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DE12753557T1 - Analyse einer sequenzierungsvorspannung - Google Patents

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c/o University of East Anglia Moulton Vincent
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Abstract

Verfahren zur Bestimmung der Sequenzverzerrung (Sequence Bias) einer Sequenzierungstechnik, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen;
(b) Bestimmen der Sequenz der Nucleinsäuremoleküle in der unter (a) bereitgestellten degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen unter Verwendung der Sequenzierungstechnik; und
(c) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen.

Claims (24)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Sequenzverzerrung (Sequence Bias) einer Sequenzierungstechnik, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; (b) Bestimmen der Sequenz der Nucleinsäuremoleküle in der unter (a) bereitgestellten degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen unter Verwendung der Sequenzierungstechnik; und (c) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Sequenzierungstechnik die Ligation von Adaptermolekülen an das 5'-, 3'- oder 5'- und 3'-Ende der Nucleinsäuremoleküle in der degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, das umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; (b) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 3'-Ende (3'-Adaptermolekül) mit den 3'-Enden der Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung einer Ligase; (c) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 5'-Ende (5'-Adaptermolekül) mit den 5'-Enden der Nucleinsäuremoleküle aus Schritt (b) unter Verwendung einer Ligase; (d) Sequenzieren der resultierenden Bibliothek von ligierten Nucleinsäuremolekülen; und (e) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen, wobei die Schritte (b) und (c) in einer beliebigen Reihenfolge ausgeführt werden können.
  4. Verfahren nach Anspruch 2, das umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, wobei die Nucleinsäuremoleküle eine konsistente 3'-Region und ein blockiertes 3'-Ende aufweisen; (b) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 5'-Ende (5'-Adaptermolekül) mit den 5'-Enden der Nucleinsäuremoleküle aus Schritt (a) unter Verwendung einer Ligase; (d) Sequenzieren der resultierenden amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; und (e) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, das umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, wobei die Nucleinsäuremoleküle eine konsistente 5'-Region und ein blockiertes 5'-Ende aufweisen; (b) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 3'-Ende (3'-Adaptermolekül) mit den 3'-Enden der Nucleinsäuremoleküle aus Schritt (a) unter Verwendung einer Ligase; (d) Sequenzieren der resultierenden amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; und (e) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, das umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, wobei die Nucleinsäuremoleküle eine konsistente 5'-Region und eine konsistente 3'-Region aufweisen; (b) Sequenzieren der resultierenden amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; und (c) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, das umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von RNA-Molekülen; (b) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 3'-Ende (3'-Adaptermolekül) mit den 3'-Enden der RNA-Moleküle unter Verwendung einer Ligase; (c) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 5'-Ende (5'-Adaptermolekül) mit den 5'-Enden der RNA-Moleküle aus Schritt (b) unter Verwendung einer Ligase; (d) Reverse Transkription der RNA-Moleküle in cDNA unter Verwendung einer Reversen Transkriptase und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist; (e) erforderlichenfalls Erzeugen einer amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen durch PCR der in Schritt (d) erhaltenen cDNA unter Verwendung eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem Komplement des 5'-Adaptermoleküls befähigt ist, und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist; (f) Sequenzieren der resultierenden Bibliothek von ligierten Nucleinsäuremolekülen; und (g) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen, wobei die Schritte (b) und (c) in einer beliebigen Reihenfolge ausgeführt werden können.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, das umfasst: (a) Bereitstellen einer degenerierten Bibliothek von DNA-Molekülen; (b) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 3'-Ende (3'-Adaptermolekül) mit den 3'-Enden der DNA-Moleküle unter Verwendung einer Ligase; (c) Ligieren eines Oligonucleotids bekannter Sequenz mit blockiertem 5'-Ende (5'-Adaptermolekül) mit den 5'-Enden der DNA-Moleküle aus Schritt (b) unter Verwendung einer Ligase; (d) Amplifizieren der ligierten DNA-Moleküle durch asymmetrische PCR; (e) erforderlichenfalls Erzeugen einer amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen durch PCR der in Schritt (d) erhaltenen DNA-Moleküle unter Verwendung eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem Komplement des 5'-Adaptermoleküls befähigt ist, und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist; (f) Sequenzieren der resultierenden Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; und (g) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um die Über- oder Unterrepräsentation bestimmter Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen, wobei die Schritte (b) und (c) in einer beliebigen Reihenfolge ausgeführt werden können.
  9. Verfahren zur Verminderung der Sequenzverzerrung (Sequence Bias) einer Sequenzierungstechnik, die eine Adapterligation umfasst, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Satzes von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle) und eines Satzes von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle und die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen; (b) Ligieren der 3'-Adaptermoleküle mit den 3'-Enden der Zielnucleinsäuremoleküle unter Verwendung einer Ligase; (c) Ligieren der 5'-Adaptermoleküle mit den 5'-Enden der in Schritt (b) erhaltenen Zielnucleinsäuremoleküle unter Verwendung einer Ligase; und (d) Bestimmen der Sequenz der in Schritt (c) erhaltenen Zielnucleinsäuremoleküle unter Verwendung eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem Komplement des 5'-Adaptermoleküls befähigt ist, und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist.
  10. Verfahren zum bevorzugten Erfassen eines Zielnucleinsäuremoleküls in einer Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Satzes von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle) und eines Satzes von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle und die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen und vorzugsweise mit dem Zielnucleinsäuremolekül ligiert werden können; (b) Ligieren des 3'-Adaptermoleküls mit den 3'-Enden der Nucleinsäuremoleküle in der Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen unter Verwendung einer Ligase; (c) Ligieren des 5'-Adaptermoleküls mit den 5'-Enden der in Schritt (b) erhaltenen Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung einer Ligase; (d) Erzeugen einer amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen durch PCR der in Schritt (d) erhaltenen Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem Komplement des 5'-Adaptermoleküls befähigt ist, und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist; (e) Sequenzieren der resultierenden amplifizierten Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen; und (f) Analysieren der Sequenzierungsergebnisse, um zu bestimmen, ob das Zielnucleinsäuremolekül in der Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen vorhanden ist.
  11. Verfahren zum bevorzugten Erfassen eines Zielnucleinsäuremoleküls in einer Bibliothek von Nucleinsäuremolekülen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Oligonucleotids bekannter Sequenz (Adaptermolekül), das ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfasst, wobei das Oligonucleotid vorzugsweise mit dem Zielnucleinsäuremolekül ligiert werden kann; (b) Ligieren des Adaptermoleküls mit den Nucleinsäuremolekülen in der Bibliothek unter Verwendung einer Ligase; (c) Durchführen einer quantitativen PCR an den in Schritt (b) erhaltenen Molekülen unter Verwendung eines für das Adaptermolekül spezifischen Primers und eines für das Zielnucleinsäuremolekül spezifischen Primers.
  12. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin die Zielnucleinsäure mit einer Erkrankung oder einem Zustand vor einer Erkrankung in Verbindung steht.
  13. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin die Zielnucleinsäure mit einem speziellen Organismus in Verbindung steht.
  14. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin die Zielnucleinsäure mit einem speziellen Gewebetyp in Verbindung steht.
  15. Verfahren nach Anspruch 10 oder Anspruch 11, worin die Zielnucleinsäure mit einem speziellen Entwicklungsstadium in Verbindung steht.
  16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 9 bis 15, worin die Nucleinsäuremoleküle RNA-Moleküle sind.
  17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 9 bis 15, worin die Nucleinsäuremoleküle DNA-Moleküle sind.
  18. Verfahren zum Erzeugen einer cDNA-Bibliothek aus einer Bibliothek von RNA-Molekülen, wobei das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen eines Satzes von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle) und eines Satzes von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle und die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen; (b) Ligieren der 3'-Adaptermoleküle mit den 3'-Enden der RNA-Moleküle unter Verwendung einer Ligase; (c) Ligieren der 5'-Adaptermoleküle mit den 5'-Enden der in Schritt (b) erhaltenen RNA-Moleküle unter Verwendung einer Ligase; (d) Erzeugen von RNA/DNA-Hybrid-Template-Molekülen aus den in Schritt (c) erhaltenen RNA-Molekülen unter Verwendung einer Reversen Transkriptase und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist; und (e) Erzeugen einer cDNA-Bibliothek durch PCR der in Schritt (d) erhaltenen RNA/DNA-Hybrid-Template-Moleküle unter Verwendung eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem Komplement des 5'-Adaptermoleküls befähigt ist, und eines Primers, der zur Hybridisierung mit dem 3'-Adaptermolekül befähigt ist.
  19. Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3, 5, 7, 8, 9 oder 18.
  20. Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 oder 18.
  21. Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle) und Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle und die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, 7, 8, 9 oder 18.
  22. Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen, wobei die Oligonucleotide vorzugsweise mit einer Zielsequenz ligiert werden können, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17.
  23. Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen, wobei die Oligonucleotide vorzugsweise mit einer Zielsequenz ligiert werden können, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17.
  24. Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 3'-Enden (3'-Adaptermoleküle) und Satz von Oligonucleotiden bekannter Sequenz mit blockierten 5'-Enden (5'-Adaptermoleküle), wobei die 3'-Adaptermoleküle und die 5'-Adaptermoleküle ein oder mehrere degenerierte Nucleotide umfassen, wobei die Oligonucleotide vorzugsweise mit einer Zielsequenz ligiert werden können, zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17.
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