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Die
vorliegende Erfindung betrifft 5'-3'-Bi-Fluorophor-markierte
Sonden zum Nachweis von Analyten, insbesondere von Nukleinsäuren, insbesondere
für die
konfokale Fluoreszenzspektroskopie.
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Der
Nachweis von Nukleinsäuremolekülen in einer
Probe erfolgt üblicherweise
durch Hybridisierung unter Verwendung von spezifischen Sonden. Eine
Möglichkeit
zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung der Hybridisierungsprodukte
besteht darin, die Sonden mit Fluoreszenz-Farbstoffgruppen zu markieren, wobei
die Markierungsgruppen in der Regel an das 5'-Ende der Nachweissonde gebunden werden.
Nach Anregung mit einer spezifischen Wellenlänge emittieren die Fluoreszenz-Markierungsgruppen
Photonen, die mittels geeigneter Detektionsmethoden nachgewiesen
werden können.
Das Auftreten einer Fluoreszenz-Markierung korreliert mit dem Vorhandensein
der nachzuweisenden Nukleinsäure
in der Probe. Durch Verwendung geeigneter Methoden können auch
Anzahl und Größe der Hybridisierungsprodukte
bestimmt werden.
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Die
Anzahl der von den markierten Sonden emittierten Photonen hat einen
erheblichen Einfluss auf die Sensitivität des Nachweisverfahrens. Während mit
roten Fluoreszenz-Markierungsgruppen markierte Sonden in vielen
Fällen
eine ausreichende Sensitivität
[ausgedrückt
in IPM (Impulse pro Molekül)]
aufweisen, ist die Quantenausbeute bestimmter Fluoreszenzfarbstoffe
im grünen
Bereich aufgrund von Elektronentransfervorgängen zwischen Nukleobasen und
der Markierungsgruppe verringert. Um diese Wechselwirkungen zu vermindern,
wurden Spacermoleküle,
z.B. Hexaethylenglycol-Moleküle,
zwischen der Sondensequenz und den Markierungsgruppen angebracht,
die zu einer geringfügigen,
aber für
viele Anwendungen nicht ausreichenden Verbesserung führen.
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Die
der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin,
die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und insbesondere
Sonden zum Nachweis von Analyten, z.B. von Nukleinsäuren mit verbesserter
Sensitivität
bereitzustellen.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch eine Sonde der allgemeinen Strukturformel (I) 5'-M-(Z)n-X1-X2-
... Xm-(Z)n,-M'-3' worin X1, X2 ... und Xm jeweils für ein beliebiges Nukleotid
oder Nukleotidanalogon stehen und worin die Sequenz X1-X2- ... Xm für eine mit
einem Analyten bindefähige
Sondensequenz steht,
Z jeweils unabhängig für ein Pyrimidin-Nukleotid oder
-Nukleotidanalogon steht,
M und M' Fluoreszenzmarkierungsgruppen darstellen,
n
und n' jeweils unabhängig ganze
Zahlen von 1 bis 15 darstellen und
m eine ganze Zahl entsprechend
der Länge
der Sondensequenz darstellt.
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Die
erfindungsgemäßen Nachweissonden
enthalten neben der Fluoreszenz-Markierungsgruppe
am 5'-Ende eine
zweite Markierungsgruppe am 3'-Ende.
Diese beiden Fluoreszenzfarbstoff-Moleküle sind von der mit der Zielnukleinsäure hybridisierenden
Sondensequenz durch Oligo-Pyrimidin-Sequenzen als Spacer getrennt. Die IPM-Werte
der erfindungsgemäßen Sonden
sind bis zu 10 mal höher
als diejenigen der aus dem Stand der Technik bekannten Sonden.
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Die
erfindungsgemäßen Sonden
können
aus Nukleotid- und Nukleotidanalogon-Bausteinen wie aus dem Stand
der Technik bekannt, z.B. PNA- oder LNA-Bausteinen, aufgebaut sein.
Vorzugsweise sind die mit dem Analyten bindefähige Sondensequenz bildenden
Einheiten X
1, X
2 ...
und X
m jeweils unabhängig ausgewählt aus Einheiten der allgemeinen
Strukturformel (II) oder Salzen davon
worin
B eine natürliche oder
nicht-natürliche
Nukleobase darstellt,
R einen Rest, ausgewählt aus H, OH, Halogen, -CN,
-C
1-C
6-Alkyl, -C
2-C
6-Alkenyl, -C
2-C
5-Alkinyl, -O-C
1-C
6-Alkyl, -O-C
2-C
6-Alkenyl, -O-C
2-C
6 Alkinyl, -SH,
-S-C
1-C
6-Alkyl,
-NH
2, -NH(C
1-C
6-Alkyl) und -N(C
1-C
6-Alkyl)
2, darstellt,
-X
jeweils unabhängig
einen Rest, ausgewählt
aus -O-, -S-, -NR'- und CR'
2 darstellt,
-Y
jeweils unabhängig
einen Rest, ausgewählt
aus =O und =S, darstellt und
-Y' jeweils unabhängig einen Rest, ausgewählt aus
-OR', -SR', -(NR')
2 und
-CH(R')
2 darstellt,
wobei
R' jeweils unabhängig für H oder
C
1-C
3 Alkyl steht.
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Die
Nukleobase B kann eine natürliche
Nukleobase, z.B. Adenin, Cytosin, Uracil, Guanin oder Thymin, oder
eine nicht-natürliche
Nukleobase, z.B. 2,6-Diaminopurin, 7-Deazaadenin, 7-Deazaguanin,
ein 5-modifiziertes Thymin- oder Cytosin-Derivat oder Isoguanin
(6-Amino-2-hydroxy-purin), sein.
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Der
Substituent R an der 2'-Position
ist vorzugsweise H, so dass die Einheiten X1,
X2 ... und Xm zumindest
teilweise 2'-Desoxynukleotide
sind. Andere bevorzugte Bedeutungen für R sind Alkyl, Alkoxy, Alkenyl
und Halogen.
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Die
Einheiten der erfindungsgemäßen Sonde
sind durch Phosphodiestergruppen oder modifizierte Phosphodiestergruppen
verknüpft,
worin bei den Einheiten der Strukturformel (II) X vorzugsweise jeweils
unabhängig
-O-, -S- oder -NH- darstellt, Y vorzugsweise jeweils unabhängig =O
oder =S darstellt und Y' vorzugsweise
jeweils unabhängig
-OH, -SH, -NH2, -CH3 oder
-C2H5 darstellt.
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In
der Strukturformel (I) steht Z für
ein Pyrimidin-Nukleotid oder ein Pyrimidin-Nukleotidanalogon, z.
B. ein Thymidin- oder/und Cytidin-Nukleotid bzw. Nukleotidanalogon.
Vorzugsweise steht Z für
ein Thymidin-Nukleotid, so dass (Z)n und
(Z)n, vorzugsweise jeweils mindestens ein
Thymidin-Nukleotid
enthalten. Besonders bevorzugt bedeutet Z jeweils ein Thymidin-2'-Desoxynukleotid. Grundsätzlich kann
Z jedoch auch eine Nukleotidanalogon-Einheit, wie zuvor beschrieben,
darstellen.
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Die
Fluoreszenz-Markierungsgruppen der Sonde (I) sind vorzugsweise jeweils
unabhängig
ausgewählt
aus Rhodaminen, Fluoresceinen, Oxazinen, Cyaninen, Bodipy Farbstoffen,
Alexa-Farbstoffen etc. Besonders bevorzugt sind Oxazine gemäß PCT/EP03/02981.
Besonders bevorzugt sind M und M' grüne Fluoreszenz-Markierungsgruppen,
wie etwa Rhodamingrün,
Tetramethylrhodamin, Rhodamin 6G, Oregon grün, Bodipy 493, Alexa 488, deren
Quantenausbeute bei üblichen
Sondenkonstrukten durch Elektronentransfer-Prozesse gequencht wird.
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Die
Fluoreszenz-Markierungsgruppen M und M' sind vorzugsweise gleich. In bestimmten
Ausführungsformen
können
M und M' jedoch
auch verschieden sein. In diesem Fall unterscheiden sich M und M' vorzugsweise in
mindestens einem Messparameter, z.B. Emissionswellenlänge oder/und
Abklingzeit, so dass ein separater Nachweis von M und M' möglich ist.
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Bei
den Sonden (I) ist die Länge
der Spacer n und n' jeweils
unabhängig
eine ganze Zahl von 1–15, vorzugsweise
eine ganze Zahl von 3–10,
besonders bevorzugt etwa 5.
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Die
Länge m
der mit den Analyten bindenden Sondensequenz wird günstigerweise
so gewählt,
dass unter den herrschenden Testbedingungen eine spezifische und
nachweisbare Bindung des Analyten möglich ist. Üblicherweise stellt m eine
ganze Zahl von 10–90,
vorzugsweise von 12–50
dar.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer oder
mehrerer Sonden der Strukturformel (I) in einem Verfahren zum Nachweis
eines Analyten, z.B. einer Nukleinsäure, in einer Probe, wobei
das Verfahren den Nachweis einer Bindung von einer oder mehreren
Sonden an den Analyten umfasst. Vorzugsweise umfasst das Verfahren
den Nachweis einer Hybridisierung von einer oder mehreren Sonden
mit einer Zielnukleinsäure.
Gegebenenfalls kann das Verfahren einen quantitativen Nachweis hinsichtlich
der Anzahl der Hybridisierungsprodukte in der Probe oder/und der
Größe der Hybridisierungsprodukte
umfassen. Es sind jedoch auch andere Nachweisverfahren möglich, z.B.
Nachweis der Bindung von einer oder mehreren Sonden an ein Protein,
wie etwa der Bindung von Aptameren an Proteine.
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Die
hervorragende Sensitivität
der erfindungsgemäßen Nachweissonden
erlaubt deren Einsatz auch bei sehr geringen Analytkonzentrationen.
So wird bei Verwendung der erfindungsgemäßen Sonden eine ausreichende
Nachweissensitivität
selbst dann erzielt, wenn die Konzentration des nachzuweisenden
Analyten ≤ 10–9 M
in der Probe beträgt.
Vorzugsweise beträgt
die Konzentration des nachzuweisenden Analyten 10–10 bis 10–15 M.
Die hohe Sensitivität
der erfindungsgemäßen Sonden
erlaubt einen Nachweis bei derart geringen Konzentrationen auch
ohne vorhergehende Amplifikation des Analyten in der Probe.
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Der
nachzuweisende Analyt ist vorzugsweise eine Nukleinsäure, z.B.
DNA oder RNA beliebiger Herkunft, die beispielsweise aus Prokaryonten,
insbesondere pathogenen Prokaryonten, Archea oder Eukaryonten, insbesondere
Säugern,
wie etwa dem Menschen, stammen kann. Besonders bevorzugt stammt
die nachzuweisende Nukleinsäure
aus einer humanen Probe, z.B. einer Körperflüssigkeit, einer Gewebeprobe
etc.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure um eine RNA aus einer biologischen
Probe oder eine daraus synthetisierte nicht-amplifizierte cDNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei der nachzuweisenden Nukleinsäure
um eine nicht-amplifizierte genomische DNA.
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Der
Nachweis der Fluoreszenz der erfindungsgemäßen Sonden kann mit einer beliebigen
Messmethode, z.B. mit einer orts- oder/und zeitaufgelösten Fluoreszenz-Spektroskopie
erfolgen. Bevorzugt wird eine Messmethode verwendet, die in der
Lage ist, in einem sehr kleinen Volumenelement, Fluoreszenzsignale
bis hinunter zu Einzelphotonenzählung
zu erfassen.
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Beispielsweise
kann die Detektion mittels konfokaler Einzelmoleküldetektion,
wie etwa durch Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie
erfolgen, wobei ein sehr kleines, vorzugsweise ein konfokales Volumenelement,
beispielsweise 0,1 × 10–5 bis
20 × 10–12 l
der Probenflüssigkeit,
dem Anregungslicht eines Lasers ausgesetzt wird, das die in diesem
Messvolumen befindlichen Fluoreszenzmarkierungen zur Emission von
Fluoreszenzstrahlung anregt, wobei die emittierte Fluoreszenzstrahlung
aus dem Messvolumen mittels eines Photodetektors gemessen wird,
und eine Korrelation zwischen der zeitlichen Veränderung der gemessenen Emission
und der relativen Beweglichkeit der beteiligten Moleküle erstellt
werden kann, so dass bei entsprechend starker Verdünnung einzelne
Moleküle
in dem Messvolumen identifiziert werden können.
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Auf
Einzelheiten zur Verfahrensdurchführung und apparative Details
zu den für
die Detektion verwendeten Vorrichtungen wird auf die Offenbarung
des europäischen
Patentes 0 679 251 verwiesen. Die konfokale Einzelmolekülbestimmung
ist weiterhin bei Rigler und Mets (Soc. Photo-Opt. Instrum. Eng. 1921 (1993), 239 ff.)
und Mets und Rigler (J. Fluoresc. 4 (1994), 259–264) beschrieben.
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Alternativ
bzw. zusätzlich
kann die Detektion auch durch eine zeitaufgelöste Abklingmessung, ein sogenanntes
Time Gating erfolgen, wie beispielsweise von Rigler et al., "Picosecond Single
Photon Fluorescence Spetroscopy of Nucleic Acids", in: "Ultrafast Phenomena", D.H. Auston, Ed., Springer 1984, beschrieben.
Dabei erfolgt die Anregung der Fluoreszenzmoleküle innerhalb eines Messvolumens
und anschließend – vorzugsweise
in einem zeitlichen Abstand von ≥ 100
ps – das Öffnen eines
Detektionsintervalls am Fotodetektor. Auf diese Weise können durch
Raman-Effekte erzeugte Hintergrundsignale ausreichend gering gehalten
werden, um eine im Wesentlichen störungsfreie Detektion zu ermöglichen.
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Besonders
bevorzugte Detektionsverfahren und -vorrichtungen sind z.B. in PCT/EP01/07190, PCT/EP01/05408,
PCT/EP01/05410, PCT/EP01/05409, PCT/EP01/13120, PCT/EP02/02582, PCT/EP02/05866,
PCT/EP02/13390, PCT/EP02/09610 und PCT/EP03/02713 beschrieben.
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Besonders
bevorzugt erfolgt die Verfahrensdurchführung derart, dass man mehrere
Fluoreszenz-markierte Sonden, wobei es sich mindestens bei einer
Sonde um eine erfindungsgemäße Sonde
handelt, mit jeweils verschiedener Sequenz und verschiedenen Markierungsgruppen
zum Nachweis eines einzigen Analyten verwendet. In diesem Fall wird
das Vorhandensein des Analyten in der Probe vorzugsweise durch Vorhandensein
einer Korrelation zwischen dem Auftreten verschiedener Sonden entsprechend
der gleichzeitigen Bindung an den Analyten bestimmt. Vorzugsweise
wird ein solches Verfahren als Kreuzkorrelationsbestimmung durchgeführt, wie
z.B. bei Schwille et al. (Biophys. J. 72 (1997), 1878–1886) und
Rigler et al. (J. Biotechnol. 63 (1998), 97–109) beschrieben. Andere bevorzugte
Nachweismethoden umfassen die Koinzidenz-Analyse, die Principle
Component-Analyse (PCA), die Fluoreszenzintensitäts-Distributionsanalyse (FIDA)
und die Fluoreszenzintensitäts-Multiple-Distributionsanalyse
(FIMDA).
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird eine Sondenkombination verwendet, die eine erfindungsgemäße doppelt
markierte Sonde, die grüne
Fluoreszenz-Markierungsgruppen trägt, zusammen mit einer Sonde,
die eine oder mehrere rote Fluoreszenz-Markierungsgruppen trägt, beinhaltet.
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Schließlich betrifft
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten
in einer Probe, umfassend das Inkontaktbringen der Probe mit einer
oder mehreren erfindungsgemäßen Sonden
unter Bedingungen, bei denen eine Bindung der einen oder mehreren
Sonden an den nachzuweisenden Analyten erfolgen kann, und Bestimmen,
ob eine Bindung stattfindet oder nicht.
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Vorzugsweise
ist der Analyt eine Nukleinsäure
und der Nachweis umfasst eine Hybridisierung der einen oder mehreren
Sonden mit der nachzuweisenden Nukleinsäure. Besonders bevorzugt wird
die nachzuweisende Nukleinsäure
vor dem Inkontaktbringen mit der oder den Sonden nicht einer Amplifikation,
z.B. einer PCR, unterzogen.
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Weiterhin
soll die Erfindung durch das nachfolgende Beispiel erläutert werden.
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Beispiel: Verwendung von
Bi-fluorophor-markierten Oligonukleotiden
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Im
Folgenden wird die hervorragende Sensitivität der Nachweissonden verdeutlicht.
Es werden zwei unterschiedliche grüne Sonden mit identischer Sequenz
verwendet. Im ersten Fall handelt es sich um eine 5'-Rhodamingrün einfach markierte Sonde,
im anderen Fall um eine erfindungsgemäße 5'-3' Rhodamingrün doppelt
markierte Sonde, die einen Thymidin-Spacer von jeweils 5 Nukleotiden
Länge sowohl
für den
3' als auch 5'-Farbstoff beinhaltet.
Die Sequenz der Nachweissonde ist spezifisch für die PGK-1-Sequenz (Accession-Number:
V00572). Zur Bestimmung der unteren Nachweisgrenze werden jeweils
eine grüne
markierte Sonde und eine rote markierte Sonde (ebenfalls PGK-1 spezifisch)
in Lösung
gleichzeitig an ein PGK-1-spezifisches cDNA-Fragment (Länge: 969
nt) hybridisiert. Die Hybridisierung erfolgt in 6 X SSC, 0,06% NP40
Puffer bei 60°C über einen
Zeitraum von 8 Stunden. Dabei werden unterschiedliche Konzentrationen
des PGK-1 Fragments (0,0 nM PGK-1 bis 2 nM PGK-1) verwendet. Die
Hybridisierungsprodukte werden mittels Kreuzkorrelationsspektroskopie
analysiert.
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Das
Ergebnis dieser Analyse ist in den 1 und 2 gezeigt. In 1 (Vergleichsbeispiel) wird
die Kombination einer 5'-einfach
markierten grünen
Sonde und einer 5'-einfach
markierten roten Sonde zum Nachweis von PGK-1 cDNA in Konzentrationen
von 2 nM, 1 nM, 0,5 nM, 0,2 nM und 0 nM untersucht.
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In 2 (Erfindungsbeispiel) wird
die Kombination einer erfindungsgemäßen 5'3'-doppelt
markierten grünen
Sonde mit Thymidinspacer und einer 5'-einfach markierten roten Sonde zum
Nachweis von PGK-1 cDNA in Konzentrationen von 0,05 nM, 0,03 nM,
0,02 nM, 0,01 nM, 0,005 nM und 0 nM untersucht.
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Die
Sondenkonzentration in 1 ist
2,0 nM und in 2 0,1
nM.
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Ein
Vergleich der 1 und 2 zeigt eindrucksvoll die
Vorteile der erfindungsgemäßen Nachweissonden.
Während
die untere Nachweisgrenze der einfach markierten Sonde bei 0,2 nM
PGK-1 liegt (1), kann bei
Verwendung der doppelt markierten sonde die Sensitivität deutlich
auf 5 nM PGK-1 erhöht
werden (2).