-
Die Erfindung betrifft ein Analyseverfahren
zur Untersuchung von spezifischen Bindungsereignissen zwischen ersten
und zweiten Makromolekülen
unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Makromolekülen und ein
Analysedevice zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
-
Zur Untersuchung von spezifischen
Bindungsreaktionen werden heutzutage sogenannte Arrays eingesetzt,
die regelmäßig auf
Oberflächen
angeordnete Makromoleküle
zum Zwecke der Analyse aufweisen. Zum Beispiel kann ein solches
Array unterschiedliche Spots in regelmäßiger Anordnung aufweisen,
so daß sich
die einzelnen Spots durch Art bzw. spezifische Eigenschaften der
Makromoleküle
unterscheiden. Die Spots können
Proteine oder DNA umfassen, die mit in einer Lösung befindlichen Molekülen (Probenlösung) spezifische
Wechselwirkungen eingehen. Die Probenlösung wird auf die Oberfläche aufgebracht
und kann dann mit den auf der Oberfläche vorhandenen Molekülen reagieren.
Anschließend
wird bei bekannten Verfahren die Probenlösung zumindest zum Teil wieder
von der Oberfläche
abgewaschen. An denjenigen Orten, an denen eine spezifische Bindung
zwischen den Probenmolekülen
und den Molekülen
an der Oberfläche
stattfand, sind die Probenmoleküle
nach diesem Waschvorgang noch vorhanden. Durch Fluoreszenzmarkierung, radioaktive
Markierung oder Änderung
der Masse oder der elektrischen Eigenschaften kann die Position
bestimmt werden, an der Probenmoleküle nach dem Waschvorgang noch
vorhanden sind, so daß diese
identifiziert werden können.
Hieraus lassen sich entweder bei bekannten Probenmolekülen Informationen über die Eigenschaften
der an der Oberfläche
gebundenen Molekülen,
oder bei bekannter Anordnung von Molekülen an der Oberfläche Informationen über das
Vorhandensein oder die Eigenschaften von Probenmolekülen in der Lösung erhalten.
-
So werden bei der Untersuchung von
DNA-Sequenzen sogenannte DNA-Microarrays eingesetzt („DNA-Microarrays", herausgegeben von
M. Schena, Oxford University Press, 1999). Bei solchen DNA-Microarrays
und ähnlichen
Hybridisierungsexperimenten werden fluoreszenzmarkierte oder radioaktiv
markierte Makromoleküle
unbekannter Sequenz zu deren Identifizierung auf unmarkierte Makromoleküle bekannter
Sequenz hybridisiert. Eine Untersuchung von unmarkierten DNA-Makromolekülen in biologischen
Proben ist so nicht möglich.
-
US 6,380,377 B1 beschreibt Hybridisierungsanalyseverfahren
unter Einsatz von haarnadelförmig
an einer Oberfläche
gebundenen DNA-Strängen,
die mit ggf. komplementären
Strängen
in Verbindung gebracht werden. Die haarnadelförmige Struktur bricht auf und
kann mit einer Markierung versehen werden, die mit geeigneten Maßnahmen
ausgelesen werden kann. Die Markierung kann nur dann an den oberflächengebundenen
Strang binden, wenn zuvor ein entsprechendes Aufbrechen der Haarnadelstruktur
durch Hybridisierung stattgefunden hat.
-
Zur markierungsfreien Untersuchung
von DNA-Molekülen
werden sogenannte „Molecular
Beacons" verwendet,
wie es in „Molecular
Beacons: Probes that fluoresce upon hybridization", S. Tyagi und F.R.
Kramer, Nature Biotechnology, Vol. 14, März 1996, Seiten 303ff. oder
US 6,150,097 beschrieben
ist. Solche „Molecular Beacons" sind DNA-Stränge, die
an einem Ende einen Fluoreszenzfarbstoff (z. B. 5-(2'-aminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic
acid (EDANS)) und am anderen Ende einen komplementären fluoreszenzunterdrückenden
Bestandteil („Quencher", z. B. 4-(4'-dimethylaminophenylazo)
benzoic acid (DABCYL)) angebunden haben. Die Fluoreszenz wird dabei
durch Energieübertrag
an den Quencher verhindert. Über
die Ausbildung einer haarnadelförmigen
Sekundärstruktur
werden die beiden an den Enden gebundenen Stoffe in unmittelbare
Nachbarschaft zueinander gebracht, so daß das Signal des Fluoreszenzfarbstoffes
unterdrückt
(„gequencht") wird. Hybridisiert
nun ein komplementäres
Makromolekül,
das nicht markiert sein muß,
an das „Molecular
Beacon", löst sich
die Haarnadelstruktur auf und das Fluoreszenzsignal wird detektierbar.
Experimente dieser Art werden als Einzelexperimente in Lösung durchgeführt. Sollen
mehrere Proben parallel untersucht werden, werden unterschiedliche „Molecular
Beacons" an verschiedenen
Positionen auf einer Oberfläche
aufgebracht. Dazu werden die „Molecular
Beacons" über einen
dritten chemischen Anker an die Oberfläche gebunden („Molecular
Beacons for DNA Biosensors with Micrometer to Submicrometer Dimensions", X. Liu, W. Farmerie,
S. Schuster und W. Tan, Analytical Biochemistry 283, Seiten 56-63
(2000); „Designing
a Novel Molecular Beacon for Surface-Immobilized DNA Hybridization
Studies", X. Fang,
X. Liu, S. Schuster und W. Tan, J. Am. Chem. Soc. 1999, Vol. 121,
Seiten 2921-2922).
-
Bei den zuletzt geschilderten Verfahren
müssen
die „Molecular
Beacons" also mit
einem fluoreszenzunterdrückenden
Bestandteil an einem Ende versehen werden.
-
Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, ein Analyseverfahren und ein Analysedevice bereitzustellen,
die es ermöglichen,
einfacher herzustellende bzw. zu synthetisierende „Molecular
Beacons"-Strukturen
zu verwenden.
-
Diese Aufgabe wird mit einem Analyseverfahren
mit den Merkmalen des Anspruches 1 und einem Analysedevice mit den
Merkmalen des Anspruches 9 gelöst.
Die Unteransprüche
sind auf vorteilhafte Ausgestaltungen gerichtet.
-
Bei dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren
wird eine Oberfläche
bereitgestellt, auf der sich zumindest ein Meßbereich mit daran gebundenen
fluoreszenzmarkierten ersten Makromolekülen befindet. Die Oberfläche ist
weiterhin zumindest teilweise mit einer fluoreszenzunterdrückenden
Schicht versehen. Die gebundenen Makromoleküle weisen eine Sekundärstruktur
auf, die derart ausgebildet ist, daß ihre Fluoreszenz von der fluoreszenzunterdrückenden
Schicht unterdrückt
wird, wenn die fluoreszenzmarkierten ersten Makromoleküle keine
spezifische Bindung mit anderen Makromolekülen eingegangen sind. Die Fluoreszenz
wird nicht unterdrückt,
wenn die ersten Makromoleküle
eine spezifische Bindung mit zweiten Makromolekülen eingegangen sind. Eine
Probenflüssigkeit
mit zweiten Makromolekülen
wird auf den Meßbereich
aufgebracht und die Fluoreszenz gemessen. Der Meßbereich bzw. die Meßbereiche
können
sich auf der fluoreszenzunterdrückenden Schicht
befinden. Die fluoreszenzunterdrückende
Schicht muß nicht
auf der ganzen Oberfläche
vorhanden sein, sondern nur im Bereich des Meßbereiches bzw. der Meßbereiche
und muß nicht
zusammenhängend sein.
-
Durch die Sekundärstruktur der ersten Makromoleküle, die
an der Oberfläche
gebunden sind, ist gewährleistet,
daß keine
Fluoreszenz auftritt, solange keine Bindung mit zweiten Makromolekülen stattgefunden hat,
da die Fluoreszenz des fluoreszenzmarkierten Bestandteiles durch
die fluoreszenzunterdrückende Schicht
auf der Oberfläche
unterdrückt
wird. Bringt man nun andere Makromoleküle in einer Probenflüssigkeit mit
den ersten Makromolekülen
in Verbindung, so können
diese eine spezifische Bindung bzw. Hybridisierung eingehen, wenn
sie zu den ersten Makromolekülen
komplementäre
Bestandteile aufweisen. Durch diese spezifische Bindung wird die
Sekundärstruktur
der ersten Makromoleküle
aufgelöst
und der fluoreszenzmarkierte Teil des ersten Makromoleküles wird
von der fluoreszenzunterdrückenden
Schicht entfernt. Die Fluoreszenz wird nicht mehr unterdrückt und
kann gemessen werden. Bei dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren ist es
nicht notwendig, daß ein „Quencher" an dem DNA-Molekül gebunden
sein muß.
Die Synthetisierung und Bereitstellung ist also stark vereinfacht.
-
Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung
wird die Sekundärstruktur
der ersten Makromoleküle
derart ausgewählt,
daß die
Fluoreszenzmarkierung an einem Ende des ersten Makromoleküles vorgesehen
ist und die Bindung an der Oberfläche an dem anderen Ende des
ersten Makromoleküles
stattfindet. Die Sekundärstruktur
wird bei dieser Ausführungsform
derart ausgewählt,
daß ohne
spezifische Bindung der ersten Makromoleküle an zweite Makromoleküle das erste
Makromolekül
schleifenförmig
bzw. haarnadelförmig
ist.
-
Eine solche Haarnadelstruktur wirkt
wie folgt. Ein Ende des ersten Makromoleküles ist fluoreszenzmarkiert.
Am anderen Ende ist das erste Makromolekül an der fluoreszenzunterdrückenden
Schicht gebunden. Durch die haarnadel- bzw. schleifenförmige Bindung
ist – wenn
keine spezifische Bindung an andere Makromoleküle vorliegt – gewährleistet,
daß das
fluoreszenzmarkierte Ende des ersten Makromoleküles sich in direkter Nähe der fluoreszenzunterdrückenden
Schicht befindet. Die Fluoreszenz wird also unterdrückt. Ein
komplementäres
Gegenstrangmolekül,
das in dem Schleifenbereich der Haarnadel an dem ersten Makromolekül hybridisiert, öffnet die
Schleife und entfernt so den fluoreszenzmarkierten Teil des ersten
Makromoleküles
von der fluoreszenzunterdrückenden
Schicht. Dadurch steigt die Fluoreszenzintensität an und die Hybridisierung kann
nachgewiesen werden. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Bindung
des ersten Makromoleküles
an der Oberfläche über das
dem fluoreszenzfarbstoffmarkierten Ende entfernte Ende des ersten
Makromoleküles geschieht,
da dann die Entfernung zwischen dem Fluoreszenzfarbstoff und der
fluoreszenzunterdrückenden Schicht
im Falle der Hybridisierung mit dem zweiten Makromolekül maximal
werden kann.
-
Die fluoreszenzunterdrückende Schicht
kann eine auf der Oberfläche
verteilte molekulare Schicht aus Quenchermolekülen (z. B. DABCYL) sein. Besonders
einfach läßt sich
der fluoreszenzunterdrückende
Effekt jedoch mit einer Goldschicht erreichen, die auf einfache
Weise z. B. mit lithographischen Techniken auf der Oberfläche aufgebracht
werden kann.
-
Das Verfahren eignet sich z. B. zur
Untersuchung von Nukleinsäuren,
z. B. DNA oder RNA. Besonders geeignet ist das erfindungsgemäße Verfahren
zur Untersuchung von DNA-Strängen,
z. B. um zu untersuchen, ob in einer Flüssigkeit zu auf der Oberfläche komplementäre DNA-Stränge vorhanden
sind oder umgekehrt.
-
Um mehrere unterschiedliche Arten
von ersten Makromolekülen
zu untersuchen bzw. zur Untersuchung einzusetzen, werden bei einer
bevorzugten Ausgestaltung mehrere Meßbereiche eingesetzt, die mit
unterschiedlichen ersten Makromolekülen funktionalisiert sind.
So kann z. B. untersucht werden, mit welcher Art von ersten Makromolekülen Makromoleküle in einer
Probenflüssigkeit
hybridisieren.
-
Bei einer solchen Ausgestaltung unter
Verwendung von mehreren Meßbereichen
kann eine Probenflüssigkeit
mit Makromolekülen über alle
Meßbereiche
gleichzeitig gebracht werden. Gerade bei begrenzter Menge von Probenflüssigkeit
ist eine Ausgestaltung vorteilhaft, bei der die Probenflüssigkeit
als Tropfen von einem Meßbereich
zum anderen bewegt wird. Dazu wird bei einer bevorzugten Ausgestaltung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
der Impulsübertrag
einer Oberflächenschallwelle
verwendet, die auf der Oberfläche
erzeugt wird. Ebenso kann der Impulsübertrag einer Oberflächenschallwelle
zur Durchmischung bzw. Homogenisierung der Probenflüssigkeit
verwendet werden, um die Reaktion zu beschleunigen bzw. gleichmäßig auszugestalten.
-
Die Messung der Fluoreszenz kann
nach Entfernen der Probenflüssigkeit
geschehen. Die an den ersten Makromolekülen gebundenen zweiten Makromoleküle verbleiben
nach dem Waschschritt an der Oberfläche und ermöglichen so die Vermessung der
Fluoreszenz der ersten Makromoleküle. Besonders vorteilhaft läßt sich
das erfindungsgemäße Verfahren
jedoch einsetzen, wenn die Messung der Fluoreszenz während der Reaktion
untersucht werden soll. Auf diese Weise ist die Analyse der Reaktionskinetik
möglich.
Da nur solche ersten Makromoleküle
fluoreszieren, die mit zweiten Makromolekülen hybridisiert haben, gibt
es nur ein sehr schwaches oder gar kein Hintergrundsignal, das durch
Fluoreszenz ungebundener erster Makromoleküle hervorgerufen werden würde.
-
Ein erfindungsgemäßes Analysedevice eignet sich
zum Einsatz mit dem erfindungsgemäßen Analyseverfahren. Es weist
eine Oberfläche
auf, die zumindest teilweise mit einer fluoreszenzunterdrückenden Schicht
versehen ist. Weiterhin weist die Oberfläche zumindest einen Meßbereich
auf, in dem fluoreszenzmarkierte erste Makromoleküle gebunden
sind. Diese ersten Makromoleküle
haben die Eigenschaften, wie sie oben bereits mit Bezug zum erfindungsgemäßen Analyseverfahren
beschrieben sind. Ein solches Analysedevice kann an die spezifischen Gegebenheiten
angepaßt
sein oder in großer
Anzahl vorgefertigt sein. Dabei ist das erfindungsgemäße Analysedevice
mit einem Fluoreszenzscanner bzw. einem Fluoreszenzmikroskop auslesbar.
-
Die Fluoreszenz kann dabei entweder
in Aufsicht oder aber unter Anregung von unten durch eine semitransparente
oder nicht-vollflächige
fluoreszenzunterdrückende
Schicht gemessen werden.
-
Eine vorteilhafte Ausgestaltung des
Analysedevices umfaßt
eine Goldschicht als fluoreszenzunterdrückende Schicht.
-
Besonders vorteilhaft ist ein Analysedevice,
das mehrere Meßbereiche
aufweist, die mit unterschiedlichen ersten Makromolekülen funktionalisiert
sind, um eine Paralleluntersuchung möglich zu machen.
-
Eine vorteilhafte Weiterbildung sieht
eine piezoelektrische Oberfläche
oder die Oberfläche
eines piezoelektrischen Festkörpers
vor, auf dem zumindest ein Interdigitaltransducer zur Erzeugung
von Oberflächenschallwellen
vorgesehen ist. Der Impulsübertrag
einer solchen Oberflächenschallwelle
kann verwendet werden, um auf der Oberfläche befindliche Probenflüssigkeit
zu durchmischen bzw. zu homogenisieren. Besonders vorteilhaft ist
es, wenn der mindestens eine Interdigitaltransducer so angeordnet
ist, daß die
Ausbreitungsrichtung einer mit ihm erzeugten Oberflächenschallwelle
entlang der Verbindung zwischen mindestens zwei Meßbereichen
angeordnet ist. So kann durch den Impulsübertrag einer mit dem Interdigitaltransducer
erzeugten Oberflächenschallwelle
ein Probenflüssigkeitstropfen
von einem Meßbereich
zum nächsten
Meßbereich
transportiert werden. Selbstverständlich können mehrere Interdigitaltransducer
vorgesehen sein, um ein Array von Meßbereichen auf diese Weise
abzudecken.
-
Bei entsprechender Auswahl der Materialien
(z. B. Gold) können
die fluoreszenzunterdrückende Schicht
und die Interdigitaltransducer in einem lithographischen Herstellungsschritt
gefertigt werden. Schließlich
können
Netzwerkstrukturen reali siert werden, die aufgrund ihrer Benetzungseigenschaften
zusätzlich
eine Führung
der Flüssigkeit
gewährleisten.
Netzwerkstrukturen zur Führung
von Flüssigkeitstropfen
sind allgemein in
DE
100 62 246 C1 beschrieben.
-
Besondere Ausgestaltungen der Erfindung
werden anhand der anliegenden Figuren im Detail erläutert. Die
Figuren sind schematischer Natur und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu.
Dabei zeigt:
-
1:
eine Querschnittsansicht durch einen Aufbau zur Durchführung des
erfindungsgemäßen Verfahrens,
-
2:
eine Draufsicht auf einen Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren,
und
-
3:
eine Detailvergrößerung in
seitlicher Ansicht.
-
1 zeigt
ein Substrat, z. B. ein Glas-Mikroskopslide oder ein transparentes
Plättchen 1 aus
piezoelektrischem Material, z. B. LiNbO3,
bzw. ein Substrat mit einer piezoelektrischen Beschichtung. Die
Größe beträgt für ein Glasslide
z. B. 25 mm × 75
mm. Ein Plättchen
kann z. B. eine Ausdehnung von 20 mm × 20 mm haben. Die Dicke beträgt z. B.
500 μm bis
1 mm. Auf dem Substrat befindet sich eine dünne Goldschicht 2. Durch
eine Abdeckung 10 ist über
Abstandshalter 12 ein Probenflüssigkeitsaufnahmeraum 8 abgeschlossen. Auch
die Abdeckung 10 kann z. B. aus Glas bestehen. Nicht gezeigt
sind Befüllöffnungen
für den
Probenaufnahmeraum, die z. B. trichterförmige Öffnungen in der Abdeckung 10 sein
können.
-
13 und 14 symbolisieren
nur schematisch einen an sich bekannten Aufbau zur Messung der Fluoreszenz
innerhalb des Probenflüssigkeitsaufnahmeraumes 8.
Es kann sich dabei um Fluoreszenzmikroskope, inverse Fluoreszenzmikroskope
oder Scanner handeln. Sind Substrat 1 und Deckel 10 transparent,
kann die Fluoreszenz in Durchsicht gemessen werden. Ist nur der
Deckel 10 oder das Slide 1 transpa rent, wird die
Fluoreszenz von der gleichen Seite angeregt, wo sie auch detektiert
wird.
-
Auf dem Goldfilm 2 befinden
sich Meßbereiche 6.
Auf einem Aufbau können
sich dabei mehrere Tausend solcher Meßbereiche z. B. in rasterförmiger Anordnung
befinden. Dabei können
sich die einzelnen Meßbereiche 6 in
ihrer Funktionalisierung unterscheiden. Die Funktionalisierung wird
durch Makromoleküle 4 dargestellt,
die im wesentlichen für
jeden einzelnen Meßbereich 6 untereinander
gleich sind. Von einem Meßbereich
6 zum anderen Meßbereich 6 unterscheiden
sich hingegen die Makromoleküle 4.
In 1 dargestellt ist ein
Zustand, in dem an die Makromoleküle 4 weitere Makromoleküle 5 gebunden
sind, wie es weiter unten im Detail näher beschrieben wird.
-
2 zeigt
eine Draufsicht auf ein geöffnetes
erfindungsgemäßes Device.
Sichtbar ist die Oberfläche des
Festkörpers 1 mit
der Goldbeschichtung 2. Auf der Goldbeschichtung 2 befinden
sich die Meßbereiche 6, von
denen wiederum nur einzelne mit der Bezugsziffer 6 versehen
sind. Auf dem Meßbereich 6 sind
schematisch dargestellt die Makromoleküle 4. Wiederum sind
nur einige Meßbereiche
dargestellt, wobei sich auf einem Substrat mehrere Tausend derartiger
Meßbereiche
in regelmäßiger Anordnung
befinden können. 2 zeigt einen Aufbau mit
einem Interdigitaltransducer 18, der aus fingerartig ineinander
greifenden Elektroden 20, die über Zuführungselektroden 22 angesteuert
werden können,
besteht. Solche Interdigitaltransducer sind aus der Oberflächenwellenfiltertechnologie
bekannt und können
auf einem piezoelektrischen Festkörper bzw. einer piezoelektrischen
Oberfläche
Oberflächenschallwellen
anregen. Dazu wird über
elektrische Zuleitungen oder drahtlos eine Frequenz von einigen
MHz bis einigen 100 MHz in den Interdigitaltransducer eingespeist. Um
Oberflächenschallwellen
anregen zu können,
wird als Festkörper
z. B. piezoelektrisches Lithiumniobat gewählt. Mit Hilfe des Impulsübertrages
einer mit dem Interdigitaltransducer erzeugten Oberflächenschallwelle, die
sich senkrecht zu den fingerartig ineinander greifenden Elektroden 20 ausbreitet,
kann ein Flüssigkeitstropfen 16 auf
der Oberfläche
in Richtung des Pfeiles 18 bewegt werden. So kann der Tropfen 16 über die
Reihe von Meßbereichen 6 sukzessive
bewegt werden.
-
Sind die Meßbereiche in Form eines Arrays
angeordnet, können
mehrere Interdigitaltransducer 18 vorgesehen sein, die
in verschiedenen Richtungen Oberflächenschallwellen abstrahlen,
um so einen Flüssigkeitstropfen 16 beliebig
auf der Oberfläche
bewegen zu können.
-
Interdigitaltransducer lassen sich
z. B. mit lithographischen Techniken aus Gold auf der Oberfläche herstellen,
so daß die
als fluoreszenzunterdrückende
Schicht dienende Goldschicht 2 gleichzeitig mit dem Transducer 18 in
einem entsprechenden Lithographieschritt hergestellt werden kann.
-
Die Verwendung des Impulsübertrages
von Oberflächenschallwellen
zur Bewegung von Flüssigkeitstropfen
auf Oberflächen
ist allgemein z. B. in
DE 100
55 318 .4 beschrieben.
-
3 zeigt
einen stark vergrößerten Ausschnitt
eines Beispieles eines an der Oberfläche 2 gebundenen DNA-Moleküles. Anders
als in 1 ist in 3 ein Zustand gezeigt, in
dem das Makromolekül 4 keine spezifische
Bindung mit einem anderen Makromolekül 5 eingegangen ist.
Das Makromolekül
ist an seinem Ende 29 an der Goldoberfläche 2 gebunden. Durch
die bindenden Gruppen des Makromoleküles im Bereich 16 bildet
sich eine Schleifenform 24. Am Ende 28 ist ein
Fluoreszenzfarbstoff Fl gebunden.
-
Alternativ zu den gezeigten Ausführungsformen
ist es auch möglich,
daß die
fluoreszenzunterdrückende
Schicht, hier Gold, nur im Bereich der Meßbereiche 6 vorhanden
ist.
-
Das erfindungsgemäße Verfahren wird mit den gezeigten
erfindungsgemäßen Devices
wie folgt durchgeführt.
Auf der Goldoberfläche 2 sind
in den Meßbereichen 6 unterschiedliche
DNA-Moleküle 4 gebunden. Sie
befinden sich in einem Zustand, der in 3 beispielhaft gezeigt ist. Der Fluoreszenzfarbstoff
Fl am Ende 28 des Moleküls 4 befindet
sich in diesem Zustand in direkter Nähe der fluoreszenzunterdrückenden
Oberfläche 2.
Mit dem Fluoreszenzaufbau 13, 14 läßt sich
dementsprechend keine Fluoreszenz nachweisen.
-
In den einzelnen Meßbereichen 6 auf
der Substratoberfläche 2 befinden
sich unterschiedliche derart ausgestaltete Makromolekülsorten 4.
In den Probenaufnahmeraum 8 wird durch die nicht gezeigten
Befüllöffnungen
eine Probenflüssigkeit
eingebracht, in der sich andere DNA-Stränge 5 befinden. Diejenigen
Makromoleküle 4,
die dazu komplementäre
Anteile im Schleifenbereich 24 aufweisen, können mit
den DNA-Strängen der
Flüssigkeit
hybridisieren. Dabei wird die Schleifenstruktur 24 aufgelöst und das
Ende 28 des Makromoleküles 4 mit
dem Fluoreszenzfarbstoff Fl entfernt sich von der Goldoberfläche 2.
Durch die Hybridisierung der einzelnen Makromoleküle 4 mit
den in der Flüssigkeit
vorhandenen Makromolekülen 5 entstehen
also Strukturen, wie sie schematisch in der 1 angedeutet sind. Der Fluoreszenzfarbstoff
Fl ist jetzt nicht mehr in der Nähe
des fluoreszenzunterdrückenden
Goldfilmes 2 und seine Fluoreszenz kann mit Hilfe der Fluoreszenzoptik 13, 14 in
bekannter Weise nachgewiesen werden. Aus dem Ort, an dem die Fluoreszenz
auftritt, kann festgestellt werden, welche Makromoleküle 4 in
welchem Meßbereich 6 mit
den in der Probenflüssigkeit
vorhandenen Makromolekülen 5 hybridisiert
haben. Auf diese Weise läßt sich
Information über
das spezifische Bindungsverhalten bzw. die Art und Menge der einzelnen
Makromoleküle
erhalten.
-
Zusätzlich kann das Device temperiert
werden, wenn ein Heizelement, z. B. ein Widerstandselement, oder
ein Peltierelement vorgesehen ist.
-
Ist nur wenig Probenflüssigkeitsmaterial
vorhanden, können
mit einem Aufbau, der in der Draufsicht der 2 sichtbar ist, mit einem einzelnen Probenflüssigkeitstropfen 16 mehrere
Meßbereiche 6 überstrichen werden.
Dazu wird ein Flüssigkeitstropfen 16 in
den Ausbreitungspfad einer Oberflächenschallwelle gebracht, die
mit einem Interdigitaltransducer 18 in bekannter Weise
auf der Oberfläche
eines Lithiumniobatkristalles 1 erzeugt wird. Durch den
Impulsübertrag
bewegt sich der Tropfen 16 über die einzelnen Meßbereiche 6 hinweg, so
daß sukzessive
untersucht werden kann, ob Probenmoleküle in dem Probenflüssigkeitstropfen 16 mit
Makromolekülen 4 in
den einzelnen Meßbereichen 6 eine
spezifische Bindung eingegangen sind oder nicht. Auf diese Weise
können
unter Einsatz von mehreren entsprechend angeordneten Interdigitaltransducern
einzelne Probenflüssigkeitstropfen 16 auch über ein
mehrere Tausend Meßbereiche 6 umfassendes
Feld bewegt werden. Dabei wird eine Fluoreszenzmeßeinrichtung 13, 14 eingesetzt,
die die Oberfläche
entsprechend abscannen kann.
-
Insbesondere läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren
vorteilhaft für
kinetische Messungen einsetzen, bei denen die Fluoreszenz während der
Reaktion gemessen wird. Dadurch, daß die Fluoreszenz nur dann auftritt,
wenn tatsächlich
eine Hybridisierung stattgefunden hat, liegt nur ein schwaches bzw. überhaupt
kein Hintergrundsignal vor.
-
Wird z. B. ein einzelner Probenflüssigkeitstropfen 6 mit
Hilfe des Impulsübertrages
von Oberflächenschallwellen
von einem Meßbereich 6 zum
anderen bewegt, tritt entsprechende Fluoreszenz auch nur an denjenigen
Meßbereichen
auf, die mit der Probenflüssigkeit
in Berührung
sind. Ein weiteres Hintergrundsignal liegt nicht vor.
-
Um die Reaktionskinetik unabhängig von
Diffusionsprozessen der Flüssigkeit
auf der Oberfläche
zu machen, kann es vorteilhaft sein, mit Hilfe des Impulsübertrages
von Oberflächenschallwellen,
die z. B. mit Interdigitaltransducern erzeugt werden, die Probenflüssigkeit
zusätzlich
zu homogenisieren bzw. durchzurühren.
-
Beispielexperiment:
-
Auf einer Goldoberfläche ist
die unten angegebene Sequenz A gebunden. Eine Probenflüssigkeit
mit der unten angegebenen Sequenz B (komplementär zu A) wurde auf die Goldoberfläche aufgebracht
und die Fluoreszenz im Verlauf der Zeit beobachtet. Das gleiche
Experiment wurde mit der unten angegebenen Sequenz C durchgeführt, die
nicht komplementär
zur A ist.
- A: 5'-Cy3-GCAGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGC-3'SH
- B: 5'-CTGGCGTAATAGCGAAGAGG-3'
- C: 5'-GAAAAAAACAAAAAAA-3'
-
Die Sequenz A bildet eine Haarnadelstruktur
durch Bindung der ersten vier (GCAG) mit den letzten vier Bestandteilen
(CTGC). Dadurch befindet sich der hier verwendete Farbstoff Cy3
in der Nähe
der fluroreszenzunterdrückenden
Goldoberfläche.
Die dazwischen befindliche Sequenz ist komplementär zur Sequenz
B. Die Sequenz B kann also in diesem Bereich an die Sequenz A angreifen
und hybridisieren. Dabei wird die Schleifenstruktur aufgelöst und der
Fluoreszenzfarbstoff entfernt sich von der die Fluoreszenz unterdrückenden
Oberfläche 2.
Die relative Fluoreszenz verhält
sich wie in Tabelle 1 angedeutet. Es zeigt sich, daß die relative
Fluoreszenzintensität
bei Aufbringen der Sequenz B sehr viel schneller sehr viel größere Werte
annimmt als bei Aufbringen der Sequenz C.
-