DE10348407A1

DE10348407A1 - Prognostische und diagnostische Marker für Zell-proliferative Erkrankungen von Brustgeweben

Info

Publication number: DE10348407A1
Application number: DE10348407A
Authority: DE
Inventors: Martin Widschwendter
Original assignee: Individual
Current assignee: Widschwendter Martin Prof Dr London Gb
Priority date: 2003-10-17
Filing date: 2003-10-17
Publication date: 2005-05-19
Also published as: WO2005040421A3; US20090162836A1; WO2005040421A2; EP1675967A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte und genomische Sequenzen, Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustands von genomischer DNA sowie ein Verfahren zur Prognose und Behandlung einer proliferativen Erkrankung von Brustgeweben.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft prognostische und diagnostische Marker für Zellproliferative Erkrankungen der Brustgewebe. Die vorliegende Erfindung stellt daher Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von biologischen Proben auf Merkmale zur Verfügung, die mit der Entwicklung von proliferativen Erkrankungen der Brustzellen assoziiert sind.

Hintergrund der Erfindung

Diese Patentanmeldung betrifft die Diagnose und Prognose von Brustkrebs. Heutzutage sind die Beteiligung von axillaren Lymphknoten und die Tumorgröße die wichtigsten prognostischen Faktoren bei Brustkebs. Obwohl die Anwesenheit von metastatischer Beteiligung in den axillaren Lymphknoten der aussagekräftigste prognostische Faktor ist, der für Patienten mit primärem Brustkrebs erhältlich ist, ist er nur ein indirektes Maß, das die Tendenz des Tumors widerspiegelt, sich auszubreiten. In ungefähr einem Drittel von Frauen mit Brustkrebs und negativen Lymphknoten tritt die Erkrankung wieder auf, während ungefähr ein Drittel an Patienten mit positiven Lymphknoten zehn Jahre nach loko-regionaler Therapie frei von Wiederauftreten ist. Diese Daten verdeutlichen den Bedarf für sensitivere und spezifischere prognostische Indikatoren, die idealerweise die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tumor-spezifischen Veränderungen im Blutstrom widerspiegeln, die eventuell noch nach Jahren zu Metastasen führen können. Es ist nun breit akzeptiert, daß eine Anschlußsystemische Therapie die Erkrankungsfreiheit und das Gesamt-Überleben in sowohl prä- und postmenopausalen Frauen mit Lymphknoten-negativem oder Lymphknoten-positivem Brustkrebs bis zu einem Alter von 70 Jahren wesentlich verbessert (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomised trials. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group. Lancet, 351: 1451–1467, 1998.2, 3). Es ist auch allgemein akzeptiert, daß Patienten mit schlechten prognostischen Merkmalen am meisten von der Anschluß-Therapie profitieren, wohingegen einige Patienten mit guten prognostischen Merkmalen überbehandelt werden könnten (Goldhirsch et al.: Meeting highlights: International Consensus Panel on the Treatment of Primary Breast Cancer. Seventh International Conference on Adjuvant Therapy of Primary Breast Cancer. J. Clin. Oncol., 19: 3817–3827, 2001.). Darüber hinaus wurden viele andere Faktoren auf ihr Potential hin untersucht, den Erkrankungsausgang vorherzusagen, jedoch haben sie im allgemeinen nur begrenzten prädiktiven Wert. Kürzlich wurden interessante prognostische Parameter, einschließlich Genexpressionsprofilen, Zellzyklus-regulierende Proteine und okkulte Cytokeratin-positive metastatische Zellen im Knochenmark zu der Liste von prognostischen Faktoren hinzugefügt, jedoch muß ihre prognostische Relevanz weiter untersucht werden.

Veränderungen im Status der DNA Methylierung, die als epigenetische Veränderungen bekannt sind, sind die am meisten verbreiteten molekularen Veränderungen bei menschlicher Neoplasie, einschließlich Brustkrebs (Widschwendter and Jones: DNA methylation and breast carcinogenesis. Oncogene, 21: 5462–5482, 2002). Eine Cytosinmethylierung findet nach der DNA Synthese durch enzymatischen Transfer einer Methylgruppe von dem Methyldonor S-Adenosylmethionin auf die Kohlenstoff-5 Position von Cytosin statt. Cytosine sind im menschlichen Genom am meisten dann methyliert, wenn sie 5' zu einem Guanosin lokalisiert sind. Regionen mit einem hohen G:C Gehalt sind sogenannte CpG Inseln. Es wurde über die letzten vier bis fünf Jahre hinweg zunehmend erkannt, daß die CpG Inseln einer großen Zahl von Genen, die in normalem Gewebe hauptsächlich nicht methyliert sind, zu veränderlichen Anteilen in menschlichen Krebserkrankungen methyliert sind und daher Tumor-spezifische Veränderungen darstellen. Die Anwesenheit von abnormal hohen DNA Konzentrationen im Serum von Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen wurde vor mehreren Jahren beschrieben. Die Entdeckung, daß zellfreie DNA in den Blutstrom abgesondert werden kann, hat großes Interesse erzeugt. Zahlreiche Studien haben Tumor-spezifische Veränderungen in DNA gezeigt, die aus dem Plasma oder Serum von Patienten mit verschiedenen malignen Erkrankungen erhalten wurde, ein Ergebnis, das Potential für die molekulare Diagnose und Prognose aufweist. Die in Plasma und Serum beschriebenen Nukleinsäuremarker schließen onkogene Mutationen, Mikrosatelliten-Veränderungen, Genrearrangements und epigenetische Veränderungen, wie zum Beispiel aberrante Promotor-Hypermethylierung (Anker et al.: Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. Cancer Metastasis Rev., 18: 65–73, 1999) ein. Während der letzten Jahre haben einige Studien über zellfreie DNA in Serum/Plasma von Brustkrebs-Patienten unter Diagnose berichtet (zum Beispiel: Silva et al.: Presence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients: clinicopathological correlations. Cancer Res., 59: 3251–3256, 1999) und in einigen Fällen eine Persistenz nach primärer Therapie (zum Beispiel: Silva et al.: Persistence of tumor DNA in plasma of breast cancer patients alter mastectomy. Ann. Surg. Oncol., 9: 71–76, 2002). Nichts desto trotz haben eine zunehmende Zahl von Studien von der Anwesenheit von methylierter DNA in Serum/Plasma von Patienten mit verschiedenen Typen von malignen Erkrankungen, einschließlich Brustkrebs und dem Fehlen von methylierter DNA in normalen Kontrollpatienten berichtet (zum Beispiel: Wong et al.: Detection of aberrant p16 methylation in the plasma and serum of liver cancer patients. Cancer Res., 59: 71–73, 1999). Bis jetzt haben nur wenige Studien den prognostischen Wert dieser epigenetischen Veränderungen im Blutstrom des Patienten adressiert (Kawakami et al.: Hypermethylated APC DNA in plasma and prognosis of patients with esophageal adenocarcinoma. J. Natl. Cancer Inst., 92: 1805–1811, 2000; Lecomte et al.: Detection of free-circulating tumor-associated DNA in plasma of colorectal cancer patients and its association with prognosis. Int. J. Cancer, 100: 542–548, 2002).

Es wird durch die Fachleute im Stand der Technik erkannt werden, daß ein kontinuierlicher Bedarf besteht, Verfahren des frühen Nachweises, der Klassifizierung und der Behandlung von Brustkrebs-Erkrankungen zu verbessern. In dieser Anmeldung werden prognostische und diagnostische DNA Methylierungs-basierte Marker für Brustkrebs beschrieben.

5-Methylcytosin-Positionen können nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist, wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die vom 5-Methylcytosin getragene epigenetische Information vollständig verloren. Die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methylcytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydrolyse in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcytosin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Daher wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, daß Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden konnte, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin, beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt werden kann. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified und improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15; 24 (24): 5064-6). Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden gegenwärtig nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersuchung von Zellen auf Tausende von möglichen Methylierungsereignisse ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.

Eine Übersicht über die weiteren bekannten Verfahren zum Nachweis von 5-Methylcytosin kann dem folgenden Übersichtsartikel entnommen werden: Fraga und Esteller: DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33: 632–649, Sept. 2002.

Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z.B. Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman und Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 Mar-Apr; S (2): 94-8) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint: 1997 Nr.v; 17 (3): 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25 (12): 2529-31, WO 95/00669) oder durch enzymatischen Verdau (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive und quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun 15; 25 (12): 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99/28498).

Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 Jun; l6 (6): 431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 Mar; 6 (3): 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb 25; 22 (4): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene und its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19; 157 (1-2): 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373, und WO 97/45560.

Eine Übersicht über den Stand der Technik in der Oligomer Array Herstellung läßt sich aus einer im Januar 1999 erschienenen Sonderausgabe von Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999) und der dort zitierten Literatur entnehmen.

Für die Abtastung immobilisierter DNA-Arrays werden vielfach fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5'-OH der jeweiligen Sonde. Die Detektion der Fluoreszenz der hybridisierten Sonden kann beispielsweise über ein Konfokalmikroskop erfolgen. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.

Matrix-unterstützte Laser Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15; 60 (20): 2299-301). Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleunigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden die Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.

MALDI-TOF Spektrometrie eignet sich ausgezeichnet zur Analyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut I G, Beck S. DNA und Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations und Future Trends. 1995, 1; 147–57). Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektrometrie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrizes gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Mittlerweile gibt es einige ansprechende Matrizes für DNA, der Empfindlichkeitsunterschied wurde jedoch nicht verringert. Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, daß sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnukleinsäuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rückgrats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut IG, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation und detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 1995 Apr 25; 23 (8): 1367-73). Die Kopplung eines „charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit auf das gleiche Niveau, wie es für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.

Genomische DNA wird von der DNA von zellulären, Gewebe- oder anderen Testproben unter der Verwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standard-Methodologie kann in Literaturstellen, wie zum Beispiel Fritsch und Maniatis eds.; Molecular Clonin: A Laboratory Manual, 1989, gefunden werden.

Beschreibung

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Nukleinsäuren für die Analyse von biologischen Proben auf Merkmale, die mit der Entwicklung von Brustzell-proliferativen Erkrankungen assoziiert sind. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure von mindestens einem Mitglied der Gruppe von Genen nach Tabelle 1 mit einem Reagenz oder Reihe von Reagenzien, die zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG Dinukleotiden innerhalb der genomischen Sequenz von Interesse unterscheiden, in Kontakt gebracht wird/werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parameter von genomischer DNA zur Verfügung.

Das Verfahren ist bei der Bestimmung der Prognose von Brustzell-proliferativen Erkrankungen brauchbar. Die Erfindung stellt Verbesserungen über den Stand der Technik dar, da mittels der hier beschriebenen Verfahren und Verbindungen ein Fachmann im Stand der Technik einen sensitiven und spezifischen Nachweistest von zellulärer Materie umfassend kanzeröses Brustgewebe durchführen könnte. Dies ist insbesondere brauchbar, da es die Analyse von Proben von Körperflüssigkeiten ermöglicht, die nur einen minimale Menge des proliferativ erkrankten Zellmaterials enthalten könnten und so den Nachweis dieser Zellen ermöglicht und der Identifizierung des Organs, von dem sie abstammen (in diesem Fall der Brust). Bis heute gibt es keine bekannten klinisch brauchbaren Mittel für den Nachweis von Brustkrebs unter der Verwendung genetischer Methylierungsmarker, um Körperflüssigkeiten zu analysieren, wie zum Beispiel Blut, Lymphflüssigkeiten, Brustwarzenaspirat und Plasma. Die erzeugte Information ist bei der Auswahl einer Behandlung des Patienten brauchbar. Falls eine positive Prognose bestimmt wird, kann eine weitere Behandlung redundant sein, während in einem Fall einer schlechten Prognose eine stärkere Behandlung erforderlich sein kann.

Weiterhin ermöglicht das Verfahren die Analyse von Cytosinmethylierungen und „single nucleotide" Polymorphismen.

Die Gene, die die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, werden bevorzugterweise in Form eines "Gen Panels", d.h. einer Sammlung, die die besonderen genetischen Sequenzen der vorliegenden Erfindung und/oder deren jeweiligen informativen Methylierungsstellen umfaßt, verwendet. Die Bildung vom Gen Paneln ermöglicht eine schnelle und spezifische Analyse von spezifischen Aspekten von Brustkrebs. Die Genpanel, wie in dieser Erfindung beschrieben und verwendet, können mit einer überraschend hohen Effizienz für die Diagnose, Behandlung und Überwachung und die Analyse einer Prädisposition gegenüber Brustzell proliferativen Erkrankungen verwendet werden.

Zusätzlich ermöglicht die Verwendung von multiplen CpG Stellen aus einem diversen Array von Gene ein relativ hohes Ausmaß an Sensitivität und Spezifität im Vergleich mit Einzelgen diagnostischen und Nachweismitteln. Von den Genen, die als spezifisch methyliert bei Brustkrebs bekannt sind, stellt die besondere Kombination der Gene gemäß der Erfindung ein be sonders sensitives und spezifisches Mittel zur Identifizierung von proliferativen Zellerkrankungen von Brustgeweben zur Verfügung.

Die Aufgabe der Erfindung wird am meisten bevorzugt mittels der Analyse der Methylierungsmuster eines oder einer Kombination der Gene, ausgewählt aus der Gruppe ESR1, APC, HSD17484, HIC1 und RASSF1A (siehe, z.B., Tabelle 1) und/oder deren regulatorischen Regionen gelöst. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eines oder einer Kombination der Gene, ausgewählt aus der Gruppe ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A mit einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien in Kontakt gebracht wird, die in der Lage sind, zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der genomischen Sequenz von Interesse zu unterscheiden.

Die Aufgabe der Erfindung kann auch durch die Analyse der CpG Methylierung eines oder einer Vielzahl von jeder Untergruppe der Gruppe der Gene ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A gelöst werden, wobei die folgenden Untergruppen bevorzugt sind:

– RASSF1A und APC,
– RASSF1A, und
– APC

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA zur Verfügung. Das Verfahren dient der verbesserten Diagnose, Behandlung und Überwachung von Brustzell-proliferativen Erkrankungen.

Die offenbarte Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Bestimmung des Phänotyps eines Subjekts mit einer Brustzell-proliferativen Erkrankung zur Verfügung, umfassend

a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, von dem Subjekt,
b) Analysieren des Methylierungsmusters von einer oder mehreren Zielnukleinsäuren, umfassend eine oder eine Kombination der Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ESR1, APC, HSD17484, HIC1 und RASSF1A und/oder deren regulatorischer Regionen durch in Kontakt bringen von mindestens einer der Zielnukleinsäuren in der biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde, mit mindestens einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien, die zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG Dinukleotiden unterscheiden, und
c) Bestimmen des Phänotyps des Individuums durch Vergleich mit zwei bekannten Phänotypen, einem ersten Phänotyps, der durch Hypermethylierung der Zielnukleinsäure und schlechter Prognose gekennzeichnet ist, relativ zu einem zweiten Phänotyp, der durch Hypomethylierung der analysierten Zielnukleinsäure und bessere Prognose gekennzeichnet ist.

Die genomische DNA kann aus jeder Form von biologischer Probe aus Quellen isoliert werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, Zellinien, histologischen Schnitte, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Brustgewebe, Blut, Plasma, lymphatische Flüssigkeit, lymphatisches Gewebe, Ductus-Zellen, ductaler Lavageflüssigkeit, Brustwarzen-Aspirationsflüssigkeit und Kombinationen davon. Die genomische DNA muß dann aus der Probe isoliert werden, unter der Verwendung jeden Mittels des Stands der Technik. Die isolierte DNA wird mit mindestens mit einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien behandelt, das zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG Dinukleotiden unterscheidet. Dies kann durch jedes Mittel durchgeführt werden, das Standard im Stand der Technik ist, einschließlich der Verwendung von Restriktionsendonukleasen. Jedoch wird dies bevorzugt mit Bisulfit (Sulfit, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse durchgeführt, was zu einer Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil oder einer anderen Base führt, die im Hinblick auf das Basenpaarungsverhalten von Cytosin verschieden ist. Falls eine Bisulfitlösung für die Reaktion verwendet wird, findet dann eine Addition an den nicht-methylierten Cytosinbasen statt. Darüber hinaus muß eine denaturierendes Reagenz oder Lösungsmittel, sowie ein Radikalfänger vorhanden sein. Eine anschließende alkalische Hydrolyse führt dann zu der Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil. Die konvertierte DNA wird dann für den Nachweis auf methylierte Cytosine verwendet. Der Methylierungsstatus eines oder mehrerer der Gene ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A und/oder deren regulatorischen Regionen wird dann analysiert. Diese Analyse kann durch jedes Mittel durchgeführt werden, das Standard im Stand der Technik ist, einschließlich den oben beschriebenen Techniken. Im letzten Schritt des Verfahrens wird das Methylierungsmuster der von dem Subjekt erhaltenen DNA mit der von zwei bekannten Phänotypen verglichen. Der erste Phänotyp ist gekennzeichnet durch Hypermethylierung oder Methylierung der Zielnukleinsäure und schlechte Prognose, relativ zu einem zweiten Phänotyp, gekennzeichnet durch Hypomethylierung oder keiner Methylierung der analysierten Ziel nukleinsäure und bessere Prognose. Es ist besonders bevorzugt, daß die Gene APC und RASSF1A analysiert werden. Durch Bestimmung, zu welchem der zwei Phänotypen das Subjekt gehört ist es möglich, eine geeignete Behandlung für ihre proliferative Erkrankung der Brustzellen zu bestimmen.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann für die Analyse einer großen Vielzahl von Zellproliferativen Erkrankungen der Brustgewebe verwendet werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf, ductale Karzinome in situ, lobuläre Karzinome, kolloidale Karzinome, tubuläre Karzinome, medulläre Karzinome, metaplastische Karzinome, intraductale Karzinome in situ, lobuläre Karzinome in situ und papilläre Karzinome in situ.

Weiterhin ermöglicht das Verfahren die Analyse von Cytosin-Methylierungen und Single Nucleotide Polymorphismen innerhalb der genannten Gene.

Die Aufgabe der Erfindung wird mittels der Analyse der Methylierungsmuster der Gene ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A und/oder deren regulatorischer Regionen gelöst. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die Sequenzen der Gene SEQ ID Nos: 1 bis 5 und dazu komplementäre Sequenzen.

Die Aufgabe der Erfindung kann auch durch die Analyse der Methylierungsmuster von einem oder mehreren der Gene, ausgewählt aus den folgenden Untergruppen der oben genannten Gruppe von Genen erreicht werden. In einer Ausführungsform wird die Aufgabe der Erfindung durch die Analyse der Methylierungsmuster der Gene RASSF1A und APC erreicht und wobei es weiter bevorzugt, daß die Sequenz der Gene jeweils SEQ ID NOs: 5 und 3 umfaßt. In einer weiteren Ausführungsform wird die Aufgabe der Erfindung durch die Analyse der Methylierungsmuster des Gens RASSF1A und/oder seiner regulatorischen Sequenzen gelöst und wobei es weiter bevorzugt ist, daß die Sequenz des Gens SEQ ID NO: 5 umfaßt. Die Aufgabe der Erfindung kann auch durch die Analyse der Methylierungsmuster des Gens APC und/oder seiner regulatorischen Sequenzen gelöst werden, wobei es weiter bevorzugt ist, daß die Sequenz des Gens SEQ ID NO: 3 umfaßt.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren durch in Kontakt bringen der Nukleinsäuresequenzen in einer biologischen Probe, die von einem Subjekt erhalten wurde, mit mindestens einem Reagenz oder einer Serie von Reagenzien gelöst, wobei das Reagenz oder die Serie von Reagenzien zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG-Dinukleotiden innerhalb der jeweiligen Zielnukleinsäure unterscheidet.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren die folgenden Schritte:
In dem ersten Schritt des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe aus Quellen isoliert werden, wie zum Beispiel Zellen oder zellulären Komponenten, die DNA enthalten, wobei Quellen von DNA zum Beispiel, Zellinien, histologische Schnitte, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Brustgewebe, Blut, Plasma, lymphatische Flüssigkeit, lymphatisches Gewebe, Ductus-Zellen, ductaler Lavageflüssigkeit, Brustwarzen-Aspirationsflüssigkeit und Kombinationen davon umfassen. Die Extraktion kann durch Mittel erfolgen, die Standard für den Durchschnittsfachmann sind, diese schließen die Verwendung von Detergenzlysaten, die Beschallen und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert wurden, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor dem nächsten Schritt des Verfahrens gespalten werden, dies kann durch jedes Mittel geschehen, das Standard im Stand der Technik ist, insbesondere, jedoch nicht begrenzt auf, mit Restriktions-Endonukleasen.

Im zweiten Schritt des Verfahrens wird die genomische DNA Probe auf solch eine Weise behandelt, das die Cytosinbasen, die an der 5'-Position nicht-methyliert sind, zu Uracil, Thymin oder einer anderen Base konvertiert werden, die im Hinblick auf das Hybridisierungsverhalten verschieden von Cytosin ist. Dies wird hier im folgenden als „Vorbehandlung" oder „chemische Vorbehandlung" verstanden.

Die oben beschriebene Behandlung der genomischen DNA wird bevorzugterweise mit Bisulfit (Sulfat, Disulfit) und anschließender alkalischer Hydrolyse durchgeführt, die zu einer Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil oder einer anderen Base führt, die sich im Hinblick auf das Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet. Falls eine Bisulfitlösung für die Reaktion verwendet wird, findet eine Addition an den nicht-methylierten Cytosinbasen statt. Darüber hinaus muß ein denaturierendes Mittel oder ein Lösungsmittel sowie ein Radikalfänger vorhanden sein. Eine anschließende alkalische Hydroly se ermöglicht dann die Konversion von nicht-methylierten Cytosin-Nukleobasen zu Uracil. Die konvertierte DNA wird dann für den Nachweis von methylierten Cytosinen verwendet.

Fragmente der vorbehandelten DNA werden unter der Verwendung von Sets von Primer-Oligonukleotiden und einer bevorzugterweise hitzebeständigen Polymerase amplifiziert. Aus statistischen und praktischen Überlegungen werden bevorzugterweise mehr als sechs verschiedene Fragmente, die eine Länge von 100–2000 Basenpaaren aufweisen, amplifiziert. Die Amplifikation von verschiedenen DNA-Segmenten kann gleichzeitig in ein- und demselben Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Gewöhnlicher weise wird die Amplifikation mittels einer Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt.

Der Aufbau solcher Primer ist dem Durchschnittsfachmann ersichtlich. Diese sollten mindestens zwei Oligonukleotide enthalten, deren Sequenzen jeweils revers komplementär oder identisch zu einem mindestens 18 Basenpaare langen Segment der Basensequenzen, die in dem Appendix angegeben sind: SEQ ID NO 6 bis 26. Die Primeroligonukleotide sind bevorzugterweise dadurch gekennzeichnet, daß sie keine CpG-Dinukleotide enthalten. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird die Sequenz der Primeroligonukleotide so aufgebaut, um selektiv nur an die Brustzell-spezifische DNA von Interesse zu annealen und diese zu amplifizieren, wodurch die Amplifikation von Hintergrund oder nicht-relevanter DNA minimiert wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung soll Hintergrund DNA genomische DNA bedeuten, die kein relevantes Gewebe-spezifisches Methylierungsmuster aufweist, wobei in diesem Fall das relevante Gewebe Brustgewebe sind.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß während der Amplifikation mindestens ein Primeroligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Die verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen können auf einer festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters angeordnet werden, wobei die feste Phasen-Oberfläche bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist, wobei auch andere Materialien, wie zum Beispiel Nitrozellulose oder Plastik als möglich verwendet werden können.

Die mittels Amplifikation erhaltenen Fragmente können einen direkt oder indirekt nachweisbaren Marker tragen. Bevorzugt sind Marker in Form von Fluoreszenzmarkern, Radionukli den oder ablösbaren Molekülfragmenten, die eine typische Masse aufweisen, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können, wobei es bevorzugt ist, daß die Fragmente, die produziert werden, eine einzelne positive oder negative Nettoladung zum besseren Nachweis im Massenspektrometer aufweisen. Der Nachweis kann durchgeführt werden und visualisiert werden mittels Matrix-assistierter Laserdesorptions-/Inonisierungs-Massenspektrometrie (MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronenspray-Massenspektrometrie (ESI).

Im nächsten Schritt werden die Nukleinsäureamplifikate analysiert, um den Methylierungsstatus der genomischen DNA vor der Behandlung zu bestimmen.

Die post-Behandlungsanalyse der Nukleinsäuren kann unter der Verwendung alternativer Verfahren durchgeführt werden. Verschiedene Verfahren für die Methylierungsstatusspezifische Analyse der behandelten Nukleinsäuren sind unten beschrieben, andere alternative Verfahren werden dem Durchschnittsfachmann ersichtlich sein.

Die Analyse kann während des Amplifikationsschritts des Verfahrens durchgeführt werden. In einer solchen Ausführungsform kann der Methylierungsstatus von ausgewählten CpG-Positionen innerhalb der Gene ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A und/oder deren regulatorischen Regionen durch die Verwendung von Methylierungs-spezifschen Primeroligonukleotiden nachgewiesen werden. Der Ausdruck "MSP" (Methylierungsspezifische PCR) betrifft den im Stand der Technik bekannten Methylierungstest, der durch Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821–9826, 1996, beschrieben wurde und auch in den US Patenten Nr. 5,786,146 und Nr. 6,265,171 offenbart ist. Die Verwendung von Methylierungsstatusspezifischen Primern für die Amplifikation von mit Bisulfit behandelter DNA ermöglicht die Differenzierung zwischen methylierten und nicht-methylierten Nukleinsäuren. MSP-Primerpaare enthalten mindestens einen Primer, der an ein Bisulfit behandeltes CpG-Dinukleotid hybridisiert. Daher umfaßt die Sequenz des Primers mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid. Für nicht-methylierte DNA spezifische MSP-Primer enthalten ein „T" an der 3'-Position der C-Position im CpG. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es daher bevorzugt, daß die Basensequenz der Primer zwingender weise eine Sequenz umfaßt, die eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte Nukleinsäurese quenz gemäß SEQ ID Nos 6 bis 26 und dazu komplementären Sequenzen hybridisiert, wobei die Basensequenz der Oligomere mindestens ein CG-, TG- oder CA-Dinukleotid umfaßt.

In einer Ausführungsform des Verfahrens kann der Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels Hybridisierungsanalyse bestimmt werden. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens werden die im zweiten Schritt erhaltenen Amplifikate an eine Anordnung oder ein Set von Oligonukleotiden und/oder PNA-Sonden hybridisiert. In diesem Kontext findet die Hybridisierung auf die wie folgt beschriebenen Weise statt. Das Set von Sonden, das während der Hybridisierung verwendet wird, setzt sich bevorzugterweise aus mindestens 4 Oligonukleotiden oder PNA-Oligomeren zusammen. Im Verfahren dienen die Amplifikate als Sonden, die an Oligonukleotide hybridisieren, die vorher an eine feste Phase gebunden wurden. Die nicht-hybridisierten Fragmente werden anschließend entfernt. Die Oligonukleotide enthalten mindestens eine Basensequenz, die eine Länge von 10 Nukleotiden aufweist, die revers komplementär oder identisch ist zu einem Segment der Basensequenzen, die im Appendix angegeben sind, wobei das Segment mindestens ein CpG- oder ein TpG-Dinukleotid enthält. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist das Cytosin des CpG-Dinukleotids, oder im Fall von TpG das Thiamin, das 5. bis 9. Nukleotid vom 5'-Ende des 10-mers. Ein Oligonukleotid existiert für jedes CpG- oder TpG-Dinukleotid.

Die nicht hybridisierten Amplifikate werden dann entfernt. Im letzten Schritt des Verfahrens werden die hybridisierten Amplifikate nachgewiesen. In diesem Kontext ist es bevorzugt, daß an die Amplifikate angebrachte Marker an jeder Position der festen Phase identifizierbar sind, an der eine Oligonukleotidsequenz lokalisiert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann der Methylierungsstatus der CpG-Positionen mittels Oligonukleotidsonden ermittelt werden, die an die behandelte DNA zusammen mit den PCR-Amplifikationsprimern hybridisiert werden (wobei die Primer entweder Methylierungs-spezifisch oder Standard sein können).

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Verwendung von Fluoreszenz-basierter Echtzeit-Quantitativer-PCR (Heid et al., Genome Res. 6: 986–994, 1996), die eine dual-markierte fluoreszente Oligonukleotidsonde verwendet (TagMan^TMPCR, unter der Verwendung eines ABI Prism 7700 Sequenznachweissystems, Perkin Elmer Applied Biosy stems, Foster City, Kalifornien. Die TagMan^TMPCR-Reaktion nutzt die Verwendung eines nicht-verlängerbaren Untersuchungs-Oligonukleotids, das TagMan^TM-Sonde genannt wird und das so aufgebaut ist, um an eine CpG-reiche Sequenz zu hybridisieren, die zwischen den Vorwärts- und Rückwärts-Amplifikationsprimern lokalisiert ist. Die TagMan^TM-Probe umfaßt weiterhin eine fluoreszente „Reportergruppe" und eine „Quenchergruppe", die kovalent an Linkergruppen gebunden sind (z. B. Phosphoramidite), die an die Nukleotide des TagMan^TM-Oligonukleotids angebracht sind. Zur Analyse von Methylierung innerhalb von Nukleinsäuren im Anschluß an die Bisulfitbehandlung ist es erforderlich, daß die Sonde Methylierungsspezifisch ist, wie in U.S. 6,331,393 beschrieben, was auch als „MethylLight-Test" bekannt ist. Variationen der TagMan^TM-Nachweismethodologie, die ebenfalls zur Verwendung mit der beschriebenen Erfindung brauchbar sind, schließen die Verwendung von dualer Sondentechnologie (Lightcycler^TM) oder fluoreszenten Amplifikationsprimern (Sunrise^TM-Technologie) ein. Diese beiden Techniken können auf eine geeignete Weise zur Verwendung mit Bisulfit behandelter DNA angepaßt werden, und darüber hinaus zur Methylierungsanalyse innerhalb von CpG-Dinukleotiden.

Ein weiter geeignetes Verfahren zur Verwendung von Sonden-Oligonukleotiden zur Bestimmung von Methylierung durch Analyse von Bisulfit behandelten Nukleinsäuren ist die Verwendung von blockierenden Oligonukleotiden. Die Verwendung von solchen Oligonukleotiden wurde in BioTechniques 23(4), 1997, 714–720 D. Yu, M. Mukai, Q. Liu, C. Steinman beschrieben. Blockierende Oligonukleotidsonden werden an die Bisulfit behandelte Nukleinsäure gemeinsam mit den PCR-Primern hybridisiert. Die PCR-Amplifikation der Nukleinsäure bricht an der 5'-Positiσn der blockierenden Sonden ab, wodurch die Amplifikation einer Nukleinsäure unterdrückt wird, wenn die komplementäre Sequenz zu der blockierenden Sonde vorhanden ist. Die Sonden können so aufgebaut sein, um an die Bisulfit behandelte Sonde auf einen Methylierungsstatus-spezifische Weise zu hybridisieren. Zum Beispiel würde für den Nachweis von methylierten Nukleinsäuren innerhalb einer Population von nicht methylierten Nukleinsäuren eine Unterdrückung der Amplifikation von Nukleinsäuren, die an der fraglichen Position nicht methyliert sind, durch die Verwendung von blockierenden Sonden bewirkt werden, die ein „CG" an der fraglichen Position umfassen, im Gegensatz zu einem „CA".

Für PCR Verfahren unter der Verwendung von Blocker-Oligonukleotiden, erfordert die effiziente Unterbrechung der Polymerase-vermittelten Amplifikation, daß das Blocker-Oligonukleotide nicht durch die Polymerase verlängert wird. Bevorzugt wird dies durch die Verwendung von Blockern erreicht, die 3'-Desoxyoligonukleotide oder Oligonukleotide sind, die an der 3' Position mit einer anderen als einer "freien" Hydroxylgruppe derivatisiert sind. Zum Beispiel sind 3'-O-Acetyloligonukleotide für eine bevorzugte Klasse von Blockermolekülen repräsentativ.

Zusätzlich, sollte der Polymerase-vermittelte Abbau der Blocker-Oligonukleotide ausgeschlossen werden. Bevorzugt, umfaßt solcher Ausschluß entweder die Verwendung einer Polymerase, der die 5'-3' Exonuklease-Aktivität fehlt, oder die Verwendung von modifizierten Blocker-Oligonukleotiden die, zum Beispiel, Thioatbrücken an den 5'-Termini davon aufweisen, die das Blockermolekül Nuklease-resistent machen. Besondere Applikationen können solche 5' Modifikationen der Blocker nicht erforderlich machen. Zum Beispiel, falls die Blocker- und Primer-Bindungsstellen überlappen, wodurch eine Bindung des Primers verhindert wird (z.B. durch Überschuß an Blocker), wird der Abbau der Blocker-Oligonukleotide wesentlich verhindert werden. Dies liegt daran, daß die Polymerase den Primer in Richtung und durch (in die 5'-3' Richtung) den Blocker hindurch nicht verlängern wird – ein Prozeß, der normalerweise zum Abbau des hybridisierten Blocker Oligonukleotids führt.

A besonders bevorzugte Blocker/PCR Ausführung, for purposes of the present invention and as implemented herein, umfaßt die Verwendung von Peptid Nukleinsäure (PNA) Oligomeren als Blocker-Oligonukleotide. Solche PNA Blocker-Oligonmere sind ideal geeignet, weil sie durch die Polymerase weder abgebaut noch verlängert werden.

Bevorzugt, erfordert es daher die Basensequenz des blockierenden Oligonukleotids, daß sie eine Sequenz umfaßt, die eine Länge von mindesten 9 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte Nukleinsäuresequenz gemäß einer der SEQ ID NOs: 6 bis 26 und Sequenzen komplementär dazu hybridisiert, wobei die Basensequenz des Oligonukleotids mindestens ein CpG, TpG oder CpA Dinukleotid umfaßt.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird der Nachweis des Methylierungsstatus der CpG-Positionen durch die Verwendung von Templat-gesteuerter Oligonu kleotidverlängerung durchgeführt, wie zum Beispiel MS-SNuPE, wie durch Gonzalgo und Jones (Nucleic Acids Res. 25: 2529–2531) beschrieben.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird die Bestimmung des Methylierungsstatus der CpG-Positionen durch Sequenzierung und anschließende Sequenzanalyse des im zweiten Schritt des Verfahrens erzeugten Amplifikats ermöglicht (Sanger F., et al., 1977 PNAS USA 74: 5463–5467).

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann durch jede Kombination der oben genannten Mittel erreicht werden. In einem besonders bevorzugten Modus der Erfindung wird die Verwendung von Echtzeit-Nachweissonden gleichzeitig mit MSP und/oder Blocker Oligonukleotide kombiniert.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Analyse des Methylierungsstatus von genomischer DNA ohne den Bedarf für eine Vorbehandlung. In den ersten und zweiten Schritten des Verfahrens muß die genomische DNA-Probe erhalten und aus dem Gewebe oder zellulären Quellen isoliert werden. Solche Quellen können Zellinien, histologische Schnitte, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Brustgewebe, Blut, Plasma, lymphatische Flüssigkeit, lymphatisches Gewebe, Ductus Zellen, ductale Lavageflüssigkeit, Brsutwarzenaustrittsflüssigkeit und Kombinationen davon einschließen. Die Extraktion kann durch Mittel erfolgen, die Standard für den Fachmann sind, diese schließen die Verwendung von Detergenzlysaten, Beschallen und Vortexen mit Glasperlen ein. Sobald die Nukleinsäuren extrahiert sind, wird die genomische Doppelstrang-DNA in der Analyse verwendet.

In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der Behandlung gespalten werden, dies kann durch jedes Mittel erfolgen, das Standard im Stand der Technik ist, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen. In dem dritten Schritt wird die DNA dann mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen verdaut. Der Verdau wird so ausgeführt, daß die Hydrolyse der DNA an der Restriktionsstelle für den Methylierungszustand eines spezifischen CpG-Dinukleotids informativ ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Restriktionsfragmente amplifiziert. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird dies unter der Verwendung der Polymerasekettenreaktion durchgeführt.

Im letzten Schritt werden die Amplifikate nachgewiesen. Der Nachweis kann durch jedes Mittel, das Standard im Stand der Technik ist, erfolgen, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, Gelelektrophorese-Analyse, Hybridisierungsanalyse, Inkorporation von nachweisbaren Markern innerhalb des PCR-Produkts, DNA-Array-Analyse, MALDI- oder ESI-Analyse.

Das oben erwähnte Verfahren wird bevorzugterweise zur Ermittlung von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA angewendet.

Um dieses Verfahren weiter zu ermöglichen, stellt die Erfindung weiterhin die modifizierte DNA eines oder einer Kombination von Genen aus der Gruppe von ESRI, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A zur Verfügung, sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere zum Nachweis von Cytosin-Methylierungen innerhalb dieser Gene. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß genetische und epigenetische Parameter und insbesondere die Cytosin-Methylierungsmuster der genomischen DNAs insbesondere für die verbesserte Behandlung und die Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen geeignet sind.

Die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Analyse von genetischen und/oder epigenetischen Parametern von genomischer DNA verwendet werden.

In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Verwendung einer Nukleinsäure, die eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 18 Basen der vorbehandelten genomischen DNA gemäß einer der SEQ ID NO 6 bis 25 und dazu komplementärer Sequenzen enthält, gelöst.

Die modifizierten Nukleinsäuren konnten bis jetzt nicht mit der Ermittlung von Erkrankungsrelevanten genetischen und epigenetischen Parametern in Zusammenhang gebracht werden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch ein Oligonukleotid oder ein Oligomer zur Analyse von vorbehandelter DNA zum Nachweis des genomischen Cytosin-Methylierungszustands gelöst, wobei das Oligonukleotid mindestens eine Basensequenz enthält, die eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die an eine vorbehandelte genomische DNA gemäß SEQ ID NO 6 bis 26 hybridisiert. Die Oligomersonden gemäß der vorliegenden Erfindung stellen wichtige und effektive Werkzeuge dar, die es zum ersten Mal ermöglichen, spezifische genetische und epigenetische Parameter während der Analyse von biologischen Proben auf Merkmale, die mit der Response eines Patienten auf endokrine Behandlung zusammenhängen. Die Oligonukleotide ermöglichen die verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. Die Basensequenz der Oligomere enthält bevorzugterweise mindestens ein CpG- oder TpG-Dinukleotid. Die Sonden können auch in Form einer PNA (Peptid-Nukleinsäure) existieren, die besonders bevorzugte Paarungseigenschaften aufweist. Insbesondere bevorzugt sind Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung, in denen das Cytosin des CpG-Dinukleotids innerhalb des mittleren Drittels des Oligonukleotids liegt, z. B. das 5.–9. Nukleotid vom 5'-Ende eines 13-mer-Oligonukleotids; oder im Fall eines PNA-Oligomers ist es bevorzugt, daß das Cytosin des CpG-Dinukleotids das 4.–6. Nukleotid vom 5'-Ende des 9-mers ist.

Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in so genannten „Sets" verwendet, die mindestens ein Oligomer für jedes der CpG-Dinukleotide innerhalb von SEQ ID NOs 6 bis 26 enthalten.

Im Fall der Sets der Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist. Es ist weiter bevorzugt, daß alle Oligonukleotide eines Sets an eine feste Phase gebunden sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Set von mindestens 2 n (Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren), die zum Nachweis des Cytosin-Methylierungszustand von genomischer DNA verwendet werden, durch Analyse der Sequenz oder behandelten Versionen der Sequenzen (der Gene ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A, wie im Sequenzprotokoll und in Tabelle 1 angegeben) und dazu komplementärer Sequenzen. Diese Sonden ermöglichen eine verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen.

Das Set von Oligomeren kann auch dazu verwendet werden, Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) durch die Analyse der Sequenz oder behandelten Versionen der Sequenz der Gene ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A nachzuweisen.

Es wird dem Fachmann leicht ersichtlich sein, daß das Verfahren gemäß der Erfindung durch die Aufnahme von Markern und klinischen Indikatoren, die im Stand der Technik bekannt sind und im Augenblick als diagnostische oder prognostische Marker verwendet werden, verbessert und ergänzt werden kann. Weiter bevorzugt schließen diese Marker den Knotenstatus, Alter, menopausalen Status, Grad, Estrogen- und Progesteronrezeptoren ein.

Die Gene, die die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, werden bevorzugterweise dazu verwendet, einen „Gen-Panel" zu bilden, d.h. eine Sammlung, die die genannten genetischen Sequenzen der Erfindung und/oder deren jeweilige informative Methylierungsstellen umfaßt. Die Bildung von solchen Gen-Panels erlaubt eine schnelle und spezifische Analyse von spezifischen Aspekten von Brustkrebs. Die wie in dieser Erfindung beschriebenen und verwendeten Gen-Panel können mit überraschend hoher Effizienz für die Behandlung von proliferativen Erkrankungen der Brustzellen verwendet werden, durch die Vorhersage des Ausgangs der Behandlung mit einer Therapie, die einen oder mehrere Wirkstoffe umfaßt, die auf den Estrogenrezeptor-Signalweg abzielen oder den Estrogen-Metabolismus, die Produktion, oder die Sekretion beeinflussen. Die Analyse jedes Gens des Panels trägt zu der Evaluierung der Patienten-Responsivität bei, so kann in einer weniger bevorzugten Ausführungsform die Patientenevaluierung durch die Analyse nur eines Gens erreicht werden. Die Analyse eines einzelnen Mitglieds des 'Genpanels' würde ein billiges, jedoch weniger genaues Mittel der Evaluierung der Patienten-Responsivität zur Verfügung stellen, die Analyse von vielen Mitgliedern des Panels würde ein wirklich teureres Mittel der Durchführung des Verfahrens zur Verfügung stellen, jedoch mit eine höheren Genauigkeit (die technisch bevorzugte Lösung).

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, daß eine Anordnung von verschiedenen Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren (ein sogenanntes „Array") durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, und auf eine solche Weise vorliegt, daß es ebenfalls eine feste Phase gebunden ist. Diese Anordnung von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomersequenzen kann dadurch gekennzeichnet sein, daß sie an der festen Phase in Form eines rechteckigen oder hexagonalen Gitters angeordnet ist. Die feste Phase-Oberfläche ist bevorzugterweise aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt. Jedoch können Nitrozellulose, sowie Plastikmaterialien, wie zum Beispiel Nylon, die in Form von Pellets oder auch als Harz-Matrices vorliegen können, geeignete Alternativen sein.

Daher ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines an einem Trägermaterial befestigten Arrays für die verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. In diesem Verfahren wird mindestens ein Oligomer gemäß der vorliegenden Erfindung an eine feste Phase gekoppelt. Verfahren zur Herstellung solcher Arrays sind bekannt, zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,744,305 mittels Festphasen-Chemie und photolabilen Schutzgruppen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft einen DNA-Chip für die verbesserte Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen. Der DNA-Chip enthält mindestens eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung. DNA-Chips sind zum Beispiel aus U.S.-Patent 5,837,832 bekannt.

Darüber hinaus ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Kit, das zum Beispiel aus einem Bisulfit-enthaltenden Reagenz, einem Set von Primeroligonukleotiden, das mindestens zwei Oligomere, deren Sequenzen in jedem Fall einem 18 Basen langen Segment der Basensequenzen, die SEQ ID NOs: 6 bis 26 entsprechen oder komplementär dazu sind, Oligonukleotiden und/oder PNA-Oligomeren sowie Anweisungen zur Durchführung und Evaluierung des beschriebenen Verfahrens zusammengesetzt ist.

In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann das Kit weiterhin Standardreagenzien zur Durchführung einer CpG-Positions-spezifischen Methylierungsanalyse umfassen, wobei die Analyse eine oder mehrere der vorliegenden Techniken umfaßt: MS-SNuPE, MSP, Methyl light, Heavy Methyl und Nukleinsäuresequenzierung. Jedoch kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung auch nur einen Teil der oben genannten Komponenten enthalten.

Typische Reagenzien (z.B. wie in einem typischen MethyLight^®-basierten Kit gefunden werden können) für die MethyLight^® Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf: PCR Primer für das spezifische Gen (oder Methylierungs-veränderte DNA Sequenz oder CpG Insel); TagMan^® Sonden; optimierte PCR Puffer und Desoxynukleotide und Taq Polymerase.

Typische Reagenzien (z.B. wie in einem typischen Ms-SNuPE-basierten Kit gefunden werden können) für die MS-SNuPE Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf: PCR Primer für das spezifische Gen (oder Methylierungs-veränderte DNA Sequenz oder CpG Insel); optimierte PCR Puffer und Desoxynukleotide; Gelextraktionskit; positive Kontrollprimer; MS-SNuPE Primer für das spezifische Gen; Reaktionspuffer (für die Ms-SNuPE Reaktion); und radioaktive Nukleotide. Zusätzlich können Bisulfit Konversionsreagenzien einschließen: DNA Denaturierungspuffer; Sulfonierungspuffer; DNA Rückerhaltsreagenzien oder Kit (z.B. Fällung, Ultrafiltration, Affinitätssäule); Desulfonierungspuffer und DNA Rückerhaltskomponenten.

Typische Reagenzien (z.B. wie in einem typischen MSP-basierten Kit gefunden werden können) für die MSP Analyse können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf: methylierte und unmethylierte PCR Primer für das spezifische Gen (oder Methylierungs-veränderte DNA Sequenz oder CpG Insel), optimierte PCR Puffer und Desoxynukleotide und spezifische Sonden.

Die Oligomere gemäß der vorliegenden Erfindung oder Arrays davon sowie ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung sind für die Anwendung bei der verbesserten Behandlung und Überwachung proliferativen Erkrankungen von Brustzellen gedacht. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Verfahren bevorzugterweise für die Analyse von wichtigen genetischen und/oder epigenetischen Parametern innerhalb genomischer DNA verwendet, insbesondere zur Anwendung bei der verbesserten Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen.

Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden für den verbesserten Nachweis, die Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die nachteilig oder relevant für die Patienten oder Individuen sind, in denen wichti ge genetische und/oder epigenetische Parameter innerhalb genomischer DNA, wobei diese Parameter mittels der vorliegenden Erfindung erhalten wurden, mit einem anderen Set von genetischen oder epigenetischen Parametern verglichen werden können, wobei die Unterschiede als eine Basis für die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen dienen, die für Patienten oder Individuen nachteilig oder relevant sind.

Unter dem Begriff "Hybridisierung" im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine Bindung eines Oligonukleotids unter Ausbildung einer Duplex-Struktur an eine vollständig komplementäre Sequenz im Sinne der Watson-Crick Basenpaarungen in der Proben-DNA verstanden werden.

"Genetische Parameter" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Mutationen und Polymorphismen von genomischer DNA und zu ihrer Regulation weiterhin erforderliche Sequenzen. Insbesondere werden als Mutationen Insertionen, Deletionen, Punktmutationen, Inversionen und Polymorphismen und besonders bevorzugt SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) bezeichnet.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck „Methylierungsstatus" als das Ausmaß von in einer Nukleinsäure von Interesse vorhandener Methylierung meinend betrachtet, wobei diese in absoluten oder relativen Ausdrücken ausgedrückt werden kann, d.h. als ein Prozentsatz oder anderen numerischen Wert oder durch Vergleich mit einem anderen Gewebe, das darin als hypermethyliert, hypomethyliert oder als einen signifikant ähnlichen oder identischen Methylierungsstatus aufweisend beschrieben ist.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck „regulatorische Region" eines Gens als die Nukleotidsequenz bedeutend verstanden, die die Expression eines Gens beeinflußt. Diese regulatorischen Regionen können innerhalb, proximal oder distal des Gens lokalisiert sein. Die regulatorischen Regionen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, konstitutive Promotoren, Gewebe-spezifische Promotoren, Entwicklungs-spezifische Promotoren, induzierbare Promotoren und ähnliches. Promotor regulatorische Elemente können auch bestimmte Enhancer Sequenzelemente einschließen, die die transkriptionale oder translationale Effizienz des Gens kontrollieren.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Chemotherapie" als die Verwendung von Wirkstoffen der chemischen Substanzen zur Behandlung von Krebs bedeutend verstanden. Diese Definition schließt die Bestrahlungsbehandlung (Behandlung mit Strahlung oder Partikeln hoher Energie), Hormontherapie (Behandlung mit Hormonen oder Hormon-Analoga (synthetische Substitute) und chirurgische Behandlung aus.

Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung sind "epigenetische Parameter" insbesondere Cytosin-Methylierungen und weitere Modifikationen von DNA Basen von genomischer DNA und für deren weitere Regulation erforderliche Sequenzen. Weitere epigenetische Parameter schließen beispielsweise die Acetylierung von Histonen ein, die jedoch mit dem beschriebenen Verfahren nicht direkt analysiert werden kann, sondern wiederum mit der DNA-Methylierung korreliert.

Im folgenden soll die Erfindung genauer auf der Basis der Sequenzen, Figuren und Beispiele beschrieben werden, ohne darauf begrenzt zu werden.

1 zeigt die Kaplan-Meier abgeschätzten Gesamt-Überlebenskurven für das Gen APC für ein Set von 86 Brustkrebspatientinnen. Die gepunktete Linie (obere Kurve) zeigt unmethylierte Proben, wohin gegen die durchgehende Linie (untere Kurve) methylierte Proben zeigt. Die x-Achse zeigt die Zahl von Jahren und die Y-Achse zeigt den Anteil der Gruppe.

2 zeigt die Kaplan-Meier abgeschätzten Gesamt-Überlebenskurven für das Gen RASSF1A für ein Set von 86 Brustkrebspatientinnen. Die gepunktete Linie (obere Kurve) zeigt unmethylierte Proben, wohin gegen die durchgehende Linie (untere Kurve) methylierte Proben zeigt. Die x-Achse zeigt die Zahl von Jahren und die Y-Achse zeigt den Anteil der Gruppe.

3 zeigt die kombinierten Kaplan-Meier abgeschätzten Gesamt-Überlebenskurven für die Gene APC und/oder RASSF1A, für ein Set von 86 Brustkrebspatientinnen. Die gepunktete Linie (obere Kurve) zeigt unmethylierte Proben, wohin gegen die durchgehende Linie (untere Kurve) methylierte Proben zeigt. Die x-Achse zeigt die Zahl von Jahren und die Y-Achse zeigt den Anteil der Gruppe.

SEQ ID Nos: 1 bis 5 stellen 5'- und/oder regulatorische Regionen und/oder CpG-reiche Regionen der Gene gemäß Tabelle 1 dar. Diese Sequenzen sind aus der Genbank abgeleitet und werden als alle kleineren Variationen des Sequenzmaterials einschließend angesehen, die im Augenblick noch nicht vorhersehbar sind, beispielsweise, jedoch nicht begrenzt auf, kleinere Deletionen und SNPs.

SEQ ID Nos: 6 bis 26 zeigen die vorbehandelte Sequenz von DNA, die von den Genen gemäß Tabelle 1 abgeleitet wurde. Diese Sequenzen werden als alle kleineren Variationen des Sequenzmaterials einschließend angesehen, die im Augenblick nicht vorhersehbar sind, zum Beispiel, jedoch nicht begrenzt auf, kleinere Deletionen und SNPs.

Unter der Verwendung von MethyLight, einem Hochdurchsatz DNA Methylierungstest, analysierten die Erfinder 39 Gene in einem Genevaluierungsset, das aus zehn Seren von metastasierenden Patienten, 26 Patienten mit primärem Brustkrebs und zehn Kontrollpatienten bestand. Um den prognostischen Wert von Genen zu bestimmen, die innerhalb des Genevalierungsset identifiziert wurden, analysierten die Erfinder zuletzt Vorbehandlungsseren von 24 Patienten, die keine Anschlußbehandlung hatten (Trainingsset), um deren prognostischen Wert zu bestimmen. Ein unabhängiges Testset, das aus 62 Patienten bestand, wurde dann verwendet, um die Validität von Genen und Kombinationen von Genen zu testen, von denen in dem Trainingsset gefunden wurde, daß sie gute prognostische Marker sind.
In dem Gen-Evaluierungsset identifizierten die Erfinder fünf Gene (ESR1, APC, HSD17B4, HIC1 und RASSF1A). In dem Trainingsset wiesen Patienten mit methylierter Serum DNA von RASSF1A und/oder APC die schlechteste Prognose auf (p < 0,001). Dieses Ergebnis wurde durch die Analyse von Serumproben aus dem unabhängigen Testset (p = 0,007) bestätigt. Wenn alle 86 untersuchten Patienten analysiert wurden, zeigte die multivariante Analyse von methylierter RASSF1A und/oder APC Serum DNA, daß diese unabhängig mit schlechtem Ausgang assoziiert waren, mit einem relativen Todesrisiko von 5,7. Die DNA Methylierung von bestimmten Genen in prätherapeutischen Seren von Brustkrebs Patienten, insbesondere von RASSF1A/APC, ist wirksamer, als Standard-prognostische Parameter.
Das Gen-Evaluierungsset bestand aus Patienten mit wieder auftretender Erkrankung (n = 10; Seren erhalten bei der Diagnose von Metastasen im Knochen, der Lunge, Hirn oder Leber) und prätherapeutischen Seren von kürzlich diagnostizierten primären Brustkrebs-Patienten (n = 26; Altersbereich: 36,1 Jahre bis 83,9 Jahre. (Mittel: 59,3 Jahre); zwei, 18 und sechs Patienten wiesen jeweils pT1, pT2 und pT3 Krebsarten; 15, zehn und ein Patient wies Lymphknoten-negative, jeweils positive und unbekannte Erkrankung auf) und normale Kontrolle (n = 10; Altersbereich: 20,5 bis 71,5 Jahre (Mittel: 44,6 Jahre); alle wurden einer Kernbiopsie unterzogen und wurden als eine benigne Erkrankung der Brust aufweisend bestätigt).
Um die prognostische Signifikanz zu ermitteln, verwendeten die Erfinder prätherapeutische Seren in unabhängigen Trainings- (n = 24) und Testsets (n = 62), die aus Patienten bestanden, die keine Anschlußtherapie nach Chirurgie erhielten.
Eine systemische Anschlußtherapie war entweder nicht erforderlich oder die Patienten waren nicht geeignet oder verweigerten jede weitere Behandlung. Das primäre chirurgische Verfahren schloß eine Brust-konservierende Lappen-Ektomie oder modifizierte Radikal-Mastektomie und axilläre Lymphknoten-Dissektion ein. Das mittlere Alter der Studienpopulation war 60 Jahre (Bereich, 28 bis 86 Jahre). Nach einer mittleren Nachfolge von 3,7 Jahren (Bereich: ein Monat bis 12,2 Jahre) waren 17 der 86 Patienten (20%) gestorben. Die Verteilung von aberranter Serum DNA Methylierung der 86 Patienten und der Assoziierung mit klinischen und histopathologischen Charakteristika ist in Tabelle 2 gezeigt.
Die Blutproben der Patienten wurden vor der therapeutischen Intervention abgenommen. Das Blut wurde bei 2000 g für 10 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und 1 ml Aliquots von Serumproben bei –30°C gelagert. Die genomische DNA von Serumproben wurde unter der Verwendung des High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) nach dem Protokoll des Herstellers mit einigen Modifikationen für die multiple Beladung der DNA Extraktionssäulen, um so eine ausreichende Menge an DNA zu erhalten, isoliert. Daher wurden 4 × 200 μl einer Serumprobe jeweils mit 200 μl Arbeitslösung (Bindepuffer, ergänzt mit polyA Träger-RNA) und 50 μl Proteinase K [18 mg/ml], gemischt und inkubiert für 10 Minuten bei 72°C gemischt. Nach Zugabe von 100 μl Isopropanol wurde die Lösung gemischt, auf die Extraktionssäule geladen und für 1 Minute bei 8000 g zentrifugiert.
Der Durchfluß wurde in dasselbe Säulenreservoir pipettiert und ein zweites Mal zentrifugiert. Dieses Verfahren wurde vier mal für jede Serumprobe wiederholt. Nachdem diese "Pooling Schritte" durchgeführt wurden, wurde die DNA Isolierung wie in dem Protokoll des Herstellers beschrieben fortgeführt. Für die DNA-Elution wurden 55 μl des AE-Puffers (Quiagen, CA, USA) hinzugefügt, inkubiert für 20 min bei 45°C und für drei Minuten bei 12.000 g zentrifugiert. Für beide, die normale Seren- und Krebsseren-Analyse wurde eine Analyse derselben Menge von Serum für die DNA Extraktion verwendet.
Die Natriumbisulfit Konversion von genomischer DNA wurde wie früher beschrieben durchgeführt (Eads et al.: MethyLight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res., 28: E32, 2000).
Die Natriumbisulfit-behandelte genomische DNA wurde mittels MethyLight analysiert, einem Fluoreszenz-basierten, Echtzeit PCR Test, wie früher beschrieben (Eads et al 2000, siehe oben, Eads et al.: Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma. Cancer Res., 61: 3410–3418, 2001). Kurz gesagt wurden zwei Sets von Primern und Sonden verwendet, die spezifisch für die Bisulfit-konvertierte DNA aufgebaut wurden: ein methyliertes Set für das Gen von Interesse und ein Referenzset, β-Aktin (ACTB), um auf Input DNA zu normalisieren. Serumproben von Patienten mit wieder auftretender Erkrankung ergaben die höchsten Mengen von β-Aktin, wohingegen kein Unterschied zwischen β-Aktin Werten aus Serumproben von Patienten mit primärem Brustkrebs und Seren von normaler Kontrolle beobachtet wurde. Die Spezifität der Reaktionen für methylierte DNA wurde getrennt unter der Verwendung von SssI (New England Biolabs)-behandelter humanen weiße Blutzellen DNA (stark methyliert) bestimmt. Der Prozentsatz von voll methylierten Molekülen an einem spezifischen Lokus wurde durch Dividieren des GENE:ACTB Verhältnisses einer Probe durch das GENE:ACTB Verhältnis von SssI-behandelter weiße Blutzell-DNA und Multiplizieren mit 100 berechnet. Die Abkürzung PMR (Prozentsatz von voll methylierter Referenz) zeigt diese Messung an. Für jede MethyLight Reaktion wurde 10 μl von Bisulfit-behandelter genomischer DNA verwendet.
Ein Gen wurde als methyliert betrachtet, falls der PMR Wert > 0 war. Die Primer und Sonden, die für methylierte DNA spezifisch waren und für die MethyLight Reaktionen verwendet wurden, sind in den ergänzenden Daten aufgelistet.
Die Erfinder verwendeten Pearsons' Chi² oder – im Fall von niedrigen Frequenzen pro Zelle Fisher's exaktes Verfahren, um auf Zusammenhänge zwischen kategorischen klinikopathologischen Merkmalen zu testen. Der Mann-Whitney-U-Test wurde verwendet, um Unterschiede zwischen nicht-parametrisch verteilten Variablen zu ermitteln. Gesamt-Überleben wurde von dem Datum der Diagnose des primären Tumor bis zum Datum des Todes oder der letzten Nachfolge berechnet. Gesamt-Überlebenskurven wurden mit den Kaplan-Meier Verfahren berechnet. Die univariante Analyse des Gesamt-Überlebens gemäß klinikopathologischer Faktoren (histologischer Typ, Tumorphase, Knotenstatus, Grad, menopausaler Status, Hormonrezeptorstatus (Estrogen- und/oder Progesteronrezeptor Positivität), Estrogen- und Progesteronrezeptor-Status) und Gen-Methylierung wurde unter der Verwendung eines zweiseitigen log-Ranktests durchgeführt.
Eine multivariante Cox proportionale Gefahrenanalyse wurde verwendet, um den prognostischen Effekt von methylierten Genen abzuschätzen.
Ein p Wert von < 0,05 wurde als ein statistisch signifikanter Unterschied angesehen. Alle statistischen Analysen wurden unter der Verwendung von SPSS Software 10.0 durchgeführt.
Die Erfinder untersuchten anfänglich 39 Gene in den Seren von zehn Patienten mit metastasierendem Brustkrebs auf die Anwesenheit von aberranter Methylierung. Die in den Seren positiven 33 Gene der metastasierenden Patienten wurden weiter in einem unabhängigen Probenset von prätherapeutischen Seren von 26 Patienten mit primärem Brustkrebs und zehn gesunden Kontrollen evaluiert. Ein Überblick der Frequenz von Methylierung in den untersuchten Serumproben ist in Tabelle 3 angegeben. Die am meisten für unsere weiteren Analysen geeigneten Gene wurden als diejenigen bestimmt, die eines der folgenden Kriterien erfüllten: (i) unmethyliert in Serumproben von gesunden Kontrollen und > 10% methyliert in Serumproben von primären Brustkrebspatienten, oder (ii) ≤ 10% methyliert in Serumproben von gesunden Kontrollen und > 20% methyliert in Serumproben von primären Brustkrebspatienten. Eine Gesamtzahl von fünf Genen, nämlich ESR1, APC, HSD17B4, HIC1 und RASSF1A erfüllte mindestens eines dieser Kriterien (Tabelle 3).
Die Vorbehandlungs-Seren von Patienten, die in das Trainingsset aufgenommen wurden, wurde dazu verwendet, um den prognostischen Wert des Methylierungsstatus dieser fünf Gene zu evaluieren. In diesem Trainingsset identifizierten die Erfinder ESR1, APC oder RASSF1A Methylierung in primären Brustkrebs-Patientenseren als Marker schlechter Prognose, wo hingegen HSD17B4 nur eine grenzwertige Signifikanz erreichte und die aberrante Methylierung von HIC1 keine signifikanten Ergebnisse zeigte (Tabelle 4). Weiterhin wurden verschiedene Kombinationen der untersuchten Gene analysiert. Patienten wurden als Methylierungs-positiv eingestuft, falls mindestens eines der in der Kombination enthaltenen Gene eine aberrante Methylierung zeigte. Patienten mit methylierter Serum DNA für RASSF1A und/oder APC wiesen die schlechteste Prognose auf (P < 0,001), sogar noch schlechter, als wenn jedes Gen einzeln analysiert wurde (Tabelle 4).
Der hoch signifikante prognostische Wert für APC und/oder RASSF1A Methylierung in Serumproben von Brustkrebspatienten wurde durch Analysieren des Testsets bestätigt (P = 0,007, log Ranktest). Die ESR1- und APC-Methylierung als einzelne Gene oder die Kombinationen ESR1/RASSF1A und ESR1/APC wiesen nicht länger prognostische Signifikanz auf (Tabelle 4).
Die kombinierte Analyse der Trainings- und Testsets (n = 86) zeigte eine Korrelation zwischen ESRI und RASSF1A (P = 0,005) und zwischen ESR1 und APC (P = 0,031), wo hingegen keine Korrelation zwischen RASSF1A und APC beobachtet wurde. In Patienten mit fortgeschrittener Tumor-RASSF1A und ESRI Methylierung und in Patienten mit Progesteronrezeptor-negativer Tumor-APC war die Methylierung in prätherapeutischen Seren häufiger, während keine weiteren Zusammenhänge zwischen klinikopathologischen Merkmalen und der DNA Methylierung von APC, ESRI oder RASSF1A gesehen wurden (Tabelle 5). Die RASSF1A Methylierung in prätherapeutischen Seren war häufiger in älteren als in jüngeren Patienten, wo hingegen das Alter keinen Effekt auf die DNA Methylierung von ESR1 oder APC hatte.
Die univariante Analyse von allen 86 untersuchten Patienten (Trainingsset plus Testset) ergab eine prognostische Signifikanz für die Tumorgröße, Lymphknoten-Metastasen und dem Methylierungsstatus von APC, RASSF1A und der Kombination von RASSF1A/APC (Tabelle 6; 1). Aufgrund der Tatsache, daß die ESR1 Methylierung mit APC sowie mit RASSF1A Methylierung korreliert, testeten die Erfinder die dreifache Kombination in den univarianten oder den multivarianten Analysen von allen 86 Patienten nicht.
Die Cox-multiple Regressionsanalyse schloß die Tumorgröße, Lymphknoten-Metastasen, Alter und Methylierungsstatus der untersuchten Gene ein. Neben dem Lymphknotenstatus, war methylierte RASSF1A und/oder APC Serum-DNA stark mit schlechtem Ausgang mit einem relativen Todesrisiko von 5,7 (Tabelle 7) assoziiert.
Die Prognose in Patienten mit neu diagnostiziertem Brustkrebs wird primär durch die Anwesenheit oder das Fehlen von Metastasen in drainierenden axillären Lymphknoten bestimmt. Nichts desto trotz ist das lebensbedrohende Ereignis bei Brustkrebs nicht Lymphknoten-Metastasen per se, sondern hämatogene Metastasen, die hauptsächlich Knochen, Leber, Lunge und Hirn beeinträchtigen. Die Erfinder zielten daher darauf ab, einen prognostischen Test zu entwickeln, der auf hämatogene Metastasen sensitiv ist und in Patienten-prätherapeutischem Serum durchgeführt werden kann.
In den letzten Jahren haben mehrere Studien über zellfreie Tumor-spezifische DNA in Serum/Plasma von Brustkrebspatienten unter Diagnose berichtet. Die aberrante Methylierung von Serum/Plasma-DNA von Patienten mit verschiedenen Typen von Malignitäten, einschließlich Brustkrebs, wurde beschrieben (siehe oben).
Im Hinblick auf diese Beobachtungen untersuchten die Erfinder den Methylierungsstatus von 39 Genen, die auf der einen Seite, als regelmäßig in Brustkrebs und anderen Malignitäten methyliert bekannt sind (Jones and Baylin: The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat. Rev. Genet., 3: 415–428, 2002; Widschwendter and Jones: DNA methylation and breast carcinogenesis. Oncogene, 21: 5462–5482, 2002) und auf der anderen Seite, als abnormal reguliert in Tumoren von Patienten mit schlechtem prognostischem Brustkrebs berichtet wurden (van't Veer et al.: Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415: 530–536, 2002; van de Vijver et al.: A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N. Engl. J. Med., 347: 1999–2009, 2002) Weil Spiegel von zirkulierender DNA in metastasierenden Patienten als höher liegend bekannt sind (Leon et al.: Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy Cancer Res., 37: 646–650, 1977) und weil der Verlust von genetischer Heterogenizität von disseminierten Tumorzellen mit dem Auftreten von klinisch evidenter Metastase kürzlich berichtet wurde (Klein et al.: Genetic heterogeneity of single disseminated tumour cells in minimal residual cancer. Lancet, 360: 683–689, 2002), untersuchten die Erfinder zuerst diese 39 Gene in zehn Seren von metastasierenden Patienten, um das Gesamt-Vorkommen von Methylierungsveränderungen in Brustkrebs zu bestimmen. Als ein nächster Schritt analysierten die Erfinder die 33 Gene, die in den metastasierenden Patienten positiv waren, in den prä-Behandlungsseren von 26 Patienten mit primärem Brustkrebs und in zehn benignen Kontrollen, um die wichtigsten Gene für die weitere Analyse zu identifizieren. So ermittelten die Erfinder fünf Gene (ESR1, APC, HSD17B4, HIC1 und RASSF1A), die in einer Gruppe von 24 Patienten zuerst analysiert wurden (Trainingsset). Um die Signifikanz dieses Ergebnisses zu bestätigen, testeten die Erfinder diese Gene in einem unabhängigen Set von 62 Patienten (Testset). Um die striktesten Kriterien zum Test des Potentials eines prognostischen Faktors anzuwenden, untersuchten die Erfinder diese Marker in Frauen, die keiner Anschlußsystemischer Behandlung unterzogen wurden. Es zeigte sich, daß die DNA Methylierung in prätherapeutischen Seren von APC und RASSF1A, die beide in menschlichen primären Brustkrebserkrankungen häufig methyliert und abnormal reguliert waren (Dammann et al.: Hypermethylation of the CpG island of Ras association domain family 1A (RASSF1A), a putative tumor suppressor gene from the 3p21.3 locus, occurs in a large percentage of human breast cancers. Cancer Res., 61: 3105–3109, 2001; Virmani et al.: Aberrant methylation of the adenomatous polyposis coli (APC) gene promoter 1A in breast and lung carcinomas. Clin. Cancer Res., 7: 1998–2004, 2001), ein starker unabhängiger prognostischer Parameter war. Diese Gene sind an Signalwegen beteiligt, die einer Metastasierung entgegenwirken: Vermittlung interzellulärer Adhäsion, Stabilisierung des Cytoskeletts, die Regulierung des Zellzyklus und Apoptose (Fearnhead et al.: The ABC of APC. Hum. Mol. Genet., 10: 721–733, 2001; Dammann et al.: Epigenetic inactivation of the Ras-association domain family 1 (RASSF1A) gene and its function in human carcinogenesis. Histol. Histopathol., 18: 665–677, 2003). Methylierte DNA in Patienten prätherapeutischem Serum, die diese zwei Gene kodiert, spiegelt eine schlechte Prognose wider. Die Quelle der Tumor-spezifischen DNA und seine definitive Rolle bei Metastasen verbleibt aufzuklären. Zirkulierende Tumor-spezifisch veränderte genetische Information kann als ein Ersatzmarker für zirkulierende Tumorzellen diesen, die letztendlich entfernte Metastasen verursachen. Eine alternative, jedoch gleichfalls attraktive Hypothese ist, daß zirkulierende veränderte DNA per se eine de novo Entwicklung von Tumorzellen in Organen entwickeln kann, die dafür bekannt sind, daß sie Brustkrebs- Metastasen beherbergen. Diese sogenannte "Hypothese der Genometastasis" schlägt vor, daß sich die maligne Transformation möglicherweise als ein Ergebnis der Transfektion von empfindlichen Zellen in entfernten Zielorgane mit dominante Onkogenen entwickelt, die in dem Plasma zirkulieren und von dem primärem Tumor abgeleitet sind. Interessanter weise ist es, irrespektiv von der Quelle von DNA in dem Serum, bemerkenswert, daß einige Gene eine prognostische Information zur Verfügung stellen, wenn in Patientenseren methyliert, wohingegen Gene, wie zum Beispiel HIC1, das jeweils in ungefähr 40% und 90% der primären und metastasierenden Brustkrebspatienten methyliert ist, jedoch in nur 10% von gesunden Individuen, in keinster Weise ein prognostischer Parameter sind.
Irrespektiv der mechanistischen Rolle von methylierter DNA im Hinblick auf Metastasen in Brustkrebs-Patienten weisen diese epigenetischen Veränderungen des Serum verschiedene Vorteile als Indikatoren schlechter Prognose auf, verglichen mit augenblicklich verwendeten oder untersuchten prognostischen Parametern: DNA in Serum ist stabil und kann durch ein high-throughput-Verfahren, wie etwa MethyLight, analysiert werden. Verglichen mit Knochenmarks-Aspiration, ist eine einfache Blutabnahme (die jederzeit während der Nachfolgeperiode Wiederholt werden kann) ausreichend. Je mehr Screening-Mammographien durchgeführt werden, desto mehr werden kleine Krebserkrankungen behandelt, und wird nach histopathologischer Untersuchung kein Tumormaterial zurückbleiben, um RNA- und/oder Proteinbasierte Tests für die Risikoevaluierung durchzuführen. Diese Anmeldung zeigt daher einen brauchbaren und einfachen Ansatz für die Risikoabschätzung von Brustkrebspatienten.
Tabelle 1
Tabelle 2. Charakteristika von Trainings- und Testsets.
Tabelle 3. Frequenz von methylierter Serum DNA in dem Gen Evaluierungsset.
Tabelle 4. Univariante Analyse des Methylierungsstatus in Trainings- und Testsets.
Tabelle 5. Frequenz von methylierten Genen gemäß klinisch pathologischen Merkmalen.
Der Tumorgrad war in sechs Fällen unbekannt. Der Hormon-Rezeptorstatus war in zehn Fällen unbekannt. Die Tumorgröße war in einem Fall unbekannt. Die DNA Methylierung von RASSF1A für einen Fall fehlte. Chi² Pearson: Tumorgröße – ESR1 (P = 0,005); Tumorgröße – RASSF1A (P = 0,049); Progesteronrezeptor – APC (P = 0,036); Mittleres Alter – RASSF1A methyliert (79,0 Jahre; 49,6 bis 86,2), RASSF1A nicht-methyliert (59,4 Jahre; 28,2 bis 82,3.) P = 0,009
Tabelle 6. Ergebnisse der univarianten Analyse.
Tabelle 7. Multivariante Analyse.
Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Prognose eines Subjekts mit einer Zellteilungsstörung der Brustgewebe, wobei das Verfahren umfaßt, ein Analysieren des Methylierungsmusters einer Zielnukleinsäure, die ein oder eine Kombination der Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A und/oder deren regulatorischer Regionen durch in Kontakt bringen von mindestens einer der Zielnukleinsäuren in einer biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde mit mindestens einem Reagenz oder Reihe von Reagenzien die zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG Dinukleotiden unterscheiden.
Verfahren zur Auswahl einer Behandlung einer Zellteilungsstörung der Brustgewebe, wobei das Verfahren umfaßt: a) Bestimmen der Prognose eines Subjekts nach Anspruch 1, und b) Auswählen einer geeigneten Behandlung gemäß der Prognose.
Verfahren zur Bestimmung des Phänotyps eines Subjekts mit einer Zellteilungsstörung der Brustgewebe, umfassend a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, von dem Subjekt, b) Analysieren der Methylierungsmuster einer oder mehrerer Zielnukleinsäuren, umfassend ein oder eine Kombination der Gene ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ESR1, APC, HSD174B4, HIC1 und RASSF1A und/oder deren regulatorische Regionen durch in Kontakt bringen von mindestens einer der Zielnukleinsäuren in der biologischen Probe, die von dem Subjekt erhalten wurde mit mindestens einem Reagenz oder einer Reihe von Reagenzien, die zwischen methylierten und nicht-methylierten CpG Dinukleotiden unterscheiden, und c) Bestimmen des Phänotyps des Individuums durch Vergleichen der zwei bekannten Phänotypen, einem erstem Phänotyp, gekennzeichnet durch Hypermethylierung der Zielnukleinsäure und schlechter Prognose, relativ zu einem zweiten Phänotyp, gekennzeichnet durch Hypomethylierung der analysierten Zielnukleinsäure und positiver Prognose.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei die Prognose die Lebenserwartung des Subjekts ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zielnukleinsäure das Gen APC und/oder seine regulatorischen Regionen umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zielnukleinsäure das Gen RASSF1A und/oder seine regulatorischen Regionen umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zielnukleinsäure die Gene APC und RASSF1A und/oder deren regulatorische Regionen umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zielnukleinsäure oder -säuren im wesentlichen eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 1 bis 5 und dazu komplementäre Sequenzen umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Sequenz der Zielnukleinsäure im wesentlichen SEQ ID NO: 3 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Sequenz der Zielnukleinsäure im wesentlichen SEQ ID NO: 5 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Zielnukleinsäure oder -säuren im wesentlichen SEQ ID NO: 3 und 5 umfassen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei die Zell-proliferative Erkrankung der Brustgewebe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus duktalem Karzinom in situ, lobulärem Karzinom, kolloidalem Karzinom, tubulärem Karzinom, medullärem Karzinom, metaplastischem Karzinom, intraduktalem Karzinom in situ, lobulärem Karzinom in situ und papillärem Karzinom in situ.
Nukleinsäuremolekül, das im wesentlichen aus einer Sequenz mit einer Länge von mindestens 18 Basen gemäß einer der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs 6 bis 25 und dazu komplementärer Sequenzen besteht.
Oligomer, insbesondere Oligonukleotid oder Peptid Nukleinsäure (PNA)-Oligomer, wobei das Oligomer im wesentlichen aus mindestens einer Basensequenz besteht, die eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden aufweist, die hybridisiert an oder identisch ist zu einer der Nukleinsäuresequenzen gemäß SEQ ID NOs: 6 bis 25.
Oligomer nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei die Basensequenz mindestens ein CpG-Dinukleotid enthält.
Set von Oligomeren, umfassend mindestens zwei Oligomere nach einem der Ansprüche 13 oder 14.
Set von Oligonukleotiden nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Oligonukleotid an eine feste Phase gebunden ist.
Set von mindestens zwei Oligonukleotiden nach einem der Ansprüche 14 oder 15, das als Primer-Oligonukleotide für die Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen, umfassend eine von SEQ ID NOs: 6 bis 25 und dazu komplementären Sequenzen verwendet wird.
Verwendung eines Sets von Oligonukleotiden, umfassend mindestens zwei der Oligomere nach einem der Ansprüche 16 bis 18 zum Nachweis des Methylierungszustands und/oder Einzel-Nukleotidpolymorphismen (SNPs) innerhalb der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NOs: 1 bis 5 und dazu komplementärer Sequenzen.
Verfahren zur Herstellung einer Anordnung von verschiedenen auf ein Trägermaterial fixierten Oligomeren (Array) zur Vorhersage der Response der proliferativen Erkrankung von Brustzellen durch Analyse des Methylierungszustands jedes der CpG- Dinukleotide aus der Gruppe der SEQ ID NOs: 1 bis 5, wobei mindestens ein Oligomer gemäß einem der Ansprüche 14 oder 15 an eine feste Phase gekoppelt wird.
Anordnung von verschiedenen Oligomeren (Array), erhältlich nach Anspruch 20.
Anordnung von verschiedenen Oligonukleotid- und/oder PNA-Oligomer-Sequenzen, nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß diese auf einer ebenen festen Phase in Form eines rechtwinkligen oder hexagonalen Gitters angeordnet sind.
Array nach einem der Ansprüche 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Phase-Oberfläche aus Silizium, Glas, Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold zusammengesetzt ist.
DNA- und/oder PNA-Array zur Vorhersage der Response der proliferativen Erkrankung von Brustzellen des Patienten durch Analyse des Methylierungszustands jedes der CpG-Dinukleotide aus der Gruppe der SEQ ID NOs: 1 bis 5, umfassend mindestens eine Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 14 bis 18.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, b) Extrahieren der genomischen DNA, c) in der genomischen DNA-Probe werden Cytosin-Basen, die an der 5'-Position unmethyliert sind durch chemische Behandlung zu Uracil oder einer anderen Base, die sich im Hinblick auf das Hybridisierungsverhalten von Cytosin unterscheidet konvertiert; d) Amplifizieren von mindestens einem Fragment der vorbehandelten genomischen DNA, wobei die Fragmente eine oder mehrere Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe von SEQ ID NOs: 6 bis 25 und dazu komplementäre Sequenzen umfassen, und e) Bestimmen des Methylierungszustands von einem oder mehrerer genomischer CpG-Dinukleotide durch Analyse der amplifizierten Nukleinsäuren.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels der Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 14 oder 15 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels der Hybridisierung von mindestens einem Oligonukleotid nach einem der Ansprüche 14 oder 15 und Verlängerung der/des hybridisierten Oligonukleotid(s/e) um mindestens eine Nukleotidbase durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels einer Sequenzierung durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt d) unter der Verwendung von Methylierungs-spezifischen Primern durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, weiterhin umfassend die Verwendung von mindestens einem Nukleinsäuremolekül oder Peptid Nukleinsäuremolekül in Schritt e), umfassend in jedem Fall eine kontinuierliche Sequenz einer Länge von mindestens 9 Nukleotiden, die zu einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs: 6 bis 25 und dazu komplementäre Sequenzen komplementär ist oder unter moderaten oder stringenten Bedingungen daran hybridisiert, wobei das Nukleinsäuremolekül oder Peptid Nukleinsäuremolekül die Amplifikation der Nukleinsäure, an die sie anhybridisiert ist, unterdrückt.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt e) mittels einer Kombination von mindestens zwei der in Ansprüchen 26 bis 30 beschriebenen Verfahren durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die chemische Behandlung mittels einer Lösung von Bisulfit, Hydrogensulfit oder Disulfit durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend die folgenden Schritte: a) Erhalten einer biologischen Probe, die genomische DNA enthält, b) Extrahieren der genomischen DNA, c) Verdauen der genomischen DNA, umfassend eine oder mehrere der Sequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NOs 1 bis 5 und dazu komplementärer Sequenzen mit einem oder mehreren Methylierungs-sensitiven Restriktionsenzymen, und d) Nachweisen der DNA-Fragmente, die in dem Verdau aus Schritt c) erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der DNA-Verdau vor Schritt d) amplifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 32 und 34 dadurch gekennzeichnet, daß mehr als sechs verschiedene Fragmente, die eine Länge von 100 – 200 Basenpaaren aufweisen, amplifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 32, 34 und 35 dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation von mehreren DNA-Segmenten in einem Reaktionsgefäß durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 32 und 34 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerase eine Hitze-resistente DNA-Polymerase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 32 und 34 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 32 und 34 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate nachweisbare Marker tragen.
Verfahren nach Anspruch 39 wobei die Marker Fluoreszenz-Marker, Radionuklide und/oder ablösbare Molekül-Fragmente sind, die eine typische Masse haben, die in einem Massenspektrometer nachgewiesen werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 32 und 34 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikate oder Fragmente in dem Massenspektrometer nachgewiesen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 oder 41, dadurch gekennzeichnet, daß die produzierten Fragmente eine einzelne positive oder negative Ladung zur besseren Nachweisbarkeit im Massenspektrometer aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 40 bis 42, daß der Nachweis durchgeführt und visualisiert wird mittels Matrix-unterstützter Laser Desorptions/Ionisierungs-Massenspektrometrie (MALDI) oder unter der Verwendung von Elektronenspray-Massenspektrometrie (ESI).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25 oder einem der einem der Ansprüche 25 bis 43, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA von Zellen oder zellulären Komponenten erhalten wird, die DNA enthalten, wobei Quellen von DNA zum Beispiel umfassen, Zellinien, histologische Schnitte, Biopsien, in Paraffin eingebettetes Gewebe, Brustgewebe, Blut, Plasma, lymphatische Flüssigkeit, Duktus Zellen, ductale Lavageflüssigkeit, Brustwarzen-Austrittsflüssigkeit, Knochenmark und Kombinationen davon.
Kit, umfassend ein Bisulfit (Bisulfit, Hydrogensulfit) Reagenz sowie Oligonukleotide und/oder PNA-Oligomere nach einem der Ansprüche 14 bis 15.
Kit nach Anspruch 45, weiter umfassend Standard-Reagenzien zur Durchführung eines Methylierungstests aus der Gruppe bestehend aus MS-SNuPE, MSP, Methyl light, Heavy Methyl, Nukleinsäuresequenzierung und Kombinationen davon.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und 25 bis 44, einer Nukleinsäure nach Anspruch 13, eines Oligonukleotids oder PNA-Oligomers nach einem der Ansprüche 14 bis 18, eines Kits nach den Ansprüchen 45 oder 46, eines Arrays nach einem der Ansprüche 21 bis 24 oder eines Verfahrens zur Herstellung eines Arrays nach Anspruch 20, für die Prognose, Diagnose, Behandlung, Charakterisie rung, Klassifizierung, und/oder Differenzierung von proliferativen Erkrankungen von Brustzellen.