauftropfen von Kondenswasser zu verhindern.
Zur Adsorption der Amylase kann auch Stärke verwendet werden, der schon bei der Dampfbehandlung etwa 10 bis 30 0/, lockere Diatomeenerde zugesetzt war. Ebenso kann Stärke verwendet werden, die in röhrenförmigen oder zylindrischen Behandlungskammern mit innenliegender Förderschnecke und äußerem Heizmantel unter Einleiten von Dampf behandelt wurden.
Es ist überraschend festzustellen, daß Stärke, die mit Wasserdampf von 100 bis 135°C behandelt ist, hinsichtlich der Amvlaseadsorption verbessert ist. da bei Adsorptionsfähigkeit von Stärke bei einer trockenen Hitzebehandlung oder bei so viel Wasserzutritt, daß die Stärke durch Amylase verdaulich wird, keine Verbesserung dieser Eigenschaft festzustellen ist.
Die mit Dampf behandelte Stärke kann in üblicher Weise zur Adsorption von in einer Lösung enthaltener α-Amylase verwendet werden. Bei der Amylase, die von der erfindungsgemäßen Stärke adsorbiert werden soll. kann es sich um irgendeine α-Amvlase handeln, die von einem beliebigen Mikroorganismus, wie z. B. dem Bacillus subtilis, erzeugt wird, und es kann auch die im Malz enthaltene sein. So wird beispielsweise eine oc-Amylase enthaltende Lösung, die von der Kultur eines Mikroorganismus herrührt, am besten mit 5 bis 20 °/0 eines anorganischen Salzes wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid oder mit einem organischen Lösungsmittel wie Methanol, Äthanol oder Isopropanol versetzt. Die Temperatur der Lösung kann normale Zimmertemperatur (d. h. 20 bis 30"C) sein, aber wenn der Gehalt an Salz oder organischem Lösungsmittel verhältnismäßig gering ist (z. B. geringer als etwa 10°/o), kühlt man die Lösung möglichst unter 20° C ab. Der pH-Wert der Lösung soll in einem Bereich liegen, in dem die Amylase stabil ist. Die Adsorption von ou-Amylase in der obigen Lösung durch die Stärke kann in einem absatzweisen Verfahren oder i3xXeinem Kolonnenverfahren durchgeführt werden. Bei dem absatzweisen Verfahren wird das Stärkepulver in die Lösung gegeben und gerührt. Die Stärkemenge wechselt in Abhängigkeit von der gesamten Amylaseaktivität in der Lösung. Gewöhnlich reichen bei einer Lösung aus der Kultur eines Mikroorganismus etwa 1 bis 3 Gewichtsprozent Stärke, bezogen auf die Lösung, aus. Das Rühren wird so lange fortgesetzt, bis keine weitere Amylase von der Stärke mehr adsorbiert wird. - -riä allgemeinen genügen dafür etwa 3 Stunden. Dann wird die Stärke von der Lösung durch Filtration oder Zentrifugierung abgetrennt.
Im Falle des Kolonnenverfahrens werden etwa 0,3 bis 1,0 Gewichtsteil eines Filterhillsmiftels (z. B.
Diatomeenerde) mit einem Teil der Stärke vermischt, und das Gemisch wird in eine Säule gefüllt (Höhe etwa 10 bis 15 cm). Dann wird die Amylase enthaltende Lösung langsam durch die Säule geschickt, so daß die oc-Amylase in d, er Lösung auf der Stärke adsorbiert wird.
Die Stärke, auf der die ol-Amylase adsorbiert worden ist, wird in der üblichen Weise gewaschen und getrocknet. Da das ; Verfahren zur Adsorbierung von oc-Amylase auf Stärke gebräuchlich und dem Fachmann gut bekannt ist, = ; èrubri ; gt sich-eine eingehende Erklärung.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert: Beispiel 1 In diesem Beispiel wurden verschiedene Arten handelsüblicher Stärken mit gesättigtem Dampf unter verschiedenen Temperaturbedingungen behandelt. In jedem Falle wurde die zu behandelnde Stärke in einer offenen Schale in einer Schicht von 3 cm Dicke ausgebreitet. Die Öffnung des Gefäßes wurde mit einem Tuch bedeckt und das Gefäß in einen Autoklav gestellt.
Bei leicht geöffneter Belüftung wurde unter Druck gesetzter Dampf durch ein Dampfzuleitungsrohr in das Gefäß eingeleitet. Nachdem ein vorher festgesetzter Druck in dem Gefäß erreicht war, wurden Belüftung und Dampfeinleitungsventil so einreguliert, daß der Druck 20 Minuten lang aufrecht erhalten wurde.
Nach dieser Behandlung wurden 30 g der behandelten Stärke entnommen und in einer 15%igen Lösung von ~Ammoniumsulfat dispergiert. Die Dispersion wurde durch einen Trichter mit Glaswolle filtriert und bildete darauf eine Stärkeschicht.
Durch diese Stärkeschicht wurden 2000 ml einer Amylase enthaltenden Lösung geschickt. Diese Lösung war in der Weise hergestellt worden, daß man zu dem Filtrat der Kultur des Bacillus subtilis, das 1700 DUN pro Milliliter Amylase enthielt (gleich 1 mg kristallisierte α-Amylase im Milliliter), 15% Ammoniumsulfat zusetzte. So wurde die in der Lösung enthaltene Amylase an der Stärke auf dem Trichter adsorbiert. Dann wurde die Stärke mit der daran adsorbierten Amylase in 500 ml einer wäßrigen Calciumchloridlösung dispergiert. Die gesamte Amylaseaktivität wurde in jeder der obigen Dispersionen gemessen, und zwar die Amylase enthaltende Lösung vor der Adsorptionsbehandlung und das durch die Stärkeschicht des Trichters geschickte Filtrat.
Es wurde so die Menge an α-Amylase bestimmt, die pro Gramm der verwendeten Stärke adsorbiert worden war. Abgesehen davon wurde ein Teil der mit Dampf behandelten Stärke in einer wäßrigen Lösung dispergiert, die 50 DUN pro Milliliter Amylase enthielt, und die Dispersion wurde 5 Stunden bei 40"C stehengelassen. Dann wurde sie durch ein Glaswollefilter filtriert, um die Menge an Stärkekomponente zu bestimmen, die durch die Amylase verdaubar ist.

Es wurden die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse erhalten:

Kartoffeln $Süßkartoffeln Mais Weizen

Dampftemperatur Feuchtigkeit in der Stärke

18 0/, ! 17,5% 1 12,5% 1 13 O/o

Kontrolle A 10 135 13 500 9 500

B #

c -

106°C A 3 300 9 800 16 200 20 000

B 2,82 3,58 3,76 10,3

C 3 390 10150 16 850 22 300

115°C A 30 400 34 200 24 200 33 700

B 9,8 4,85 5,00 16,7

C 33 700 35 950 25 500 40 450

117°C A 66 700 37 000 33 000 40 000

B 36,7 6,30 6,50 18,3

C 105400 39 500 35 300 49 000

1200C A 77 500 40 000 35 000 47 400

B 55,5 7,1 6,87 21,0

C 174200 43 100 37 600 60 000

127°C A 82 500 53 700 80 000 82 000

B 67,8 25,6 27,4 59,3

C 256 500 72 200 110 000 201200

133°C A 72 000 70 000 65 000 70 000

B 73,0 32,6 49,2 66

C 266 700 103800 128000 206 000

A: Die Menge (DUN) oc-Amylase, die an 1 g der mit Dampf behandelten Stärke adsorbiert worden ist.

B: Die Menge durch Amylase verdaulicher Stärke in der dampfbehandelten Stärke (O/,).
C: Die Menge (DUM) α-Amylase, die an 1 g der durch Amylase nicht verdaubaren Stärke adsorbiert worden ist.
DUN: 17000 DUN entsprechen 10 mg kristallisierter Amylase.
Beispiel 2 Nach dem Verfahren des Beispiels 1 wurden 10 kg handelsüblicher Kartoffelstärke bei einem Normaldruck von 1,5 kg/cm2 (bei 127"C) 60 Minuten lang mit Dampf behandelt. Die so erhaltene stark adsorptionsfähige Stärke wurde in etwa 30 1 einer 15%igen wäßrigen Lösung von Ammoniumsulfat dispergiert.
Die Dispersion wurde in 500 1 einer 15%igen wäßrigen Lösung von Ammoniumsulfat gegossen, die 2000 DUN pro Milliliter Amylase und 1000 Einheiten pro Milliliter Protease enthielt. Nachdem 20 Minuten lang gerührt worden war, wurde die Dispersion filtriert und die Stärke gesammelt, die dann schnell bei 45°C getrocknet wurde. Es wurden so 9 kg trockenes Stärkepulver erhalten, dessen Amylasegehalt 53000 DUN pro Gramm betrug.
Beispiel 3 12 kg handelsübliche Maisstärke wurden mit 3 kg Diatomeenerde vermischt, und das Gemisch wurde auf einer Aluminiumpfanne ausgebreitet (etwa 1,0 m2).
Die Pfanne wurde in einen Autoklav gestellt und die Stärke bei einem Normaldruck von 1,Skg/cma (127"C) 30 Minuten lang Dampf ausgesetzt.
Die mit Dampf behandelte und mit Diatomeenerde vermischte Stärke wurde in 5001 einer Enzymlösung gegeben (pH 6,0), die etwa 15% Ammoniumsulfat und 230 DUN pro Milliliter Amylase enthielt. Das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt und dann zentrifugiert. Das Filtrat enthielt 30 DUN pro Milliliter Amylase, und die gesamte an der Stärke adsorbierte Amylasemenge betrug 1 108 DUN. Der Filterkuchen wurde mit einer 15%igen wäßrigen Ammoniumsulfatlösung gewaschen und dann entwässert.
Die entwässerte Stärke (mit Diatomeenerde) wurde dann in 5001 einer wäßrigen Lösung (pH 6,0) gegeben, die 18% Ammoniumsulfat und 1700 DUN pro - Milliliter Amylase enthielt. Das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt und in der oben beschriebenen -Weise der Zentrifugierung unterworfen. Der Filterkuchen wurde gesammelt und mit Hilfe einer Presse zu Preßlingen, z B. in Form von Kügelchen verarbeitet. Die Tabletten wurden mit einem Lufttrockner getrocknet. Erhalten wurden 8,0 kg trockene Preßlinge mit einem Gehalt von 5% Wasser, 13°/e Ammoniumsulfat und 3,9% Diatomeenerde. Jede Tablette enthielt 90,000 DUN Amylase pro Gramm.
Die Ausbeute an zurückgewonnener Amylase betrug 9001,.

Claims

Patentanspruch: Verwendung von mit Wasserdampf bei 100 bis 135°C behandelter Stärke für die Adsorption von Amylase.