DE10337904A1

DE10337904A1 - Substanzen für die Apoptoseregulation, insbesondere Apoptosestimulation

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Publication number: DE10337904A1
Application number: DE10337904A
Authority: DE
Inventors: Erich Prof. Dr. Gulbins; Constantin Adams; Ildiko Szabo
Original assignee: Universitaet Duisburg Essen
Current assignee: Universitaet Duisburg Essen
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2005-03-24

Abstract

Beschrieben sind apoptoseinduzierende oder apoptosestimulierende Substanzen für die prophylaktische oder kurative Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum oder Zellteilung auftritt bzw. hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, sowie deren Verwendung in entsprechenden therapeutischen Verfahren. Gleichermaßen beschrieben sind entsprechende Testsysteme zur Identifizierung solcher Substanzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanzen (AIS) zur Herstellung von Medikamenten bzw. Arzneimitteln für die prophylaktische oder kurative Behandlung von Erkrankungen des menschlichen odertierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen bzw. bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, sowie ein entsprechendes Behandlungsverfahren.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induzierung bzw. Stimulation von Apoptose in Zellen, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, durch Beeinflussung von mitochondrialen Kaliumkanälen der betreffenden Zellen mittels apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanzen.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Auffindung bzw. Identifizierung apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanzen, welche derart ausgewählt bzw. beschaffen sind, daß sie durch Wechselwirkung bzw. Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induzieren bzw. stimulieren.
Apoptose, bisweilen auch als programmierter oder physiologischer Zelltod bezeichnet, ist ein im Organismus vorkommender natürlicher Vorgang und stellt eine genetisch fixierte Form des Zelltods dar, die durch bestimmte Umstände bzw. Faktoren aktiviert werden kann. Apoptotische Vorgänge ermöglichen in einem komplexen, multizellulären Organismus die kontrollierte Aufrechterhaltung und Regulation des Zellgleichgewichts, so daß diese Vorgänge in bezug auf die Entstehung und Erhaltung des Lebens von grundlegender Bedeutung sind. In diesem Zusammenhang ist als wichtiger Prozeß beispielswei se die Embryonalentwicklung zu nennen, in deren Zusammenhang für die weitere Entwicklung irrelevante Zellen oder Gewebestrukturen gezielt durch Apoptose eliminiert werden, wie es beispielsweise für die sogenannten Interdigitalfalten der Fall ist. Weiterhin ist die apoptotische Regulation des Immunsystems zu nennen, wobei insbesondere eine Kontrolle bestimmter Immunzellen stattfindet, um beispielsweise Abwehneaktionen dann zu unterbinden, wenn die entsprechenden Pathogene erfolgreich beseitigt worden sind. Das spezifische Absterben beispielsweise solcher Zellen, die eine virale Infektion aufweisen, ist eine weitere effektive immunregulatorische Maßnahme, die in Verbindung mit Apoptose steht. Aber auch geschädigte, entartete Zellen sterben durch gezielte apoptotische Prozesse, damit diese keinen manifesten Krebs ausbilden können. So bewirken beispielsweise cytotoxische T-Zellen die Aktivierung eines Apoptoseprogramms in Zellen mit veränderter HLA-Struktur (Humane Leukocyten Antigen-Struktur).
Allerdings funktioniert die natürliche Kontrolle der Apoptose nicht immer, so daß schwere Erkrankungen resultieren können, die beispielsweise in Zusammenhang mit einer erhöhten zellulären Apoptose stehen, wie neurodegenerative Erkrankungen, oder bei denen eine erniedrigte Apoptoserate vorliegt, wie es z. B. für Krebserkrankungen der Fall sein kann.
In bezug auf die Erforschung pathologischer Apoptoseprozesse ist es daher ein vorrangiges Ziel, den Prozeß der Apoptose in gewünschter Weise therapeutisch zu beeinflussen. Eine Voraussetzung hierfür ist, daß die an der Apoptose beteiligten Faktoren und ihre Funktionsweise bekannt sind. Darüber hinaus sollte der therapeutische Eingriff in die Apoptose wegen ihrer generellen Bedeutung vorteilhafterweise selektiv und spezifisch sein, um Nebenwirkungen zu vermeiden. In diesem Zusammenhang ist deshalb die Aufklärung der spezifischen Signalwege der Apoptose auf zellphysiologischer Ebene, insbesondere auf molekularer Ebene, von großer Bedeutung.
Hier spielen offenbar proapoptotische Bc1-2-ähnliche Proteine, wie Bax, Bad oder Bak, bei vielen Formen der Apoptose, beispielsweise nach Stimulation verschiedener proapoptotischer Rezeptoren, Behandlung mit ionisierenden Strahlen oder UV-Licht, eine entscheidende Rolle.
Obwohl in fast allen Formen der Apoptose Bc1-2-ähnliche Moleküle eine entscheidende Rolle spielen, sind die zellulären Wirkmechanismen dieser Moleküle noch weitgehend unbekannt. Man kann Bc1-2-ähnliche Proteine in zwei Gruppen unterteilen, nämlich in proapoptotische und antiapoptotische Mitglieder dieser Proteinfamilie. Proapoptotische Bc1-2-ähnliche Proteine sind beispielsweise Bax, Bak, Bok, Bad, Bim, Bmf, Bid, Noxa oder Puma. Antiapoptotische Familienmitglieder sind beispielsweise Bc1-2 selbst, Bc1-x_L, Bc1-w, Mc1-1, Boo/Diva und A1/Bf1-1. Einige virale Proteine, wie z. B. E1B19K oder BHRF1, sind homolog zu Bc1-2 und hemmen ebenfalls die Apoptose. Alle Bc1-2 ähnlichen Proteine enthalten konservierte α-helikale Domänen, sogenannte BH-Domänen. Insgesamt sind vier homologe BH-Domänen bekannt, von denen aber nur BH3 in allen Bc1-2 ähnlichen Proteinen, sowohl den antiapoptotischen als auch den proapoptotischen Proteinen, zu finden ist. Die genaue molekulare Funktion dieser BH-Domänen ist bisher nicht bekannt, sie scheinen aber der Interaktion zwischen verschiedenen Bc1-2-ähnlichen Proteinen zu dienen.
Bc1-2-ähnliche Proteine scheinen über verschiedene Mechanismen reguliert zu werden. So assoziieren die antiapoptotischen Moleküle Bc1-2 und Bc1-x_L mit proapoptotischen Molekülen wie Bax oder den BH-3-Proteinen. Dadurch scheinen die proapoptotischen Moleküle in Bezug auf ihre Wirkung neutralisiert und Apoptose blockiert zu werden. Über einen ähnlichen Mechanismus wirken auch die Assoziation Bc1-2-ähnlicher Proteine mit 14-3-3-Proteinen, die Interaktion von Bim mit Dynein, von Bmf mit dem Aktincytoskelett oder die Bindung von phosphoryliertem Bad an bestimmte Bereiche der Zellmembran, den sogenannten Lipid Rafts. Schließlich werden einige proapoptotische Bc1-2-ähnliche Proteine auch über eine PKB/Akt-abhängige Phosphorylierung inaktiviert. Eine Dephosphorylierung führt zur Aktivierung der proapoptotischen Aktivität dieser Bc1-2-ähnlichen Proteine.
Die meisten Konzepte über die Wirkmechanismen Bc1-2-ähnlicher Proteine gehen zur Zeit davon aus, daß diese Proteine bei einem entsprechenden apoptotischen Stimulus aus dem Cytosol oder anderen zellulären Kompartimenten an Mitochondrien binden und dort Apoptose induzieren. Zur Zeit ist nicht geklärt, wie proapoptotische Bc1-2-ähnliche Proteine auf molekularer Ebene wirken. Es wurde beschrieben, daß Bax an den Adenin-Nukleotid-Translo kator der mitochondrialen Permeability Transition Pore (PTP), eines großen und unselektiven mitochondrialen Innenkanals, bindet und damit die Funktion von PTP reguliert. Nach dieser Vorstellung resultiert durch eine Bindung von Bax an die PTP eine Aktivierung des Kanals, als Folge wird die Mitochondrienmembran depolarisiert und Apoptose induziert. Die Mechanismen der Regulation der PTP durch Bax und die physiologische Bedeutung der Interaktion für Apoptose sind jedoch noch unbekannt.
Ein weiteres Konzept über die Funktion Bc1-2-ähnlicher Proteine wurde aus der Struktur dieser Proteine abgeleitet. Strukturanalysen zeigten eine Homologie Bc1-2-ähnlicher Proteine mit dem Diphterietoxin, was zur Hypothese führte, daß proapoptotische Bc1-2-ähnliche Proteine in der mitochondrialen Membran einen eigenen Kanal bilden und dadurch die Mitochondrien depolarisieren. Dieses Konzept basiert auf der Annahme der Funktion von Bc1-2-ähnlichen Proteinen als Ionenkanäle, was aber unter physiologischen Bedingungen – zumindest bislang – nicht bestätigt werden konnte.
Die WO 00/06187 A2 betrifft die Modulation von Apoptose, insbesondere ein Verfahren zur Induzierung von Apoptose zur Behandlung von mit verminderter Zellapoptose in Verbindung stehenden Krankheitszuständen. Die WO 00/06187 A2 geht von dem zuvor beschriebenen, aber für physiologische Zellvorgänge bislang nicht nachgewiesenen Konzept aus, daß proapoptotische Proteine und darüber hinaus auch antiapoptotische Proteine der Bc1-2-Familie große Kanäle in der Mitochondrienmembran ausbilden, wobei im Fall der von proapoptotischen Proteine gebildeten, chloridselektiven Kanäle Cytochrom c aus den Mitochondrien freigesetzt werden kann, wohingegen die von antiapoptotischen Proteinen gebildeten Kanäle kaliumselektiv sowie für Cytochrom c nicht permeabel sind. Das in der WO 00/06187 A2 beschriebene Verfahren soll folglich darauf abzielen, Substanzen bereitzustellen, die in Mitochondrienmembranen Kanäle bzw. Poren mit hoher Cytochrom c-Permeabilität ausbilden sollen und so Apoptose hervorrufen bzw. solche Substanzen zur Verfügung zu stellen, welche die Eigenschaften von Kanälen, die aus antiapoptotischen Proteinen gebildet sind, derart verändern sollen, daß es schließlich zur Apoptose der Zelle kommt. Ein Nachteil des in der WO 00/06187 A2 beschriebenen Verfahrens ist insbesondere darin zu sehen, daß es – wie bereits geschildert – auf einem für physiologische Zellvorgänge bislang nicht nachgewiesen Konzept beruht.
Die WO 02/40025 A1 beschreibt die Induzierung von Apoptose insbesondere bei entzündungsspezifischen Zellen, wie beispielsweise Eosinophilen, zur Behandlung und Prävention entzündlicher Erkrankungen, wobei Substanzen verwendet werden, die spezifisch mit mitochondrialen K_ATP-Kanälen (d. h. mitochondrialen, ATP-abhängigen Kaliumkanälen) interagieren und zur Öffnung dieser Kanäle führen, wodurch als Folge eine Apoptose in den betroffenen Zellen stattfinden soll. Das in der WO 02/40025 A1 beschriebene Verfahren zielt somit ausschließlich auf ATP-abhängige mitochondriale Kaliumkanäle als pharmakologisches Target; darüber hinaus ist die WO 02/40025 A1 auf die Behandlung entzündlicher Erkrankungen, wie beispielsweise Rhinitis, Myokarditis oder Arthritis, beschränkt.
Letztlich sind die molekularen Mechanismen, über die Bc1-2-ähnliche Proteine Apoptose regulieren, noch immer unbekannt. Da diese Proteinfamilie aber von herausragender Bedeutung in Bezug auf die Regulation von Apoptose ist, ermöglicht eine Identifizierung dieser Mechanismen völlig neue Ansätze zur Therapie von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist.
Die zuvor geschilderten Methoden des Standes der Technik ermöglichen bisher keine effiziente Therapiemöglichkeit in Bezug auf Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, eine effiziente kurative bzw. prophylaktische Behandlungsmöglichkeit für Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers bereitzustellen, bei denen eine therapeu tisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist oder bei denen eine übermäßige Verminderung von Apoptose (d. h. also eine reduzierte bzw. herabgesetzte zelluläre Apoptose) bzw. eine übermäßige Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Auffindung bzw. Identifizierung entsprechender Wirkstoffe, welche sich zur Verwendung im Rahmen der Behandlung der vorgenannten Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers eignen, bereitzustellen.

Gemäß einem ersten Gegengstand der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung somit die Verwendung mindestens einer apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) zur Herstellung eines Medikaments oder Arzneimittels zur prophylaktischen oder kurativen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, wobei die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt bzw. beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung bzw. Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert oder stimuliert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter Apoptoseinduzierung bzw. Apoptosestimulierung insbesondere eine gezielte Veränderung bzw. Beeinflussung, insbesondere eine Erhöhung bzw. Zunahme der natürlichen Apoptose der betreffenden Zellen zu verstehen. Unter dem Begriff Apoptoseinduzierung kann hierbei erfindungsgemäß eine insbesondere direkte bzw. aktive Einleitung des Apoptosevorgangs in den betreffenden Zellen verstanden werden, während der Begriff Apoptosestimulation erfindungsgemäß als eine insbesondere indirekte Einleitung des Apoptosevorgangs verstanden werden kann, beispielsweise als Folge insbesondere einer Reizung bzw. Anregung der betreffenden Zellen.

Unter dem Begriff der betreffenden Zellen sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Zellen zu verstehen, die von übermäßig verminderter Apoptose bzw. übermäßiger Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung betroffen bzw. in Mitleidenschaft gezogen sind oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose beabsichtigt ist und die am Krankheitsbild bzw. -verlauf beteiligt sind bzw. das Krankheitsbild bestimmen. Für diesen Fall erfolgt die Behandlung kurativ bzw. therapeutisch. Weiterhin zählen zu den betreffenden Zellen auch solche Zellen, die beispielsweise im Rahmen eines progressiven bzw. chronischen Krankheitsverlaufs erst künftig von einer übermäßig verminderten Apoptose bzw. übermäßiger Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung betroffen sind oder betroffen sein könnten, in diesem Fall erfolgt die Behandlung auf prophylaktischer Ebene, d. h. vor Einsetzen der verminderten Apoptose bzw. vor Einsetzen der übermäßigen Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung. Zu den betreffenden Zellen können beispielsweise auch eukaryotische Erreger, sofern sie insbesondere mitochondriale Kaliumkanäle (MK), insbesondere den Kv1.3-Kaliumkanal der inneren Mitochondrienmembran, besitzen, aber auch körpereigene Zellen, bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose beabsichtigt ist, wie beispielsweise Zellen, die von Erregern, wie Bakterien bzw. Viren, befallen sind, gezählt werden.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben übenaschenderweise herausgefunden, daß in den meisten Zellen des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere in Zellen, bei denen eine übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine übermäßige Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose beabsichtigt ist, mitochondriale, insbesondere in der innermitochondrialen Membran lokalisierte, im allgemeinen spannungsabhängige Kaliumkanäle, insbesondere Kv1.3-Kaliumkanäle bzw. deren Homologe, existieren (d. h. natürlich und dauerhaft vorhanden sind), welche – wenn sie in Wechselwirkung mit proapoptotischen Substanzen, insbesondere natürlich vorkommenden proapoptotischen Substanzen, wie proapoptotischen Bc1-2-ähnlichen Proteinen, wie z. B. Bax, treten – zur Auslösung von Apoptose der betreffenden Zellen führen, und daß die gezielte Beeinflussung, insbesondere die Inhibierung bzw. Blockade, dieser Kaliumkanäle mit apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) eine effiziente Maßnahme darstellt, um die Apoptose der betreffenden Zellen zu induzieren bzw. zu stimulieren und folglich mit übermäßig verminderter Apoptose bzw. übermäßiger Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung in Zusammenhang stehende Erkrankungen oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder Erkrankungen, bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, zu therapieren. Auf diese Weise wird erfindungsgemäß eine sehr effiziente Therapiemöglichkeit für derartige Erkrankungen bereitgestellt, welche gezielt bzw. selektiv in die apoptotischen Zellvorgänge eingreift. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter dem Begriff der Wechselwirkung zwischen apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) einerseits und mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) andererseits eine Beeinflussung der Aktivität der mitochondrialen Kaliumkanäle (MK) in den betreffenden Zellen zu verstehen, derart daß Apoptose induziert bzw. stimuliert wird.

Denn den Erfindern der vorliegenden Erfindung ist der Nachweis gelungen, daß die in den Mitochondrien exprimierten Kaliumkanäle (insbesondere die in der innermitochondrialen Membran lokalisierten, im allgemeinen spannungsabhängigen Kaliumkanäle, insbesondere Kv1.3-Kaliumkanäle und deren Homologe) mit proapoptotischen Bc1-2-ähnlichen Proteinen, wie z. B. Bax, interagieren und Bc1-2-induzierte (z. B. Bax-induzierte) Apoptose vermitteln, so daß eine "Nachahmung" bzw. Aktivierung dieser Interaktion bzw. Wechselwirkung zu einer Induzierung bzw. Stimulation und damit zu einer Erhöhung der Apoptose als solcher führt und somit eine effiziente Therapiemöglichkeit in Bezug auf mit dem Auftreten von übermäßig verminderter Apoptose bzw. übermäßiger Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung in Zusammenhang stehenden Erkrankungen oder Erkrankungen, bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, bietet. Proapoptotische Proteine der Bc1-2-Familie, wie z. B. Bax, interagieren bzw. wechselwirken also beispielsweise mit Kv1.3-Kaliumkanälen der inneren Mitochondrienmembran (IMM) und können über diesen Mechanismus Apoptose induzieren. Dabei werden beispielsweise die Kv1.3-Kanäle der inneren Mitochondrienmembran (IMM), insbesondere durch die proapoptotischen Proteine der Bc1-2-Familie, wie z. B. Bax, derart blockiert bzw. inhibiert, daß in den betreffenden Zellen eine Apoptose induziert bzw. stimuliert wird. Unter dem Begriff Blockade bzw. Blockieren oder Inhibieren kann im Sinne der vorlie genden Erfindung insbesondere eine Veränderung kanalspezifischer, z. B. biophysikalischer Parameter, wie beispielsweise eine Abnahme beispielsweise des Kanalleitwerts, der Kanaloffenzeit (Lebensdauer) und/oder der Offenwahrscheinlichkeit des Kanals, verstanden werden. Die Wechselwirkung bzw. Interaktion der proapoptotischen Proteine der Bc1-2-Familie, wie z. B. Bax, insbesondere mit den Kv1.3-Kanälen der inneren Mitochondrienmembran (IMM) kann dabei beispielsweise eine direkte, insbesondere eine physikalische und/oder chemische Wechselwirkung, oder eine indirekte Wechselwirkung sein.

Zwar ist die Existenz beispielsweise von Kv1.3-Kanälen in der äußeren Zell- bzw. Cytoplasmamembran an sich seit längerem bekannt, jedoch war es bis zum Zeitpunkt der Erfindung unbekannt, daß auch in Mitochondrienmembranen, insbesondere in den inneren Mitochondrienmembranen, derartige Kaliumkanäle vorhanden sind und daß diese mitochondrialen Kaliumkanäle von herausragender Bedeutung in Bezug auf apoptotische Zellvorgänge sind und folglich eine effizientes Target für eine Regulation, insbesondere ein Auslösen der Zellapoptose darstellen.

Die Erfinder konnten in ihren Experimenten die Existenz von spannungsabhängigen Kaliumkanälen, insbesondere von Kv1.3-Kaliumkanälen oder hierzu homologen Kanälen, in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) nachweisen. Darüber hinaus konnten die Erfinder anhand von Versuchen an vollständigen Zellsystemen sowie an isolierten Mitochondrien zeigen, daß die funktionelle Expression dieser Kanäle in Mitochondrien in Bezug auf apoptotische Vorgänge von großer Bedeutung ist. So konnte nachgewiesen werden, daß das Vorhandensein von spannungsabhängigen mitochondrialen Kaliumkanälen, insbesondere von Kv1.3-Kaliumkanälen oder hierzu homologen Kanälen, die insbesondere in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) lokalisiert sind, in Bezug auf eine Apoptoseinduzierung, insbesondere durch proapoptotische Bc1-2-ähnliche Proteine, wie Bax, notwendig ist. So konnten die Erfinder zeigen, daß Zellen bzw. Mitochondrien, die diese Kanäle aufgrund ihrer genetischen Disposition nicht enthalten, eine Resistenz gegenüber proapoptotischen Bc1-2-ähnlichen Proteinen, insbesondere Bax, und darüber hinaus auch gegenüber anderen Substanzen, von denen bekannt ist, daß sie Apoptose induzieren, wie beispielsweise C₆-Ceramid oder Staurosporin, aufweisen und eine Apoptose bei derartigen Zellen bzw. Mitochondrien nicht induziert werden kann. Die Inhibierung bzw. Blockade dieser Kanäle an isolierten Mitochondrien führte zur Induzierung von apoptosespezifischen Prozessen, wie Cytochrom c-Freisetzung, Veränderungen des mitochondrialen Membranpotentials, insbesondere Depolarisation, und Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). Zusammenfassend belegen die experimentellen Erkenntnisse, die durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung gewonnen worden sind, die zentrale Bedeutung der in den Mitochondrien, insbesondere in der innermitochondrialen Membran lokalisierten, im allgemeinen spannungsabhängigen Kaliumkanäle, insbesondere Kv1.3-Kaliumkanäle, in bezug auf apoptotische Vorgänge sowie eine Möglichkeit der Apoptoseregulation bzw. Apoptosestimulation über diese Kaliumkanäle.

Wie zuvor geschildert, kommen erfindungsgemäß solche apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) zum Einsatz, die derart ausgewählt bzw. beschaffen sind, daß sie durch Wechselwirkung bzw. Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induzieren bzw. stimulieren.

Dies kann auf verschiedene Arten und Weisen erfolgen, wie im folgenden ausgeführt wird:
Eine erste Möglichkeit besteht darin, daß die erfindungsgemäß eingesetzte apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ist, daß sie mit dem mitochondrialen Kaliumkanal (MK) in der Weise wechselwirkt bzw. interagiert, daß in den betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert bzw. stimuliert wird. Hierbei kann die Wechselwirkung der apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) mit dem mitochondrialen Kaliumkanal (MK) insbesondere durch physikalische und/oder chemische Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) an den mitochondrialen Kaliumkanal (MK) erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) an den mitochondrialen Kaliumkanal (MK) dabei zumindest im wesentlichen selektiv, d. h. vorteilhafterweise besitzt die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) in bezug auf den mitochondrialen Kaliumkanal (MK) eine erhöhte Bindungsaffinität im Vergleich zur Bindungsaffinität gegenüber anderen Substanzen. Die Interaktion bzw. Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) an den mitochondrialen Kaliumkanal (MK) kann beispielsweise im Porenbereich des mitochondrialen Kaliumkanals (MK) im Sinne eines Kanalblockers stattfinden oder aber an einer hiervon verschiedenen Bindungsstelle erfolgen, jedoch stets mit der Maßgabe, daß eine Wechselwirkung bzw. Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) in bezug auf den mitochondrialen Kaliumkanal (MK) in den betreffenden Zellen zu einer Induzierung bzw. Stimulierung von Apoptose in diesen Zellen führt.

Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform dieser ersten Möglichkeit ist die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt bzw. beschaffen, daß sie den mitochondrialen Kaliumkanal (MK), insbesondere den Kv1.3-Kaliumkanal der inneren Mitochondrienmembran und/oder dessen Homologe, blockiert bzw. inhibiert.

Unter dem Begriff Blockieren bzw. Inhibieren kann erfindungsgemäß insbesondere eine durch die Wechselwirkung bzw. Interaktion der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) mit dem mitochondrialen Kaliumkanal (MK), insbesondere dem Kv1.3-Kaliumkanal der inneren Mitochondrienmembran, hervorgerufene Veränderung kanalspezifischer, z. B. biophysikalischer Parameter, wie beispielsweise des Kanalleitwerts, der Kanaloffenzeit (Lebensdauer) und/oder der Offenwahrscheinlichkeit des Kanals, verstanden werden. Die Wechselwirkung bzw. Interaktion der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) mit dem mitochondrialen Kaliumkanal (MK), insbesondere dem Kv1.3-Kaliumkanal der inneren Mitochondrienmembran, kann dabei beispielsweise eine direkte, insbesondere eine physikalische und/oder chemische Wechselwirkung, beispielsweise im Bereich der Kanalpore, was insbesondere zu einem "Versperren" bzw. "Verstopfen" der Kanalpore führen kann, sein. Darüber hinaus ist erfindungsgemäß auch eine indirekte Wechselwirkung möglich, beispielsweise durch Änderungen zellphysiologischer Parameter. Erfindungsgemäß ist unter dem Begriff Blockade bzw. Blockieren insbesondere eine vollständige Inaktivierung des mitochondrialen Kaliumkanals (MK), insbesondere des Kv1.3-Kaliumkanals der inneren Mitochondrienmembran, vorzugsweise ein hergehend mit einem vollständigen Rückgang der Kanalaktivität, im allgemeinen in bezug auf die oben genannten biophysikalischen Kanalparameter, zu verstehen, verbunden mit einer Erhöhung bzw. Zunahme der natürlichen Apoptose. Der Begriff Inhibieren kann erfindungsgemäß insbesondere als eine zumindest teilweise Inaktivierung des Kanals verstanden werden derart, daß eine Abnahme bzw. Verringerung der Kanalaktivität, im allgemeinen in bezug auf die vorgenannten biophysikalischen Kanalparameter, eintritt, verbunden mit einer Erhöhung bzw. Zunahme der natürlichen Apoptose.

Eine zweite, alternative Möglichkeit der Wechselwirkung zwischen apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) einerseits und mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen andererseits besteht darin, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) eine Änderung oder Beeinflussung des physiologischen Zellverhaltens bzw. der physiologischen Zellparameter hervorruft, wie es im folgenden weiter konkretisiert wird. Gemäß dieser Ausführungsform kann die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) so beschaffen bzw. ausgewählt sein, daß sie die physiologischen Parameter der betreffenden Zellen, wie insbesondere deren Metabolismus, Osmolarität, pH-Wert, Membranpotential und dergleichen, derart beeinflußt, daß die biophysikalischen Eigenschaften, insbesondere Kanalleitwert, Kanaloffenzeit und/oder Kanaloffenwahrscheinlichkeit, der mitochondrialen Kaliumkanäle (MK) der betreffenden Zellen in der Weise verändert werden, daß in den betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert wird. Gemäß einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform dieser zweiten Möglichkeit werden die physiologischen Zellparameter durch die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart beeinflußt, daß der mitochondriale Kaliumkanal (MK), insbesondere der Kv1.3-Kaliumkanal der inneren Mitochondrienmembran, blockiert bzw. inhibiert wird.

Zusätzlich kann die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart beschaffen sein, daß sie – neben der kanalblockierenden oder kanalinhibierenden Wirkung bzw. neben der Beeinflussung der physikalischen Zellparameter – außerdem auch mit antiapoptotischen Substanzen (AAS), wie nachfolgend noch definiert wird, in der Weise wechselwirkt bzw. interagiert, daß die antiapoptotische Wirkung der antiapoptotischen Substan zen (AAS) inhibiert oder zumindest gehemmt wird. Dabei kann die antiapoptotische Substanz (AAS) insbesondere durch physikalische bzw. chemische Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) an die antiapoptotische Substanz (AAS) beispielsweise inaktiviert werden. Im Rahmen dieses Wirkmechanismus kann demnach in den betreffenden Zellen beispielsweise eine insbesondere durch die antiapoptotische Substanz (AAS) hervorgerufene verminderte Apoptose auf ein höheres Maß zurückgeführt werden. Bei der antiapoptotischen Substanz (AAS) kann es sich beispielsweise um eine im Körper und/oder in Körperzellen vorkommende natürliche, insbesondere körpereigene Substanz handeln, insbesondere ein antiapoptotisch wirkendes Peptid, insbesondere ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein antiapoptotisch wirkendes Peptid, z. B. der Bc1-2-Familie, wie Bc1-2, Mc1-1, A1/Bf1-1, Bc1-X_L, Boo/Diva oder Bc1-w, sowie deren Homologe oder Derivate. In Bezug auf den Begriff der Homologe und Derivate kann auf nachfolgende Ausführungen zu der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) verwiesen werden, die in diesem Zusammenhang entsprechend gelten. Kennzeichnend z. B. für eine aus der Bcl-2-Familie stammende, antiapoptotische Substanz (AAS) ist insbesondere die Existenz von BH-Domänen als Strukturmerkmale, wobei die antiapoptotisch wirksamen Bc1-2-Proteine insbesondere vier kurze BH-Domänen aufweisen können, die als BH1, BH2, BH3 und BH4 bezeichnet werden.

Bei allen zuvor beschriebenen Ausführungsformen sollte die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) vorteilhafterweise derart ausgewählt werden, daß die sie in Bezug auf die Zelle, insbesondere in Bezug auf die physiologischen Parameter der betreffenden Zelle, kompatibel ist und vor allem die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) selbst keine Apoptose inhibiert oder zumindest hemmt. Der Begriff kompatibel ist hierbei so zu verstehen, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) insbesondere die physiologischen Parameter der betreffenden Zelle nicht dahingehend ändert, daß apoptotische Folgereaktionen, wie etwa eine Cytochrom c-Freisetzung oder eine Aktivierung der PTP, inhibiert (d. h. vollständig unterbunden) oder gehemmt werden.

Die erfindungsgemäß eingesetzte apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) kann eine anorganische oder organische Substanz sein. Beispielsweise kann die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) eine niedermolekulare Substanz (sogenanntes "Small Drug Molecule") oder aber eine höhermolekulare, insbesondere oligomere oder polymere Substanz sein.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäß eingesetzte apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) ein Kohlenwasserstoff, eine Nukleinsäure, ein Lipid oder ein Peptid bzw. ein Derivat der vorgenannten Verbindungen sein, wie beispielsweise ein Lipoprotein. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter einem Peptid eine Verbindung zu verstehen, die aus α-Aminosäuren besteht, welche durch Säureamidbindungen (Peptidbindungen) kettenförmig verknüpft sind; in Abhängigkeit der Anzahl der Aminosäuren kann zwischen Oligopeptiden (bis zu 10 Aminosäuren), Polypeptiden (10 bis 100 Aminosäuren) und Proteinen (über 100 Aminosäuren) differenziert werden, d. h. der Begriff Peptid wird erfindungsgemäß sehr weit verstanden und umfaßt somit Oligopeptide, Polypeptide und Proteine. Unter einem Peptidderivat ist jede funktionelle Variante des Peptids zu verstehen. Beispielsweise umfaßt eine funktionelle Variante eines natürlich vorkommenden Peptids z. B. die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in seiner Sequenz, so daß die Funktion des resultierenden Peptids als apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) nicht beeinflußt wird. Eine funktionelle Variante umfaßt im Rahmen der vorliegenden Erfindung beispielsweise auch eine Veränderung der Sequenz, wobei eine oder mehrere Aminosäuren entfernt und/oder durch eine andere Aminosäure bzw. modifizierte Aminosäure oder nicht natürliche Aminosäure ersetzt werden können bzw. eine solche Aminosäure eingefügt werden kann. Unter Beibehaltung der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Wirkung können beispielsweise auch Glykosylierungen oder Phosphorylierungen in Bezug auf die verwendeten Peptide durchgeführt werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) insbesondere ein proapoptotisch wirkendes Peptid, insbesondere ein Oligopeptid, ein Polypeptid oder ein Protein, so z. B. ein Mitglied der proapoptotisch wirksamen Bc1-2-Familie, sein. Hierzu zählen Peptide wie Bax, Bak, Bok, Bim, Bmf, Bad, Bik, Bid, Bc1-x_s, Noxa oder Puma sowie deren Homologe und Derivate. Derartige Peptide der Bc1-2-Familie können ebenfalls BH-Domänen als Strukturmerkmale enthalten, wobei hier insbesondere die BH4-Domäne und die BH3-Domäne zu nennen sind. Diese Domänen können beispielsweise als mögliche Interaktionsstellen in bezug auf antiapoptotischen Substanz (AAS) dienen (z. B. vorzugsweise selektive Bindung der AIS an die entsprechenden Domäne der AAS zu deren Inaktivierung). Darüber hinaus kann die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) im Rahmen der vorliegenden Erfindung aus der Gruppe von spezifischen Inhibitoren bzw. Kanalblockern des Kv1.3-Kaliumkanals der inneren Mitochondrienmembran (IMM), wie Margatoxin und/oder Shigatoxin, sowie deren Homologen und Derivaten, ausgewählt sein.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) ganz besonders bevorzugt derart ausgewählt und/oder beschaffen, daß sie mit den Kv1.3-Kaliumkanälen und/oder deren Homologen der inneren Mitochondrienmembranen (IMM) der betreffenden Zellen wechselwirkt bzw. interagiert und dabei die Kv1.3-Kaliumkanäle und/oder deren Homologe insbesondere blockiert bzw. inhibiert, so daß eine Apoptose der betreffenden Zellen induziert oder stimuliert wird.

Wie zuvor geschildert, besteht eine maßgebliche Zielsetzung der vorliegenden Erfindung insbesondere darin, durch eine Wechselwirkung zwischen mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen einerseits und apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) andererseits in diesen Zellen Apoptose zu induzieren bzw. zu stimulieren.

Bei dem betreffenden mitochondrialen Kaliumkanal (MK) handelt es sich vorzugsweise um einen insbesondere spannungsabhängigen Kaliumkanal, welcher in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) lokalisiert ist. Dieser mitochondriale Kaliumkanal (MK) ist insbesondere ein Kv1.3-Kaliumkanal oder ein hierzu homologer Kaliumkanal, wie beispielsweise ein Kv1.1-Kaliumkanal, Kv1.2-Kaliumkanal, Kv1.4-Kaliumkanal oder Kv1.5-Kaliumkanal. Unter einem homologen Kaliumkanal ist erfindungsgemäß insbesonde re ein solcher Kanal zu verstehen, der hinsichtlich seiner spezifischen, insbesondere biophysikalischen Eigenschaften und seiner Sequenz mit dem mitochondrialen Kaliumkanal (MK) der inneren Mitochondrienmembran, insbesondere dem Kv1.3-Kaliumkanal, vergleichbar ist. Unter einem Kaliumkanal ist erfindungsgemäß insbesondere ein solcher Kanal zu verstehen, der gegenüber Kaliumionen zumindest im wesentlichen selektiv ist, d. h. dessen Permeabilitäts- bzw. Selektivitätsverhältnis in bezog auf Kaliumionen im Vergleich zu anderen Ionen größer als 1 ist. Kaliumkanäle können insbesondere durch Kanalblocker wie Tetraethylammoniumchlorid (TEACI) geblockt werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff mitochondrialer Kaliumkanal insbesondere auf solche Kaliumkanäle, die durch spezifische Kanalblocker, wie Margatoxin (MgTx) oder Shigatoxin, inhibiert werden können, wie insbesondere Kv1.3-Kaliumkanäle.

Ohne sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, kann die Ursache des Auslösens von Apoptose z. B. durch ein proapoptotisch wirksames Bc1-2-ähnliches Peptid unter Umständen dadurch erklärt werden, daß beispielsweise das proapoptotisch wirksame Bc1-2-ähnliche Peptid z. B. an den innermitochondrialen Kv1.3-Kaliumkanal der betreffenden Zelle bindet und dadurch diesen Kv1.3-Kaliumkanal inhibiert, so daß als Folge Zellparameter, wie beispielsweise das mitochondriale Membranpotential, derart verändert werden, daß es zum Auslösen von Apoptose kommt. Einer anderen Theorie zufolge, die bislang jedoch unter physiologischen bzw. in-vivo-Bedingungen nicht nachvollzogen werden konnte, kann z. B. ein proapoptotisch wirksames Bc1-2-ähnliches Peptid einen neuen Kanal ausbilden oder mit dem Kv1.3-Kaliumkanal oder dessen Homologen zusammen einen neuen Kanal bzw. eine neue Pore ausbilden.

Wie zuvor ausgeführt, wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) zur prophylaktischen oder kurativen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers eingesetzt, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist. Hierbei kann es sich um akute wie chro nische Erkrankungen handeln. Die zu behandelnde Erkrankung kann beispielsweise eine Tumor- oder Krebserkrankung, insbesondere eine benigne oder maligne Tumorerkrankung, wie eine Krebserkrankung, z. B. Darmkrebs (Kolonkarzinom), Brustkrebs (Mammakarzinom), Ovarialkarzinom, Uteruskarzinom, Lungenkrebs, Magenkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Knochenkrebs, Hautkrebs, Kaposi-Sarkom, Hirntumor, Myosarkom, Neuroblastom, Lymphom und Leukämie, oder eine parasitäre Erkrankung, wie Leishmanose, Malaria oder Giardiasis, oder eine bakterielle Erkrankung oder eine virale Erkrankung, wie Hepatitis oder AIDS, sein.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Behandlung der vorgenannten Erkrankungen durch systemische oder topische Applikation bzw. Verabreichung der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) erfolgen. Dabei wird die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) vorteilhafterweise in einer Menge verwendet, die ausreicht, um in den betreffenden Zellen die gewünschte Wechselwirkung zwischen den mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) einerseits und apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits zu erreichen, die ausreicht, um in den betreffenden Zellen insbesondere eine Apoptose zu induzieren bzw. zu stimulieren. Dabei sind der eigentliche Wirkort der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) die betreffenden Zellen, also insbesondere die Zellen, in denen Apoptose induziert bzw. stimuliert werden soll, vorzugsweise die Mitochondrien bzw. die Mitochondrienmembranen, in der die zuvor beschriebenen innermitochondrialen Kaliumkanäle (MK) lokalisiert sind. Somit ist die Menge der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) im Rahmen der vorliegenden Erfindung derart zu wählen, daß die Konzentration dieser Substanz am zuvor definierten Wirkort ausreicht, um den gewünschten Effekt zu erzielen.

Dabei kann die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) als solche oder aber auch in Form eines entsprechenden Vorläufers, insbesondere eines Prodrugs (Propharmakons), appliziert werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist unter einem Prodrug ein Wirkstoffvorläufer zu verstehen, der (beispielsweise vor dem Hintergrund einer verbesserten Resorption, einer erhöhten Wasserlöslichkeit, eines besseren Geschmacks und/ oder einer geringeren Toxizität etc.) die eigentliche apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) erst nachfolgend im Körper bzw. in den betreffenden Zellen, z. B. durch physiologische Aktivität, insbesondere in situ, aus dem Prodrug generiert. Hierbei spielen insbesondere chemische und/oder physikalische Umwandlungen eine große Rolle. Unter einem Prodrug ist erfindungsgemäß aber nicht nur eine direkte chemische Vorläufersubstanz zu verstehen, sondern beispielsweise auch ein für die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) codierendes Gen bzw. die entsprechende Nukleotidsequenz, das bzw. die (beispielsweise im Rahmen eines gentherapeutischen Ansatzes) z. B. über geeignete Vektorsysteme in den Körper und insbesondere in die betreffenden Zellen eingebracht werden kann, wobei nachfolgend die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS), insbesondere im Rahmen einer Proteinbiosynthese, generiert wird.

Die Applikation der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) kann, je nach Art der zu behandelnden Erkrankung, systemisch und/oder topisch erfolgen, wobei die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) entsprechend üblicher Applikationsformen verabreicht werden kann. So kann die Verabreichung beispielsweise oral, lingual, sublingual, bukkal, rektal oder parenteral, also unter Umgehung des Gastro-Intestinaltraktes, wie intravenös, intraarteriell, intrakardial, intrakutan, subkutan, transdermal, intraperitoneal oder intramuskulär erfolgen. Für bestimmte Krankheiten, wie intrakranielle Tumore, kann auch eine intracerebrale und/oder intrathekale Applikation bevorzugt sein.

Für die erfindungsgemäße Anwendung werden die apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt, wie zum Beispiel Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen, Lösungen, Salben, Cremes und Gele aller Art, insbesondere unter Verwendung im wesentlichen inerter und nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei sollten die erfindungsgemäß eingesetzten apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) vorteilhafterweise in einer therapeutisch wirksamen Konzentration vorhanden sein, d. h. in Men gen, die ausreichend sind, um am Wirkort den gewünschten Effekt der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) zu erzielen.

Die Dosierung der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) hängt dabei von zahlreichen Faktoren ab, wie der Art der zu behandelnden Erkrankung, dem Körpergewicht bzw. dem Applikationsweg, dem individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Formulierung, der Bioverfügbarkeit der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS), der Resorption, der Verteilung, der Ausscheidung, der Biotransformation (Entgiftung, Aktivierung) der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) sowie von dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Verabreichung erfolgt. Eine exakte Dosierung kann beispielsweise in Verbindung mit standardisierten Studien in Bezug auf Dosis/Wirkungsbeziehungen ermittelt werden. Darüber hinaus können der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) bzw. der Formulierung, welche die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) enthält, Trägersubstanzen ("Canier") zur Verbesserung der Bioverfügbarkeit, insbesondere zur Veränderung der Permeabilität der Blut/Hirn-Schranke, zugesetzt werden bzw. die Wirkstoffe in entsprechende Trägersysteme integriert bzw. inkorporiert sein. Insbesondere sollte die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt bzw. beschaffen und/oder sollte die Formulierung für die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart gestaltet sein, daß die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) vorteilhafterweise zumindest im wesentlichen selektiv in Bezug auf die betreffenden Zellen appliziert wird bzw. zur Anwendung kommt. Dies kann beispielsweise dadurch gesteuert werden, daß die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS), insbesondere durch Auswahl der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) und/oder durch spezielle Abstimmung bzw. Konfektionierung der Formulierung, vorzugsweise zumindest im wesentlichen selektiv, zumindest überwiegend oder besonders bevorzugt nur in den betreffenden Zellen, die gewünschte Wirkung entfaltet.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Formulierungen können neben mindestens einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) weitere wirksame Arzneimittel enthalten.

Weiterhin kann gegebenenfalls auch eine Behandlung der betreffenden Zellen außerhalb des Körpers, insbesondere ex vivo, in Betracht kommen. Hierbei werden gegebenenfalls die betreffenden Zellen aus dem Körper ausgeschleust bzw. explantiert, und anschließend wird die apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) auf die betreffenden Zellen einwirken gelassen. Dann erfolgt eine (Re-)Implantation der verbliebenen Zellen in den erkrankten und/oder zu therapierenden Körper. Diese Form der Behandlung eignet sich beispielsweise dann, wenn eine mitunter toxisch wirkende apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) eingesetzt werden soll bzw. zum Erreichen des gewünschten therapeutischen bzw. prophylaktischen Effekts im Rahmen einer systemischen oder lokalen Behandlung eine derart hohe Dosis eingesetzt werden müßte, die zu unterwünschten Nebenwirkungen führen könnte. Darüber hinaus kann eine derartige ex-vivo-Behandlung dann in Betracht kommen, wenn die Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs bei topischer oder systemischer Behandlung am Wirkort nicht ausreicht, um den gewünschten Effekt zu erzielen. Die ex-vivo-Behandlung kann insbesondere zur Behandlung von Gehirnzellen in Betracht kommen, weil die sogenannte Blut/Hirn-Schranke häufig einen Übertritt des Wirkstoffs aus dem Blutkreislauf in das Gehirn verhindert. Weiterhin kann auch eine ex-vivo-Behandlung von Knochenmarkszellen in Betracht kommen.

Gemäß einem zweiten Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induzierung und/oder Stimulation von Apoptose in Zellen, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, durch Beeinflussung von mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen mittels apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanzen (AIS), wobei das Verfahren die folgenden Verfahrensschritte beinhaltet:

(a) Bereitstellung und/oder Auswahl einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS), welche derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung und/oder Inter aktion mit den mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert;
(b) Verabreichung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) in therapeutisch wirksamen Mengen und/oder Zufuhr der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) zu den betreffenden Zellen in zur Erzielung des beabsichtigten Effekts ausreichenden Mengen.

Für weitere Einzelheiten und Ausgestaltungen in bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren zur Induzierung und/oder Stimulation von Apoptose in Zellen gemäß dem zweiten Gegenstand der vorliegenden Erfindung kann auf die obigen Ausführungen zu der erfindungsgemäßen Verwendung gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Gegenstand verwiesen werden, welche hier entsprechend gelten.

Weiter betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem dritten Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, durch Verabreichung mindestens einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) in therapeutisch wirksamen Mengen, wobei die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt bzw. beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung bzw. Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) (z. B. Kv1.3-Kaliumkanälen und/oder Homologen) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert. Für weitere Einzelheiten und Ausgestaltungen in bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Körpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose bzw. eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum bzw. Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsich tigt ist, kann auf die obigen Ausführungen zu der erfindungsgemäßen Verwendung gemäß dem ersten erfindungsgemäßen Gegenstand verwiesen werden, welche hier entsprechend gelten.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung – gemäß einem vierten Ge enstand der vorliegenden Erfindung – ein Verfahren zur Auffindung bzw. Identifizierung einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS), welche derart beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung und/oder Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert, wobei das Verfahren durch die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:

(a) Bereitstellung eines geeigneten Testsystems, mit dem die Wechselwirkung zwischen apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) einerseits und mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) andererseits erfaßt werden kann;
(b) Einwirkenlassen der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) oder eines entsprechenden Vorläufers auf das in Verfahrensschritt (a) bereitgestellte Testsystem;
(c) Auswertung mit geeigneten, an das jeweilige Testsystem angepaßten Methoden, insbesondere in Bezug auf das Vorliegen einer Wechselwirkung und/oder Interaktion von apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) oder entsprechendem Vorläufer einerseits und Testsystem andererseits.

Gemäß einer ersten Ausführungsform kann das in Verfahrensschritt (a) bereitgestellte Testsystem mindestens einen Kaliumkanal aufweisen, der sich gegebenenfalls in einer künstlichen oder natürlichen Membran befindet. Die Membran kann dabei insbesondere eine Lipiddoppelschicht darstellen, und der zu untersuchende Kaliumkanal kann insbesondere ein spannungsabhängiger Kaliumkanal, insbesondere ein Kv1.3-Kaliumkanal oder ein hierzu homologer Kaliumkanal, wie beispielsweise ein Kv1.1-Kaliumkanal, Kv1.2-Kaliumkanal, Kv1.4-Kaliumkanal oder Kv1.5-Kaliumkanal, sein. Diesbezüglich kann auf obige Ausführungen verwiesen werden, die hier entsprechend gelten. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können bei dieser Ausführungsform die zu untersuchenden mitochondrialen Kaliumkanäle einerseits di rekt aus solchen Zellen isoliert werden, in denen mitochondriale Kaliumkanäle (MK) natürlich bzw. endogen vorkommen, oder andererseits aus solchen Zellen isoliert werden, die im Rahmen eines Expressionssystems mitochondriale Kaliumkanäle, insbesondere nach erfolgter Injektion von Vorläufersubstanzen (wie DNA, cDNA, mRNA etc.), insbesondere in ihrer Membran funktional exprimieren, wie insbesondere Xenopus-Oocyten, CTLL-2-Zellsysteme oder C8166 B-Lymphocyten ("C8166-Zellsystem(e)"). Im Rahmen spezieller Ausgestaltungsformen des Testsystem werden insbesondere natürliche oder künstliche Membranen verwendet, die mitochondriale Kaliumkanäle (MK) als funktionellen Bestandteil enthalten. Dazu zählen beispielsweise mitochondriale Membranen und insbesondere die inneren Mitochondrienmembranen (IMM), aber auch zelluläre Membranen, die mitochondriale Kaliumkanäle im Rahmen eines natürlichen Expressionsystems, insbesondere nach Injektion mit entsprechenden Vorläufersubstanzen, enthalten, wie beispielsweise die Zellmembranen von Xenopus-Oocyten, Membranen eines CTLL-2-Zellsystems oder eines C8166-Zellsystems.

Weiterhin können im Rahmen der vorliegenden Erfindung künstliche Membranen verwendet werden, in denen isolierte mitochondriale Kaliumkanäle (MK) rekonstituiert werden. Künstliche Membranen können mit Hilfe entsprechender Standardmethoden hergestellt werden, sie besitzen eine definierte Lipidzusammensetzung, wobei natürlich vorkommende Lipide, wie Palmitoyloleoylphosphatidylcholin und/oder Dioleoylphospatidylethanolamin, bzw. natürliche Lipidgemische, wie Asolectin oder künstliche Lipide, also solche Lipide, die nicht in natürlichen Membranen vorkommen, verwendet werden können.

Natürliche Membranen, die mitochondriale Kaliumkanäle (MK) enthalten, können sowohl als intakte Membranen eines zellulären Systems, wie insbesondere Mitochondrien und/oder Mitoplasten, oder als Membranfragmente verwendet werden.

In Verfahrensschritt (c) kann die Auswertung bzw. Analyse einer möglichen Interaktion von apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) oder einem entsprechenden Vorläufer einerseits und dem Testsy stem, insbesondere den mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) andererseits mittels verschiedener Meßmethoden erfolgen.

Hierzu zählen insbesondere immunologische Nachweisreaktionen, wie z. B. Immunblotting, wobei Proteine, mitochondriale Kaliumkanäle (MK) und/oder die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) elektrophoretisch aufgetrennt werden, insbesondere mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese), und auf eine immobilisierende Matrix, beispielsweise ein Nitrocellulose-Filter, z. B. durch Elektrotransfer, übertragen werden. Anschließend kann eine immunologische Nachweisreaktion erfolgen, z. B. durch enzym- und/oder farbstoffmarkierte spezifische und/oder unspezifische (primäre und/oder sekundäre) Antikörper, mit der eine Interaktion von mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) einerseits und apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits nachgewiesen werden kann. Beispielsweise kann die Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) einerseits und apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits auch durch Coimmunpräzipitationsstudien analysiert bzw. erfaßt werden. Beispielsweise können in solchen Untersuchungen, insbesondere bei Einsatz eines Kv1.3-Kaliumkanals, z. B. kommerziell erhältliche anti-Kv1.3-Antikörper (insbesondere Antikörper, die aus Immunisierungen mit an GST-(Glutathion-S-transferase)-gekoppelten Kv1.3-Kaliumkanälen stammen) verwendet werden. Nach Immunpräzipitation der Kv1.3-Kanäle können die Präzipitate dann beispielsweise mittels Westernblot-Analysen und z. B. mit in bezug auf die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) spezifischen Antikörpern analysiert bzw. erfaßt werden. Darüber hinaus können auch Fusionsproteine der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS), die insbesondere durch eine Fusion (Kopplung) mit dem GST-Protein erhalten werden können, eingesetzt werden.

Weiterhin kann eine derartige Interaktion beispielsweise auch über physikalisch-technische Nachweismethoden erfolgen, wie beispielsweise durch eine kristallographische Röntgenstrukturanalyse.

In bezug auf die in natürlichen oder künstlichen Membransystemen vorhandenen mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) kann eine Interaktion zwischen diesen einerseits und apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits neben physikalischen und/oder chemischen Nachweismethoden auch mittels elektrophysiologischer Meßmethoden zur Bestimmung biophysikalischer Parameter untersucht werden. Hierzu zählen insbesondere die Patch-clamp-Methode und elektrophysiologische Untersuchungen an planaren Lipidmembranen, wobei insbesondere im Rahmen von Einzel- oder Vielkanalexperimenten eine Analyse elektrophysiologischer Kanalparameter, wie Ionenselektivität und/oder Kanalkinetik, wie z. B. Kanalleitwert, Kanaloffenzeit, Offenwahrscheinlichkeit des Kanals, insbesondere unter Einwirkung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS), erfolgen kann. Hierzu kann beispielsweise eine transmembrane Potentialdifferenz aufgebaut sein, insbesondere durch Anlegen einer externen Spannung und/oder durch Verwendung verschiedener (z. B. asymmetrischer) Innenkonzentrationen in bezug auf die entsprechenden Membranseiten. Im Rahmen der Patch-clamp-Methode können die Messungen in verschiedenen Modi durchgeführt werden, insbesondere im Cell-attached-, Inside-out-Modus oder im Whole-cell- bzw. Inside-out-Modus. Insbesondere können Patch-clamp-Analysen an isolierten Mitochondrien, insbesondere an Kv1.3-positiven Mitochondrien, die beispielsweise aus insbesondere transfizierten CTLL-2 und/oder C8166-Zellsystemen stammen, beispielsweise im Mitoplast-attached-Modus, durchgeführt werden. Dabei können den Versuchsansätzen apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanzen (AIS) zugegeben werden, und es kann deren mögliche Einflußnahme insbesondere auf die funktionellen Eigenschaften der mitochondrialen Kaliumkanäle (MK), wie beispielsweise Kanalleitwert, Kanaloffenzeit und Offenwahrscheinlichkeit des Kanals, analysiert werden. Insbesondere kann beispielsweise eine Blockierung bzw. Inhibierung des mitochondrialen Kaliumkanals durch die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS), die z. B. zu Änderungen der Kanalkinetik (beispielsweise geringere Kanaloffenzeit, geringerer Kanalleitwert etc.) und zu einer Veränderung des Membranpotentials führen kann, mit den zuvor beschriebenen Methoden eindeutig nachgewiesen werden.

Darüber hinaus kann eine Veränderung der Kanalkinetik, die eine Änderung des Membranpotentials zur Folge haben kann, auch über spannungsabhängige Farbstoffe nachvollzogen werden, die mit der Membran assoziiert sein können und die bei einem bestimmten Membranpotential ihre Affinität zur Membran verringern und von der Membran abgelöst werden, wie beispielsweise 3,3'-Dihexyloxacarbocyaniniodid ("DioC₆(3)").

Gemäß einer besonderen Ausgestaltung kann das Testsystem zusätzlich mindestens eine antiapoptotische Substanz (AAS) enthalten, die im Rahmen eines weiteren Verfahrensschritt dem Testsystem z. B. zwischen den Verfahrensschritten (a) und (b) bzw. zwischen den Verfahrensschritten (b) und (c) zugeführt werden kann und die auf das Testsystem einwirken gelassen wird. Dabei kann eine Wechselwirkung der antiapoptotischen Substanz (AAS) mit der apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanz (AIS) und/oder den mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) zu weiteren Änderung von Systemparametern führen, die anhand der oben genannten Methoden analysiert werden können, so daß auf diese Weise sichergestellt werden kann, daß die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) auch in Anwesenheit einer antiapoptotischen Substanz (AAS) (noch) wirksam ist.

In einer zweiten, alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Identifizierungs- bzw. Auffindungsverfahrens beinhaltet das in Verfahrensschritt (a) bereitgestellte Testsystem ein Expressionssystem, wobei das Expressionssystem einerseits eine Nukleotidsequenz (I), welche insbesondere für einen mitochondrialen Kaliumkanal (MK) codiert, und andererseits eine Nukleotidsequenz (II), die insbesondere für eine apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) codiert, aufweist. In Verfahrensschritt (c) kann dann die Interaktion der Genprodukte (Proteine) der Nukleotidsequenzen (I) und (II), insbesondere des mitochondrialen Kaliumkanals (MK) und der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS), mit Hilfe einer der oben angeführten Methoden, insbesondere über immunologische oder physikalisch-chemische Methoden erfaßt werden.

In einer weiteren Ausgestaltung dieser zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Auffindungs- bzw. Identifizierungsverfahrens können die Nukleotidsequenzen (I) und (II) zu Zwecken der in Verfahrensschritt (c) durchzuführenden Auswertung außerdem jeweils mindestens einen Bereich aufweisen, der jeweils für mindestens eine Proteindomäne codiert, welche sich zur Verwendung im Rahmen einer geeigneten Nachweismethode, insbesondere im Rahmen eines Two-Hybridsystems, eignet. Dabei ist mindestens eine Proteindomäne eine sogenannte DNA-bindende Domäne und mindestens eine weitere Proteindomäne eine Aktivierungsdomäne, wobei die DNA-bindende Domäne einerseits und die Aktivierungsdomäne andererseits an verschiedene Proteine gebunden sind. So kann beispielsweise die DNA-bindende Domäne an das Protein gebunden sein, das von der Nukleotidsequenz (I) codiert wird, also z. B. an den mitochondrialen Kaliumkanal (MK), oder es kann an die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) (Nukleotidsequenz II) gebunden sein.

Im Rahmen des Two-Hybridsystems werden insbesondere Hefezellen mit entsprechenden Vektoren cotransfiziert, wobei beispielsweise ein erster Vektor die Nukleotidsequenz (I) und die Nukleotidsequenz der DNA-bindenden Domäne aufweist und ein zweiter Vektor entsprechend die Nukleotidsequenz (II) und die für die Aktivierungsdomäne codierende Nukleotidsequenz aufweist. Die DNA-bindende Domäne sowie die Aktivierungsdomäne stellen funktionale Bestandteile eines Hefe-Transkriptionsaktivators dar, für dessen Funktion beide Domänen essentiell sind. Dabei funktioniert die Transkriptionsaktivierung aber auch, wenn beide Domänen auf verschiedenen Proteinen lokalisiert sind, solange sie in nahen Kontakt gebracht werden. Dies bedeutet, daß bei einer Interaktion der Proteine, die von der Nukleotidsequenz (I) bzw. (II) codiert werden, die DNA-bindende Domäne sowie die Aktivierungsdomäne in Kontakt gebracht werden und somit eine Transkriptionsaktivierung eines bestimmten Reportergens erfolgen kann. Als Transkriptionsaktivator kann insbesondere der GAL4-Hefetranskriptionsaktivator verwendet werden. Das aktivierte Reportergen ist dann z. B. das Lac-Z-Reportergen. Eine Aktivierung dieses Gens führt zur Synthese von β-Galactosidase, welche die Substanz X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) in Galactose und den blauen Farbstoff 5-Bromo-4-chlor-3-indol enzymatisch umsetzt. Hieraus folgt, daß eine Interaktion der entsprechenden Proteine und folglich eine Interaktion zwischen mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) einerseits und apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits dann anhand einer Blaufärbung der entsprechenden Kolonien zu erkennen ist. Beispielweise kann zur Untersuchung der Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) einerseits und apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits auch ein mammalisches Two-Hybridsystem eingesetzt werden; ein derartiges System bietet den Vorteil, daß unter Umständen als fälschlicherweise positiv erfaßte Proteininteraktionen in einem geringeren Maß als im Fall von Two-Hybridsystemen auf Hefezellenbasis auftreten.

Insbesondere können für die Analyse der in-vivo-Bedeutung der Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) einerseits und apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) andererseits physiologische Modelle, wie z. B. Knock-out-Mäuse, insbesondere in bezug auf die apoptoseinduzierende bzw. apoptosestimulierende Substanz (AIS) und/oder die antiapoptotische Substanz (AAS) defiziente Mäuse, verwendet werden. Hierbei kann beispielsweise eine Induzierung von Apoptose insbesondere anhand der Abnahme von CD-4-positiven Zellen, des Auftretens von Apoptose im Knochenmark, der Abnahme der peripheren Leukocytenzahlen, der Freisetzung von LDH (Laktatdehydrogenase) etc. erfaßt bzw. gemessen werden.

Das Verfahren zur Auffindung und/oder Identifizierung apoptoseinduzierender bzw. apoptosestimulierender Substanzen (AIS) kann im Rahmen eines vorzugsweise automatisierten Screeningverfahrens, insbesondere eines High-Throughput-Screenings (HTS), durchgeführt werden, wobei im Rahmen dieses automatisierten Screeningsystems ein hoher Durchsatz an Proben ermöglicht wird. Weiterhin können die apoptoseinduzierenden bzw. apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) oder ihre entsprechenden Vorläufer aus einer entsprechenden Substanzbibliothek (Substanzbank) bereitgestellt werden, wobei es sich hierbei insbesondere um eine Protein- oder Genbibliothek ("Protein- bzw. Genbank") handeln kann.

Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen, Variationen und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.

Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele veranschaulicht, welche die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls beschränken.
Methoden:
Zellkultur:
Die Zellen wurden in RPMI-1640 angezogen, das mit 10 % fötalem Kälberserum, 10 mM HEPES (pH 7,4), 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, 100 μM nichtessentiellen Aminosäuren, 100 Units (U)/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin (Life Technologies) und 50 μM β-Mercaptoethanol ergänzt war. Murines Interleukin-2 (IL-2) (4 U/ml, Roche) wurde den CTLL-2-Zellen (ATCC, VA, USA) alle 2 Tage gegeben. CTLL-2-Zellen wurden mittels Elektroporation mit jeweils 40 μg pJK/Kv1.3- bzw. pJK-Plasmid transfiziert und in 800 μg/ml G418 kultiviert, um stabil transfizierte Zellen zu erhalten. Sämtliche Experimente wurden mit einer gemischten Population transfizierter Zellen durchgeführt, wodurch eine Selektion bestimmter Klone vermieden wurde. Zudem wurden sämtliche Kulturen nach einer Wachstumsphase von 4 Wochen aus gefrorenen Stammansätzen wieder eingesetzt, um eine Selektion bestimmter Klone zu vermeiden. IL-2 wurde vor den Experimenten entfernt, um eine Wechselwirkung von IL-2 mit proapoptotischen Stimulantien zu vermeiden. Zu diesem Zweck wurden die Zellen in 132 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,4), 5 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 0,7 mM MgCl₂, 0,8 mM MgSO₄ (H/S), das mit 500 mM Glycin (pH 5,0) ergänzt wurde, gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen zur Erholung 3 Stunden in ein IL-2-freies Zellkulturmedium gegeben. Unter den entsprechenden Bedingungen und Zeitverläufen führte die Entfernung von IL-2 nicht zu einer signifikanten Apoptose (5±3 % Todesrate 12 Stunden nach IL-2-Entfernung).
Bax-Transfektion:
20⁶ × CTLL-2/pJK- bzw. CTLL-2/Kv1.3-Zellen wurden mit 10 μg eines Expressionsvektors für ein GFP-markiertes Aktin und 50 μg pcDNA-Bax cotransfiziert. Die Zellen wurden bei 400 V mit 5 Pulsen, die jeweils 3 ms betrugen, elektroporiert und für 16 Stunden rekultiviert. Abgestorbene Zellen wurden mittels eines Ficoll-Gradienten entfernt und die Zellen wurden für weitere 30 Stunden kultiviert. Die Zellkultivierung wurde wie oben beschrieben in Gegenwart von IL-2 durchgeführt. Zur Feststellung einer Baxinduzierten Apoptose wurden die Zellen wie oben angeführt in H/S gewaschen, das mit 500 mM Glycin ergänzt wurde, um IL-2 von den Zellen zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen zweimal in H/S gewaschen und in normalem Zellkulturmedium (ohne IL-2) für 12 Stunden kultiviert. Transfizierte Zellen wurden über eine Expression des GFP-markierten Aktins identifiziert, wobei der FITC-Kanal eines Floureszenzmikroskops verwendet wurde. Diese Zellen wurden auf Bindung von Cy3-Annexin untersucht, um Apoptose festzustellen. Kontrollexperimente mit Propidiumiodid schlossen nekrotische Zellen aus.
Patch-clamp-Experimente:
Whole-cell-Ströme (Ganzzellströme) wurden mit einem EPC-7-Verstärker (List) aufgenommen (Filterung: 1 kHz, Leserate (Samplingrate): 5 kHz). Leckströme wurden nicht abgezogen. Die Badlösung enthielt 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM HEPES (pH 7,3). Die intrazelluläre Lösung enthielt 134 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES (pH 7,3). Mitoplasten wurden mittels osmotischen Schocks isolierter Mitochondrien in 30 mM Tris/HCl (pH 7,4) hergestellt. Die Mitoplasten wurden anschließend in 134 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES (pH 7,3) äquilibriert. Zellen mit einem Durchmesser von 2-3 μm wurden mittels Videomikroskopie selektiert. Gigaseals (Gigaohm-Abdichtungen) wurden auf der Membran hergestellt. Die Daten wurden mit einer Leserate von 10 kHz aufgenommen und mit 200 Hz gefiltert. Die Ströme wurden unter asymmetrischen [K⁺]-Bedingungen in einer Badlösung mit 134 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES/K⁺ (pH 7,3) und einer Pipettenlösung mit 50 mM KCl, 84 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES/K⁺ (pH 7,3) aufgenommen. Einige Experimente wurden unter symmetrischen [K⁺]-Bedingungen mit 114 mM K-Glukonat, 20 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 10 mM EGTA, 10 mM HEPES/K⁺ (pH 7,3) durchgeführt. In den entsprechend gekennzeichneten Patch-clamp-Experimenten wurde MgTx mit einer Konzentration von 2 nM und Charybdotoxin mit einer Konzentration von 50 nM eingesetzt (beide Toxine stammen von Alamone Labs, Israel).
Kv1.3-Westernblot:
Die Zellen wurden in 25 mM HEPES (pH 7,4), 0,1 % SDS, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 1 % Triton X-100, 125 mM NaCl und jeweils 10 mM Natriumfluorid, EDTA und Natriumpyrophosphat und jeweils 10 μg/ml Aprotinin und Leupeptin (A/L) lysiert und zentrifugiert. Die Proteine wurden mittels SDS- PAGE (10 %) aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen geblottet (übertragen). Diese Membranen wurden mit 1 μg/ml anti-Kv1.3-Antiserum inkubiert, gefolgt von einer Behandlung mit alkalische-Phosphatase (AP)gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörpern. Die Erfassung wurde mit Hilfe eines Tropix-Systems (TROPIX Inc., Bedford, MA) durchgeführt.
Apoptose-Versuche:
Zur Bestimmung der DNA-Fragmentierung wurden die Zellen mit Propidiumiodid behandelt und eine Analyse der Sub-G1/S-Fraktion mittels Durchflußcytometrie vorgenommen. Die Zellen wurden fixiert und in 35 % Ethanol permeabilisiert, die RNA wurde verdaut und die Zellen wurden mit 5 μg/ml Propidiumiodid behandelt.
Zur Bestimmung der Caspase-3-Aktivität wurden die Zellen in 50 mM HE-PES (pH 7,4), 0,1 % CHAPS, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA lysiert, die Proben wurden zentrifugiert und die Überstände wurden mit 1 mM EDTA, 10 mM Glycerol ergänzt und mit 20 nM Ac-DEVD-pNA inkubiert. Die Caspase-3-Aktivität wurde anschließend mittels Spektrophotometrie bestimmt. Das Membranpotential (ΔΨ_m) wurde an ganzen Zellen durch 30minütige Inkubation in 200 pM DioC₆(3) (Molecular Probes, Eugene, Oregon) in H/S bestimmt. Die Zellen wurden gewaschen, in H/S resuspendiert und mittels Durchflußcytometrie analysiert.
Zur Bestimmung der Freisetzung von mitochondrialem Cytochrom c wurden die Zellen nach Stimulation in kaltem H/S gewaschen, für 30 Minuten bei 4 °C in 220 mM Mannitol, 68 mM Sucrose, 50 mM PIPES-KOH (pH 7,3), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5 mM Succinat-KOH (pH 7,3), 10 μm Cytochalasin B, 10 μg/ml A/L inkubiert und anschließend homogenisiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die in den Überständen befindlichen Proteine (20 μg) wurden mittels SDS-PAGE (15 %) aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die Westernblots wurden unter Verwendung eines monoklonalen, aus der Maus stammenden anti-Cytochrom c-Antikörpers (Klon 7H8.2C 12, BD Pharmingen, San Diego, CA) und des Systems Tropix ECL analysiert.
Elektronenmikroskopische Untersuchungen:
Zur Durchführung von elektronenmikroskopischen (EM)-Untersuchungen wurde zunächst ein polyklonaler, aus einem Kaninchen stammender anti-Kv1.3-Antikörper hergestellt, der spezifisch mit den extrazellulär lokalisierten Aminosäuren 204-220 (LPEFRDEKDYPASTSQD) reagiert. Die Ergebnisse wurden mit einem zweiten polyklonalen, aus einem Kaninchen stammenden anti-Kv1.3-Antikörper bestätigt. Periphere Blutlymphocyten wurden mittels Ficoll-Hypaque-Gradienten aufgereinigt, die Zellen wurden in 4 % Paraformaldehyd und 1 % Glutaraldehyd fixiert, im Ethanolgradienten dehydriert und in LR-Weiß-Harz (London Resin Company Limited, Berkshire) eingebettet. Für eine "on-grid" immunochemische Untersuchung wurden 85 nm-Abschnitte angefertigt, geblockt und mit PBS gewaschen, das 0,1 % Gelatine aus Kaltwasserfischhaut (Sigma), 0,5 M NaCl und 0,05 % Tween 20 enthielt. Die Abschnitte wurden mit aus einem Kaninchen stammenden anti-Kv1.3-Antikörper und mit aus einer Ziege stammendem goldbelegtem (6 nm) anti-Kaninchen-IgG (Aurion, Wageningen, Niederlande) markiert. Die Proben wurden mit Uranacetat behandelt und an einem JEOL 1200EX II-Elektronenmikroskop (JEOL USA, Peabody, MA) analysiert.
Durchflußcytometrieanalyse und Westernblots an isolierten Mitochondrien
Zur Durchflußcytometrie wurden die Zellen transient mit pEYFP-Mito oder pEYFP-ER (Clontech) transfiziert und nach 48 Stunden sortiert. In bezug auf die Westernblot-Experimente wurden Wildtyp-Jurkatzellen, CTLL-2/pJK- oder CTLL-2/Kv1.3-Zellen verwendet. Zur Aufreinigung der Mitochondrien wurden die Zellen für 30 Minuten bei 4 °C in 0,3 M Sucrose, 10 mM TES (pH 7,4), 0,5 mM EGTA inkubiert und anschließend homogenisiert. Zellkerne und nicht aufgeschlossene Zellen wurden mittels 5minütiger Zentrifugation bei 600·g und 4 °C pelletiert. Die Überstände, welche die Mitochondrien enthalten, wurden mittels einer 10minütigen Percoll-Gradientenzentrifugation (60 %, 30 %, 18 % Percoll im oben angeführten Puffer, 8500·g) bei 4 °C weiter aufgereinigt. Mitochondrien, die sich zwischen der 30 %- und 60 %-Schicht befanden, wurden gesammelt, zweimal gewaschen und in 50 mM PIPES-KOH (pH 7,4), 50 mM KCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 μg/ml A/L, 2 mM ATP, 10 mM Phosphokreatin, 50 μg/ml Kreatinkinase resuspendiert. Ein leicht hyperosmotisches Medium (340 mosmol, gemessen mittels Osmometeranalyse) wurde verwendet, um die Mitochondrien vor einer Schwellung zu schützen. Für die Westernblots bzw. FACS-Analyse des Kv1.3 wurden Äquivalente entsprechend 30 μg Gesamtprotein verwendet. Die Westernblots wurden unter Verwendung eines anti-Kv1.3-Antikörpers, eines AP-gekoppelten sekundären anti-Kaninchen-Antikörpers und des Chemolumineszenssystems Tropix durchgeführt. Durchflußcytometrieanalysen wurden mit Cy3-gekoppelten anti-Kv1.3-Antikörpern (Alamone Labs) an intakten Mitochondrien und an permeabilisierten Mitochondrien durchgeführt, die mit 0,75 % Triton X-100 behandelt wurden.
Cytochrom c-Freisetzung, Membranaotential und Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies bei isolierten Mitochondrien nach Behandlung mit rekombinantem Bax oder MgTx:
Zur Bestimmung der Cytochrom c-Freisetzung aus isolierten Mitochondrien wurden aufgereinigte Mitochondrien in 5 mM Succinat, 50 mM PIPES-KOH (pH 7,4), 50 Mm KCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 μM A/L, 2 mM ATP, 10 mM Phosphokreatin, 50 μg/ml Kreatinkinase (Puffer A) resuspendiert, für 20 Minuten mit 100 ng/mg GST-Bax, GST (als Kontrolle) oder 20 nM MgTX (Alamone Labs) inkubiert und wie oben beschrieben mit Hilfe von Westernblots analysiert.
Das Membranpotential der isolierten Mitochondrien wurde mittels Inkubation von aufgereinigten Mitochondrien in Puffer A mit 1 nM DioC₆(3) und Zugabe von 20 nM MgTx bestimmt. MgTx wurde während des Experiments zugegeben, und die Analyse des Membranpotentials mittels Durchflußcytometrie wurde unmittelbar nach Zugabe der Substanz aufgenommen. Eine Depolarisation der mitochondrialen Membran wurde durch eine Linksverschiebung des Fluoreszenzsignals angezeigt, die durch eine verminderte Bindung von Dio-C₆(3) hervorgerufen wurde. Eine vollständige Depolarisation der Mitochondrien wurde mit 1 μM Carbonylcyanidchlorphenylhydrazon (CCCP) für 10 Minuten bei Raumtemperatur erreicht und diente als Kontrolle für die Unversehrtheit der Mitochondrien.
Eine relativ hohe MgTx-Konzentration wurde in diesen Experimenten und in den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen an isolierten Mitochondrien verwendet, um schnelle Änderungen des mitochondrialen Membranpotentials zu erfassen und um eine Veränderung der mitochondrialen Aktivität zu ver meiden, die durch eine verlängerte in-vitro-Inkubation hervorgerufen wird. Diese Konzentrationen sind immer noch signifikant geringer als die aus der Literatur bekannten MgTx-Konzentrationen, die im μM-Bereich liegen und die zur Beeinflussung von Ca²⁺-sensitiven K⁺-Kanälen oder anderen Kv-Kanälen erfoderlich sind.
Zur Bestimmung der Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) aus isolierten Mitochondrien wurden aufgereinigte Mitochondrien für 30 Minuten bei 37 °C mit 0,8 μM Hydroethidin in Puffer A inkubiert, der mit 2 mg/ml Cytochrom c ergänzt wurde. Die aufgereinigten Mitochondrien wurden anschließend mit 20 nM MgTx behandelt und die ROS-Freisetzung mittels Änderungen der Absorption bei 550 nm mittels Spektrophotometrie bestimmt. Die Identifizierung von ROS wurde über eine Unterdrückung des Signals infolge einer Probeninkubation mit Dismutasesuperoxid (20 U/ml), Dithiothreitol (DTT, 3 mM) und Buthylhydroxytoluol (BHT, 50 μM) durchgeführt. Die Inkubation wurde durchgeführt, um ROS zu degenerieren bzw. zu neutralisieren. Die Reagenzien wurden 10 Minuten vor der MgTx-Behandlung zugegeben.
Expression des funktionalen Kv1.3 in Mitochondrien aus Lymphocyten:
Zur Bestimmung der molekularen Aufgabe von Kv1.3 in bezug auf Apoptose wurde zunächst das subzelluläre Vorkommen des Kanals bestimmt. Untersuchungen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) an frisch isolieren peripheren Lymphocyten aus dem menschlichen Blut bestätigten das Vorhandensein von Kv1.3 in der Plasmamembran und in intrazellulären Vesikeln, wie dem endoplasmatischen Retikulum, aber überraschenderweise zeigten sie auch das Vorhandensein des Kanals in Mitochondrien (1a). Eine nähere Analyse der TEM-Untersuchungen zeigte, daß Kv1.3 in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) vorkommt (1a), wobei ein Vorkommen von Kv1.3 in Fragmenten des endoplasmatischen Retikulums, die möglicherweise mit den Mitochondrien verbunden waren, ausgeschlossen wurde.
1a verdeutlicht, daß Kv1.3 in Mitochondrien exprimiert wird. Zu sehen ist eine Untersuchung mittels Transmissionselektronenmikroskopie an frisch isolierten, aufgereinigten Lymphocyten aus dem menschlichen Blut, die das Vorhandensein von Kv1.3 in Mitochondrien zeigten. Die Pfeile sind auf Goldpartikel gerichtet und zeigen auf Kv1.3 in Mitochondrien (Pfeile mit durchgehender Linie) und in der Zellmembran (Pfeil mit gestrichelter Linie). Kv1.3 ist in anderen Zellkompartimenten nicht zu erkennen. Die typische Doppelmembran und das Vorhandensein von Cristae sind kennzeichnend für die Mitochondrien. Die Experimente wurden mit zwei verschiedenen anti-Kv1.3-Anitkörpern durchgeführt: Die obere Teilabbildung von 1a zeigt einen Kv1.3-Kanal, der mit einem aus einem Kaninchen stammenden polyklonalen Antikörper, der gegen die Aminosäuren 204 bis 220 gerichtet ist, markiert ist. Die untere Teilabbildung von 1a zeigt die Markierung mit polyklonalen Antikörpern, die aus einem Kaninchen stammen und die gegen den C-Terminus von Kv1.3 spezifisch sind. Die Verstärkung war 60.000fach. Kontrollmarkierungen unter Verwendung irrelevanter Antikörper waren negativ. Um die funktionelle Expression von Kv1.3 in Mitochondrien zu zeigen, wurden Patch-clamp-Experimente an Mitoplasten von Jurkatzellen durchgeführt, von denen aus der Literatur bekannt ist, daß sie Kv1.3 endogen exprimieren.
Diese Mitoplasten wiesen einen Kationenkanal auf, der solche biophysikalische Eigenschaften besaß, die denen des Kv1.3 aus der Zellmembran ähneln. Diese Charakteristika umfassen literaturbekannte Kenngrößen, wie Kanalleitwert (1b–1d), Strom-/Spannungsbeziehung (Kennlinie) (1c), Innenselektivität (1d, 1c) und Sensitivität gegenüber dem Kv1.3-spezifischen Inhibitor Margatoxin (MgTx) (1d).
Die Kv1.3-Inaktivierungskinetiken in Mitoplasten konnten nicht untersucht werden, da das Applizieren von großen Spannungssprüngen über der Membran des Mitoplasten zu einem Verlust der elektrischen Abdichtung (Seal) führte. Die Daten belegen die Expression von Kv1.3 in den Mitochondrien üblicher Zellen.
1b–1d zeigen die funktionale Expression von Kv1.3 in Mitochondrien. Sie zeigen Einzelkanal-Patch-clamp-Aufnahmen an Mitoplasten, die aus Jurkatzellen isoliert wurden. Anhand von Kenngrößen, wie Kanalleitwert (1b–1d), Strom-/Spannungsbeziehung (1c), Innenselektivität (1b, 1c) und Sensititvität gegenüber MgTx (1d) wurde die funktionale Expression von Kv1.3 in Mitoplasten belegt. 1b zeigt repräsentative Stromspuren unter asymmetrischen [K⁺]-Bedingungen (134/50 mM K⁺) bei +30, 0, –30 und –60 mV. Zwei Kanäle angedeutet mit Status 1 und 2 in Bezug auf die offenen Kanäle) schalten häufig gemeinsam. Ein auswärts gerichteter Nettostrom bei 100 mV verdeutlicht die Kaliumselektivität. 1c zeigt die Strom-/Spannungsbeziehung des Kanals für symmetrische [K⁺]-Bedingungen (134 mM; Kreise) oder asymmetrische [K⁺]-Bedingungen (134/50 mM [K⁺]; Dreiecke). 1d zeigt die Behandlung von Mitochondrien aus Jurkatzellen mit dem Kv1.3-Inhibitor MgTx (2 nM), resultierend in der Blockade des Kanals. Entsprechende Spuren, die bei +10 mV unter asymmetrischen [K⁺]-Bedingungen aufgenommen wurden, sind ebenfalls dargestellt.
Gentransfektionsexperimente führen zum Vorhandensein von Kv1.3 in Mitochondrien:
Um zu vermeiden, daß ein anderer, aber ähnlicher mitochondrialer Kaliumkanal gemessen wurde, wurde ein genetisches Modell verwendet. Kv1.3-defiziente CTLL-2-Zellen wurden mit einem Kv1.3-Expressionsvektor (pJK-Kv1.3) (Zellen bezeichnet als CTLL-2/Kv1.3) oder mit einem Kontrollvektor (pJK) (bezeichnet als CTLL-2/pJK) transfiziert. Westernblots von Zellysaten (2a) und Patch-clamp-Untersuchungen in der Ganzzellkonfiguration (2b–2g) bestätigen die ausschließliche Expression von Kv1.3 in transfizierten Zellen und zeigen, daß die Höhe der funktionalen Expression vergleichbar mit der von Jurkatzellen ist (2b, 2c). Die biophysikalischen Eigenschaften von Kv1.3 in der Plasmamembran von CTLL-2/Kv1.3-Zellen waren mit denen von endogenem Kv1.3 in Jurkat-T-Lymphocyten identisch (2d–2g). Diese Daten zeigen die Verwendbarkeit dieses genetischen Modells zur Analyse der mitochondrialen Expression von Kv1.3.
Die Ergebnisse veranschaulichen die Expression von Kv1.3 in CTLL-2-Zellen, wobei 2a Westernblots von Zellysaten zeigt, welche die spezifische Expression von Kv1.3 in CTLL-2/Kv1.3-Zellen verdeutlichen. Das Kv1.3-Protein (65 kDa) war in Ganzzellysaten von CTLL-2/pJK-Zellen nicht vorhanden. Die Proteine wurden mittels SDS-Page (10 %) aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet und unter Verwendung von polyklonalen, aus einem Kaninchen stammenden anti-Kv1.3-Antikörpern mit Hilfe des Chemolumineszenzsystems von Tropix entwickelt. Gezeigt sind repräsentative Blots aus drei Experimenten. 2b–2g repräsentieren die biophysikalischen Eigenschaften von Kv1.3 in CTLL-2/Kv1.3-Zellen, die den biophysikalischen Eigenschaften von Kv1.3 in Jurkatzellen ähneln. 2b zeigt die Transfektion von Kv1.3 in CTLL-2-Zellen, die zu einer mittleren Amplitude des Ganzzell stroms führt, die fast identisch zu der ist, die an den Kanal endogen exprimieren Jurkatzellen ermittelt wurde. Die mittleren Amplituden des Ganzzellenstroms wurden bei 50 mV für Jurkat-, CTLL-2/Kv1.3- und CTLL-2/pJK-Zellen ermittelt.
2c zeigt die Verteilung der mittleren Hauptamplitudenströme, die bei 50 mV gemessen wurden, woraus sich ein für Jurkatzellen und CTLL-2/Kv1.3-Zellen vergleichbares Expressionsverhalten in bezug auf Kv1.3 ergibt.
Repräsentative Ganzzellströme von CTLL-2/pJK-Zellen (2d) oder CTLL-2/Kv1.3-Zellen (2e) wurden durch Änderung des Membranpotentials im Rahmen von 6 diskreten 20 mV-Schritten (–70 bis 50 mV) gewonnen. Die Spannungspulse wurden alle 45 Sekunden appliziert. Die Daten zeigen die Abwesenheit von Kv1.3 in CTLL-2-Zellen (2d) und ein für Kv1.3 typischen Strom in CTLL-2/Kv1.3-Zellen (2e).
2f zeigt die anwendungs- bzw. spannungsabhängige Inaktivierung von Kv1.3 in CTLL-2/Kv1.3-Zellen, die durch instantane Änderung des Membranpotentials von –70 auf 50 mV in Intervallen von je 1 s ermittelt wurde. Die Inaktivierungskinetiken sind mit denen identisch, die für Jurkat-T-Zellen gemessen wurden. In 2g ist die Zugabe von 50 nM Charybdotoxin (ChTx), einem Kv1.3-Inhibitor, gezeigt, der den K⁺-Strom in CTLL-2/Kv1.3-Zellen inhibiert. Ein Wechsel der 5 mM KCl enthaltenden Badlösung zu einem Medium, das 150 mM KCl enthält, führt zu einer Verschiebung des Umkehrpotentials von –70/–80 mV auf (0 ± 8) mV, was die Kaliumselektivität von Kv1.3 in CTLL-2/Kv1.3-Zellen verdeutlicht (nicht gezeigt).
Weiterhin wurden Patch-clamp-Untersuchungen an isolierten Mitochondrien durchgeführt, die aus CTLL-2/Kv1.3- und Kontroll-CTLL-2/pJK-Zellen stammten. Die Patch-clamp-Untersuchungen an Mitoplasten aus CTLL-2/Kv1.3-Zellen zeigen eine Kaliumkanalaktivität, die den Eigenschaften endogener Kv1.3-Kanäle in Jurkat-Mitoplasten ähnelt (3a–3e). Dieser Strom war bei CTLL-2/pJK-Zellen (Kontrolle) nicht vorhanden (3a). Der Kanal in Kv1.3-transfizierten CTLL-2-Zellen besaß einen Leitwert von etwa 16 bis 25 pS, eine schwache Einwärtsgleichrichtung (wie sie für Kv1.3 erwartet wurde), ein Umkehrpotential von (–20 ± 6) mV, das nahe am theoretischen Gleichgewichtspotential für Kalium (E_K) von –25 mV lag (wobei dies die Kaliumselektivität des Kanals verdeutlicht), eine Sensitivität gegenüber TEAC1 und eine Sensitivität gegenüber dem sehr spezifischen Kv1.3-Inhibitor Margatoxin (3a–3e). Die konkrete Erfassung von Kv1.3-Strömen in Mitoplasten von Kv1.3-transfizierten CTLL-2-Zellen (3a) zeigt die Expression von Kv1.3 in Mitochondrien und schließt die Erfassung eines anderen Kanals aus.
Um das Vorhandensein von Kv1.3 in Mitochondrien weiter zu untersuchen, wurden Westernblot-Untersuchungen an aufgereinigten Mitochondrien von CTLL-2/Kv1.3-, CTLL-2/pJK- und Jurkatzellen durchgeführt, die ebenso eine spezifische Expression von Kv1.3 in Mitochondrien zeigen (3f).
Anschließend wurden CTLL-2/Kv1.3- und CTLL-2/pJK-Zellen transient mit dem pEYFP-Vektor, der für ein gelbfluoreszierendes Protein (Yellow fluorescent protein, EYFP) codiert, das entweder mit der mitochondrialen Zielsequenz der Cytochrom c-Oxidase (Mito-EYFP) oder mit Calreticulin (ER-EYFP), einer Zielsequenz des endoplasmatischen Retikulums, fusioniert wurde, wie es jeweils aus der Literatur bekannt ist. Transfizierte Zellen wurden mittels Durchflußcytometrie (FACS) sortiert, die Mitochondrien wurden aufgereinigt, mit Cy3-gekoppelten anti-Kv1.3-Antikörpern markiert und mittels FACS analysiert. Die Mitochondrienpopulation war Mito-EYFP-positiv und wurde über ihr typisches Lichtstreuungsmuster identifiziert. Eine Comarkierung von Mito-EYFP und Cy3-gekoppelten anti-Kv1.3 wurde ausschließlich in Mitochondrien erfaßt, die von CTLL-2/Kv1.3-Zellen (3g) und aus Jurkatzellen (nicht gezeigt) stammen, aber nicht in solchen Mitochondrien erfaßt, die aus CTLL-2/pJK-Zellen stammen (3g). Die Transfektionsexperimente in Bezug auf das ER-EYFP-Konstrukt verdeutlichen die Abwesenheit von kontaminierenden Fragmenten des endoplasmatischen Retikulums in den mitochondrialen Präparationen (3g). Mito-EYFP-positive Partikel reagierten nicht mit einem anti-CD3-Antikörper, so daß ausgeschlossen ist, daß Kv1.3 beinhaltende Zellmembranfragmente die mitochondriale Präparation kontaminierten (3g). Diese Daten sind ein weiterer Beweis für die Expression von Kv1.3 in Mitochondrien.
Die Untersuchungen zeigen, daß die Transfektion von Kv1.3 in CTLL-2-Zellen zu einer funktionalen Expression des Kaliumkanals in Mitochondrien führt.
3a–3e zeigen Patch-clamp-Experimente an isolierten Mitoplasten aus transfizierten CTLL-2-Zellen, die eine funktionale Expression von Kv1.3-Kanälen verdeutlicht, wobei diese Kanäle denen von Mitochondrien aus Jurkatzellen ähneln.
3a zeigt repräsentative Stromspuren von CTLL-2/Kv1.3 unter symmetrischen Bedingungen, die bei 30 mV aufgenommen wurden. Untersuchungen an CTLL-2/pJK-Zellen unter denselben Bedingungen zeigen die Abwesenheit des Kv1.3-Kanals. Das Amplitudenhistogramm zeigt Stromamplituden bei geöffnetem und geschlossenen Kanal.
3b bezieht sich auf die Strom-/Spannungsbeziehung des Kanals in CTLL-2/Kv1.3-Zellen unter asymmetrischen (134/59 mM [K⁺]; Dreiecke) oder symmetrischen (134 mM [K⁺]; Kreise) Bedingungen.
3c, 3d zeigen die Behandlung von Mitochondrien, die aus CTLL-2/Kv1.3 isoliert wurden, mit TEACI (100 mM) (3c) oder mit MgTx (2 nM) ( 3d). Der Kanal wurde in beiden Fällen blockiert. Die Ströme wurden bei 10 mV (3c) oder 100 mV (3d) unter asymmetrischen [K+]-Bedingungen aufgenommen. MgTx zeigte keinen Effekt auf Mitoplasten von CTLL-2/pJK-Zellen (nicht gezeigt), so daß ein unspezifischer Effekt des Toxins ausgeschlossen ist.
3e zeigt den Zeitverlauf des mittleren Stroms von Mitoplasten aus CTLL-2/Kv1.3- und Jurkatzellen unter Einwirkung von TEACI (geschlossene Quadrate, n=3), MgTx (geschlossene Kreise, n=5) und ohne Inhibitor (offene Dreiecke, n=4). In Mitochondrien von Kv1.3-defizienten Zellen wurden vergleichbare Aktivitäten, wie sie in 3b–3e beschrieben wurden, nicht gefunden.
3f zeigt eine Westernblot-Untersuchung an aufgereinigten Mitochondrien aus CTLL-2/Kv1.3- und Jurkatzellen, welche die Expression von Kv1.3 in CTLL-2/Kv1.3-Zellen verdeutlicht, wogegen Mitochondrien aus kontrolltransfizierten CTLL-2/pJK-Zellen das 65 kDa-Kanalprotein nicht aufweisen. Zellysate wurden mittels SDS-PAGE (10 %) aufgetrennt, geblottet und unter Verwendung eines polyklonalen, aus einem Kaninchen stammenden Antikörper, eines zweiten AP-gekoppelten anti-Kaninchen-Antikörper und des Chemolumineszenzsystem von Tropix analysiert.
3g bezieht sich auf die transiente Transfektion von CTLL-2/Kv1.3- oder CTLL-2/pJK-Zellen mit pEYFP-Mito oder Kontroll-pEYFP-ER, was die Expression von Kv1.3 in Mitochondrien zeigt. Eine Markierung der aufgereinigten Mitochondrien mit Cy3-gekoppelten anti-Kv1.3-Antikörpern zeigte die Expression von Kv1.3 in Mitochondrien, die aus CTLL-2/Kv1.3-Zellen stammen und die Abwesenheit des Kanals in Mitochondrien aus CTLL-2/pJK-Zellen. Eine Kontamination der Mitochondrien mit Kv1.3-haltigen Zellmembranfragmenten oder mit Fragmenten des endoplasmatischen Retikulums wurde durch Markierung mit Cy3-gekoppelten anti-CD3-Antikörpern oder durch Transfektion eines EYFP-Proteins, das mit einer Zielsequenz des endoplasmatischen Retikulums (pEYFP-ER) fusioniert, ausgeschlossen.
Kv1.3 kommt zusammen mit bekannten mitochondrialen Ionenkanälen vor:
Um das Vorhandensein von Kv1.3 in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) eindeutig zu bestätigen, wurden Patches (Membranabschnitte), die eine Kv1.3-Aktivität aufwiesen, auf das Vorhandensein von aus der Literatur bekannten mitochondrialen Ionenkanälen untersucht. Der 107 pS-Kanal und die PTP (Permeability Transition Pore) wurden in diesen Untersuchungen als Indikatoren in bezug auf die IMM verwendet. Beide Kanäle, von denen nachgewiesen wurde, daß sie nur in der IMM vorkommen, aber nicht in der äußeren mitochondrialen Membran existieren, wurden anhand ihrer biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften identifiziert.
Die Experimente zeigen eine gleichzeitige Aktivität von Kv1.3 und dem 107 pS-Kanal in Patches, die von CTLL-2/Kv1.3-Zellen (4a) und Jurkat-Mitoplasten (nicht gezeigt) stammen, wogegen Patches von CTLL-2/pJK lediglich den 107 pS-Kanal beinhalten und keinerlei Kv1.3-Aktivität aufweisen (nicht gezeigt).
Um das gemeinsame Vorkommen von PTP und Kv1.3 zu untersuchen, wurde die Ca²⁺-Konzentration auf den Matrixseiten der Patches erhöht, die in bezug auf Kv1.3 positiv waren. Die [Ca²⁺]-Zunahme führte zu einer Aktivierung der PTP, wie sie aus der Literatur bekannt ist. Die Daten zeigen, daß 50 % der Patches, die Kv1.3 enthalten, gleichzeitig PTP aufweisen (4b). Das gemeinsame Vorkommen beider Kanäle wurde nur in Mitoplasten von CTLL-2/Kv1.3- und Jurkatzellen detektiert (4b), wogegen Mitoplasten aus CTLL-2/pJK-Zellen zwar eine PTP-Aktivität zeigten, aber keine Aktivität in bezug auf Kv1.3 aufwiesen. Einige Patches von Mitoplasten aus CTLL-2/Kv1.3- und Jurkatzellen enthielten alle drei Kanäle, d. h. Kv1.3 den 107 pS-Kanal und – nach einer [Ca²⁺]-Zunahme – die PTP. Das gemeinsame Auftreten von Kv1.3 und dem 107 pS-Kanal und/oder der PTP in Mitoplasten von CTLL-2/Kv1.3- oder Jurkatzellen verdeutlicht die funktionale Expression von Kv1.3 in der IMM.
Die Ergebnisse zeigen das gemeinsame Vorkommen von Kv1.3 mit dem 107 pS-Kanal und der PTP in der inneren Mitochondrienmembran. 4a zeigt Kv1.3 (Stufe 1) und den 107 pS-Kanal (Stufe 1''), der typisch für IMM ist, wobei die Stromaufnahme von demselben Membranpatch stammt. Die entsprechende Spur wurde bei +60mV unter symmetrischen [K⁺] (134 mM K⁺) aufgenommen. Die Amplitude des kleinen Kanals betrug 0,96 pA bei einer für den Kv1.3 bei dieser Potentialdifferenz (Spannung) angenommenen Höhe von 1 pA. Ein gemeinsames Vorkommen von Kv1.3 und des 107 pS-Kanals wurde in drei von sieben Kv1.3-haltigen Patches aus Jurkatzellen und an zwei von sieben Patches aus CTLL-2/Kv1.3-Zellen ermittelt.
In 4b wurde im Rahmen eines Patches Kv1.3 gemessen und anschließend [Ca²⁺] in der Badlösung auf eine Konzentration von 0,1 mM (150 mM KCl, 0,1 mM CaCl₂, 20 mM HEPES/K+, pH 7,3) erhöht, um den mitochondrialen Megakanal in denselben Patches, die Kv1.3 enthalten, zu erfassen. In einem solchen Experiment zeigt die Spur die Aktivität des mitochondrialen Megakanals bei einem transmembranen Potential von –20 mV. Vergleichbare Ergebnisse wurden in zwei von sieben Patches von CTLL-2/Kv1.3 und an fünf von sieben Patches von Jurkatmitoplasten ermittelt. Anschließend wurden in zwei von den sieben Patches (1 Patch an CTLL-2/Kv1.3 und 1 Patch an Jurkat) das gemeinsame Vorkommen von allen drei Kanälen ermittelt, d. h. von Kv1.3, dem 107 pS-Kanal und, nach Erhöhung von [Ca²⁺], der PTP. Der 107 pS-Kanal und die PTP wurden anhand ihrer typischen biophysikalischen und pharmakologischen Eigenschaften identifiziert.
Der mitochondriale Kv1.3 wird für die Bax-induzierte Apoptose benötigt:
Zur Analyse der funktionalen Bedeutung des mitochondrialen Kv1.3 in bezug auf die Induzierung von Apoptose wurden CTLL-2/Kv1.3- und Kontroll-CTLL-2/pJK-Zellen mit einem Expressionsvektor für Bax transfiziert und die Apoptose der Zellen bestimmt, die durch die Expression von Bax induziert wurde. Transfizierte Zellen wurden mittels Cotransfektion mit einem GFP-Aktin-Fusionskonstrukt identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, daß Kv1.3 für die Bax-induzierte Apoptose benötigt wurde. Während die Expression von Bax die Apoptose in (70 ± 10) % der Kv1.3-positiven Zellen induzierte (nach 12 Stunden), waren die Kv1.3-defizienten CTLL-2-Zellen in bezug auf Bax resistent (5a). Die Induzierung von Apoptose in CTLL-2/Kv1.3 durch zelluläre Expression von Bax wurde nicht durch die gleichzeitige Behandlung mit 2 nM MgTx beeinflußt; dies entspricht einer Dosis, die ausreicht, Kv1.3 in der Plasmamembran vollständig zu inaktivieren. Diese Konzentration liegt aber nicht an den Mitochondrien vor, da das Peptid nicht membrangängig ist. Ein Inhibitor des K_ATP-Kanals beeinflußte die Bax-induzierte Apoptose ebenfalls nicht (nicht gezeigt).
Um die Hypothese in bezug auf die wichtige Funktion von Kv1.3 im Rahmen der Apoptose eindeutig zu zeigen, wurden isolierte und aufgereinigte Mitochondrien mit rekombinantem GST-Bax oder GST als Kontrolle inkubiert. Während rekombinantes Bax eine schnelle Freisetzung von Cytochrom c aus Kv1.3-positiven Mitochondrien induzierte – was ein Zeichen für apoptotische Veränderungen in diesen Mitochondrien ist – zeigte es in bezug auf die Kv1.3-defizienten Mitochondrien keinen Effekt (5b). Diese Daten zeigen, daß das Vorhandensein des mitochondrialen Kv1.3 hinsichtlich der Baxinduzierten Apoptose notwendig ist. Im Gegensatz dazu führte die Inkubation intakter Zellen mit 100 ng/ml GST-Bax nicht zu einer signifikanten Apoptose (5b), so daß eine wichtige Funktion des membranlokalisierten Kv1.3 in bezug auf Apoptose auszuschließen ist.
Die Ergebnisse verdeutlichen, daß Kv1.3 für die Bax-induzierte Apoptose notwendig ist, wobei 5a sich auf ein Experiment bezieht, in dem Zellen mit pcDNA-Bax oder dem Kontrollvektor durch Elektroporation transfiziert wurden. Abgestorbene Zellen wurden mittels Ficoll entfernt, und in bezug auf die Bax-induzierte Apoptose wurde die Abnahme der Zellen 46 Stunden nach erfolgter Transfektion bestimmt. Die Daten zeigen, daß Kv1.3 in bezug auf die Bax-induzierte Apoptose notwendig ist. Kv1.3-defiziente Zellen waren in bezug auf die Bax-induzierte Apoptose resistent. Die Inkubation von intakten Zellen mit 2 nM MgTx, das eingesetzt wurde, um den Kv1.3 in der Plasmamembran zu inaktivieren, oder mit einem Inhibitor des K_ATP-Kanals beeinflußten die Bax-induzierte Apoptose nicht (nicht gezeigt).
5b zeigt, daß eine 20minütige Inkubation von aufgereinigten Kv1.3-positiven Mitochondrien mit 100 ng/ml rekombinantem GST-Bax zu einer Freisetzung von Cytochrom c führte, was ein Indiz für apoptotische Veränderungen in diesen Mitochondrien ist. Kontroll-GST zeigte dabei keinen Effekt. Eine Kv1.3-Defizienz verhinderte die Freisetzung von Cytochrom c aus isolierten Mitochondrien bei Inkubation mit rekombinantem Bax. Isolierte Mitochondrien wurden wie zuvor beschrieben behandelt, die Proben wurden für 10 Minuten zentrifugiert, um die Mitochondrien zu pelletieren. Den Überständen wurden 5 × SDS-Probenpuffer zugegeben, und die Überstände wurden mittels SDS-PAGE (2,5 %) aufgetrennt und mit anti-Cytochrom c-Antikörpern behandelt und mit dem Chemolumineszenssystem Tropix entwickelt.
Die Inaktivierung des mitochondrialen Kv1.3 führt zu apoptotischen Veränderungen:
Um die Funktion von Kv1.3 in Bezug auf die Apoptose weiter zu studieren, wurden Kv1.3-positive CTLL-2/Kv1.3-Zellen und Kv1.3-defiziente CTLL-2-Zellen mit 100 ng/ml TNFα (Tumor-Nekrose-Faktor α), 1 μM Staurosporin oder 20 μM C₆-Ceramid inkubiert. Während Kv1.3-transfizierte Zellen mit DNA-Fragmentierung (6a, 6b), Caspase-3 (DEVDase)-Aktivierung (6c), mitochondrialer Cytochrom c-Freisetzung (6d), Verlust des mitochondrialen Membranpotentials (6e) und morphologischen Veränderungen, die typisch für Apoptose sind, reagierten, wiesen CTLL-2/pJK-Zellen eine Resistenz auf und zeigten keine dieser Veränderungen (6a–6e).
Die Untersuchungen zeigen, daß die Expression von Kv1.3 in Bezug auf eine TNFα-, Staurosporin- und C₆-Ceramid-vermittelte Apoptose erforderlich ist. Die Behandlung von CTLL-2/Kv1.3-Zellen mit 20 μM C₆-Ceramid, 1 mM Staurosporin oder 100 ng/ml TNFα führte zu einer DNA-Fragmentierung (6a–6b), Caspase-3-Aktivierung (6c), Cytochrom c-Freisetzung (6d) und Veränderung in ΔΨ_m (6e), wogegen Zellen ohne Kv1.3 nicht auf apoptotische Stimulantien reagieren. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SD (Standardabweichung) bzw. repräsentative Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Zur Bestimmung der Bedeutung des mitochondrialen Kv1.3-Kanals in Bezug auf die Apoptose wurden aufgereinigte, isolierte Mitochondrien aus CTLL-2/Kv1.3- oder CTLL-2/pJK-Zellen verwendet. Um die Inaktivierung von Kv1.3-Kanälen, die bekanntermaßen bei Stimulierung mit CD95 oder Behandlung mit zellulärem C₆-Ceramid auftritt, nachzuahmen, wurden isolierte Mitochondrien mit 20 nM MgTx inkubiert, einen aus der Literatur bekannten, spezifischen Inhibitor des Kv1.3. Wenn mitochondriale Kv1.3-Kanäle in Bezug auf Apoptose notwendig sind, sollten nur Kv1.3-exprimierende Mitochondrien sensitiv gegenüber MgTx sein und folglich solche Veränderungen aufweisen, die typisch für Apoptose sind.
Die Untersuchungen zeigen, daß die Expression von Kv1.3 in Bezug auf eine TNFα-, Staurosporin- und C₆-Ceramid-vermittelte Apoptose erforderlich ist. Die Behandlung von CTLL-2/Kv1.3-Zellen mit 20 μM C₆-Ceramid, 1 mM Staurosporin oder 100 ng/ml TNFα führte zu einer DNA-Fragmentierung (6a–6b), Caspase-3-Aktivierung (6c), Cytochrom c-Freisetzung (6d) und Veränderung in ΔΨ_m (CCCP als Kontrolle) (6e), wogegen Zellen ohne Kv1.3 nicht auf apoptotische Stimulantien reagieren. Gezeigt sind die Mittelwerte ± SD (Standardabweichung) bzw. repräsentative Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten.
MgTx induzierte eine schnelle und deutliche Freisetzung von Cytochrom c aus Kv1.3-positiven Mitochondrien, wogegen Kv1.3-defiziente Mitochondrien keine Reaktion aufwiesen (7a). Die Behandlung der Mitochondrien mit einem Inhibitor für K_ATP-Kanäle zeigte in Bezug auf isolierte Mitochondrien keinen Effekt und führte nicht zur Apoptose. Entsprechende Ergebnisse wurden für das mitochondriale Membranpotential bei MgTx-Behandlung festgestellt: Kv1.3-positive Mitochondrien zeigen unter Einfluß von MgTx eine transiente Hyperpolarisation, die in Kv1.3-defizienten Mitochondrien nicht vorhanden war (7b, 7c). Dies ist mit biophysikalischen Überlegungen konsistent, die eine Hyperpolarisation in Bezug auf das mitochondriale Membranpotential bei Inhibierung von Kv1.3 ergeben. Der Hyperpolarisation folgte eine deutliche Depolarisation von ΔΨ_m, die durch Cyclosporin A (7c) inhibiert wurde. Da Cyclosporin A die PTP bekanntermaßen inhibiert, ist die beobachtete Depolarisation hauptsächlich auf eine Aktivierung der PTP zurückzuführen. Eine Aktivierung der PTP und die ΔΨ_m-Veränderungen traten in Kv1.3-defizienten Mitochondrien nicht auf, die mit MgTx behandelt wurden (7c). In Bezug auf unbehandelte Mitochondrien war ΔΨ_m hoch und während des Experiments konstant, was darauf hindeutet, daß die Isolationsschritte die Mitochondrien nicht beschädigten.
Darüber hinaus zeigten nur Kv1.3-positive Mitochondrien mit der schnellen und anhaltenden Freisetzung von ROS (7d), was bei vielen Formen der Apoptose vorkommt – eine Reaktion auf MgTx. Kv1.3-Defizienz in CTLL-2/pJK-Zellen führte nicht zu einer ROS-Freisetzung aus Mitochondrien bei Behandlung mit MgTx (7d). Eine Zugabe des Radikalfängers Butylhydroxytoluol (BHT) oder der reduzierenden Substanz Dithiothreitol (DTT) in Verbindung mit MgTx führte zu einer Unterbindung der ROS-Freisetzung (7d) und zu einer Unterbindung der Cyclosporin A-sensitiven Depolarisation (nicht gezeigt).
Diese Daten zeigen, daß die Inhibierung des mitochondrialen Kv1.3 zu Veränderungen in Mitochondrien führt, die eine zentrale Rolle in vielen Formen der Apoptose spielen.
Die Ergebnisse verdeutlichen, daß die Inhibierung des mitochondrialen Kv1.3 zu Veränderungen in Mitochondrien hervorruft, die Apoptose vermitteln können bzw. die für apoptopische Prozesse charakteritisch sind.
Die Inhibierung von Kv1.3 in isolierten Mitochondrien durch MgTx führt zu einer Cytochrom c-Freisetzung (7a), einer ΔΨ_m Hyperpolarisation, gefolgt von einer Depolarisation (7b, 7c) und einer ROS-Freisetzung (7d), während Kv1.3-defiziente Mitochondrien aus CTLL-2/pJK keine Reaktion auf MgTx zeigten (7a–7d). 7a bezieht sich auf die 30minütige Inkubation von isolierten und aufgereinigten Mitochondrien in 20 nM MgTx und zeigt die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien von CTLL-2/Kv1.3 oder CTLL-2/pJK, die mit Hilfe von Westernblots bestimmt wurde. Die Westernblots zeigen den Cytochrom c-Gehalt in Mitochondrien vor und nach Behandlung mit MgTx als auch den entsprechenden Gehalt an Cytochrom c im Überstand derselben Mitochondrienpräparationen. 7b zeigt eine repräsentative FACS-Analyse von ΔΨ_m an isolierten Mitochondrien, die mit 1 nM DioCb(3) markiert wurden. Isolierte Mitochondrien wurden für 0,5 und 20 Minuten in 20 nM MgTx inkubiert und Aliquots in Bezug auf Veränderungen von ΔΨ_m analysiert. Die FACS-Daten wurden viermal reproduziert.
7c zeigt eine quantitative Analyse (n=3) des mitochondrialen Membranpotentials von isolierten Mitochondrien vor und nach Applizierung von MgTx. Die Daten zeigen eine anfängliche Hyperpolarisation von ΔΨ_m, gefolgt von einer deutlichen Depolarisation. Die Zugabe von Cyclosporin A, einem PTP-Inhibitor, verhindert eine mitochondriale Depolarisation, aber nicht die anfängliche Hyperpolarisation. Hieraus folgt, daß PTP in bezog auf die primäre Hyperpolarisation die mitochondriale Depolarisation sekundär vermittelt. In Mitochondrien aus CTLL-2/pJK-Zellen wurden nach Behandlung mit MgTx keine Veränderungen von ΔΨ_m ermittelt. Das mitochondriale Membranpotential wurde unter Verwendung von 1 nM DioCb(3) bestimmt und in Experimenten unter Verwendung von TMRE bestätigt. Eine vollständige Depolarisation bei Verwendung von CCCP diente als Kontrolle in bezug auf die Unversehrtheit der Mitochondrien. Gezeigt sind Mittelwerte ± SD der Fluoreszensintensitäten, die mittels Durchflußcytometrie gemessen wurden und die als freigewählte Fluoreszenzeinheiten angegeben sind. Die Fluoreszenzintensitäten wurden unter Einsatz einer Becton-Dickinson Software ausgewertet, um den Mittelwert aus 10.000 Signalen, die pro Analyse gemessen wurden, zu bestimmen. Die Untersuchungen wurden jeweils 4 mal wiederholt.
7d zeigt die MgTx-induzierte ROS-Freisetzung aus isolierten Kv1.3-positiven Mitochondrien, die in Kv1.3-defizienten Mitochondrien nicht zu sehen war. ROS wurde durch Präinkubation der isolierten Mitochondrien mit 3 mM DTT und 50 μM BHT neutralisiert. Gezeigt sind Mittelwerte ± SD aus vier unabhängigen Experimenten.
Nachweis der Wechselwirkung bzw. Interaktion der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AISI mit dem in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) lokalisierten Kv1.3-Kaliumkanal:
Um die Funktion des in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) lokalisierten Kv1.3-Kaliumkanals weitergehend zu analysieren, wurde untersucht, ob Kv1.3 direkt mit einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) wechselwirkt bzw. interagiert. Als Testsubstanz wurde Bax verwendet, ein Mitglied der proapoptotisch wirksamen Bc1-2-Familie.
Im Rahmen der experimentellen Vorgehensweise wurden Kv1.3-positive Zellen mit CD95 stimuliert und anschließend lysiert sowie Bax immunpräzipitiert und die Wechselwirkung bzw. Interaktion mittels eines Westernblots getestet. Die Ergebnisse zeigen eine Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen Kv1.3 und Bax nach proapoptotischer Stimulation (8a).
8a zeigt die Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen Kv1.3 und Bax, wobei die Zellen über CD95 stimuliert wurden. Immunpräzipate von Bax wurden mittels SDS-PAGE (7,5 %) aufgetrennt und die Proteine auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Nach Inkubation mit polyklonalen alkalische-Phosphatase (AP)-gekoppelten sekundären Antikörpern erfolgte die Auswertung bzw. Entwicklung mit dem Chemolumineszenssystem Tropix.
Diese Coimmunpräzipitationsversuche ergänzen die Ergebnisse in 5b, die zeigen, daß nur Kv1.3-positive, aber nicht Kv1.3-defiziente Mitochondrien nach Inkubation mit einem GST-Bax-Fusionsprotein Cytochrom c freisetzen.
Die Coimmunpräzipitationsversuche wurden mit einer unabhängigen Methode, nämlich der Analyse von Molekülwechselwirkungen bzw. -interaktionen im Hefe-Two-Hybridsystem bestätigt (8b). 8b zeigt ein Experiment unter Verwendung des Hefe-Two-Hybridsystems. Durch die Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen Kv1.3 und Bax kommt es zur räumlichen Nähe der fusionierten Aktivierungsdomäne und der DNA-bindenden Domäne des Hefe-Transkriptionsaktivators, der dadurch aktiviert wird und die Expression von β-Galaktosidase induziert. Durch Anfärbung mit β-Gal erfolgt eine Blaufärbung (in der schwarz/weiß-Darstellung der 8b als Graufärbung dargestellt) der Kolonien, in denen eine Wechselwirkung bzw. Interaktion zwischen Kv1.3 und Bax stattgefunden hat. In Zellen, die mit Bax und einem Kontrollvektor transfiziert wurden, konnten keine blauen Kolonien gefunden werden.

Claims

Verwendung mindestens einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) zur Herstellung eines Medikaments oder Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung und/oder Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ist, daß sie mit dem mitochondrialen Kaliumkanal (MK) in der Weise wechselwirkt und/oder interagiert, insbesondere durch physikalische und/oder chemische Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) an den mitochondrialen Kaliumkanal (MK), daß in den betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert wird.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie den mitochondrialen Kaliumkanal (MK) blockiert und/oder inhibiert.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) die physiologischen Parameter der betreffenden Zellen, insbesondere deren Metabolismus, Osmolarität, pH-Wert, Membranpotential und dergleichen, derart beeinflußt, daß die biophysikalischen Eigenschaften, insbesondere Kanalleitwert, Kanaloffenzeit und/oder Kanaloffenwahrscheinlichkeit, der mitochondrialen Kaliumkanäle (MK) der betreffenden Zellen in der Weise verändert werden, daß in den betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie zusätzlich mit antiapoptotischen Substanzen (AAS), insbesondere in den betreffenden Zellen natürlich vorkommenden und/oder körpereigenen antiapoptotischen Substanzen (AAS), in der Weise wechselwirkt und/oder interagiert, daß die antiapoptotische Wirkung der antiapoptotischen Substanzen (AAS) inhibiert oder zumindest gehemmt wird und/oder die antiapoptotischen Substanzen (AAS) inaktiviert werden, insbesondere durch physikalische und/oder chemische Bindung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) an die antiapoptotischen Substanzen (AAS).
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) als solche keine antiapoptotischen Eigenschaften aufweist und/oder in bezug auf die betreffenden Zellen eine Apoptose nicht inhibiert oder hemmt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) aus der Gruppe von Kohlenwasserstoffen, Nucleinsäuren, Lipiden oder Peptiden, wie Oligopeptiden, Polypetiden und Proteinen, sowie Derivaten der vorgenannten Verbindungen, wie Lipoproteinen, ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) aus der Gruppe von spezifischen Inhibitoren und/oder Kanalblockern des Kv1.3-Kaliumkanals der inneren Mitochondrienmembran (IMM), wie Margatoxin und/oder Shigatoxin sowie deren Homologen und Derivaten, ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) ein proapoptotisch wirkendes Peptid, insbesondere Oligopeptid, Polypeptid oder Protein, insbesondere ein proapoptotisch wirkendes Peptid der Bc1-2-Familie, wie Bax, Bak, Bok, Bim, Bmf Bad, Bik, Bid, Bc1-x_s, Noxa oder Puma sowie deren Homologe und Derivate, ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der mitochondriale Kaliumkanal (MK) in der inneren Mitochondrienmembran (IMM) lokalisiert ist und/oder daß der mitochondriale Kaliumkanal (MK) ein spannungsabhängiger Kaliumkanal ist und/oder daß der mitochondriale Kaliumkanal (MK) ein Kv1.3-Kaliumkanal oder ein hierzu homologer Kaliumkanal, insbesondere ein Kv1.1-Kaliumkanal, Kv1.2-Kaliumkanal, Kv1.4-Kaliumkanal oder Kv1.5-Kaliumkanal, ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung der betreffenden Zellen außerhalb des Körpers, insbesondere ex-vivo, durchgeführt wird, insbesondere indem die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) auf die betreffenden Zellen einwirken gelassen wird, gefolgt von einer (Re-)Implantation der auf diese Weise behandelten Zellen in den erkrankten und/oder zu therapierenden Körper.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) in einer Menge verabreicht wird, die ausreicht, um eine Wechselwirkung und/oder Interaktion dieser Substanz mit den mi tochondrialen Kaliumkanälen (MK) hervorzurufen derart, daß in den betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) in Form eines entsprechenden Vorläufers, insbesondere als Prodrug, appliziert wird, welcher nachfolgend, insbesondere in den betreffenden Zellen, in situ die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) generieren kann, insbesondere durch chemische und/oder physikalische Umwandlung, Genexpression, Proteinbiosynthese und dergleichen.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) systemisch und/oder topisch appliziert oder zugegeben wird.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die zu behandelnde Erkrankung eine parasitäre Erkrankung, eine bakterielle Erkrankung, eine virale Erkrankung wie, Hepatitis oder AIDS, oder eine Tumor- oder Krebserkrankung, insbesondere eine benigne oder maligne Tumorerkrankung, insbesondere eine Krebserkrankung, wie Darmkrebs (Kolonkarzinom), Brustkrebs (Mammakarzinom), Ovarialkarzinom, Uteruskarzinom, Lungenkrebs, Magenkrebs, Leberkrebs, Pankreaskarzinom, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Prostatakrebs, Hodenkrebs, Knochenkrebs, Hautkrebs, Kaposi-Sarkom, Hirntumor, Myosarkom, Neuroblastom, Lymphom und Leukämie, ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie die Kv1.3-Kaliumkanäle der inneren Mitochondrienmembran (IMM) der betreffenden Zellen blockiert und/oder inhibiert.
Verfahren zur Induzierung und/oder Stimulation von Apoptose in Zellen, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, durch Beeinflussung von mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen mittels apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanzen (AIS), gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: (a) Bereitstellung und/oder Auswahl einer apoptoseinduzierenden und/-oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS), welche derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung und/oder Interaktion mit den mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert; (b) Verabreichung der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) in therapeutisch wirksamen Mengen und/oder Zufuhr der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) zu den betreffenden Zellen in zur Erzielung des beabsichtigten Effekts ausreichenden Mengen.
Verfahren nach Anspruch 17, gekennzeichnet durch die Merkmale des kennzeichnenden Teils eines oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren zur prophylaktischen und/oder kurativen Behandlung von Erkrankungen des menschlichen oder tierischen Köpers, bei denen eine insbesondere übermäßige Verminderung von Apoptose und/oder eine insbesondere übermäßige Erhöhung von Zellwachstum und/oder Zellteilung auftritt oder die hiermit in Zusammenhang stehen oder bei denen eine therapeutisch gezielte Apoptose der betreffenden Zellen beabsichtigt ist, durch Verabreichung mindestens einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) in therapeutisch wirksamen Mengen, dadurch gekennzeichnet, daß die apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) derart ausgewählt und/oder beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung und/oder Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert.
Verfahren nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch die Merkmale des kennzeichnenden Teils eines oder mehrerer der Ansprüche 1 bis 16.
Verfahren zur Auffindung und/oder Identifizierung einer apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS), welche derart beschaffen ist, daß sie durch Wechselwirkung und/oder Interaktion mit mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) der betreffenden Zellen eine Apoptose dieser Zellen induziert und/oder stimuliert, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte: (a) Bereitstellung eines geeigneten Testsystems, mit dem die Wechselwirkung zwischen apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) einerseits und mitochondrialen Kaliumkanälen (MK) andererseits erfaßt werden kann; (b) Einwirkenlassen der apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanz (AIS) oder eines entsprechenden Vorläufers auf das in Verfahrensschritt (a) bereitgestellte Testsystem; (c) Auswertung mit geeigneten, an das jeweilige Testsystem angepaßten Methoden, insbesondere in bezug auf das Vorliegen einer Wechselwirkung und/oder Interaktion von apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) oder entsprechendem Vorläufer einerseits und Testsystem andererseits.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das in Verfahrensschritt (a) bereitgestellte Testsystem einen Kaliumkanal, gegebenenfalls in einer künstlichen oder natürlichen Membran, insbesondere einer Lipid-Doppelschicht, umfaßt, insbesondere wobei der Kaliumkanal ein spannungsabhängiger Kaliumkanal, insbesondere ein Kv1.3-Kaliumkanal oder ein hierzu homologer Kaliumkanal, wie ein Kv1.1-Kaliumkanal Kv1.2-Kaliumkanal Kv1.4-Kaliumkanal oder Kv1.5- Kaliumkanal, sein kann, und daß in Verfahrensschritt (c) die Erfassung der Interaktion von apoptoseinduzierender und/oder apoptosestimulierender Substanz (AIS) oder entsprechendem Vorläufer einerseits und Testsystem, insbesondere Kaliumkanal des Testsystems, andererseits mittels elektrophysiologischer Meßmethoden und/oder mittels physikalischer und/oder chemischer Nachweismethoden, insbesondere spannungsabhängiger Farbstoffreaktionen, und/oder mittels immunologischer Nachweisreaktionen, insbesondere Immunblotting, erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den Verfahrensschritten (a) und (b) und/oder zwischen den Verfahrensschritten (b) und (c) ein zusätzlicher Verfahrensschritt zwischengeschaltet ist, bei dem mindestens eine antiapoptotische Substanz (AAS) auf das Testsystem einwirken gelassen wird.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das in Verfahrensschritt (a) bereitgestellte Testsystem ein Expressionssystem umfaßt, wobei das Expressionssystem einerseits eine Nucleotid-Sequenz (I), welche für einen mitochondrialen Kaliumkanal (MK) codiert, und andererseits eine Nucleotid-Sequenz (II), welche für eine apoptoseinduzierende und/oder apoptosestimulierende Substanz (AIS) codiert, umfaßt, und daß in Verfahrensschritt (c) die Interaktion der exprimierten Genprodukte (Proteine) der Nukleotid-Sequenzen (I) und (II) erfaßt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Nucleotid-Sequenzen (I) und (II) zu Zwecken der in Verfahrensschritt (c) durchzuführenden Auswertung außerdem jeweils mindestens einen Bereich aufweisen, welcher jeweils für mindestens eine Proteindomäne codiert, welche sich zur Verwendung im Rahmen einer geeigneten Nachweismethode, insbesondere im Rahmen einesTwo-Hybridsystems, eignet, insbesondere wobei im Rahmen eines Two-Hybridsystems mindestens eine Proteindomäne eine DNA-bindende Domäne und mindestens eine weitere Proteindomäne eine Aktivierungsdomäne ist, wobei DNA-bindende Domäne einerseits und Aktivierungsdomäne andererseits an verschiedene Proteine gebunden sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren im Rahmen eines vorzugsweise automatisierten Screeningverfahrens, insbesondere High-Throughput-Screening (HTS), durchgeührt wird und/oder daß die apoptoseinduzierenden und/oder apoptosestimulierenden Substanzen (AIS) oder ihre entsprechenden Vorläufer aus einer entsprechenden Substanzbibliothek (Substanzbank), insbesondere Protein- oder Genbibliothek (Protein-/Genbank), bereitgestellt werden.